【発明の詳細な説明】
ヒトカリクレイン技術分野
本発明は、新規なヒトカリクレインの核酸及びアミノ酸配列に関するものであ
り、また疾病の診断、研究、予防、及び治療におけるこれらの配列の利用に関す
るものである。背景技術
カリクレインは、種々の循環系及び免疫系機能において作用する相同性セリン
プロテアーゼの大きなファミリーである（MacDonald RJ等(1988)Biochem J 253:
313-321;Murray SR等(1990)J Cardiovasc Pharmacol 15 Suppl 6:S7-16）。カリ
クレインは、血漿に存在し得、又は細胞膜に結合して存在し得る。カリクレイン
は、局所的又は全身の双方に作用して、血流及び血圧を調節する。カリクレイン
は、強力な血管拡張剤であるブラジキニン（Pisano JJ(1979)Handb Exp Pharmac
ol 25:suppl 273-285;Schachter M(1979)Pharmacol Rev 31:1-17）のような血管
作用性キニンペプチドをつくり出す低分子量のキニノーゲンを特異的に切断し得
る。遺伝子及び遺伝子組換え研究により、カリクレインが血圧調節においてもあ
る役目を果たしていることが分かった（Berry TD等(1989)Hypertention 13:3-8;
Woodley-Miller等1989;Pravenac M等(1991)Hipertention 17:242-246;Wang J等(
1994)Hypertention 23:236-243）。
カリクレインは、血液凝固カスケードにおいて二重の機能を有している。カリ
クレインは、カスケードの初期の成分である凝固ＸＩ因子（Griffin JH等(1976)
Proc Natl Acad Scli 73:2554-2558）を活性化することにより血餅形成を促進す
ることができ、既存の血餅に対しては、それを溶解し、凝固因子を破壊するプラ
スミン（Heimark RL等（1980）
Nature 286:456-460）の形成を促進することができる。
カリクレインは、重要な免疫学的機能を有する。血漿カリクレインは、ヒト好
中球を刺激して、これらを凝集かつ脱顆粒させ、それらのリソソームの内容物を
放出させることができる（Schapira M等(1982)JClin Invest 69:1199-1202）。
更に、補体成分Ｃ５と共に、血漿カリクレインをインキュベートすることにより
、免疫学的に活性なＣ５の断片がつくり出される（Wiggins RC等(1981)J Exp Me
d 153:1391-1404）。何人かの研究者が、炎症反応におけるカリクレインの役割
についての証拠を発見した。ある研究では、Clements JA等（1995,Endocrinolog
y 136:1137-1144）は、性腺刺激ホルモンの初期刺激を受けた非成熟女子の卵巣
において、排卵期における組織のカリクレイン発現及び活性が、排卵時の炎症様
反応において一定の役割を果たしていることを示唆していると報告した。
カリクレイン間の最も大きなヌクレオチドの違いはｍＲＮＡの５'末端にある
。カリクレインのｍＲＮＡの安定性及び／又は代謝回転速度の調節は、この５'
末端により、種依存的に影響を受け得る（Seidah NG等(1990)DNA Cell Biol 9:7
37-748）。更に、研究者は、カリクレイン遺伝子間の僅かな配列の違いが、組織
特異的発現及び機能の多種多様なパターンをつくり出す際に一定の役割を果たし
ていると推測している（Wines DR等(1991)J Mol Evol 32:476-492）。
局所的カリクレイン−キニン系は、ラットの心臓に存在する（Nolly N等(1994
)Hypertension 23:919-923）。ラットの心臓組織におけるカリクレイン活性及び
遺伝子発現の証拠が発見された。キニンは虚血再灌流傷害、心筋梗塞、及び心臓
肥大におけるアンジオテンシン変換酵素インヒビターを用いた治療によって誘導
される有利な心臓への効果の一部を媒介する。研究者は、ラットの心臓のカリク
レイン−キニン系が。他の
組織又は血漿のカリクレイン−キニン系とは独立して作用しているか否かについ
ては決定しなかった。
カリクレイン及び疾病
心肺バイパスは、生化学的及び細胞の炎症性反応を開始することにより、重傷
の出血性合併症を引き起こすことがある。カリクレインの選択的インヒビターが
、心肺バイパスにおける接触媒介炎症性反応を弱めるために効果的であり得ると
いうことが示唆されている（Wachtfogel YT等(1995)Am J Physiol 268:H1352-13
57）。
選択的組織カリクレインインヒビターＣＨ−６９４を、卵白アルブミン増感モ
ルモットでの試験の前後に腹腔内に投与すると、カリクレイン活性及び気道拒絶
が著しく低下した（Szelke M等(1994)Braz J Med Biol Res 27:1943-1947）。従
って、組織カリクレインのインヒビターは、アレルギー性炎症の治療において効
果的であることが分かった。
特異的カリクレインインヒビターは、関節炎についてのラットモデルにおいて
、おそらく炎症性反応によって誘発されたカリクレインに干渉することにより腫
脹と貧血との結合を低下させる（Dela Cadena RA等(1995)FASEB J 9:446-452）
。従って、特異的カリクレインインヒビターは、関節炎の患者の治療に役立つ可
能性がある。
高血圧症の治療のためのカリクレイン遺伝子治療の利用の可能性がラットで調
査された。ヒトカリクレイン遺伝子を、自然発症高血圧のラットに静脈内投与す
ることにより、持続的な体血圧の著しい低下が生じた（Wang C等(1995)J Clin I
nvest 95:1710-1716）。従って、カリクレイン遺伝子治療は、高血圧に悩む人口
の約２５％に対しての治療オプションとなり得ると考えられる。
アンジオテンシン変換酵素インヒビター（ACEi）は、高血圧及び心不全の治療
において幅広く用いられている。虚血再灌流傷害、心筋梗塞、
及び心臓肥大の治療においてACEiの効果のいくつかをキニンが媒体している証拠
が得られた（Nolly等，前出）。ACEiの心臓に対する作用におけるキニンの関与
は、独立した心臓のカリクレイン−キニン系の存在を示唆している。１４個のカ
リクレイン遺伝子ファミリーメンバーはマウスにおいて特性化されたが、現在ま
でにヒトでは３つのメンバーしか発見されていない。そしてその３つのメンバー
の何れも心臓には局在していない（Wines等，前出）。心臓におけるカリクレイ
ン活性の発見は非常に望ましいことである。なぜならばこの発見により高血圧、
心不全、炎症、及び血液凝固疾患の新たな治療法の可能性が得られるからである
。発明の開示
本発明は、新規なヒトカリクレイン（以下ＨＫＬＰと称する）を開示するもの
である。このＨＫＬＰはラットのカリクレイン(GI 205011)及びヒト腎臓カリク
レインとの相同性を有することで特性化されている。従って、本発明は、配列番
号：１のアミノ酸配列に示すような、カリクレインプロテアーゼファミリーの特
性を有する実質的に精製されたカリクレイン又はその断片を提供する。
本発明のある実施例は、ＨＫＬＰをコードする単離され、実質的に精製された
ポリヌクレオチドを提供する。特定の態様では、このポリヌクレオチドは、配列
番号：２の核酸配列を有する。更に、本発明は、厳密な条件の下で、配列番号：
２の配列とハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列を提供する。
本発明は更に、ＨＫＬＰをコードする核酸配列、そのオリゴヌクレオチド、ペ
プチド核酸（ＰＮＡ）、断片、部分、又はアンチセンス分子に関するものである
。本発明はまた、ＨＫＬＰをコードするポリヌクレオチドを有する発現ベクター
、及び宿主細胞又は生物体の形質転換のため
のその利用に関するものである。図面の簡単な説明
第１Ａ図、第１Ｂ図、第１Ｃ図、第１Ｄ図、及び第１Ｅ図は、MacDNAsisソフ
トウェア（Hitachi Software Engineering社）を用いて作製された新規なカリク
レインＨＫＬＰのアミノ酸配列（配列番号：１）及び核酸配列（配列番号：２）
を示す図である。
第２図は、LIFESEQTMデータベース（Incyte Pharmaceuticals,Palo Alto CA）
を用いて電気的に作製されたインサイト社クローンＮｏ．307474（配列番号：２
）に対するノーザン分析の結果を示した図である。量のパーセンテージは、ライ
ブラリーにおいて見い出された転写物の数に１００を乗じ、更にライブラリーに
おける転写物の総数で除すことによって計算される。
第３Ａ図、第３Ｂ図、及び第３Ｃ図は、ＨＫＬＰ（配列番号：１）、ラットの
カリクレイン(GI 205011；配列番号：３)、及びヒト腎臓カリクレイン（GI 1251
70；配列番号：４）の間のアミノ酸配列アライメントを示した図であり、このア
ミノ酸配列アライメントはDNAStarソフトウェア（DNAStar Inc,Madison WI）の
マルチシーケンスアライメントプログラムを用いて作製された。
第４図は、ＨＫＬＰ(配列番号：１)に対する疎水性グラフ(MacDNAsissoftware
を用いて作製)を示した図であり、Ｘ軸はアミノ酸の位置を、Ｙ軸は負の方向に
疎水性のレベルを示している（第４図及び第５図）。
第５図は、ラットのカリクレイン（配列番号：３）に対する疎水性のグラフで
ある。発明の実施の形態
定義
本明細書において、「核酸配列」とは、一本鎖若しくは二本鎖の、セ
ンス鎖、又はアンチセンス鎖であるゲノムの若しくは合成起源のＤＮＡ若しくは
ＲＮＡや、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、又はポリヌクレオチド、及びそ
の断片又は一部分を意味する。同様に、本明細書において「アミノ酸配列」とは
、ペプチド若しくはタンパク質配列を意味する。
本明細書において「ペプチド核酸」とは、リジンのようなアミノ酸残基及びア
ミノ基が加えられたオリゴマーを含む分子を意味する。これらの小分子は、抗遺
伝子剤とも称され、核酸のこれらの相補的な（鋳型の）鎖に結合することにより
転写物の伸張を停止させる（Nielsen PE等(1993)Anticancer Drug Des 8:53-63
）。
本明細書で用いられるとき、ＨＫＬＰとは、任意の種、特にウシ、ヒツジ、ブ
タ、マウス、ウマ、及び好ましくはヒトを含む哺乳類に由来する、天然の、合成
の、半合成の、又は組換え体を起源とする実質的に精製されたＨＫＬＰのアミノ
酸配列を意味する。
ＨＫＬＰの「変異体」は、１又は２箇所以上のアミノ酸の「置換」により異な
るものとなったアミノ酸配列を有し得るものである。この変異体は「保存的」変
化を含むものであり得、この保存的変化においては例えばロイシンをイソロイシ
ンで置き換える場合のように置換されるアミノ酸が類似な構造的及び化学的特性
を有する。稀に、変異体が「非保存的」に変化する場合もあり、この非保存的変
化では例えばグリシンがトリプトファンで置換される。類似した小変化には、ア
ミノ酸の欠失、挿入、若しくはその両方も含まれ得る。例えばDNAStarソフトウ
エアのような従来より周知のコンピュータプログラムを用いて、生物学的或いは
免疫学的活性を損なわずに、置換、挿入、又は除去できるアミノ酸及びそのアミ
ノ酸の数を決定することができる。
用語「生物学的に活性」とは、自然発生のＨＫＬＰの構造的機能、調
節機能、又は生化学的機能を有するＨＫＬＰを意味する。同様に「免疫学的活性
」とは、天然の、組換えの、又は合成のＨＫＬＰ、若しくはその任意のオリゴペ
プチドが適当な動物や細胞における特定の免疫応答を誘発し、特定の抗体に結合
する能力として定義される。
本明細書において、「誘導体」なる用語は、化学的に修飾されたＨＫＬＰをコ
ードする核酸、又はコードされたＨＫＬＰを意味する。このような修飾の例には
、水素からアルキル基、アシル基、又はアミノ基への置換がある。核酸誘導体は
、天然ＨＫＬＰの必須の生物学的特性を保持しているポリペプチドをコードする
。
本明細書において、「実質的に精製」なる用語は、この天然の環境から取り除
かれ、天然にはそれが結合して存在する少なくとも１つの他の成分から単離又は
分離されて、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは
少なくとも９０％遊離した核酸配列又はアミノ酸配列を有する分子を意味する。
「厳密性」とは、典型的には、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃下）か
らＴｍの約２０〜２５℃下の範囲で発生する。当業者には理解できるように、厳
密性のあるハイブリダイゼーションでは、同一のポリヌクレオチド配列を同定、
つまり検出したり、或いは類似の、すなわち近縁なポリヌクレオチド配列を同定
、つまり検出するために用いることができる。
本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション（ハイブリッド形成）」は
「核酸の鎖が塩基対合を介して相補鎖と結合する過程」（Coombs J（1994）Dict ionary of Biotechnology
,Stockton Press社,New York）を含む概念である。増
幅とは、核酸配列の複製を作り出すこととして定義され、通常周知のポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により実行される（Dieffenbach CW and GS Dveksler(1
995),PCR Primer,a Laboratory Manual
,Cold Spring Harbor Press社,New york）。
本明細書において「欠失」とは、１または２以上のヌクレオチド若しくはアミ
ノ酸残基が欠ける、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化として定
義される。
本明細書において「挿入」或いは「付加」とは、自然発生のＨＫＬＰと比較し
て、結果的に１または２以上のヌクレオチド或いはアミノ酸残基の加わるような
ヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。
本明細書において「置換」とは、１または２以上のヌクレオチド或いはアミノ
酸を異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置換することによって生ずる変化を指
す。
説明
本発明は、心臓組織ライブラリー（HERTNOT01）由来のｃＤＮＡの中から初め
に同定された新規なヒトカリクレインに関するものであり、疾病の研究、診断、
予防、及び治療におけるその核酸及びアミノ酸配列の利用に関するものである。
ＨＫＬＰの一部をコードするｃＤＮＡは、心臓組織由来ライブラリーのみにおい
て見いだされた（第２図参照）。
本発明はまた、ＨＫＬＰ変異体をその範囲に含む。好適なＨＫＬＰ変異体は、
ＨＫＬＰアミノ酸配列（配列番号：１）に対して少なくとも８０％のアミノ酸配
列の類似性を有するものであり、より好適なＨＫＬＰ変異体は、配列番号：１と
少なくとも９０％のアミノ酸配列類似性を有するものであり、最も好適なＨＫＬ
Ｐ変異体は配列番号：１の配列と少なくとも９５％のアミノ酸配列類似性を有す
るものである。
本発明のヒトカリクレインをコードする核酸は、ｃＤＮＡ、インサイト社クロ
ーンＮｏ．307474（配列番号：２）の中から、アミノ酸配列アライメントのコン
ピュータ検索によって初めに同定された。ＨＫＬＰ核酸配列（配列番号：２）は
、配列番号：１のＨＫＬＰアミノ酸配列をコ
ードする。本発明は、ＨＫＬＰ、ラットのカリクレイン(GI 205011;Seidah NG等
,(1989)DNA 8:563-574)、及びヒト腎臓カリクレイン(GI 125170;Baker AR等(198
5)DNA 4:445-450;第３Ａ図及び第３Ｂ図)の間の化学的及び構造的相同性に部分
的にその基礎をおいている。ＨＫＬＰはラットカリクレインに対して３５％の同
一性、ヒト腎臓カリクレインに対して３３％の同一性を有する。疎水性プロット
解析から、ＨＫＬＰとラットカリクレインの双方が、分子を膜に誘導するシグナ
ル配列と思われるアミノ末端において疎水性を共通のものとしていることが分か
る。ラットのカリクレインとは異なり、血漿カリクレインＨＫＬＰは、カルボキ
シ末端におていも疎水性であり、従って、膜結合を維持し易い。この新規なＨＫ
ＬＰは３５６個のアミノ酸からなる長さを有し、３つの潜在性グリコシル化部位
を有する。
ＨＫＬＰコーディング配列
ＨＫＬＰの核酸配列及び推定アミノ酸配列を第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ
図に示す。本発明によれば、ＨＫＬＰのアミノ酸配列をコードする任意の核酸配
列を用いて、ＨＫＬＰを発現する組換え体分子を生成することができる。ここに
開示する特定の実施例では、ＨＫＬＰをコードする核酸の部分的配列は、初めに
心臓組織ｃＤＮＡライブラリー（HEARTNOT01）からインサイト社クローンＮｏ．
307474として単離されたものである。
遺伝暗号の縮重の結果、既知の又は自然発生の遺伝子のヌクレオチド配列に対
して最小限の相同性しか有していないものも含まれる多数のＨＫＬＰコード化ヌ
クレオチド配列が作り出され得る、ということは当業者には明らかであろう。本
発明は、特に、可能なコドン選択に基づく組み合わせの選択によりなされ得る全
ての可能な核酸配列の変化をその範囲に含んでいる。それらの組み合わせは、自
然発生のＨＫＬＰのヌクレ
オチド配列に当てはまる標準的なトリプレット遺伝暗号に基づいて作り出される
ものであり、このような全ての変異は、ここに具体的に示されたものと考えられ
たい。
ＨＫＬＰ及びその変異体をコードするヌクレオチド配列は適切に選択された厳
密性の条件の下で、自然発生配列のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能な
ものであるのが好ましいが、概ね異なるコドン使用を有するＨＫＬＰ又はその変
異体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。コドン選
択は、特定のコドンが宿主によって使用される頻度に従って、特定の原核細胞の
、或いは真核細胞の発現宿主においてペプチドが発現する速度を高めるように選
択され得る。ＨＫＬＰ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を、コード
されるアミノ酸配列を変更することなく実質的に変更する理由は、例えば天然配
列から作り出される転写物よりより長い半減期のようなより望ましい特性を有す
るＲＮＡ転写物の産生のためである。
現在では、ＨＫＬＰ又はその誘導体をコードするＤＮＡ配列、若しくはその一
部分を、完全に合成ケミストリにより作製して、その後、その合成遺伝子を任意
の入手可能なＤＮＡベクター及び細胞系に、この出願時点において周知の試薬を
用いて挿入することができる。更に、合成ケミストリを用いてＨＫＬＰをコード
する配列又はその任意の部分に突然変異を誘発させることができる。
また本発明の範囲に含まれるものとして、種々の厳密性の条件の下で、第１Ａ
図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能なポリ
ヌクレオチド配列がある。ハイブリダイゼーション条件は、Berger及びKimmel(1
987,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzvmology,Vol 152,
Academic Press,San Diego CA)に記載されているように、核酸結合複合体または
プローブの融点（Ｔｍ）
に基づいており、定義された「厳密性」で用いられる基準を与える。上記文献は
本明細書と一体に引用されたものである。
本発明において用いられ得るＨＫＬＰをコードする変異核酸配列は、異なるヌ
クレオチド残基の欠失、挿入並びに置換を含み、結果的に同一の、または機能的
に等価のＨＫＬＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとなるものである
。そのタンパク質も、サイレント変化を生ずるアミノ酸残基の欠失、挿入並びに
置換を含み、結果的に機能的に等価なＨＫＬＰとなる。慎重なアミノ酸置換は、
ＨＫＬＰの生物学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度
、疎水性、親水性並びにまた両親媒性についての類似性に基づいてなされ得る。
例えば負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正
に荷電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンが含まれ、同じ親水値を持つ荷電
していない極性頭基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、
グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニ
ルアラニン並びにチロシンが含まれる。
本発明の範囲に含まれるものとして、ＨＫＬＰのアレルがある。ここで用いる
「アレル」或いは「アレル配列」とは、ＨＫＬＰの別形態である。アレルは変異
、すなわち核酸配列の変化によって生じ、一般に変化したｍＲＮＡ或いはポリペ
プチドを生成するが、そのｍＲＮＡ或いはポリペプチドの構造或いは機能は変更
される場合もあれば、されない場合もある。遺伝子によっては、アレル形態が存
在しないもの、１つ存在するもの、或いは多数存在するものがある。アレルを生
じる変異は一般に、アミノ酸の自然な欠失、付加並びに置換に起因する。このタ
イプの変化はそれぞれ単独で、或いは他の遺伝子の組み合わせて、与えられた配
列内の１又は２以上の位置で生じ得る。
ＤＮＡ配列決定のための方法は周知であり、例えばＤＮＡポリメラー
ゼＩ，Sequenase（商標）のクラノウフラグメント（US Biochemical社,Clevelan
d OH）、Ｔａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer社,Norwalk CT）、熱安定性Ｔ７ポ
リメラーゼ（Amersham社,Chicago IL）、或いはGibco BRL（Gaithersburg MD）M
ethods社から市販されているELONGASE増幅システムのような組換えポリメラーゼ
とプルーフリーディングエキソヌクレアーゼとの組み合わせのような酵素を使用
する。好ましくは、この処理は、Hamilton Micro Lab2200(Hamilton社,Reno NV)
、Peltier Thermal Cycler（PTC200;MJ Reserch社,Watertown MA）並びにABI377
DNAシーケンサ（Perkin Elmer社）のような装置を用いて自動化される。
ポリヌクレオチド配列の延長
ＨＫＬＰをコードするポリヌクレオチド配列は、部分的なヌクレオチド配列と
、プロモータ及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当業者には
周知の様々な方法とを用いて延長することができる。Gobinda等（1993;PCR Meth
ods Applic 2:318-22）は既知の部位に隣接する未知の配列を検索するために汎
用プライマーを用いる直接的な方法として「制限部位」ポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）法を開示している。ここでは、まずゲノムＤＮＡが、既知の領域に対し
て特異的なプライマー及びリンカー配列に対するプライマーの存在下で増幅され
る。増幅された配列は、その同じリンカープライマー及び最初のプライマーの内
部に含まれる別の特異的プライマーを用いてＰＣＲの２巡目にかけられる。ＰＣ
Ｒの各回の生成物は、適切なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、逆転写酵素
を用いて配列決定される。
逆転写ＰＣＲ法を用いて、既知領域に基づく多様なプライマーを利用した配列
の増幅、または延長を行うことができる（Triglia等（1988）Nucleic Acids Res
16:8186）。プライマーは、OLIGO（登録商標）4.06
（National Biosciences社,Plymouth MN）或いは別の適切なプログラムを用いて
設計され、長さが２０〜３０ヌクレオチドで、５０％以上のＧＣ含有率を有し、
かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールする。この方法ではいくつかの
制限酵素を用いて、遺伝子の既知領域の適当なフラグメントを生成する。次いで
このフラグメントは分子内ライゲーションにより環状にされ、ＰＣＲ用の鋳型と
して使用される。
キャプチャＰＣＲ法（Lagerstrom M等(1991)PCR Methods Applic 1:111-19）
は、ヒト及び酵母菌人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡ内の既知の配列に隣接するＤＮ
ＡフラグメントのＰＣＲ増幅を行うための方法である。またキャプチャＰＣＲで
は、多重制限酵素消化及びライゲーションによってＰＣＲ前にＤＮＡ分子の未知
の部分に、組換え二本鎖配列を配置する必要がある。
未知の配列を釣り上げるために用いることができる別の方法は、標的遺伝子歩
行のための方法である歩行ＰＣＲ法（Parker JD等1991;Nucleic Acids Res 19:3
055-60）である。PromoterFinder（登録商標）なる、Clontech社（Palo Alto CA
）から市販されている新しいキットでは、ＰＣＲ、入れ子プライマー並びにProm
oterFinderのライブラリーを用いて、ゲノムＤＮＡ内を歩行させる。この過程は
、ライブラリーをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エクソン接合部
を探し出すのに有用である。完全長ｃＤＮＡをスクリーニングするための好適な
ライブラリーは、サイズ選択された、より大きなｃＤＮＡを含むライブラリーで
ある。またランダムプライマーを与えた（rondom primed）ライブラリーは、遺
伝子の５’及び上流領域を含むより多くの配列を含むという点で好適である。ラ
ンダムプライマーを与えられたライブラリーは、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーが
完全長ｃＤＮＡを生成しない場合、特に有用である。またゲノムライブラリーは
、プロモータ結合領域の５
’まで延長するために有用である。
サイズを分析したり、或いは配列決定やＰＣＲ処理の産物のヌクレオチド配列
を確認するための新しい方法はキャピラリー電気泳動法である。迅速な配列決定
のためのシステムは、Perkin elmer社、Beckman Instruments社（Fullerton CA
）並びに他の企業から入手できる・キャピラリー電気泳動法では、電気泳動分離
のための流動性ポリマー、レーザで活性化される４つの異なる蛍光色素(各ヌク
レオチドに対して１つ)を使用し、ＣＣＤカメラにより放射線の波長の検出を行
う。出力／光強度は適切なソフトウエア（例えばPerkin elmer社製のGenotyper
（登録商標）及びSequence Navigator（登録商標））を用いて電気信号に変換さ
れ、サンプルの負荷からコンピュータ解析及び電子データ表示までの全過程がコ
ンピュータ制御される。キャピラリー電気泳動法は特定のサンプルの限定された
量の中に存在するＤＮＡの小片の配列決定に特に適している。この方法により３
０分間でＭ１３ファージＤＮＡの３５０ｂｐを再現可能な形で配列決定できたこ
とが報告されている（Ruiz-Martinez MC等（1993）Anal Chem 65:2851-8）。
ヌクレオチド配列の発現
本発明に従って、ＨＫＬＰ、そのポリペプチドの断片、融合タンパク質或いは
その機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列を、適切な宿主細胞内での
ＨＫＬＰの発現を誘導する組換えＤＮＡ分子を生成するために用いることができ
る。遺伝暗号固有の縮重のために、概ね同一か或いは機能的に等価なアミノ酸配
列をコードする他のＤＮＡ配列も、ＨＫＬＰのクローニングや発現のために用い
ることができる。当業者には理解できるように、非自然発生コドンを有するＨＫ
ＬＰコード化ヌクレオチド配列を生成することは有益であり得る。特定の原核細
胞或いは真核細胞の宿主において好適なコドン（Murray E等（1989）;Nucleic
Acids Res 17:477-508）を選択して、例えば、ＨＫＬＰ発現率を増大させたり、
或いは自然発生配列から生成された転写産物より長い半減期のような望ましい特
性を有する組換えＲＮＡ転写産物を生成することができる。
本発明のヌクレオチド配列は、様々な目的でＨＫＬＰコード配列を変更するた
めに組換えられ得るが、このような変更には、限定はしないが遺伝子生成物のク
ローニング、プロセシング並びにまた発現を修飾するための変更が含まれる。例
えば、特定部位突然変異誘発のような当業者には周知の技術を用いて突然変異を
誘発させることによって、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更
、コドン選好の変化等をもたらすことができる。
本発明の別の実施例では、天然ＨＫＬＰコーディング配列、修飾ＨＫＬＰコー
ディング配列或いは組換えＨＫＬＰコーディング配列を異種の配列に結合して、
融合タンパク質をコードする配列にする。例えば、ＨＫＬＰ活性のインヒビター
を選別すべくペプチドライブラリーをスクリーニングするために、市販の抗体に
より認識される異種のペプチドを発現するキメラＨＫＬＰタンパク質をコード化
することが役立ち得る。融合タンパク質はＨＫＬＰ配列と異種のタンパク質配列
との間の位置に切断部位を包含するように設計することもでき、これによってＨ
ＫＬＰを切断して、異種の部分から分けて実質的に精製することが可能となる。
本発明の別の実施例では、ＨＫＬＰコーディング配列は、当業者によく知られ
た化学的方法（Caruthers等（1980）Nuc Acids Res Symp Ser 7:215-223、Crea,
Horn（1980）Nuc Acids Res 9:2331、Matteucci,Caruthers（1980）Tetrahedron
Lett 21:719、Chow,Kempe（1981）Nuc Acids Res 9:2807-2817参照）を用いて
、全体的に、或いは部分的に合成することができる。別法では、ＨＫＬＰアミノ
酸配列を、全体的
に或いは部分的に合成する化学的方法を用いてタンパク質自体を生成することが
できる。例えば、種々の固相技術(Roberge JY等(1995)Science 269:202-204)で
ペプチド合成を行うことができ、合成の自動化は、例えばABI431Aペプチドシン
セサイザ（Perkin Elmer）を製造者の指示に従って用いることにより達成するこ
とができる。
この新たに合成されたペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィにより精
製することができる（例えばCreighton（1983）Proteins Structure And Molecu lar Principles
,WH Freeman and Co,New York参照）。合成されたペプチドの組
成は、アミノ酸解析或いは配列決定処理により確認することができる（例えばth
e Edman degradation procedure;Creighton，上述）。さらにＨＫＬＰのアミノ
酸配列、或いはその任意の部分を、その直接の合成の際に改変したり、また他の
細胞内メディエータ或いはその任意の部分に由来する配列と化学的方法を用いて
結合して、変異体ポリペプチドを生成することができる。
発現系
生物学的に活性のＨＫＬＰを発現するために、ＨＫＬＰコーディングヌクレオ
チド配列或いは機能的等価物は、適切な発現ベクター、すなわち挿入されたコー
ド化配列の転写及び翻訳に必要不可欠な要素を含むベクターに挿入される。
ＨＫＬＰコーディング配列及び適切な転写や翻訳の制御エレメントを含む発現
ベクターを構成するために当業者に周知の方法が用いられる。これらの方法には
、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術、並びにin vivo組換え、即ち遺伝子組
換え技術が含まれる。このような技術は、Sambrook等（1989）Molecular Clonin g.A Laboratory Manual
,Cold Spring Harbor Press,Planview NY及びAusubel FM
等Current Protocol in Molecular Biology,John Wilky&Sons,New Yorkに記載さ
れている。
種々の発現ベクター／宿主系を、ＨＫＬＰコード化配列を保持し、かつ発現す
るために利用することができる。このようなものには、限定はされないが、組摸
えバクテリオファージ、プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転
換した細菌、酵母菌発現ベクターで形質転換した酵母菌、ウイルス発現ベクター
（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（
例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMV、タバコモザイクウイルスTMV）をト
ランスフェクトした、或いはバクテリア発現ベクター（例えばTi、或いはpBR322
プラスミド）で形質転換した植物細胞系、或いは動物細胞系が含まれる。
これらの系の「制御エレメント」或いは「調節配列」は、その力及び特異性は
様々で、ベクターの非翻訳領域、エンハンサー、プロモータ及び３’非翻訳領域
であり、これらは転写及び翻訳を実行するために宿主細胞のタンパク質と相互作
用する。利用されるベクター及び宿主に応じて、構成的及び誘導性プロモータを
含む任意の数の適切な転写及び翻訳エレメントが用いられ得る。例えば、バクテ
リア系においてクローニングする際には、Bluescript（登録商標）ファージミド
（Stratagene社,LaJolla CA）のハイブリッドlacZプロモータ及びptrp-lacハイ
ブリッド並びに同様の誘導性プロモータが用いられる。バキュロウイルスポリヘ
ドリンプロモータは昆虫細胞において用いられる。植物細胞のゲノム（例えば熱
ショック，RUBISCO及びストレージタンパク質遺伝子）に由来する、或いは植物
ウイルス（例えばウイルス性プロモータ或いはリーダー配列）に由来するプロモ
ータ或いはエンハンサはベクターにクローン化され得る。哺乳動物細胞では、哺
乳動物遺伝子或いは哺乳動物ウイルス由来のプロモータが最適である。ＨＫＬＰ
の多数の複製を含む株細胞を生成する必要がある場合には、SV40或いはEBVに基
づくベクタ
ーを、適切な選択マーカーと共に用いる。
細菌系では、ＨＫＬＰの発現の用途に応じて多数の発現ベクターが選択され得
る。例えば抗体を誘発するために大量のＨＫＬＰが必要とされる場合は、容易に
精製される融合タンパク質を高濃度で発現できるベクターが望まれる。そのよう
なベクターには、限定はしないが、大腸菌クローニングベクター及び発現ベクタ
ーBluescript（Stratagene社）（このベクターでは、ＨＫＬＰコード化配列が、
アミノ基末端メチオニン及び後続のβ−ガラクトシダーゼの７残基の配列を備え
たフレーム内においてベクターに結合されてハイブリッドタンパク質が生成され
る）や、pINベクター（Van Heeke&Schuster（1989）J Biol Chem 264:5503-5509
）等が含まれる。またpGEXベクター（Promage社、Madison WI）も、グルタチオ
ンＳ−トランスファーゼ（GST）を有する融合タンパク質として異種ポリペプチ
ドを発現するため用いられる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であ
り、グルタチオンアガロースビーズへの吸着に続き、遊離グルタチオンの存在下
における溶出により溶解した細胞から容易に精製できる。その系において生成さ
れたタンパク質はヘパリン、トロンビン或いはＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を
含むように設計され、対象となるクローン化ポリペプチドは随意にGST部分から
放出され得る。
酵母菌、サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）では、α因
子、アルコールオキシダーゼ及びPGHのような構成的或いは誘導性プロモータを
含む多数のベクターが用いられる。再検討する場合には、Ausubel等（前出）及
びGrant等（1987）Methods Enzymol 153:516-544を参照されたい。
植物発現ベクターを用いる場合には、ＨＫＬＰをコードする配列の発現は、多
数の任意のプロモータにより促進される。例えばCaMVの35S
及び19Sプロモータ（Brisson等（1984）Nature 310:511-514）のようなウイルス
性プロモータは、単独で、或いはTMV(Takamatsu等(1987)EMBO J 6:307-311)から
のオメガ−リーダー配列と共に用いられる。別法では、RUBISCO（Coruzzi等（19
84）EMBO J 3:1671-1680）、Broglie等（1984）Science 224:838-843）の小サブ
ユニット、或いは熱ショックプロモータ（Winter J 及びSinibaldiRM(1991)Resu
lts Probl Cell Differ 17:85-105）のような植物プロモータが用いられる。こ
れらの構成は直接ＤＮＡ形質転換或いは病原体媒介トランスフェクションにより
植物細胞内に導入される。そのような技術を再検討する場合には、Hobbs S 及び
Murry LE、McGraw Hill Yearbook of Science and Technology（1992）McGraw H
ill NY,pp191-196及びWeissbach and Weissbach（1988）Mehd for Plnt Molecul r Bilogy
,Academic Press NY,pp421-463を参照されたい。
ＨＫＬＰを発現するために用いることができる別の発現系は昆虫系である。そ
のような系の一つでは、Autographa californica核多角体病ウイルス（AcNPV）
がベクターとして用いられ、Spodovtera frugiperda細胞或いはTrichoplusiaの
幼虫において外来遺伝子を発現する。ＨＫＬＰコード化配列は、ポリヘドリン遺
伝子のような、ウイルスの非必須領域にクローニングされ、ポリヘドリンプロモ
ータの制御下に置かれる。ＨＫＬＰの挿入が成功した場合には、ポリヘドリン遺
伝子が不活性にされ、コートタンパク質膜が欠如した変異体ウイルスが生成され
る。次いで、この変異体ウイルスは、S.frugiperda細胞或いはTrichoplusiaの幼
虫への感染させるために用いられ、その中でＨＫＬＰが発現される（Smith等（1
983）J Virol 46:584、Engelhard EK等（1994）Proc Nat Acad Sci 91:3224-7）
。
哺乳類宿主細胞では、多数のウイルス性発現系を利用することができ
る。発現ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合には、ＨＫＬＰのコー
ド化配列は、後期プロモータ及び三連リーダ配列からなるアデノウイルス転写物
／翻訳物複合体内に結合される。ウイルス性ゲノムの非必須領域への挿入により
、感染した宿主細胞でＨＫＬＰを発現することができる生存可能なウイルスにな
る（Logan及びShenk（1984）Proc Nat Acad Sci 81:3655-3659）。さらにラウス
肉腫ウイルス（RSV）エンハンサのような転写エンハンサを哺乳類宿主細胞内の
発現を増加させるために用いることができる。
また、ＨＫＬＰ配列の効率的な翻訳のためには、特定の開始シグナルも必要で
ある。これらのシグナルには、ATG開始コドン及び隣接の配列が含まれる。ＨＫ
ＬＰ及びその開始コドン及び上流配列が適切な発現ベクター内に挿入される場合
には、追加の翻訳制御シグナルは不要である。しかしながらコード化配列、或い
はその一部のみが挿入される場合には、ATG開始コドンを含む外来の翻訳制御シ
グナルが与えられなければならない。さらに、開始コドンは正しい読み枠内にあ
る必要があり、全インサートの転写を確実に行わなければならない。外来転写エ
レメント及び開始コドンは、自然及び合成両方の様々な起源に由来するものであ
り得る。発現の効果は、その細胞系に適切なエンハンサを含めることにより強化
される（Scharf等（1994）Results Probl Cell Differ 20:125-62、Bitter等（1
987）Methods Enzymol 153:516-544）。
さらに宿主細胞株は、挿入された配列を望ましい形に改変したり、発現したタ
ンパク質のプロセシングを行う能力で選択される。このようなポリペプチドの修
飾は、限定はしないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化
、脂質化（lipidation）並びにアシル化を含む。またタンパク質の「プレプロ」
形態を切り離す、翻訳後プロセシングは、正しい挿入、折り畳み、並びにまた機
能の発揮のために重要である。CHO,
HeLa,MDCK,293,WI38等のような異なる宿主細胞は、そのような翻訳後活性のため
の特定の細胞機構及び特徴的な機構を有しており、導入される外来タンパク質の
修飾やプロセシングを確実に実行するべく選択される。
長期間にわたって高収率の変異体タンパク質の生産を確保するためには、安定
した発現が望ましい。例えばＨＫＬＰを安定的に発現する株細胞は、ウイルス由
来の複製物、或いは内在性発現エレメント及び選択マーカー遺伝子を含む発現ベ
クターを用いて形質転換される。ベクターの導入に続いて、細胞は、選択培地に
切り替えられる前に、濃縮培地内で１〜２日間成長させられる。選択マーカーは
選択物への耐性を与え、導入された配列をＤＮＡ内に安定的に結合する細胞を同
定できるようにする。安定的に形質転換された細胞の耐性凝集塊はその細胞型に
適切な組織培養技術を用いて増殖することができる。
形質転換された株細胞を回収するために任意の数の選択系を用いることができ
る。限定はしないが、選択系は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler
等（1977）Cell 11:223-32）及びアデニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ
（Lowy等（1980）Cell 22:817-23）遺伝子を含み、それぞれtk-及びaprt-細胞に
おいて用いられる。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択の
基礎として用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を
与え（Wigler等(1980)Natl Acad Sci 77:3567）、nptはアミノグリコシッド剤、
ネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え（Colberre-Garapin等（1981）J Mol
Biol 150:1）、als或いはpatはクロルスルフロン（chlorsulfuron）、フォスフ
ィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（phosphinotricinacetyltransferase
）に対する耐性を与える（上記Murry）。さらに選択可能な遺伝子として、例え
ば細胞がトリプトファンの代わりにインドー
ルを利用できるようにするtrpB、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（hi
stinol）を利用できるようにするhisDが記載されている（Hartman及びMulligan
（1988）Proc Nalt Acad Sci 85:8047）。最近になって、形質転換体を同定する
ためばかりではなく、特定ベクター系による一過性の或いは安定なタンパク質発
現の量を定量するために広く用いられるβ−グルクロニダーゼ、アントシアニン
及びルシフェリンのような標識による可視標識が非常によく用いられるようにな
った（Rhodes CA等（1995）Methods Mol Biol 55:121-131）。
本発明のポリヌクレオチド配列を含む形質転換体の同定
マーカー遺伝子発現の存在／不存在は、対象の遺伝子も存在することを示唆す
るが、その存在及び発現は確認されるべきである。例えばＨＫＬＰがマーカー遺
伝子配列内に挿入されるなら、ＨＫＬＰを含む組換え細胞がマーカー遺伝子の機
能の存在により同定できる。別法ではマーカー遺伝子は、単一プロモータの制御
下でＨＫＬＰ配列と直列に配置することができる。誘導または選択に応じてのマ
ーカー遺伝子の発現は、通常さらにＨＫＬＰの発現をも示す。
この他、ＨＫＬＰのコーディング配列を含み、さらにＨＫＬＰを発現する宿主
細胞が、当業者には周知の様々な手順により同定できる。これらの手順は、限定
はしないが、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション及び
、核酸及びタンパク質の検出並びにまた定量するための膜、溶液或いは破片ベー
スの技術を含むタンパク質バイオアッセイ或いはイムノアッセイを含む。
ＨＫＬＰポリヌクレオチド配列の存在は、ＨＫＬＰのプローブ、一部、或いは
フラグメントを用いるＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーシ
ョン或いは、増幅により検出することができる。核酸増幅に基づくアッセイでは
、ＨＫＬＰ配列に基づくオリゴヌクレオチド或
いはオリゴマーを使用し、ＨＫＬＰのＤＮＡ或いはＲＮＡを含む形質転換体を検
出する。本明細書において「オリゴヌクレオチド」或いは「オリゴマー」とは、
プローブ或いは、ＰＣＲで増幅されるセグメントであるアンプリマーとして用い
ることができる、少なくとも１０ヌクレオチド、多い場合には６０ヌクレオチド
、好適には１５〜３０ヌクレオチド、より好適には２０〜２５ヌクレオチドの核
酸配列を指す。
目的タンパク質に特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいず
れかを用いてＨＫＬＰポリペプチドの発現を検出し、測定するための種々のプロ
トコルが当業者には周知である。このようなプロトコルの例としては、酵素結合
免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び蛍光表示式細
胞分取器法（ＦＡＣＳ）を含む。ＨＫＬＰポリペプチド上で２つの非干渉なエピ
トープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナルベ
ースイムノアッセイ（two-site,monoclonal-based immunoassay）は好適ではあ
るが、競合的結合アッセイも用いられる。これらアッセイの並びに他のアッセイ
は、Hampton R等(1990,Serologivcal Methods,a Laboratory Manual,APS Press,
St Paul MN)及びMaddox DE等（1983,I Exp Med 158:1211）等に記載されている
。
さらに多くの標識及び結合技術は当業者には周知であり、種々の核酸及びアミ
ノ酸検査法において用いることができる。ＨＫＬＰに関連する配列を検出するた
めの標識されたハイブリダイゼーション或いはＰＣＲプローブを生成するための
手段には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション法、末端標識化或いは標識
化ヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅などがある。別法では、ＨＫＬＰ配列、或い
はその任意の部分が、ｍＲＮＡプローブの生成のためにベクターにクローニング
される。そのようなベクターは当分野では周知であり、市販されており、Ｔ７，
Ｔ３或い
はＳＰ６並びに標識されたヌクレオチドのような適切なＲＮＡポリメラーゼの付
加により、in vitroでのＲＮＡプローブ合成のために用いることができる。
Pharmacia Biotech社（Piscataway NJ）、Promega社（Madison WI）並びにUS
Biochemical社（Cleveland OH）のようないくつかの企業がこれらの手順に対す
る商用のキット及びプロトコルを提供している。適切なリポーター分子、すなわ
ち標識には、放射性核種、酵素、蛍光性剤、化学ルミネセンス剤或いは色素生成
剤や、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子或いはそれに類似のものが含ま
れる。そのような標識の使用について記載している特許には、米国特許第3,817,
837号、第3,850,752号、第3,939,350号、第3,996,345号、第4,277,437号、第4,2
75,149号並びに第4,336,241号がある。また、組換え免疫グロブリンの製造につ
いては米国特許第4,816,567号に記載の方法を用いることができ、本明細書とと
もに参照されたい。
ＨＫＬＰの精製
ＨＫＬＰをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培
地からコード化タンパク質を発現及び回収するために適切な条件下で培養される
。組換え細胞により生成されるタンパク質は、用いられる配列並びにまたベクタ
ーに応じて、細胞内に分泌、つまり含有されるようにすることができる。当業者
には理解されるように、ＨＫＬＰをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベク
ターは、原核細胞か、真核細胞の細胞膜を通してのＨＫＬＰの分泌を誘導するシ
グナル配列を含むように設計される。他の組換え体作製物では、ＨＫＬＰを、可
溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオ
チド配列に結合することができる（Kroll DJ等（1993）DNA Cell Biol 12:441-5
3、融合タンパク質を含むベクターに関する上記論議も参照され
たい）。
またＨＫＬＰは、タンパク質精製を容易にするために加えられた１または２以
上の付加的なポリペプチドドメインを備えた組換えタンパク質として発現される
。そのような精製を容易にするドメインには、限定はしないが、固定化金属上で
の精製を可能にするヒスチジントリプトファンモジュールのような金属キレート
ペプチド（Porath J(1992)Protain Expr Purif 3:263-281）、固定化免疫グロブ
リン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、並びにＦＬＡＧＳ延長／ア
フィニティ精製システムにおいて用いられるドメイン（Immunex社、Seattle WA
）が含まれる。精製ドメイン及びＨＫＬＰ間に第ＸＡ因子或いはエンテロキナー
ゼ（Invitrogen,San Diego CA）のような切断可能なリンカー配列を含めるのは
精製を促進するのに役立つ。このような発現ベクターの１つは、ＨＫＬＰを含む
融合タンパク質の発現を提供し、かつ６個のヒシチジン残基、それに続くチオレ
ドキシン及びエンテロキナーゼ切断部位をコードする核酸を含む。ヒシチジン残
基によりＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー、Po
rathら(1992)Protein Expresslon and Purification 3:263-281に記載）上での
精製を促進すると共にエンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質からの目的
タンパク質の精製のための手段となる。
組換え体の産生に加えて、ＨＫＬＰのフラグメントは、固層技術を用いた直接
のペプチド合成で形成することもできる。（Stewartら（1969）Solid-Phase Pet ide Synthesis,WH Freeman Co,San Francisco;Merrifield J(1963) J Am Chem S
oc 85:2149-2154を参照されたい）。in vitroタンパク質合成は手作業で行える
が、自動化することもできる。自動的な合成は、例えば、Applied Biosystem 43
1Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer,Foster City CA）を製造者の指示に従
って用いて
行うことができる。ＨＫＬＰの種々のフラグメントを個別に化学的に合成し、化
学的方法を用いて結合して完全長分子を作り出すことができる。
ＨＫＬＰの使用
ここに開示する核酸及びポリペプチド配列の利用の原理は、ここに開示する新
規なヒトＨＫＬＰ、ラットカリクレイン(GI 205011;Seidah等,前出)、及びヒト
腎臓カリクレイン(GI 125170;Baker等，前出)の間の化学的及び構造的相同性に
部分的に基づくものである。
このためＨＫＬＰは炎症経路に作用することができ、従ってＨＫＬＰの特異的
インヒビターは、心肺バイパス、喘息、又は他の要因によって生ずる炎症を防止
する助けとなり得る。特異的ＨＫＬＰインヒビターは、関節炎の患者に対する治
療の可能性を有している。ＨＫＬＰをコードするポリヌクレオチドを利用した遺
伝子治療を用いて、ヒトの高血圧を治療することが可能である。この他、タンパ
ク質ＨＫＬＰを適切な外形で送達することにより、体血圧の持続的な低下をもた
らすことができる。ＨＫＬＰは、キニンをつくり出すことによって高血圧、脳卒
中、及び心臓障害についての新たな治療法を提供し得る。
カリクレイン活性を低下させることが望ましいようなこれらの病気では、細胞
にＨＫＬＰをコードする遺伝子に対するアンチセンス配列をトランスフェクトす
るか、或いはＨＫＬＰのインヒビターを供給することができる。このような病気
には、低血圧、凝固傷害、及び炎症性疾患が含まれる。
ＨＫＬＰの抗体
ＨＫＬＰ特異的抗体は、ＨＫＬＰの発現が関係する病気や疾病の診断のために
役立つ。このような抗体には、限定はしないが、ポリクローナル抗体、モノクロ
ーナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Ｆａｂフラグメント並びにＦａｂ発現ライブ
ラリにより生成されるフラグメントが含まれ
る。中和抗体、すなわちＨＫＬＰポリペプチドの生物活性を抑制する抗体は、特
に診断及び治療に好適である。
抗体誘発のためのＨＫＬＰは生物学的活性を有している必要はないが、そのタ
ンパク質断片、つまりオリゴペプチドは抗原性でなければならない。特異的抗体
を誘発するために用いられるペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸、好ましく
は少なくとも１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。これらの配列は
、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一のものであり、小さい自然発生の
分子の全アミノ酸配列を含み得る。ＨＫＬＰアミノ酸の短いストレッチを、キー
ホールリンペットヘモシアニン及びキメラ分子に対して産生された抗体のような
他のタンパク質の配列に融合することができる。ＨＫＬＰに対する抗体の生成の
ために、当分野においてよく知られる手順が用いられる。
抗体を産生するために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等を含む種々の宿主は
、免疫学的特性を保持するＨＫＬＰ或いはその任意の部分、フラグメント或いは
オリゴペプチドを注入することにより免疫することができる。宿主の種に応じて
、種々のアジュバントが免疫学的反応を促進するために用いられる。そのような
アジュバントには、限定はしないが、フロイントのアジュバント、水酸化アルミ
ニウムのような無機質ゲルアジュバント、リゾレシチンのような表面活性物質ア
ジュバント、プルロニックポリオルアジュバント、ポリアニオンアジュバント、
ペプチドアジュバント、油性乳剤アジュバント、キーホールリンペットヘモシニ
アンアジュバント並びにジニトロフェノールアジュバントが含まれる。ＢＣＧ（
カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウムパルヴム（Corynebacterium
parvum）は有用なヒトアジュバントである。
ＨＫＬＰに対するモノクローナル抗体は、培地中の連続株細胞による抗体分子
の産生を行うための任意の技術を用いて調製される。これらは、
限定はしないが、Koehler及びMilstein（1975,Nature 256:495-497）に当初掲載
されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor等（1983）
Immunol Today 4:72、Cote等（1983）Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030）及び
ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cote等（1985）Monoclonal Antibodies and Canc er Therapy
,Alan R Liss Inc,pp77-96）を含む。
さらに、適切な抗原特異性並びに生物活性を有する分子を得るための「キメラ
抗体」の生成、即ちヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングのた
めに開発された技術が用いられる（Morrison等（1984）Proc Natl Acad Sci 81:
6851-6855）、Neuberger等（1984）Nature 312:604-608、Takeda等（1985）Natu
re 314:452-454）。別法では、一本鎖抗体の生成のための周知技術（米国特許第
4,946,778号）を、ＨＫＬＰ特異的一本鎖抗体を生成するために適用する。
また抗体は、リンパ球集団におけるin vivo産生を誘導することにより、或い
はOrlandi等（1989,Proc Natl Acad Sci 86:3833-3837）並びにWinter G及びMil
stein C（1991,Nature 349:293-299）に開示されているような組換え免疫グロブ
リンライブラリー、または高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングす
ることによっても生成することができる。
ＨＫＬＰに対する特異結合部位を含む抗体フラグメントも生成することができ
る。例えばこのようなフラグメントには、限定はしないが、抗体分子のペプシン
消化により生成することができるＦ（ａｂ’）2フラグメント及びＦ（ａｂ’）2
フラグメントのジスルフィド架橋を減らすことにより生成することができるＦａ
ｂフラグメントが含まれる。別法では、所望の特異性を有するモノクローナルＦ
ａｂフラグメントを迅速に、しかも容易に同定できるように、Ｆａｂ発現ライブ
ラリーを構築す
る（Huse WD等（1989）Science 256:1275-1281）。
確立された特異性を有するポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体のい
ずれかを用いる競合的結合アッセイ或いは免疫放射定量測定法のための種々のプ
ロトコルが当分野ではよく知られている。そのようなイムノアッセイでは、一般
に、ＨＫＬＰとその特異的抗体（或いは類似のＨＫＬＰ結合分子）との間の複合
体の形成、並びに複合体形成の測定が行われる。特異的ＨＫＬＰタンパク質上の
２つの非干渉性エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部
位モノクローナル用イムノアッセイが好適ではあるが、競合結合アッセイも用い
られる。これらの検査法はMaddox DE等（1983,J Exp Med 158:1211）に記載され
ている。
ＨＫＬＰ特異的抗体を用いる診断検査法
特定のＨＫＬＰ抗体は、ＨＫＬＰの発現の誘発によって特性化される病気或い
は疾病の診断や、ＨＫＬＰで治療されている患者のモニタリングのためのアッセ
イにおいて役立つ。ＨＫＬＰについての診断アッセイは、ヒトの体液、細胞或い
は組織の抽出物において、ＨＫＬＰを検出するための抗体或いは標識を利用する
方法を含む。本発明のポリペプチド及び抗体は、修飾の有無に拘わらず用いるこ
とができる。多くの場合、ポリペプチド及び抗体は、共有結合、或いは非共有結
合かのいずれかでそれらをリポーター分子と結合することにより標識される。種
々のリポーター分子が周知となっており、その幾つかについては上記した。
それぞれのタンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体或いはモノクロー
ナル抗体を用いて、ＨＫＬＰポリペプチドを測定するための種々のプロトコルが
当分野では周知である。その例として、酵素結合免疫測定法（ELISA）、ラジオ
イムノアッセイ（RIA）並びに蛍光表示式細胞分取器法（FACS）がある。ＨＫＬ
Ｐポリペプチド上の２つの非干
渉性エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクロ
ーナル用イムノアッセイは好適ではあるが、競合的結合アッセイも用いられる。
これらのアッセイは、他にもあるが、Maddox DE等（1983,I Exp Med 158:1211）
に記載されている。
疾病の診断の基礎を提供するために、ＨＫＬＰ発現についての通常の値、すな
わち標準値が確立されなければならない。これは複合体形成のために適切な条件
下で、ヒト成いは動物どちらでもよいが、正常の被験者から得られる体液或いは
細胞抽出物と、ＨＫＬＰに対する抗体とを結合することにより得ることができる
が、これは当分野ではよく知られた技術である。標準的な複合体形成量は、一連
のポジティブコントロールの希釈系とそれを比較することにより定量され、抗体
の既知の量が既知の濃度の精製ＨＫＬＰと結合される。その後正常サンプルから
得られた標準値を、ＨＫＬＰが関係する疾患を潜在的に患う被験者からのサンプ
ルから得られた値と比較する。標準値と対象値との偏差によって疾病の存在を確
認できる。
薬物スクリーニング
ＨＫＬＰ、その触媒作用性または免疫原性フラグメント或いはオリゴペプチド
は、種々の任意の薬物スクリーニング技術において治療用化合物のスクリーニン
グのために用いることができる。そのような試験において用いられるフラグメン
トは、溶液、固体支持体への付着、細胞表面ヘの付着、或いは細胞内への定着に
おいて制限はない。ＨＫＬＰと試験される薬剤との間の触媒活性、すなわち結合
複合体形成の低下が測定される。
薬物スクリーニングのための別の方法は、ＨＫＬＰポリペプチドへの安定的な
結合親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングを可能にするもので
あり、１９８４年９月１３日公告の欧州特許出願第
84/03564号（Guysen）に詳細に記載されている。この文献を本明細書に一体に参
照されたい。概要としては、多数の別々の小ペプチド試験用化合物をプラスチッ
クピン或いはいくつかの他の表面のような、固体基質上で合成する。ポリペプチ
ド試験化合物をＨＫＬＰフラグメントと反応させ、洗浄する。次いで結合ＨＫＬ
Ｐを当分野で周知の方法により検出する。また精製ＨＫＬＰを前述の薬物スクリ
ーニング技術において使用するために、プレート上に直接コーティングすること
もできる。別法では、ペプチドを捕捉し、固形支持体上にペプチドを固定するた
めに非中和抗体を用いる。
また本発明は、ＨＫＬＰに結合し得る中和抗体特性が、ＨＫＬＰとの結合につ
いて特に試験化合物と競合する競合的薬物スクリーニングアッセイの使用も意図
している。このようにして、抗体を用いて１または２以上の抗原性決定基をＨＫ
ＬＰと共通に有する任意のペプチドの存在を検出することができる。
ＨＫＬＰコーディングポリヌクレオチドの使用
ＨＫＬＰポリヌクレオチド、或いはその一部が診断並びにまた治療目的で用い
られる。診断目的の場合、本発明のＨＫＬＰは、ＨＫＬＰの発現が関与する生検
組織における遺伝子発現を検出し、かつ定量するために用いられる。診断試験は
、ＨＫＬＰが存在、不存在、及び過剰発現の何れの状態にあるかを区別したり、
治療的介入の際にＨＫＬＰ濃度の調節をモニタリングするのに役立つ。本発明の
範囲には、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及び
ＰＮＡが含まれる。
本発明の別の側面は、ＨＫＬＰまたは近縁な分子をコードするゲノム配列を含
むポリヌクレオチド配列を検出できるハイブリダイゼーションプローブ或いはＰ
ＣＲプローブを提供することである。そして、そのプローブの特異性、すなわち
非常に高度な保存領域（例えば５’調節領域
における１０個の独特のヌクレオチド）か、低度に保存的な領域（例えば特に３
’領域におけるシステイン残基の間の領域）の何れに由来するのかということや
、ハイブリダイゼーション或いは増幅の（高度の、中程度の或いは低度の）厳密
性によって、そのプローブが自然発生ＨＫＬＰのみを同定するものであるか、或
いはアレル配列や近縁な配列も同定するものであるかが決まってくる。
プローブは近縁なインヒビターをコードする配列を検出するためにも用いるこ
とができ、好ましくは、これらのＨＫＬＰの任意のものをコードする配列から得
られるヌクレオチドを少なくとも５０％含むべきである。本発明のハイブリダイ
ゼーションプローブは、配列番号：２のヌクレオチド配列か、プロモータ、エン
ハンサエレメント及び自然発生ＨＫＬＰのイントロンを含むゲノムの配列に由来
するものであり得る。ハイブリダイゼーションプローブは種々のリポータ分子に
より標識することができ、この標識には、32Ｐや35Ｓのような放射性核種、アビ
ジン／ビオチン結合系によりプローブに結合するアルカリホスファターゼのよう
な酵素標識等が含まれる。
ＨＫＬＰのＤＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションプローブの生成のた
めの他の手段は、ｍＲＮＡプローブ産生用のベクターにＨＫＬＰやＨＫＬＰ誘導
体をコードする核酸配列をクローン化することである。このようなベクターは周
知であって市販されており、Ｔ７やＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのような適切な
ＲＮＡポリメラーセや適切な放射性標識ヌクレオチドを付加することにより、in
vitroでＲＮＡプローブを合成するために用いることができる。
ＨＫＬＰをコードするポリヌクレオチド配列を、ＨＫＬＰの発現が関与する病
気や疾病の診断のために用いることができる。例えば、ＨＫＬＰをコードするポ
リヌクレオチド配列を、ＨＫＬＰ発現を検出するため
の生検組織や体液の、ハイブリダイゼーションアッセイ或いはＰＣＲアッセイに
おいて用いることができる。そのような定性的及び定量的方法の形態には、サザ
ンブロット法或いはノーザンブロット法、ドットブロット法或いは他の膜用技術
、ＰＣＲ技術、ディップスティック試験法（試験紙法）、ピン或いはチップ技術
及びELISA技術が含まれる。これらの技術は全て、当分野ではよく知られており
、実際に市販されている多くの診断キットの基礎となっている。
ここに開示したＨＫＬＰヌクレオチド配列は、筋肉るいそうに関係する活性化
や誘導を検出するアッセイのための基礎を提供する。ＨＫＬＰヌクレオチド配列
は、既知の方法により標識され得、ハイブリダイゼーション複合体の形成に適し
た条件の下で、患者の体液や組織のサンプルに加えられる。インキュベーション
時間の経過後、このサンプルを、ヌクレオチドが酵素で標識されている場合には
所望に応じて色素（または他の展開剤を要する標識）を含む適合性の液体で洗浄
する。この適合性の液体をリンスした後、色素を定量して標準値と比較する。生
検サンプルや抽出サンプルにおける色素の量が、比較用対照サンプルの色素量を
著しく上回っている場合には、このヌクレオチド配列はサンプルのヌクレオチド
配列とハイブリッド形成しており、サンプル内に著しく高い濃度のＨＫＬＰヌク
レオチド配列が存在していることは、関連する炎症及び／または疾患が存在して
いることを示している。
このようなアッセイは、特定の治療行為の有効性を評価するため、動物実験、
臨床試験、或いは個々の患者の治療をモニタリングする際に用いることができる
。疾患を診断するための基礎を与えるために、ＨＫＬＰ発現に対する正常な或い
は標準的なプロフィールが確立されなければならない。この標準プロフィールは
、正常な被験者、すなわち動物或いはヒトから得られる体液或いは細胞抽出物を
、ハイブリダイゼーション
或いは増幅に適切な条件下で、ＨＫＬＰ或いはその一部と結合することにより確
立される。標準的なハイブリッド形成は、正常被験者に対して得られる値と、既
知の実質的に精製されたＨＫＬＰの量が用いられる同一の実験におけるポジティ
ブコントロール希釈系列で得られる値とを比較することにより定量することがで
きる。正常なサンプルから得られた標準値は、ＨＫＬＰ発現に関連する障害或い
は疾患を潜在的に患っている被験者からのサンプルから得られる値と比較される
。標準値と被験者値との偏差から疾病の存在が確認される。
ひとたび疾患が確認されると、現存する治療用薬剤が投与され、治療プロファ
イルが作成される。このようなアッセイは、その数値が正常すなわち標準パター
ンに向かって回復しているか否かを評価するために規則的に繰り返される。継続
的な治療プロファイルを用いて数日間或いは数ヶ月の期間にわたる治療効果を示
すことができる。
米国特許第4,683,195号、第4,800,195号並びに第4,965,188号に記載のような
ＰＣＲ法により、ＨＫＬＰ配列に基づくオリゴヌクレオチドの追加の使用法が提
供される。このようなオリゴマーは一般には化学的に合成されるが、酵素を用い
て発生させたり、或いは組換えソースから生成することもできる。一般にオリゴ
マーは、通常特定の遺伝子或いは状態を同定するために最適な条件下で用いられ
る２つのヌクレオチド配列、即ちセンス方向（５’→３’）のヌクレオチド及び
アンチセンス方向（３’←５’）のヌクレオチドからなる。同一の２つのオリゴ
マー、入れ子オリゴマーの組、或いはオリゴマーの縮重プールでさえ、近縁なＤ
ＮＡまたはＲＮＡ配列の検出や定量のためのより低い厳密性の条件下であっても
用いることができる。
さらに特定の分子の発現を定量するための方法には、放射性標識(radiolabeli
ng)(Melby PC等1993J Immunol Methods 159:235-44)
或いはビオチン標識（Duplaa C等1993 Anal Biochem 229-36）ヌクレオチドの利
用、制御核酸の同時増幅（coamplification）の利用、並びに実験結果を補完し
て書かれた標準的なグラフ曲線の利用が含まれる。多数のサンプルの定量は、Ｅ
ＬＩＳＡ形式のアッセイを実行することにより迅速に行うことができ、対象のオ
リゴマーが様々な希釈溶液中に現れ、分光光度分析或いは比色分析反応により迅
速に定量することができる。例えば、生検組織の抽出物においてＨＫＬＰが比較
的高いレベルで存在することは、筋肉るいそうの発症を示している。このタイプ
の確定診断により、健康の専門家が患者の積極的治療を開始したり、病状の悪化
を防ぐことが可能となる。同様に、当業者に周知のアッセイを用いて、患者の治
療の際に、その病状の進行をモニタリングすることができる。また、まだ開発さ
れていない分子生物学的技術でも、その新技術が既知のヌクレオチド配列の性質
、例えばトリプレット遺伝暗号、特異的塩基対形成等に基づくものであれば、こ
こに開示したヌクレオチド配列をそれに利用することができる。
治療的利用
カリクレインをコードする遺伝子に対するその相同性及びその発現プロフィー
ルに基づき、ここに開示するＨＫＬＰをコードするポリヌクレオチド配列は、高
血圧、心肥大、関節炎、炎症性疾患、及び血液凝固障害のような病気の治療にお
いて役立つ。
レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス或いはワクシニアウイルスに由来
する発現ベクター、或いは細菌性プラスミドに由来する発現ベクターは、標的の
器官、組織、または細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いられる。当
業者によく知られた方法は、アンチＨＫＬＰを発現する組換えベクターを構築す
るために用いることができる。例えばManiatis等（上記）及びAusubel等（上記
）に記載された技術を参
照されたい。
完全長ｃＤＮＡ配列、並びにまたその調節エレメントを含むポリヌクレオチド
により、研究者は遺伝子機能のセンス調節（Youssoufian H及びHF Lodish 1993
Mol Cell Biol 13:98-104）、或いはアンチセンス調節（Eguchi等（1991）Annu
Rev Biochem 60:631-652）の調査用のツールとしてＨＫＬＰを用いることができ
る。このような技術は、現在当分野ではよく知られており、センス或いはアンチ
センスオリゴヌクレオチド、或いはより大きなフラグメントを、コーディング領
域或いは制御領域に沿った様々な位置から設計することができる。
所望のＨＫＬＰコーディング断片を高度に発現する発現ベクターを細胞または
組織にトランスフェクトすることにより、ＨＫＬＰをコードする遺伝子の機能を
停止させることができる。このような作製物は、翻訳不可能なセンス或いはアン
チセンス配列とともに細胞から溢れ出し得る。ＤＮＡへの組み込みがない場合で
すら、このようなベクターは、全ての複製物が内在性ヌクレアーゼにより分解さ
れるまで、ＲＮＡ分子を転写し続ける。このような一過性の発現は、非複製ベク
ター（Mettler I，personal communication）でも１ヶ月以上、適当な複製エレ
メントがベクター系の一部である場合には更に長い期間継続し得る。
上述のように、ＨＫＬＰの制御領域、例えばプロモータ、エンハンサ或いはイ
ントロンに対するアンチセンス分子、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡを設計するこ
とにより遺伝子発現を修飾することができる。転写開始部位、例えばリーダー配
列の＋１０〜−１０領域の間に由来するオリゴヌクレオチドが好適である。また
アンチセンス分子は、転写産物がリボソームへの結合するのを防止することによ
り、ｍＲＮＡの翻訳を阻止するように設計される。同様に、抑制は、「三重らせ
ん」塩基対合法を用いて達成することができる。三重らせん対合は、二重らせん
が、ポリ
メラーゼ、転写因子、或いは調節分子を結合するべく十分に開かないようにする
。三重らせんＤＮＡを用いた最近の治療法は、Gee JEら(Huber BE and BI Carr(
1994)Molecular and Immunologic Approaches，Futura Publishing Co,Mt Kisco
NY)により記載されている。
リボザイムはＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素性ＲＮＡ分子で
ある。リボザイムの作用の仕組みでは、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の
配列特異的ハイブリダイゼーションが行われ、その後エンドヌクレアーゼによる
切断（endonucleolytic cleavage）がなされる。発明の範囲内には、ＨＫＬＰの
エンドヌクレアーゼによる切断を、特異的に及び効果的に触媒し得る、人工合成
のハンマーヘッド型リボザイム分子も含まれている。
任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム切断部位の最初の同定は、
配列ＧＵＡ、ＧＵＵ並びにＧＵＣが後続するリボザイム切断部位に対する標的分
子を走査することにより行われる。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝
子の領域に対応する１５〜２０個のリボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列は、
そのオリゴヌクレオチドの機能を停止させる２次構造の特徴について評価される
。また候補の標的の適切性の評価は、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相
補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に対する接触性を試験すること
により行われる。
本発明のアンチセンス分子及びリボザイムは、ＲＮＡ分子を合成するのための
当分野で周知の方法により調製することができる。これらの技術には、固相ホス
ホラミダイト（phosphoramidite）化学合成のような化学合成オリゴヌクレオチ
ドの技術が含まれる。別法では、ＲＮＡ分子を、ＨＫＬＰをコードするＤＮＡ配
列のin vivo及びin vitro転写により生成することができる。このようなＤＮＡ
配列は、Ｔ７或いはＳＰ６
のような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモータを有する多種のベクターに組み込
まれる。別法では、構造的に或いは誘導的にアンチセンスＲＮＡを合成するアン
チセンスｃＤＮＡ構成物が、株細胞、細胞或いは組織内に導入される。
ＲＮＡ分子は細胞内安定性を高め及び半減期を長くするために修飾することが
できる。実行可能な修飾には、限定はしないが、その分子の５’並びにまた３’
末端のフランキング配列の付加、或いは分子のバックボーン内にホスホジエステ
ラーゼ連鎖ではなくホスホロチオネート（phosphorothioate）或いは２’Ｏ−メ
チルを使用することを含む。このコンセプトは、ＰＮＡの産生において固有のも
のであり、内在性エンドヌクレアーゼにより容易に認識されないアデニン、グア
ニン、シチジン、チミン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び
類似の修飾形態とともに、イノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブト
シン（Wybutosine）のような従来あまり用いられなかった塩基を含めることによ
って、これら全ての分子に拡張することができる。
細胞或いは組織内にベクターを導入するための方法には、以下に議論される方
法が含まれ、これらの方法は、in vivo、in vitro、及びex vivo治療法に対して
も適切なものである。ex vivo治療法の場合には、患者から採取された幹細胞に
ベクターを導入し、自家移植のためにクローンとして増殖して同じ患者に戻す方
法が、ここで引用されている米国特許第5,399,493号及び第5,437,994号に記載さ
れている。トランスフェクションによる送達、リポソームによる送達は、当分野
でよく知られているものである。
更に、ここに開示するＨＫＬＰのヌクレオチド配列は、新技術、即ち、限定は
しないが、それがトリプレット遺伝暗号及び特異的塩基対合相互作用のような特
性を含む、現在周知のヌクレオチド配列の特性に依存す
る技術であれば、まだ開発されていない分子生物学的技術においても用いること
ができる。
近縁なポリヌクレオチド配列の検出及びマッピング
ＨＫＬＰの核酸配列は、自然発生のゲノム配列のマッピングのためのハイブリ
ダイゼーションプローブを生成するために用いることができる。この配列は、よ
く知られた技術を用いて、特定の染色体或いはその染色体の特定領域に対してマ
ッピングすることができる。このような技術には、染色体を拡げたもの（chromo
somal spreads）についてのin situハイブリダイゼーション（Verma等（1988）H
uman Chromosomes:A.Manual of Basic Technique,Pergamon Press,New York）、
フローソーティング(flow-sorted)染色体調製法、或いは酵母菌人工染色体(ＹＡ
Ｃｓ)、細菌性人工染色体(ＢＡＣｓ)、細菌性Ｐ１構造体或いはpriceCM（1993;B
lood Rev 7:127-34）及びTrask BJ（1991;Trends Ganet 7:149-54）に概要が示
されている単染色体ｃＤＮＡライブラリのような人工染色体構造が含まれる。
染色体を拡げたものについての蛍光in situハイブリダイゼーションの技術は
、“Verma等(1988)Human Chromosomes:A Manual of Basic Technioue,Pergamon
Press,New York”に記載されている。染色体調製物の蛍光in situハイブリダイ
ゼーション及び他の染色体マッピング技術は、追加の遺伝子地図データと関係を
有する。遺伝子地図データの例は、1994 Genome Issue of Science(265:1981f)
に見ることができる。物理的染色体地図上でのＨＫＬＰの位置と、特定の失敗（
または特定の疾病の素因）との相関関係を助けとして、ある遺伝病が関係するＤ
ＮＡの領域を限界決定することができる。本発明のヌクレオチド配列を、健常者
と、キャリアまたは患者との遺伝予配列の違いを検出するために用いることがで
きる。
染色体調製物のin situハイブリダイゼーション及び確定された染色体マーカ
ーを用いる連鎖解析のような物理的地図作成技術は、遺伝子地図を延長する際に
大変重要である。ヒトゲノムのＳＴＳに基づく地図の最近の例は、Whitehead-MI
T Center for genomic Reserch（Hudson TJら(1995)Science270:1945-1954）か
ら最近出版されている。多くの場合、特定のヒト染色体の数或いは腕が知られて
いなくても、マウスのような別の哺乳動物種の染色体上の遺伝子の配置から、関
連する標識を明らかにすることができる。新しい配列は、染色体の腕、或いはそ
の一部への物理的マッピングにより割当てることができる。これは位置クローニ
ング或いは他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を調査する研究者に貴重な情
報を提供する。ひとたび毛細血管拡張性運動失調（ＡＴ）のような疾患或いは症
候群が、特定のゲノム領域、例えばＡＴ〜11q22-23（Gatti等（1988）Nature 33
6:577-580）への遺伝子連鎖により粗く局所化されれば、その領域にマッピング
される任意の配列は、さらなる研究のための関連する遺伝子、或いは調節遺伝子
を表すことができる。本発明のヌクレオチド配列は、正常者とキャリアまたは患
者との間の、転座、逆位等による染色体位置の違いを検出するために用いること
もできる。
医薬品組成物
本発明は、ヌクレオチド、タンパク質、抗体、アンタゴニスト、またはインヒ
ビターを、単独で、或いは安定化化合物のような少なくとも１つの他の薬剤とと
もに含んでいる医薬品組成物を、その範囲に含む。この医薬品組成物は、任意の
無菌の生体適合性製薬用担体に含めて投与されるが、このような担体には、限定
はしないが、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖或いは水が含まれる。これらの
分子は、患者に対して、単体で、或いは他の薬品やホルモンと結合して、賦形剤
或いは製薬学的に
許容される担体と混合される他の薬品組成物に入れて投与され得る。本発明の一
実施例では、製薬学的に許容される担体とは、製薬学的に不活性なものである。医薬品組成物の投与
医薬品組成物は経口投与、或いは非経口投与される。非経口投与の方法には、
局所的投与、動脈内（腫瘍への直接の）投与、筋肉内投与、皮下投与、髄内投与
、くも膜下内投与、脳室内投与、静脈内投与、腹腔内投与或いは鼻腔内投与が含
まれる。活性成分に加えて、これらの薬品組成物は、薬学的に用いられ得る調合
物内への活性化合物の処理を容易にする賦形剤及び補助剤を含む適切な製薬学的
に許容される担体を含み得る。調合或いは投与に関する技術の詳細は、“Reming
ton's Pharmaceutical Sciences”（Mack Publishing Co,Easton PA）の最新版
において見出すことができる。
経口投与用の医薬品組成物は、当分野でよく知られる製薬学的に許容される担
体を用いて適切な剤形に製剤される。このような担体により、薬品組成物は、治
療を受ける患者による経口及び鼻腔摂取のための、錠剤、丸剤、カプセル剤、液
体剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤或いは類似の剤形として処方さ
れる。
経口投与するための医薬品調製物は、活性化合物と固形の賦形剤とを結合する
ことによって得ることができるが、所望に応じて、必要なら適切な補助剤を添加
した後、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理して、錠剤或いは糖衣剤
核を得ることができる。適切な賦形剤は、ラクトース、サクロース、マンニトー
ル或いはソルビトールを含む砂糖のような糖質或いはタンパク質充填剤、とうも
ろこし、小麦、米、じゃがいも等からのでんぷん、メチルセルロース、ヒドロキ
シプロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムの
ようなセ
ルロース、アラビアゴム或いはトラガカントのようなゴム、並びにゼラチン或い
はコラーゲンのようなタンパク質である。必要ならば、架橋結合したポリビニル
ピロリドン、寒天、アルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸或いはアルギン酸
ナトリウムのようなその塩のような、崩壊剤或いは可溶化剤が加えられる。
糖衣剤核は、濃縮砂糖溶液のような適切な錠皮を与えられるが、溶液はアラビ
アゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル剤、ポリエチレングリ
コール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機溶剤或いは溶剤混
合物が含み得る。錠剤の識別のため、すなわち活性化合物の量、すなわち投与量
を特徴付けるために染料或いは色素が錠剤或いは糖衣錠皮に加えられてもよい。
経口投与可能な製剤は、ゼラチンからなるプッシュフィットカプセル及びゼラ
チンからなる柔らかい、密封されたカプセル、並びにグリセロール或いはソルビ
トールのような錠皮を含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトース或いはで
んぷんのような充填剤或いは結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネシウムの
ような潤滑剤、並びに付加的には安定剤と混合された活性処方組成物を含み得る
。柔らかいカプセルでは、活性化合物は、安定剤があるなしにかかわらず、脂肪
油、液体パラフィン、液体ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解或
いは懸濁される。
非経口投与用の剤形は、水溶性の活性化合物の水溶液を含む。注射用として、
本発明の薬品組成物を水溶液、好適にはハンクの溶液、リンガー溶液或いは生理
緩衝食塩水のような生理学的に適合性の緩衝液に入れて製剤することができる。
水性の注入懸濁剤は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール
或いはデキストランのような懸濁剤の粘性を増加する物質が含み得る。更に、活
性成分の懸濁液は、適切
な油性注入懸濁剤として調製される。適切な親油性の溶媒或いは媒介物は、胡麻
油のような脂肪油や、オレイン酸エチル、トリグリセリド或いはリポソームのよ
うな合成脂肪酸エステルを含む。また懸濁剤は、所望に応じて、それにより溶解
度を増加し、非常に濃縮された溶液の調製ができるようになる適切な安定剤或い
は薬剤を含んでもよい。
局所的投与または経鼻投与用には、浸透される特定の障壁に対して適切な浸透
剤を用いて調合が行われる。このような浸透剤は、一般的に周知である。製造と保管
本発明の薬品組成物は周知の方法、例えば従来の混合処理、溶解処理、顆粒化
処理、糖衣形成処理、研和処理、乳化処理、封入処理(entrapping)処理或いは凍
結乾燥処理により製造される。
この医薬品組成物は塩類として提供されることもあり、限定はしないが、塩酸
、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む、多くの酸とともに
形成することができる。塩は、対応する遊離塩基形態である水性或いはプロトニ
ック溶剤において、より可溶性が高くなる傾向がある。他の場合には、好適な製
剤は、１ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン、０．１％〜２％のショ糖、使用前に緩衝
剤と結合させたｐＨ範囲４．５〜５．５にある２％〜７％のマンニトールにおけ
る凍結乾燥粉末である。
製薬学的に許容される担体内に製剤された本発明の化合物を含む組成物は、調
製された後、適切な容器内に入れられて、さらに提示した疾病状態の治療のため
にラベル付けされる。ＨＫＬＰの投与のため、このようなラベルには、投与の量
、頻度、方法が表示される。治療上効果的な投与量
本発明において使用するために適切な医薬品組成物は、活性成分を所
望の目的を達成するに効果的な量だけ含む組成物である。効果的な投与量の決定
は、当業者の能力の範囲内で行うことができる。
任意の化合物の場合、治療的に有効な投与量は、初めに、新生物細胞、或いは
通常マウス、ウサギ、イヌ、ブタのような動物モデルの何れかの細胞培地のアッ
セイから推定される。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおいて効果的な
投与量や投与経路を決定することができる。
治療的に有効な投与量とは、疾病状態を寛解するタンパク質、その抗体、アン
タゴニスト、またはインヒビターの量である。そのような化合物の毒性及び治療
有効性は、例えばＬＤ５０（個体群の５０％の致死投与量）及びＥＤ５０（個体
群の５０％において治療的に有効な投与量、５０％有効量）を決定するための、
細胞培地或いは実験動物における標準的な製薬学的手順により決定することがで
きる。毒性と治療有効性との間の投与量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５
０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬品組成物が好ましい
。これらの細胞培地のアッセイ及び付加的な動物研究から得られるデータは、ヒ
トへの使用に対する投与量の範囲を決める際に用いることができる。そのような
化合物の投与量は、毒性がほとんど或いは全くなく、ＥＤ５０を達成する循環濃
度の範囲内にあることが望ましい。投与量は、用いられる剤形、患者の感受性並
びに投与経路に応じてこの範囲内で変化する。
正確な投与量は治療されるべき患者を考慮して個々の医師により選択される。
投与量及び投薬量は、十分なレベルの活性部分を与え、かつ所定の効果を維持す
るために調整される。考慮すべき付加的な要因は、疾患状態の重症度、または患
者の年齢、体重並びに性別、食事、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感
受性、並びに治療への耐性／反応を含む。長期的に作用する薬品組成物は３〜４
日毎に、１週間毎に、或いは半減期及び特定の処方のクリアランス速度に応じて
２週間に１度投与
してもよい。
通常の投与量は０．１〜１００，０００μｇの範囲にあって、全投与量は最大
約１ｇであり、投与経路に応じて変化する。特定の投与量或いは供給の方法に関
するガイダンスは、文献において見出すことができる。米国特許第4,657,760号
、第5,206,344号或いは第5,225,212号を参照されたい。当業者は、ヌクレオチド
に対しては、タンパク質やインヒビター用の剤形とは異なる剤形を採用するであ
ろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状
態、位置等によって決まってくる。
例えば、ＨＫＬＰまたはＨＫＬＰ誘導体を、適切な剤形で送達させて、特定の
タンパク質の分解を誘導することが可能である。このような治療により、高血圧
の患者における体血圧を低下させることが可能である。同様に、ＨＫＬＰアンタ
ゴニストの投与により、このタンパク質の活性を阻害したり、寿命を短くして、
種々の薬剤により生じた炎症を低下させることもできる。
以下に本発明の実施例を示す。但し、以下の実施例は単なる例示であって、本
発明をこの実施例に限定しようとするものではない。
産業上の応用
１ ｃＤＮＡライブラリーの構築
心臓ｃＤＮＡライブラリー作製のための心臓組織は、５６歳の白人男性から得
られた（Lot No.HAL194,International Institute for the Advancement of Med
icine(IIAM),ExtonPA）。左心室ｃＤＮＡライブラリー作製のための左心室は、
５１歳の白人女性から得られた(Lot No.RU95-03-196,IIAM)。右心房及び左心房
ｃＤＮＡライブラリー作製のための右心房及び左心房組織は、それぞれ同じ白人
女性から得られた。
各組織は個別にフラッシュ冷凍し、乳棒と乳鉢で擦り潰した。組織を
グアニジウムイソチアネート含有緩衝液に即座に溶解し、塩化セシウムを通して
遠心沈殿させた。この調製物を何回かのフェノールクロロフォルム抽出及びｐＨ
８でのエタノール沈殿で処理した。次に得られたサンプルをＤＮアーゼ処理した
。次に、Qiagen Ologotex（Quiagen Inc.,Chatsworth CA）を用いてポリアデニ
ル化ｍＲＮＡを単離し、精製した。
第１鎖のｃＤＮＡ合成は、XhoI制限部位をも含むオリゴｄ（Ｔ）プライマー／
リンカーを用いて行った。第２鎖合成は、ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌リガー
ゼ、及びＲＮアーゼＨを用いて行い、次にEcoRIアダプタを加えて平滑末端を有
するｃＤＮＡを得た。このEcoRIを負荷した二重鎖のｃＤＮＡを、XhoI制限酵素
で切断し、分画化して、サイズが８００ｂｐを超える配列を得た。このｃＤＮＡ
をLambdaZapベクターシステム（Stratagene）に挿入し、次にpBluescriotTMファ
ージミド（Stratagene）に含められたこのベクターを大腸菌宿主細胞株XL1-Blue
MRFTM（Stratagene）に入れて形質転換させた。
個々のｃＤＮＡクローンのファージミド形態は、in vivo切除プロセスにより
得られた。pBluescriot及び同時導入されたｆ１ヘルパーファージの双方に由来
する酵素がＤＮＡにニックを入れ、新たなＤＮＡ合成を開始させ、このｃＤＮＡ
インサートを含むより小さい、一本鎖の環状ファージミドをつくり出した。この
ファージミドＤＮＡは、遊離され、精製されて、新たな宿主細胞（SOLR,Stratag
ene）に再度感染させるのに用いられた。βラクタマーゼの遺伝子を含むファー
ジミドが存在することにより、形質転換された細菌が、アンピシリン含有培地上
で成長可能となった。
２ ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定
プラスミドＤＮＡは細胞から放出され、ミニプレップキット（Catalogue # 77
468;Advanced Genetic Technologies Corporation,
Gaithersburg MD）を用いて精製した。このキットは９６０回の精製のための試
薬を備えた、９６穴ブロックからなるキットである。以下の変更点を除いてキッ
トの推奨プロトコルを採用した。（１）９６個のウエルのそれぞれを、２５ｍｇ
／Ｌのカルベニシン及び０．４％のグリセロールを含む滅菌Terrific Broth（Ca
talogue # 22711,LIFE TECHNOLOGIESTM,Gaithersburg MD）を１ｍｌだけ充填し
た。（２）細菌をウェルヘ負荷した後２４時間培養して６０μｌの溶解バッファ
に溶解した。（３）Beckman GS-6Rを用いて、２９００ｒｐｍで５分間遠心分離
処理を行った後に、内容物をブロックし、一次濾板に添加した。（４）TRISバッ
ファにイソプロパノールを添加するオプションの行程は、定例的には行わなかっ
た。プロトコルの最終ステップの後、サンプルの保管のためBeckman９６穴ブロ
ックにサンプルを移送した。
プラスミドＤＮＡの精製のための別の方法では、MAGIC MINIPREPSTMDNA精製シ
ステム（Catalogue ♯ A7100,Promega,Mad1son WI）又はQIAwellTM-8プラスミド
、QIAwell PLUS DNA、及びQIAwell ULTRA DNA精製システム（QIAGEN Chatsworth
CA）を用いる。
ｃＤＮＡの配列決定は、Hamilton Micro Lab 2200（Hamilton,RenoNV）を、４
基のPeltier Thernal Cyclers（PTC200 MJ Research,Watertown MA）及びApplie
d Biosystems 377又は373DNA Sequencing Systems（Perkin Elmer）と組み合わ
せて用いて、Sanger F及びAR Coulson（1975;J MolBiol94:441f）の方法で行い
、読み枠を決定した。
３ ｃＤＮＡクローン及びそれらの推定タンパク質の相同性検索
Applied Biosystems社で開発された検索アルゴリズムを、INHERIT（商標）670
Sequence Analysis Systemに組み込んで用いて、各ｃＤＮ
Ａの配列をGenBankの配列と比較した。このアルゴリズムでは、Pattern Specifi
cation Language（TRW社、LosAngeles CA）を用いて相同な領域を決定した。配
列の比較をどのように行うかを決定する３つのパラメータは、ウィンドウサイズ
、ウィンドウオフセット、及び誤差許容度であった。これら３つのパラメータの
組を用いて、対象の配列に対して相同な領域を含む配列をＤＮＡデータベースか
ら検索し、適切な配列には、初期値とともにスコアが付けられた。これによって
、これらの相同な領域をドットマトリクスホモロジーブロット法を用いて検定し
、相同な領域と偶然の一致とを区別した。相同性検索の結果は、Smith-Waterman
アライメントを用いて表示した。
ペプチド及びタンパク質配列の相同性は、INHERIT（商標）670配列解析システ
ムをＤＮＡ配列の相同性検索で用いたのと同様に用いて確かめた。Pattern Spec
ification Language及びパラメータウインドウを用いて、タンパク質データベー
スから相同性領域を含む配列を検索し、その結果には初期値とともにスコアを付
けられた。ドットマトリクスホモロジーブロット法を用いて検定し、有意な相同
性を有する領域と偶然の一致とを区別した。
BLASTは、Baslc Local Alignment Search Tool(Altschul SF(1993)J Mol Evol
36:290-300;Altschul,SF等(1990)J Mol Biol215:403-10)の略称であり、これを
用いて局部的な配列アライメントを検索した。BLASTはヌクレオチド及びアミノ
酸配列の両方のアライメントを生成して配列類似性を求める。そのアライメント
の局所性のために、BLASTは厳密な一致、すなわちホモログを求める際に特に有
効である。BLASTは間隙を含まない一致を求めるのに役立つ。BLASTアルゴリズム
出力の基本的な単位は、High-scoring Segment Pair（HSP）である。
HSPは２つの配列フラグメントからなり、両フラグメントは任意では
あるが、そのアライメントが局所的に最大となっている等しい長さものであり、
そのアライメントスコアはユーザにより設定された閾値すなわちカットオフスコ
アを満足、即ち、カットオフスコアを超えている。BLASTアプローチは問い合わ
せ配列とデータベース配列との間のHSPを見つけ出すものであり、見出された任
意の一致の統計的有意性を評価し、そのユーザが設定した有意性の閾値を満足す
る一致のみを報告するものである。パラメータＥはデータベース配列一致を知ら
せるための統計的に有意な閾値を確定するパラメータである。Ｅは全データベー
ス検索の情況においてHSP（或いはHSPの組）の発生の機会の期待される頻度の上
側の境界として解釈される。その一致がＥを満足する任意のデータベース配列が
プログラム出力において報告される。
４ ノーザン法による解析
ノーザン解析は、標識されたヌクレオチド配列と特定の細胞型または組織に由
来するＲＮＡが結合したメンブランとのハイブリッド形成を伴う、遺伝子の転写
物の存在を検出するために用いられる実験技術である（Sambrookら、上述）。
類似の電子的ノーザン分析ではBLAST（Altschul SF 1993 and 1990,上述）を
用いて、GenBankまたはLIFESEQ(商標)データベース(Incyte,Palo Alto CA)のよ
うなデータベースにおける同一のまたは近縁な分子を検索した。この解析は、多
数の膜式ハイブリダイゼーションより非常に短時間で行うことができる。更に、
コンピュータ検索の感度を変更して、ある一致が正確な一致か、相同的であるか
の分類を決定することができる。
検索の基準値は、プロダクトスコアであり、これは以下の式で定義されるもの
である。
（配列の一致（％）×最大BLASTスコア（％））／１００
このプロダクトスコアは、２つの配列間の類似性の程度、及び配列の長さの一致
の双方を考慮している。例えば、プロダクトスコアが４０の場合は、一致は誤差
が１〜２％の範囲で正確であり、スコアが７０の場合は正確に一致している。相
同な分子は、通常プロダクトスコアとして１５〜４０を示すものを選択すること
により同定されるが、スコアの低いものは近縁関係にある分子として同定される
。
５ 完全長まで、又は調節エレメントを回復するまでのＨＫＬＰの延長
完全長ＨＫＬＰの核酸配列（配列番号：２）は、部分的ヌクレオチド配列を完
全長まで延長するため、或いはゲノムライブラリから５’配列を得るためのオリ
ゴヌクレオチドプライマーを設計するために用いることができる。一方のプライ
マーはアンチセンス方向（ＸＬＲ）の延長を開始するために合成され、他方のプ
ライマーはセンス方向（ＸＬＦ）に配列を延長するために合成される。これらの
プライマーにより、周知のＨＫＬＰ配列を「外側に」延長し、対象の制御領域の
新しい未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成できるようになった。
初期プライマーは、Oligo(登録商標)4.06(National Biosciences社、Plymouth M
N)、或いは他の適切なプログラムを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチドで５
０％以上のＧＣ含有率を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニール
するように設計することができる。結果的にヘアピン構造及びプライマー−プラ
イマー二量体化を生じる任意のヌクレオチドのストレッチの延長はが回避される
。
元の選択されたｃＤＮＡライブラリーか、ヒトゲノムライブラリーを用いて、
配列を延長する。後者のライブラリーは、５’上流配列を得るために最も役立つ
。必要なら、既知領域をさらに延長するために追加のプライマーの組が設計され
る。
XL-PCRキット（Perkin Elmer社）のための指示に従って、酵素と反
応混合物とを完全に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られる。４０pm
olの各プライマーと、推奨された濃度のキットの他の全ての成分とから増幅を開
始する場合、ＰＣＲはPeltier Thermal Cycler（PTC200;MJ Reserch社、Waterto
wn MA）を用いて、以下のパラメータで実行される。
ステップ１ ９４℃で１分間（初期変性）
ステップ２ ６５℃で１分間
ステップ３ ６８℃で６分間
ステップ４ ９４℃で１５秒間
ステップ５ ６５℃で１分間
ステップ６ ６８℃で７分間
ステップ７ ステップ４〜６をさらに１５サイクル反復
ステップ８ ９４℃で１５秒間
ステップ９ ６５℃で１分間
ステップ１０ ６８℃で７分１５秒間
ステップ１１ ステップ８〜１０を１２サイクル反復
ステップ１２ ７２℃で８分間
ステップ１３ ４℃（その温度を保持）
反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを、低濃度（約０．６〜０．８％）ア
ガロースミニゲルにおける電気泳動で解析して、反応物が配列を延長することに
成功したか否かを決定する。最も大きな生成物或いはバンドを選択して、ゲルか
ら切り出した。さらなる精製には、QIAQuick（登録商標）（QIAGEN社）のような
市販のゲル抽出法を用いる。ＤＮＡ回収の後、クレノウ酵素を用いて一本鎖ヌク
レオチドの延び出しを切り取り、再結合及びクローニングを容易にする平滑末端
を作った。
エタノール沈殿の後、生成物を１３μｌのリゲーション緩衝液内に再
溶解し、１μｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌク
レオチドキナーセを加えて、その混合物を、室温で２〜３時間、或いは１６℃で
一昼夜インキュベートする。コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞（４０μｌの適切
な溶媒内にある）を、３μｌのリゲーション混合物を用いて形質転換し、８０μ
ｌのＳＯＣ培地（Sembrook J等、上記）で培養する。３７℃で１時間のインキュ
ベーションの後、全ての形質転換混合物を、２ｘＣａｒｂを含むLuria Bertani
（ＬＢ）寒天上にのせる。後日、いくつかのコロニーを各プレートから無作為に
選択し、適切な市販の無菌の９６穴マイクロタイタープレートの個々のウェル内
に入れられた１５０μ１の液状ＬＢ／２ｘＣａｒｂ培地で培養する。さらに後日
、５μｌの各オーバーナイト培養物を非無菌９６穴プレート内に移し、水で１：
１０に希釈した後、各５μｌのサンプルをＰＣＲアレイ内に移す。
ＰＣＲ増幅の場合、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの４単位を含む１８μｌの濃
縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）、ベクタープライマー、並びに延長反応に用い
られる遺伝子特異的プライマーの一方或いは両方を各ウェルに加える。増幅は以
下の条件に従って行う。
ステップ１ ９４℃で６０秒間
ステップ２ ９４℃で２０秒間
ステップ３ ５５℃で３０秒間
ステップ４ ７２℃で９０秒間
ステップ５ ステップ２〜４をさらに２９サイクル反復
ステップ６ ７２℃で１８０秒間
ステップ７ ４℃（そのまま保持）
ＰＣＲ反応物のアリコットを、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で移動
させる。ＰＣＲ生成物のサイズを元の部分的なｃＤＮＡと比較
して、適切なクローンを選択し、プラスミドに結合して、配列決定を行う。
６ ハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用
配列番号：２の配列に基づくハイブリダイゼーションプローブは、ｃＤＮＡ、
ｍＲＮＡ並びにゲノムＤＮＡをスクリーニングするために用いられる。約２０の
塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、大きなｃＤＮＡ
フラグメントの場合でも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、５０ｐ
ｍｏｌの各オリゴマーと、２５０ｍＣｉの[γ−32Ｐ]アデノシン三リン酸（Amer
sham社,Chicago IL）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN（商標）
、Boston MA）とを組み合わせて用いて標識する。標識されたオリゴヌクレオチ
ドを、SephadexG-25超精細樹脂カラム（Pharmacia社）を用いて精製する。それ
ぞれ毎分１０7カウントを含む各部分を、以下のエンドヌクレアーゼ（AseI，Bgl
II，EcoRI,PstＩ，Xba1或いはPvuII；DuPont NEN（商標））の１つを用いて消化
されるヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ハイブリダイゼーション解析において用い
る。
各消化物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画化して、ナイロン
膜（Nytran Plus,Schleicher ＆ Schuell,Durham NH）に移す。ハイブリダイゼ
ーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くために、
ブロットは、０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナト
リウムまで段階的に厳密性が増す条件下で、室温にて順次洗浄される。XOMAT AR
(登録商標)フィルム(Kodak，Rochester NY）を、数時間かけてPhosphoimager ca
ssette（Molecular Dynamics,Sunnyvale CA）においてブロットに露光された後
、ハイブリダイゼーションパターンが視覚的に比較される。
７ アンチセンス分子
ＨＫＬＰ配列或いはその任意の一部は、天然ＨＫＬＰのin vivoまたはin vitr
o発現を抑制するために用られ得るアンチセンス分子の設計のための基礎となる
。約２０塩基対からなるアンチセンスオリゴマーの使用について特に記すが、大
きなｃＤＮＡフラグメントの場合でも概ね同じ手順を用いることができる。第１
Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図に示すようなＨＫＬＰのコード化配列に基づく相
補的なオリゴヌクレオチド用いて、自然発生ＨＫＬＰの発現を抑制することがで
きる。この相補的なオリゴヌクレオチドを第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図に
示す最も一義的な５’配列から設計し、これを用いてプロモーターが結合するの
を阻害することにより転写を抑制したり、リボソームが転写物に結合するのを阻
害することによりＨＫＬＰ転写物の翻訳を抑制することができる。配列番号：２
のリーダー配列及び５’配列の適切な部分を用いることにより、効果的なアンチ
センスオリゴヌクレオチドは、第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図に示すヌクレ
オチドのなかの、ポリペプチドのシグナル配列または初めの方のコーディング配
列に翻訳される領域全体にわたる１５〜２０個のヌクレオチドを含むようになる
。
８ ＨＫＬＰの発現
ＨＫＬＰの発現は、ｃＤＮＡを適切なベクター内にサブクローニングし、その
ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることによって行われる。クローニン
グ用のpBluescriptベクターを、大腸菌株であるXL1-BlueMRF（商標）（Stratage
ne）においてＨＫＬＰを発現するのに用いる。クローニング部位の上流には、β
−ガラクトシダーゼに対するプロモータが存在し、その後ろにはアミノ基末端メ
チオニン及びβ−ガラクトシダーゼの７残基が存在する。直後に続くこれら８つ
の残基は、転写に役立つバクテリオファージプロモーターであり、多くの一義的
な切断部位を含むリンカーである。
単離されたＩＰＴＧトランスフェクト菌株を標準的な方法を用いて誘導するこ
とにより、初めのβガラクトシダーゼの７残基、約５〜１５残基のリンカー、及
び完全長ＨＫＬＰからなる融合タンパク質を作り出す。このシグナル配列は、後
の行う活性のアッセイにおいて直接用いることができる菌培地へのＨＫＬＰの分
泌を誘導する。
９ ＨＫＬＰの活性
ＨＫＬＰの、invitroでのＰＫＡ活性への影響についてアッセイする。ＰＫＡ
活性は、ｃＡＭＰ存在下における合成基質、例えばヘプタペプチドLRRASLGへの
、［γ−32Ｐ］−ＡＴＰからの放射活性のトランスファーを測定することにより
見出される（Roskoski R Meth Enzymol99:3-6）。反応混合物へのＨＫＬＰの添
加は、基質の添加の前に行う。多くのＨＫＬＰ投与量に対してＨＫＬＰ活性に与
える影響を測定し、（ＨＫＬＰを欠く）ネガティブコントロールと比較する。
１０ ＨＫＬＰ特異的抗体の産生
標準的なプロトコルを用いたウサギの免疫化及び抗体の産生には、ＰＡＧＥ電
気泳動法（Sambrook前出）を用いて精製されたＨＫＬＰを用いる。ＨＫＬＰから
翻訳されたアミノ酸配列をDNAStarソフトウエア（DNASTAR社）を用いて解析して
免疫抗原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを当業者には周知の手
段により合成して、当業者に周知の方法で抗体をを産生するために用いる。Ｃ末
端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープのような、適切なエピトー
プを選択するための解析法は、Ausubel FM等（上記）の論文に記載されており、
第４図及び第５図に示されている。
通常、約１５残基の長さを有するオリゴペプチドを、Applied Biosystemsのペ
プチドシンセサイザ−Model 431Aを用いてｆｍｏｃ法ケミストリにより合成し、
Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル（ＭＢＳ：Ausubel FM等、上記）を用いた反応によりキ
ーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ、Sigma）に結合する。フロイントの
完全アジュバントにおけるオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫
する。得られた抗血清の抗ペプチド活性を検査するには、例えばペプチドをプラ
スチックに結合し、１％BSAを用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗
浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧに反応させる。
１１ 特異的抗体を用いる自然発生ＨＫＬＰの精製
自然発生ＨＫＬＰ或いは組換えＨＫＬＰは、ＨＫＬＰに対する特異的な抗体を
用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより精製することができる。イ
ムノアフィニティーカラムは、CnBr活性化Sepharose（Pharmacia Biotech社）の
ような活性化クロマトグラフレジンとＨＫＬＰ抗体とを共有結合させることによ
り構成される。結合後、そのレジンを製造者の指示に従って、ブロックし洗浄す
る。
ＨＫＬＰを含む培地をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラムをＨＫ
ＬＰを優先的に吸収できる条件下で（例えば界面活性剤の存在下において高イオ
ン強度緩衝剤で）洗浄する。このカラムを、抗体／ＨＫＬＰ結合を切るような条
件下（例えばｐＨ２〜３の緩衝剤、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イ
オンのようなカオトロピックイオン）で溶離させ、ＨＫＬＰを回収する。
１２ ＨＫＬＰと相互作用する分子の同定
ＨＫＬＰ、或いはその生物学的に活性なフラグメントを、125Ｉ ボルトンハ
ンター試薬を用いて標識する（Bolton,AE及びHunter,WM（1973）Biochem J133:5
29）。９６穴プレートのウェル内に前に入れておいた候補分子を、標識したＨＫ
ＬＰとともに培養し、洗浄し、標識したＨＫＬＰ複合体を有する任意のウェルを
アッセイする。異なる濃度
のＨＫＬＰを用いて得られるデータを用いて、候補分子とＨＫＬＰの数、アフィ
ニティー並びに会合度の数値を計算する。
上記のすべての刊行物及び特許明細書は、本明細書と一体に参照されたい。本
発明の記載した方法及びシステムの種々の変更例及び変形例は、本発明の範囲及
び精神から逸脱しないことは当業者には明らかであろう。本発明は特に好適な実
施例に関連して記載されているが、本発明の請求の範囲は、そのような特定の実
施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際には、本発明を
実施するために記載された方法の種々の変更例は、分子生物学或いは関連する分
野の当業者には明らかなように、以下の請求項の範囲内に含まれるものである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 29/00 Ｃ０７Ｋ 16/40
Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｎ 1/21 9/64 Ａ
9/64 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
Ｃ１２Ｐ 21/02 21/08
21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ
Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/553
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ
Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ
，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＲ
，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，
ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＵ，ＳＥ，Ｓ
Ｇ，ＵＳ
(72)発明者 ブラクストン、スコット・マイケル
アメリカ合衆国カリフォルニア州94402・
サンマテオ・ヨークタウンロード 1786
(72)発明者 ゴリ、スリヤ・ケイ
アメリカ合衆国カリフォルニア州94086・
サニーベイル・＃338・アイリスアベニュ
ー 620