ES2307338T3 - Corina, una serina proteasa. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido de corina humana de longitud completa aislado que comprende desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 1042 según se establece en SEC ID Nº: 2.

Description

Corina, una serina proteasa.

Antecedentes de la invención

Las serina proteasas participan en una diversidad de procesos fisiológicos y del desarrollo (Stroud R, Sci. Am. 231: 74-88,1974: Neurath H, Science 224:350-357, 1984). Por ejemplo, las serina proteasas están implicadas en el señalamiento celular, la diferenciación celular y la conversión de prohormonas a formas biológicamente activas. Véase, por ejemplo, Hong and Hashimoto. Cell. 82:785-794, 1995: Inagami. J. Biol. Chem., 264: 3043-3046, 1989.

El documento WO 98/03665 describe secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de una calicreína humana nueva y el uso de estas secuencias en el diagnóstico, estudio, prevención y tratamiento de enfermedades. Tomita Y. y col., J. Biochem., 124:784-789, 1998, identificaron una proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad con una estructura análoga a la proteína de membrana tipo II en el corazón de ratones.

El documento WO 98/36054 describe entre otros un polipéptido, denominado ATC2, un miembro de la familia de serina proteasas que tiene similitud con hepsina, protasina y acrosina.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a ácidos nucleicos, polipéptidos y fragmentos de los mismos, de un gen nuevo, por ejemplo, una serina proteasa, especialmente una serina proteasa de mamífero, tal como corina humana y de ratón, que contiene una o más repeticiones ricas en cisteína del receptor barredor, frizzled, LDLR y dominios catalíticos serina proteasa. La invención además se refiere a los procedimientos para usar tales ácidos nucleicos y polipéptidos en tratamientos, diagnósticos e investigación. Por ejemplo, los ácidos nucleicos y polipéptidos de corina pueden utilizarse en procedimientos para identificar moduladores de su actividad y en modelos animales para simular enfermedades humanas y en el diagnóstico de afecciones patológicas.

Breve descripción de los dibujos

SEC ID Nº: 1 muestra una secuencia de nucleótidos para corina humana.

SEC ID Nº: 2 muestra una secuencia deducida de aminoácidos de corina humana.

SEC ID Nº: 3 muestra una secuencia de nucleótidos para corina de ratón.

SEC ID Nº: 4 muestra una secuencia deducida de aminoácidos para corina de ratón.

La Fig. 1 es un esquema que ilustra el ordenamiento de dominios funcionales dentro de un polipéptido de corina humana.

La Fig. 2 muestra una alineación de aminoácidos de dominios frizzled ("Corina Crd1" y "Corina Crd2") de un polipéptido de corina humana con Frizzled, Fz-1, y lin-17.

La Fig. 3 muestra una alineación de secuencia de aminoácidos de repeticiones de LDLR identificadas dentro de un polipéptido de corina humana con una secuencia de consenso para LDLR humano.

Fig. 4 muestra una alineación de secuencia de aminoácidos de un dominio serina proteasa de corina humana ("Corina") con dominios serina proteasa presentes en otras tres proteínas. KAL es calicreína. ENTK es enterocinasa. TRPI es tripsina.

Descripción detallada de la invención

Se han identificado secuencias de ácido nucleico y polipéptidos que codifican corina, un gen nuevo que comprende un péptido transmembranario/señal, dominio frizzled, repeticiones del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR), repeticiones ricas en cisteínas del receptor barredor (SRCR), y un dominio catalítico serina proteasa. Véase, por ejemplo, Fig. 1.

De acuerdo con la presente invención un polipéptido corina tiene una actividad inmunogénica que es específica para corina; o, una secuencia de aminoácidos que es obtenible de una fuente natural que se presenta en la naturaleza y que tiene una o más de las siguientes actividades o dominios: una actividad catalítica serina proteasa; un dominio de actividad catalítica serina proteasa; una actividad de sustrato de unión a serina proteasa; una actividad catalítica de enzima convertidora de factor natriurético pro-atrial (ANF); un dominio frizzled: un dominio de repetición LDLR; y repeticiones ricas en cisteína del receptor barredor (SRCR).

Se excluyen los fragmentos de polipéptidos codificados por los siguientes fragmentos de ácido nucleico de la base de datos Unigene [PubEST]: Hs.62794 (AA126468 [1686098], AA126648 [1686206], AA625395 [2537780], AA046682 [1524579], AA249850 [1881137] y AA046793 [1524691]), y Hs. 71798 (AA147031 [1716421]). (Los números entre paréntesis se refieren a la base de datos PubEST). Los siguientes fragmentos también pueden excluirse: Hs.121626 (AA771958), Hs.1657 (M69297) y Hs.47712 (AA203291), g1231787; g1312726; g1337948; y g942724.

Las secuencias de nucleótidos de los ácidos nucleicos mencionados anteriormente pueden identificarse buscando en bases de datos públicas disponibles. Sin embargo, los polipéptidos que contienen o comprenden estas secuencias no están excluidas, por ejemplo, corina de longitud total, un polipéptido que tiene dos o más de estos fragmentos mencionados o un polipéptido que tiene uno de los fragmentos mencionados y otras secuencias de aminoácidos, de corina o de otra fuente.

Por el término "actividad inmunogénica específica para corina", se entiende que el polipéptido de corina provoca una respuesta inmunológica que es selectiva para corina. Tal respuesta puede ser celular o humoral. Por consiguiente, la estimulación de anticuerpos, células T, macrófagos, células B, células dendríticas, etc., por una secuencia de aminoácidos de corina seleccionada de un polipéptido de corina de mamífero, por ejemplo, corina humana como se muestra en la SEC ID Nº: 2, es una actividad inmunogenética específica. Estas respuestas pueden medirse de manera rutinaria. Véase además, a continuación la discusión sobre anticuerpos específicos para corina.

Actividad catalítica serina proteasa significa, por ejemplo, que el polipéptido de corina posee una actividad de escisión de polipéptidos, de preferencia en el enlace peptídico, por ejemplo, donde un residuo serina de corina participa en la escisión del enlace peptídico. Véase, por ejemplo, Stroud. Sci. Am., 231:74-88, 1974; Kraut, Ann. Rev. Biochem., 46: 331-358, 1977. La secuencia completa del polipéptido de corina que se muestra en la SEC ID Nº: 2 o 4 , o una parte de ella, puede tener actividad catalítica serina proteasa. La escisión tras la posición de aminoácido 801 de la SEC ID Nº: 2 (que separa el enlace peptídico entre arginina y isoleucina) puede aumentar o pontenciar tal actividad catalítica, dando lugar a la liberación de un fragmento catalítico que comprende, o está constituido esencialmente por, las posiciones de aminoácidos 802-1042.

Un "dominio de actividad catalítica serina proteasa" se refiere a una región de un polipéptido que es capaz de mostrar actividad catalítica serina proteasa, como se describió anteriormente, pero que no necesariamente posee actividad completa, si acaso alguna, en el escenario en que está presente. Por ejemplo, los miembros de la familia tripsina con frecuencia se expresan inicialmente como una proenzima que exhibe actividad completa sólo tras la escisión en un sitio específico dentro del polipéptido. La escisión da lugar a la liberación de un fragmento proteolítico. En general, el "fragmento liberado" se mantiene en el lugar por medio de enlaces disulfuro con la porción restante de la proteína. Véase, la SEC ID Nº: 2, por ejemplo, para cisteínas que podrían formar los enlaces disulfuro. Un dominio catalítico serina proteasa se refiere al fragmento proteolítico previo a su liberación de la secuencia completa de corina.

Una "actividad catalítica de enzima convertidora del pro factor natriurético atrial (ANF)" significa, por ejemplo, una actividad catalítica en la que pro-ANF se convierte por medio de escisión proteolítica en uno o más péptidos más pequeños. Véase, por ejemplo, Inagami, J. Biol. Chem., 264: 3043-3046, 1989; Rosenzweig and Seidman, Ann. Rev. Biochem., 60:229-255,1991; Wilkins y col., Lancet, 349:1307-1310, 1997. ANF (también, conocido como ANP) es una hormona cardiaca que, por ejemplo, regula la homeostasis de los líquidos del cuerpo, la tensión arterial, el volumen plasmático y otros procesos fisiológicos involucrados en la función del corazón y del riñón. Otros sustratos para la actividad convertidora, también pueden incluir homólogos y homólogos de proteínas para ANF, tales como BNP y CNP. Véase, por ejemplo, Wilkins y col., Lancet 349:1307-1310, 1997; Levin y col., New Eng. J. Med.. 339:321-328, 1998. La actividad convertidora puede medirse de forma convencional, por ejemplo, como se describe en los ejemplos en los que la escisión de pro-ANF se ensaya detectando una diferencia en el peso molecular de pro-ANF antes y después del tratamiento con corina, o con un fragmento de corina biológicamente activo. Ya que corina puede expresarse en la superficie celular, pueden usarse las células intactas para procesar sustratos, tales como pro-ANF.

La unión del sustrato se considera generalmente la primera etapa en la catálisis enzimática porque el sustrato, que actúa como un ligando, debe en primer lugar unirse a la superficie de la enzima para permitir a la enzima llevar a cabo sus reacciones catalíticas. Esta superficie de la enzima puede denominarse como el sitio activo de la enzima. La unión del sustrato a la superficie de la enzima puede involucrar múltiples interacciones con la enzima, por ejemplo, enlace químico con uno o más aminoácidos y/o grupos funcionales que comprenden la enzima. Una actividad de unión del sustrato a la serina proteasa como se usa en el presente documento significa que un sustrato, por ejemplo, (H-D-Pro-Phe-Arg-pNA.2HCl), S2444 (pyroGlu-Gly-Arg-pNA\cdotHCl), y S2288 (H-D-Ile-Pro-Arg-pNA.2HCl), respectivamente, o pro-ANF, se une específicamente a una superficie de un polipéptido de corina. La unión a la enzima puede realizarse por medio de una o más de las interacciones que sostienen su sustrato presente en la naturaleza a la misma; sin embargo, un polipéptido puede tener una actividad de unión del sustrato cuando sostiene el sustrato con menos interacciones que las que se presentan en la naturaleza en cantidad y en calidad. Una actividad de unión del sustrato a serina proteasa puede opcionalmente ser eficaz: para obtener catálisis del sustrato, para unirlo de forma competitiva o no competitiva al sitio activo, para unirlo de manera irreversible a la enzima, para dar como resultado la pérdida de actividad catalítica (por ejemplo, donde existe un sustrato suicida), etc.

La actividad de unión del sustrato a serina proteasas puede medirse convencionalmente. Por ejemplo, pueden usarse un ensayo de competición de unión para identificar sustratos que se unen a un polipéptido, o derivado del mismo, por ejemplo, combinando bajo condiciones eficaces, un sustrato que contiene un marcador detectable, un polipéptido de corina humana, o fragmentos del mismo, y un compuesto en el que se va a probar la actividad de unión del sustrato.

El ensayo puede realizarse en fase líquida, donde el sustrato libre y el unido están separados por una membrana, o, puede realizarse en fase sólida, según se desee. Los ensayos en fase sólida pueden realizarse usando procedimientos de alto rendimiento, por ejemplo, sobre chips, obleas, etc. La unión del sustrato y la actividad catalítica pueden disociarse una de la otra. Por consiguiente, un polipéptido de corina puede tener actividad de unión del sustrato pero no tener actividad catalítica.

Un polipéptido de corina también puede comprender un "dominio rico en cisteína análogo a frizzled" (o "dominio frizzled", como se usa en este documento) que tiene actividad de unión Wnt. Un dominio frizzled puede tener una actividad o región de enlace de ligando, por ejemplo, como la definida y descrita en Zorn, Current Biolog, 7: R501-R504, 1997. Por ejemplo, un dominio frizzled puede actuar como un receptor para ligandos que tienen homología con Wnts y otras glicoproteínas secretadas involucradas en la proliferación celular, señalamiento celular, etc. Puede estar unido a membrana o ser soluble. En una forma soluble, también puede actuar como antagonista, por ejemplo, cuando el dominio frizzled libre de corina une el ligando libre y evita su interacción con su receptor relacionado en la superficie celular.

Una repetición de LDLR contiene una secuencia de consenso de LDLR humano como se muestra en la Fig. 7 y puede opcionalmente tener actividad de unión de ligando.

Un polipéptido de corina también puede comprender un dominio de repetición rico en cisteína del receptor barredor ("SRCR"). Véase, por ejemplo, Matsumoto y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9133-9137, 1990.

Una corina de mamífero es un polipéptido de mamífero que tiene una secuencia de aminoácidos que es obtenible a partir de una fuente natural y las actividades mencionadas. Puede tener longitud total (es decir, como se muestra en la SEC ID Nº: 2) o puede tener longitud menor a la total y poseer una o más de las actividades mencionadas. Por lo tanto incluye secuencias que se presentan en la naturaleza normales, mutantes, polimórficas, etc. Las fuentes naturales incluyen, por ejemplo, células vivas, por ejemplo, obtenidas de tejidos o de organismos enteros, líneas celulares cultivadas, que incluyen líneas celulares primarias e inmortalizadas, tejidos biopsiados, etc.

La presente invención también describe fragmentos de una corina de mamífero de longitud total, tal como corina humana o de ratón. Los fragmentos son de preferencia "biológicamente activos". Por "biológicamente activo", se entiende que el fragmento de polipéptido posee una actividad en un sistema vivo o con componentes de un sistema vivo. Las actividades biológicas incluyen las mencionadas, por ejemplo, una actividad catalítica, una actividad de unión de sustrato, y/o una actividad inmunogénica. Los fragmentos pueden prepararse de acuerdo con cualquier procedimiento deseado, incluidos, síntesis química, ingeniería genética, productos de excisión, etc. Véase, a continuación.

La presente invención también se refiere a una corina humana que tiene una secuencia deducida de aminoácidos 1 hasta 1042 como se muestra en SEC ID Nº: 2. El polipéptido de 1042 aminoácidos tiene un peso molecular previsto de aproximadamente 116 kilodaltons. Comprende los siguientes dominios: región hidrófoba en las posiciones de aminoácidos aproximadamente 46-66; dominios ricos en cisteína frizzled en las posiciones de aminoácidos aproximadamente 134-259 y 450-573; siete repeticiones de LDLR en las posiciones de aminoácidos aproximadamente 268-415 y 579-690; una región rica en cisteína en las posiciones de aminoácidos aproximadamente 713-801 homólogas a un motivo de receptor barredor de macrófagos; y un dominio catalítico serina proteasa en las posiciones de aminoácidos aproximadamente 802-1042. Existen diecinueve sitios de N glicosilación putativos presentes en el dominio extracelular que está en las posiciones de aminoácidos aproximadamente 67-1042.

Un polipéptido de corina de la invención, por ejemplo, que tiene una secuencia de aminoácido como se muestra en la SEC ID Nº: 2, puede analizarse por medio de procedimientos disponibles para identificar otros dominios estructurales y/o funcionales en el polipéptido. por ejemplo, puede analizarse un polipéptido de corina por medio de los procedimientos descritos en, por ejemplo, Kyte and Doolittle, J. Mol. Bio.,157: 105,1982; EMBL Protein Predict; Rost and Sander. Proteins, 19:55-72, 1994.

Los dominios hidrófobos en aproximadamente los aminoácidos 46-66 de una corina humana pueden servir como una secuencia de anclaje de membrana. Véase, también, hepsina, serina proteasa de mamífero de la familia de la tripsina que contiene un transmembranario cerca de su extremo amino terminal (Kurachi y col., Methods in Enzymology 244: 100-114, 1994); Stubble-stubbloid, una serina proteasa de Drosophila melanogaster que también contiene un dominio transmembranario (Appel y co., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 90:4937-4941, 1993). Hay residuos de aminoácidos cargados positivamente inmediatamente antes del dominio hidrófobo y transmembranario putativo, que indican que la corina puede ser una proteína transmembranaria tipo II con el amino terminal en el citosol.

La corina también contiene al menos dos dominios frizzled ricos en cisteína en las posiciones de aminoácidos aproximadamente 134-259 y 450-573. La Fig. 2 muestra una comparación de los dominios frizzled de corina humana con FZ-1, Iin-17, y Frizzled. El dominio frizzled comprende, por ejemplo, un sitio de unión al ligando. Véase, por ejemplo, Zorn, Current Biology, 7: R501-R504, 1997; Leyns y col., Cell, 88:747-756, 1997. Como se describe a continuación, un aspecto de la invención es identificar ligandos que se unen a los dominios frizzled de corina, y que opcionalmente regulan la actividad de células que expresan el polipéptido de corina o células que expresan el ligando.

El análisis de la secuencia de proteína corina mostró que en la región extracelular existen dos dominios ricos en cisteína análogos a frizzled, siete repeticiones del receptor LDL, un dominio análogo al receptor de barredor de macrófagos y un dominio serina proteasa análogo a tripsina (2A). Dos dominios ricos en cisteína análogos a frizzled están localizados en los aminoácidos 134-259 y 450-573, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de estos dos dominios comparten homología significativa con el dominio extracelular rico en cisteína de la proteína Frizzled de Drosophila, siete repeticiones del receptor transmembranario esencial para la determinación de la polaridad durante el desarrollo de la mosca de la fruta (Vinson y col., Nature, 338: 263-264, 1989). También se han encontrado los dominios ricos en cisteína análogos a frizzled en otras proteínas, tales como Dfz2 en Drosophila (Bhanot y col., Nature, 382: 225-230, 1996), Lin-17 en C. elegans (Sawa y col., Genes Dev., 10: 2189-2197, 1996) y FZ-1 en seres humanos (Chan y col., J. Biol. Chem., 267: 25202-25207, 1992).

Las secuencias de dos dominios ricos en cisteína análogos a frizzled en corina son más cercanas a las de Lin-17 y FZ-1. Los diez residuos cisteína conservados están presentes en los dominios ricos en cisteína análogos a frizzled de corina. Entre los aminoácidos 268-415 y 579-690, existen siete repeticiones ricas en cisteína homólogas a las repeticiones de clase A del receptor de LDL (Brown y col., Nature, 388: 629-630, 1997). Cada repetición tiene una longitud de aproximadamente 36 aminoácidos y contiene seis residuos cisteína así como un grupo altamente conservado de aminoácidos cargados negativamente. En el receptor LDL, estas repeticiones ricas en cisteína unen iones de calcio y desempeñan una función esencial en la endocitosis de los ligandos extracelulares (Ibid). Se han encontrado motivos similares en el dominio extracelular de otros receptores de membrana, tales como la proteína relacionada con el receptor de LDL (LRP 1) (Krieger and Herz, Annu. Rev. Biochem. 63: 601-6037, 1994), megalina (también conocida como LRP2 o gp330) (Kounnas y col., J. Biol. Chem., 268: 14176-14181, 1993), proteínas del complemento (Catterall y col., Biochem. J. 242: 849-856, 1987), enterocinasa (Kitamoto y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, 91: 7588-7592, 1994), y proteínas yolkless y nudel de Drosophila (Schombaum y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, 92: 1485-1489, 1995; Hong and Hashimoto, Cell, 82: 785-794, 1995).

Además de los dominios ricos en cisteína análogos a frizzled y las repeticiones análogas al receptor LDL, existe otra región rica en cisteína entre los aminoácidos 713 y 801 en corina. Esta región contiene 88 aminoácidos y es homóloga al motivo rico en cisteína hallado en el receptor barredor de macrófagos (Matsumoto y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, 87: 9133-9137, 1990). Este motivo también está presente en el receptor de speract de espermatozoides del erizo de mar (Thorpe and Garbers, J. Biol. Chem. 264: 6545-6549, 1989; Dangott y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, 86: 2128-2132, 1989) y la serina proteasa de vertebrados, enterocinasa (Kitamoto y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, 91: 7588-7592, 1994).

En el carboxilo terminal de la proteína corina entre los residuos de aminoácido 802 y 1042, se encuentra un dominio serina proteasa análogo a tripsina. Este dominio de proteasa es altamente homólogo al dominio catalítico de miembros de la superfamilia de la tripsina. Por ejemplo, la similitud de secuencia de aminoácidos entre corina y precalicreína (Chung y col., Biochemistry, 25: 2410-2417, 1986), factor XI (Fujikawa y col., Biochemistry, 25: 2417-2424, 1986) y hepsina (Leytus y col., Biochemistry, 27: 1067-1064, 1988) es de 40%, 40% y 38%, respectivamente. En la corina están bien conservadas todas las características esenciales de las secuencias de serian proteasa. Los residuos del sitio activo de la triada catalítica están localizados en His843, Asp892 y Ser985. Los residuos de aminoácidos que forman el bolsillo de especificidad de sustrato están localizados en Asp979, Gly1007 y Gly1018. Se prevé que estos residuos unan los residuos P1 del sustrato, lo que sugiriere que la corina escindiría su sustrato tras residuos básicos, tales como lisina o arginina. Además, se ha encontrado un sitio de escisión de activación putativa en Arg801, que sugiere que la corina
se sintetizaría como un zimógeno inactivo y que sería necesaria otra enzima análoga a tripsina para su activación.

En el dominio de proteasa, existen 12 residuos cisteína. El apareamiento potencial de estos residuos cisteína puede predecirse comparando con otras serina proteasas bien estudiadas, tales como tripsina y quimotripsina. Los primeros tres pares de residuos cisteína presentes esencialmente en todos los miembros de la superfamilia de la tripsina están localizados en Cys828-Cys844, Cys955-Cys970 y Cys981-Cys1010. En las posiciones Cys790-Cys912 y Cys926-Cys991 están presentes dos pares más de residuos cisteína. Estos dos pares de residuos cisteína se encuentran comúnmente en una subfamilia de serina proteasas de dos cadenas, tales como quimotripsina y precalicreína (Chung y col., Biochemistry, 25: 2410-2417, 1986). La presencia de Cys790 y Cys912 indicó que, tras la escisión de activación en Arg801, el dominio catalítico de corina podría permanecer unido al resto de la molécula por un enlace disulfuro. Es interesante notar que hay un par adicional de residuos cisteína, Cys817 y Cys830, presente en la corina. Los residuos cisteína en estas dos posiciones no se encontraron en ninguna otra serina proteasa en vertebrados. Una búsqueda en bases de datos mostró que una serina proteasa análoga al quimotripsinógeno del gusano, Arenicola marina, tenía dos residuos cisteína en las posiciones correspondientes (Kyte and Doolitle, J. Mol. Biol., 157: 105-132, 1982). Se construyó un modelo de dominio proteasa de corina en la estructura del quimotripsinógeno A bovino. En base a este modelo de corina, en el que los átomos de C\alpha de estos dos residuos cisteína se mantenían fijados durante la minimización de energía, la distancia entre los átomos de azufre y sus cadenas laterales es de aproximadamente 2,5 A tras la búsqueda de rotámeros. El modelo indica que estas dos cisteínas tienen probabilidad de formar un enlace disulfuro para conectar dos láminas b en el núcleo del dominio proteasa.

Además de la secuencia de corina humana, se ha clonado e identificado una corina de otra especie de mamífero, el ratón. En las SEC ID Nº: 3 y 4 se muestra la secuencia completa de nucleótidos y aminoácidos de corina de ratón. Existen 1113 aminoácidos en la corina de ratón y comprende los mismos dominios que la corina humano. Hay una similitud de secuencia de aminoácidos del 89% entre la corina de ratón y la humano.

Pueden obtenerse otros homólogos de corina de mamíferos y de fuentes diferentes a los mamíferos por medio de procedimientos diversos. Por ejemplo, puede usarse la hibridación con un oligonucleótido selectivo para una corina de mamífero para seleccionar tales homólogos, por ejemplo, como se describe en Sambrook y col., Molecular Cloning, 1989, Capítulo 11. Tales homólogos pueden tener cantidades variables de similitud y homología de secuencia de nucleótidos y aminoácidos con corina. Los organismos no mamíferos incluyen, por ejemplo, vertebrados, invertebrados, pez cebra, pollo, Drosophila, C. elegans, Xenopus, S. pombe, S. cerevisiae, nematodos, procariotas, plantas, Arabidopsis, virus, etc.

La invención también describe secuencias de aminoácidos específicas de corina, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos definida que se encuentra en la secuencia humana particular de SEC ID Nº: 2 pero no en otras secuencias de aminoácidos de polipéptidos diferentes de corina. Una secuencia de aminoácidos específica puede encontrarse rutinariamente, por ejemplo, al buscar en una base de datos de gen/proteína usando la serie de programas informáticos BLAST. Una secuencia de aminoácidos específica de corina puede ser útil para producir péptidos como antígenos para generar una respuesta inmune específica para el mismo. Los anticuerpos obtenidos por medio de tal inmunización pueden usarse como una sonda específica para una proteína corina de mamífero para fines de diagnóstico o investigación.

Como se ha mencionado, los polipéptidos de la presente invención comprenden una secuencia codificadora humana completa para una corina. Los fragmentos útiles incluye, por ejemplo, fragmentos que comprenden, o están constituidos esencialmente, por el dominio frizzled, uno o más dominios LDLR, repeticiones SRCR del dominio transmembranario, el dominio catalítico de serina o un fragmento. Un fragmento de corina humana de preferencia comprende la secuencia de polipéptidos de SEC ID Nº: 2, con la condición de que el fragmento no sea un polipéptido codificado por Hs.62794 (AA126468[1686098], AA126648 [1686206], AA625395 [2537780], AA046682 [1524579], AA249850[1881137] y AA046793 [1524691]), y Hs. 71798 (AA147031 [1716421]). Véase, a continuación.

Puede seleccionarse un fragmento de un polipéptido de corina para que tenga una actividad biológica específica, por ejemplo, una actividad serina proteasa, una actividad de enzima convertidora de pro-ANF, una actividad de unión al sustrato, una actividad inmunogénica, etc. Puede identificarse un fragmento útil rutinariamente probando tales fragmentos para una actividad deseada. La medición de estas actividades se describe a continuación en los ejemplos. Estos péptidos pueden también identificarse y prepararse como se describe en el documento EP 496 162.

Un polipéptido de la presente invención puede también tener similitud de secuencia de aminoácidos del 100% o menos con la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID Nº: 2. Para los objetos de la siguiente discusión: Similitud de secuencia significa que el mismo nucleótido o aminoácido que se encuentra en la secuencia estabalecida en SEC ID Nº: 1-2 se encuentra en la posición correspondiente de la(s) secuencia(s) comparada(s). Un polipéptido que tiene menos del 100% de similitud de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID Nº: 2 puede contener diversas sustituciones de la secuencia que se presenta naturalmente, incluidas sustituciones de aminoácidos homólogos y no homólogos. Véase a continuación para ejemplos de sustitución de aminoácidos homólogos. La suma de residuos idénticos y homólogos dividida por el número total de residuos en la secuencia sobre la que se compara el polipéptido de corina es igual al porcentaje de similitud de secuencia. Para el objeto de calcular la identidad y similitud de secuencias, la secuencias comparadas pueden alinearse y calcularse según cualquier procedimiento deseado, algoritmo, programa informático, etc., incluidos, por ejemplo, FASTA, BLASTA. Un polipéptido que tiene menos del 100% de similitud de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 puede comprender, por ejemplo, aproximadamente 99%, 98%, 97%, 95%, 90%, 70%, etc. Una cantidad de similitud de secuencia de aminoácidos de preferencia es de aproximadamente 85% o más, por ejemplo, aproximadamente 86%.

Un polipéptido, fragmento o polipéptido sustituido de corina de mamífero puede también comprender diversas modificaciones, donde tales modificaciones incluyen modificación de lípidos, metilación, fosforilación, glicosilación, modificaciones covalentes (por ejemplo, de un grupo R de un aminoácido), sustitución de aminoácidos, deleción de aminoácidos o adición de aminoácidos. Las modificaciones al polipéptido pueden llevarse a cabo según diversos procedimientos, incluidos recombinantes, sintéticos, químicos, etc.

Los polipéptidos de la presente invención (por ejemplo, corina humana o corina de ratón, fragmentos de los mismos, mutaciones de los mismos) pueden usarse en diversas formas, por ejemplo, en ensayos, como inmunógenos para anticuerpos como se describió anteriormente, como agentes biológicamente activos (por ejemplo, con una o más de las actividades asociadas con corina).

Un polipéptido que codifica una corina, un derivado de la misma, o un fragmento de la misma, puede combinarse con uno o más dominios estructurales, dominios funcionales, dominios detectables, dominios antigénicos y/o un polipéptido deseado de interés, en una disposición que no se presenta en la naturaleza, es decir que no se presenta naturalmente, por ejemplo, como en un gen de corina humana o murina, un fragmento genómico preparado a partir del genoma de un organismo vivo, por ejemplo, un animal, de preferencia un mamífero, tal como un ser humano, ratón, o líneas celulares de los mismos. Un polipéptido que comprende tales características es un polipéptido quimérico o de fusión. Tal polipéptido quimérico puede prepararse de acuerdo con diversos procedimientos, incluidos procedimientos químicos, sintéticos, cuasi sintéticos y/o recombinantes. Un ácido nucleico quimérico que codifica un polipéptido quimérico puede contener los diversos dominios o polipéptidos deseados en un marco de lectura abierto continuo (por ejemplo, con múltiples dominios N-terminal para estabilizar o potenciar la actividad) o interrumpido, que contiene, por ejemplo, intrones, sitios de empalme, promotores, etc. El ácido nucleico quimérico puede producirse según diversos procedimientos. Véase, por ejemplo, la Patente de EEUU Nº 5.439.819. Un dominio o polipéptido deseado puede tener cualquier propiedad deseada, incluida una función biológica tal como una fusión catalítica, de señalamiento, promotora del crecimiento, de marcación celular (por ejemplo, secuencia señal, secuencia de marcado, tal como para endosomas, lisosomas, RE, núcleo), etc., una función estructural tal como hidrófoba, hidrófila, que atraviesa la membrana, etc., funciones de receptor-ligando, y/o funciones detectables, por ejemplo, combinado con enzimas, polipéptidos fluorescentes, proteína fluorescente verde, (Chalfie y col., 1994, Science, 263:802; Cheng y col., 1996, Nature Biotechnology, 14:606; Levy y col., 1996, Nature Biotechnology, 14:610, etc. Además, un polipéptido o parte del mismo, puede usarse como un marcador seleccionable cuando se introduce en una célula huésped, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la presente invención puede fusionarse en el marco con una secuencia codificadora deseada para actuar como un marcador para purificación, selección o fines de marcación. La región de fusión puede codificar un sitio de escisión para facilitar la expresión, el aislamiento, la purificación, etc.

Puede producirse un polipéptido según la presente invención en un sistema de expresión, por ejemplo, in vivo, in vitro, libre de células, recombinante, de fusión celular, etc. según la presente invención. Las modificaciones al polipéptido impartidas por tales sistemas incluyen glicosilación, sustitución de aminoácidos (por ejemplo, por uso de codones diferentes), procesamiento del polipéptido tal como digestión, escisión, actividad endopeptidasa o exopeptidasa, unión de restos químicos, incluidos lípidos y fosfatos, etc.

Puede recuperarse un polipéptido según la presente invención de fuentes naturales, células huésped transformadas (medios de cultivo o células) según los procedimientos usuales, incluidos extracción con detergentes (por ejemplo, Triton-X-100 CHAPS, octilglucósido), precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácidos, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía con hidroxiapatita y cromatografía con lectina. Pueden usarse etapas de replegamiento proteico, según necesidad, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, puede usarse cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para las etapas de purificación. También puede aislarse un polipéptido de corina como se describió para otras serina proteasas, por ejemplo, Wu y col., J. Biol. Chem., 267: 24408-24412, 1992; Wu y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 6775-6779,1991.

Un ácido nucleico de corina de mamífero, o un fragmento del mismo, es un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos obtenible de una fuente natural. Véase, a continuación. Incluye por consiguientes alelos que se presentan en la naturaleza, normales, mutantes, polimorfos, secuencias degeneradas, etc. Las fuentes naturales incluyen, por ejemplo, células vivas obtenidas a partir de tejidos y organismos completos, líneas celulares cultivadas, incluidas líneas celulares primarias e inmortalizadas. De preferencia, se excluyen los siguientes fragmentos de ácido nucleico de la base de datos Unigene [PubEST]: Hs. 62794 (AA126468 [1686098], AA126648 [1686206], AA625395 [2537780], AA046682 [1524579], AA249850 [1881137], y AA046793 [1524691]), y Hs. 71798 (AA147031 [1716421]). (Los números entre paréntesis se refieren a la base de datos PubEST). De manera óptima, pueden también excluirse los siguientes fragmentos: Hs. 121626 (AA771958), Hs.1657 (M69297), y Hs.47712 (AA203291), g1231787; g1312726; g1337948; y g942724. Las secuencias de nucleótidos de los ácidos nucleicos anteriores pueden identificarse buscando en las bases de datos públicas disponibles. Sin embargo, los ácidos nucleicos que contienen o comprenden estas secuencias no están excluidos, por ejemplo, corina de longitud total, o un ácido nucleico con dos o más de estos fragmentos mencionados. Resulta también de preferencia que se excluyan los fragmentos anteriores en un vector de clonación, tal como un plásmido o un fago.

La corina humana se expresa como un ARNm de aproximadamente 5 kb. Es más abundante en el corazón. Está prácticamente ausente, o se expresa en niveles muy bajos en el cerebro, placenta, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón, páncreas, bazo, timo, próstata, testículos, ovarios, intestino delgado, colon, vejiga, útero y estómago. Por consiguiente, la corina puede usarse como un marcador para la presencia de tejido cardiaco, por ejemplo, en secciones de tejidos (usando anticuerpos específicos de corina o sondas de ácidos nucleicos específicas de corina), en muestras de biopsias, etc. También se detectó corina en diversas líneas celulares humanas, incluidos tumores de útero, osteosarcoma, líneas del carcinoma de endotelio HEC-1-A, AN3 CA, y RL95-2, leimiosarcoma SK-LM1 y osteosarcoma U2-OS. En los siguientes ejemplos se describen más detalles.

En SEC ID Nº: 1 se muestra una secuencia del ácido nucleico del alelo de corina humana que tiene 4933 pares de bases. El tamaño del ADN es coherente con la longitud del ARNm de corina (-5 kb) detectada por medio de análisis Northern. En la posición 95 se encuentra un codón ATG que puede representar el sitio de iniciación de la traducción. El marco de lectura abierto (ORF) se extiende 3126 pb con una región 5' no traducida (UTR) de 94 nucleótidos antes del codón de iniciación. En el extremo 3', hay una 3' UTR de 1,7 kb después del codón de terminación en la posición 3221. 12 nucleótidos antes de la cola de poli (A)* está presente una señal de poliadenililación de AATAAA. Un ácido nucleico de la invención puede contener la secuencia codificadora completa desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 1042, secuencias degeneradas de la misma y fragmentos de la misma. Un ácido nucleico según la presente invención puede también comprender una secuencia de nucleótidos 100% complementaria, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos antisentido con respecto a cualquiera de las mencionadas anteriormente y a las que se presentan a continuación.

La presente invención también describe una secuencia de nucleótidos de ratón que codifica toda o una parte de una corina, por ejemplo, como se muestra en SEC ID Nº: 3. Como es el caso para el alelo humano, la invención se refiere a secuencias degeneradas de la misma, y fragmentos antisentido de la misma. El análisis Northern muestra un transcrito prominente en aproximadamente 5 kb en muestras derivadas del corazón. En contraste con el análisis Northern con muestras humanas, se detectaron bajos niveles de ARNm en muestras obtenidas de testículos y riñones de ratones. La hibridación in situ con ARNm de corina de ratón también se detectó en tejido embrionario cardiaco, miocitos de auriculares y ventriculares, riñones en desarrollo y estructuras derivadas del cartílago. En los ejemplos se describen más detalles.

Puede obtenerse un ácido nucleico según la presente invención de una diversidad de fuentes diferentes. Puede obtenerse a partir de ADN o ARN, tal como ARNm poliadenilado, por ejemplo, aislado de tejidos, células o de un organismo completo. El ácido nucleico puede obtenerse directamente a partir de ADN o ARN, o a partir de una biblioteca de ADNc. El ácido nucleico puede obtenerse de una célula en una etapa particular del desarrollo, con el genotipo, fenotipo deseados (por ejemplo, una célula o tejido de corazón embrionario o adulto), etc.

Como se describió para anteriormente los polipéptidos de corina, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido según la presente invención puede incluir sólo la secuencia codificadora; una secuencia codificadora y otra secuencia codificadora (por ejemplo, secuencias que codifican péptidos líderes, secretores, marcadores, enzimáticos, fluorescentes u otros péptidos de diagnóstico), secuencias codificadoras y no codificadoras, por ejemplo, secuencias no traducidas en el extremo 5' ó 3' , o dispersas en la secuencia codificadora, por ejemplo, intrones. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica sin interrupción un polipéptido significa que la secuencia de nucleótidos contiene una secuencia que codifica aminoácidos para una corina, sin interrupción o intervención de nucleótidos no codificadores en la secuencia codificadora, por ejemplo, intrón o intrones ausentes. Tal secuencia de nucleótidos puede también describirse como contigua. Un ADN genómico que codifica una corina de un mamífero, ratón o ser humano, etc., puede obtenerse de manera rutinaria.

Un ácido nucleico según la presente invención también puede comprender una secuencia de control de expresión unida de manera operativa a un ácido nucleico como se describió anteriormente. La frase "secuencia de control de expresión" significa una secuencia de ácido nucleico que regula la expresión de un polipéptido codificado por un ácido nucleico al que está unido de manera operativa. La expresión puede regularse a nivel del ARNm o del polipéptido. Por consiguiente, la secuencia de control de expresión incluye elementos relacionados con el ARNm y elementos relacionados con la proteína. Tales elementos incluyen promotores, potenciadores (virales o celulares), secuencias de unión a ribosomas, terminadores transcripcionales, etc. Una secuencia de control de expresión está unida de manera operativa a una secuencia codificante de nucleótidos cuando la secuencia de control de expresión está localizada de tal manera que provoca o consigue la expresión de la secuencia codificadora. Por ejemplo, cuando un promotor está unido de manera operativa en posición 5' a una secuencia codificadora, la expresión de la secuencia codificadora es dirigida por el promotor. Las secuencias de control de expresión pueden ser heterólogas o endógenas al gen normal.

Puede seleccionarse un ácido nucleico según la presente invención en base a la hibridación del ácido nucleico. La capacidad de dos preparaciones de ácidos nucleicos de hebra única para hibridar juntos es una medida de la complementariedad de sus secuencias de nucleótidos, por ejemplo, el apareamiento de bases entre nucleótidos, tales como A-T, G-C, etc. La invención se refiere por consiguiente también a ácidos nucleicos que hibridan con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos como la establecida en SEC ID N: 1. Una secuencia de nucleótidos que hibrida con la última secuencia tendrá una hebra de ácido nucleico complementaria, o actuará como molde para una en presencia de una polimerasa (es decir, una enzima sintetizadora de ácidos nucleicos adecuada). La presente invención incluye ambas hebras del ácido nucleico, por ejemplo, una hebra con sentido y una hebra antisentido.

Pueden elegirse las condiciones de hibridación para seleccionar ácidos nucleicos que tengan una cantidad deseada de complementariedad de nucleótidos con la secuencia de nucleótidos establecida en SEC ID Nº: 1. Un ácido nucleico capaz de hibridar con tal secuencia, de preferencia, tiene, por ejemplo, aproximadamente 85%, de más preferencia, 90%, 92%, y de más preferencia aún, 95%, 97% o 100% de complementariedad, entre las secuencias. La presente invención se refiere en particular a secuencias de ácidos nucleicos que hibridan con la secuencia de nucleótidos establecida en SEC ID Nº: 1 bajo condiciones de rigurosidad baja o alta.

Los ácidos nucleicos que hibridan con las secuencias de corina pueden seleccionarse de diversas maneras. Por ejemplo, pueden incubarse tansferencias (es decir, matrices que contienen ácidos nucleicos) en una solución de prehibridación (6X 100 \mug SCC, SDS al 0,5%, ADN desnaturalizado de esperma de salmón 100 \mug/ml, 5X solución de Denhardt y formamida al 50%) a 30EC durante la noche y a continuación hibridar con sondas radiomarcadas (corina) en una solución de hibridación (6X SSC, SDS al 0,5%, ADN desnaturalizado de esperma de salmón 100 ug/ml y formamida al 50%), a 42EC durante la noche según los procedimientos conocidos. Las transferencias pueden lavarse en condiciones muy rigurosas que permitan, por ejemplo, un emparejamiento erróneo inferior al 5% bp (por ejemplo, lavar dos veces SSC al 0,1% y SDS al 0,1% durante 30 minutos a 65EC), es decir una similitud de secuencia del 95% o mayor. Mientras que el lavado muy riguroso puede permitir un emparejamiento erróneo inferior al 5%, las condiciones con baja rigurosidad (por ejemplo, lavar dos veces en SSC al 0,2% y SDS al 0,5% durante 30 minutos a 37EC) pueden dar lugar a un emparejamiento erróneo de hasta el 20%. Otro ejemplo no limitante de condiciones de baja rigurosidad incluye un lavado final a 42EC en un tampón que contiene NaCl 30 mM y SDS al 0,5%. Otro ejemplo no limitante de condiciones de alta rigurosidad incluye un lavado final a 65 EC en tampón acuoso que contiene NaCl 30 mM en SDS al 0,5%. El lavado y la hibridación pueden también realizarse como se describe en Sambrook y col., Molecular Cloning, 1989, Capítulo 9. La hibridación puede también basarse en un cálculo de la temperatura de fusión (Tf) del híbrido formado entre la sonda y su diana, como se describe en Sambrook y col. Tales condiciones rigurosas pueden seleccionar secuencias que tienen, por ejemplo, al menos 95%, de preferencia 97%, de complementariedad de nucleótidos entre los ácidos nucleicos, a condición de que tal ácido nucleico no sea: Hs. 62794 (AA126468 [1686098], AA126648 [1686206], AA625395 [2537780], AA046682 [1524579], AA249850 [1881137] y AA046793 [1524691]), y Hs.71798 (AA147031 [1716421]). Véase, también anteriormente y a continuación. No se excluyen los ácidos nucleicos que contienen o comprenden estas secuencias, por ejemplo, corina de longitud total, o un ácido nucleico que tenga dos o más de estos fragmentos mencionados.

Según la presente invención, un ácido nucleico o polipéptido puede comprender una o más diferencias en la secuencia de nucleótidos o aminoácidos establecida en SEC ID Nº: 2. Los cambios o modificaciones a las secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos pueden realizarse por medio de cualquier procedimiento disponible, incluidos la mutagénesis dirigida o aleatoria.

Un ácido nucleico que codifica una corina humana o de ratón según la invención puede comprender nucleótidos que se presentan en el gen de corina que se presenta en la naturaleza, por ejemplo, polimorfismos que se presentan naturalmente, alelos normales o mutantes (nucleótido o aminoácido), mutaciones que se descubren en una población natural de mamíferos, tales como seres humanos, monos, cerdos, ratones, ratas o conejos. Por el término que se presentan naturalmente, se entiende que el ácido nucleico es obtenible de fuentes naturales, por ejemplo, tejidos y células de animales, líquidos corporales, células de cultivos tisulares, muestras forenses. Las mutaciones que se presentan naturalmente pueden incluir deleciones (por ejemplo, extremos amino o carboxi terminales truncados), sustituciones, o adiciones de secuencias de nucleótidos. Estos genes pueden detectarse y aislarse por hibridación de ácidos nucleicos según los procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de corina humana de la invención puede contener codones que se encuentran en el gen que se presenta naturalmente, transcritos, o ADNc, por ejemplo, como se establece en SEC ID Nº: 1, o puede contener codones degenerados que codifican las mismas secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, puede resultar deseable cambiar los codones en la secuencia para optimizar la secuencia para la expresión en un huésped deseado.

La presente invención también se refiere a muteínas de polipéptidos de corina, es decir, cualquier polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos que difiera en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos obtenible de una fuente natural (un fragmento de una corina de mamífero no difiere en secuencia de aminoácidos de la corina que se presenta en la naturaleza). Por consiguiente, las muteínas de corina comprenden sustituciones, inserciones y deleciones de aminoácidos, incluidos los aminoácidos que no se presentan en la naturaleza. Véase, por ejemplo, Wu y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 7775-6779, 1991, que informa especialmente sustituciones de aminoácidos en las que se sustituye un aminoácido básico con ácido glutámico, como guía para realizar mutaciones.

Las muteínas para una secuencia de aminoácidos de corina de la invención pueden también prepararse en base a búsqueda de homologías de bancos de datos de genes, por ejemplo, Genbank, EMBL. La búsqueda de homología de secuencias puede realizarse usando diversos procedimientos, incluidos algoritmos descritos en la familia de programas informáticos BLAST, el algoritmo de Smith-Waterman, etc.

Puede introducirse una o varias muteínas en una secuencia identificando y alineando aminoácidos dentro de un dominio que sean idénticos y/u homólogos entre los polipéptidos y a continuación modificando un aminoácido en base a tal alineamiento. Por ejemplo, en las Figuras 2-4 se ilustran las comparaciones de secuencias entre corina humana y los dominios Frizzled, LDLR y de serina proteasa de otras proteínas. Estos alineamientos revelan posiciones de aminoácidos que son idénticas y también posiciones de aminoácidos donde los residuos difieren uno de otro pero son homólogos. Los aminoácidos homólogos pueden definirse basándose en el tamaño de la cadena lateral y el grado de polarización, incluidos, no polares pequeños: cisteína, prolina, alanina, treonina; polares pequeños: serina, glicina, aspartato, asparragina; polares grandes: glutamato, glutamina, lisina, arginina; de polaridad intermedia: tirosina, histidina, triptófano; no polares grandes: fenilalanina, metionina, leucina, isoleucina, valina.

Los ácidos homólogos pueden también agruparse de la siguiente manera: grupos R polares no cargados, glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparragina, glutamina; aminoácidos ácidos (cargados negativamente), ácido aspártico y ácido glutámico; aminoácidos básicos (cargados positivamente), lisina, arginina, histidina. Los aminoácidos homólogos también incluyen los descritos por Dayhoff en el Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978), y por Argos en EMBO J., 8, 779-785 (1989).

Las muteínas de acuerdo con la presente invención incluyen secuencias de aminoácidos en las que un residuo en la secuencia de corina humana o de ratón está reemplazado por un residuo homólogo de un dominio correspondiente.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a una secuencia de nucleótidos de corina de SEC ID Nº: 2, en la que dicho ácido nucleico codifica un polipéptido y una o más posiciones de aminoácidos están sustituidas, delecionadas, o ambos, y el polipéptido codificado por el ácido nucleico tiene una actividad de dominio catalítico serina proteasa o una actividad inmunogénica específica para corina. Tal ácido nucleico puede contener una o más posiciones sustituidas de aminoácidos que están sustituidas por aminoácidos homólogos.

Además, los alineamientos de secuencias como ilustran las Figuras 2-4 también proporcionan información sobre sustituciones de aminoácidos que se espera podrían reducir, disminuir o eliminar la actividad biológica. Por ejemplo, donde el alineamiento revela aminoácidos idénticos conservados entre dos o más dominios (por ejemplo, reemplazando los residuos H, D o S conservados indicados en la Fig. 4), la eliminación o sustitución del (los) aminoácido(s) podría afectar su actividad biológica. Las mutaciones en la tríada catalítica, a saber, His910, Asp959 y Ser1052 (corina de ratón), suprimen la actividad catalítica de serina proteasas.

Una muteína del polipéptido de corina, y su correspondiente secuencia de nucleótidos codificadora, pueden tener una secuencia de aminoácidos como se establece en SEC ID Nº: 1, excepto donde una o más posiciones están sustituidas por aminoácidos homólogos, por ejemplo, donde hay 1, 5, 10, 15 ó 20 sustituciones. La invención también se refiere a polipéptidos de muteínas y ácidos nucleicos de muteínas que codifican tales polipéptidos.

Un ácido nucleico según la presente invención puede comprender, por ejemplo, ADN, ARN, ácido nucleico sintético, ácido nucleico peptídico, nucleótidos modificados, o mezclas. Un ADN puede ser de hebra doble o simple. Los nucleótidos que comprenden un ácido nucleico pueden estar unidos por medio de diversos enlaces conocidos, por ejemplo, éster, sulfamato, sulfamida, fosforotioato, fosforoamidato, metilfosfonato, carbamato, etc., dependiendo del objeto deseado, por ejemplo, resistencia a nucleasas, tales como ARNasa H, mejor estabilidad in vivo, etc. Véase, por ejemplo, la Patente de EEUU Nº 5.378.825.

Pueden realizarse diversas modificaciones a los ácidos nucleicos, tales como unir marcadores detectables (avidina, biotina, elementos radioactivos), restos que mejoran la hibridación, detección o estabilidad. Los ácidos nucleicos pueden también unirse a soportes sólidos, por ejemplo, nitrocelulosa, microesferas magnéticas o paramagnéticas (por ejemplo, como se describe en la Patente de EEUU Nº 5.411.863; Patente de EEUU Nº 5.543.289; por ejemplo, que comprenden microesferas ferromagnéticas, supermagnéticas, paramagnéticas, superparamagnéticas, óxido de hierro y polisacáridos), nylon, agarosa, celulosa diazotada, microesferas sólidas de látex, poliacrilamidas, etc., según un procedimiento deseado. Véase, por ejemplo, las Patentes de EEUU Nº 5.470.967; 5.476.925; 5.478.893.

Otro aspecto se refiere a sondas de oligonucleótidos y de ácidos nucleicos. Tales sondas de oligonucleótidos o de ácidos nucleicos pueden usarse, por ejemplo, para detectar, cuantificar o aislar un ácido nucleico de corina de mamífero en una muestra de prueba. Los ácidos nucleicos pueden usarse como sondas de oligonucleótidos, por ejemplo, en PCR, en RACE, expresión diferencial, en combinaciones con bibliotecas de ADNc, bibliotecas de expresión, etc. En los ejemplos a continuación se describen oligonucleótidos útiles. La detección puede ser deseable para una diversidad de objetos diferentes, incluidos investigación, diagnóstico y forense. Para objeto de diagnóstico, puede resultar deseable identificar la presencia o cantidad de una determinada secuencia de ácido nucleico en una muestra obtenida de tejido, células, líquidos corporales, etc. La presente invención describe un procedimiento para detectar un ácido nucleico que comprende, poner un ácido nucleico diana en una muestra de prueba en contacto con un oligonucleótido bajo condiciones eficaces para alcanzar la hibridación entre la diana y el oligonucleótido; y detectar la hibridación. También puede usarse un oligonucleótido según se describe en la invención en la amplificación sintética de ácidos nucleicos tal como PCR (por ejemplo, Saiki y col., 1988. Science 241: 53; Patente de EEUU Nº 4.683.202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis y col., eds., Academic Press, Nueva York, 1990) o expresión diferencial (Véase, por ejemplo, Liang y col., Nucl. Acid. Res., 21: 3269-3275, 1993; Patente de EEUU Nº 5.599.672; Documento WO97/18454) o RACE. Tal detección puede realizarse en combinación con oligonucleótidos para otros genes, por ejemplo, genes involucrados en el desarrollo o en la función del tejido cardiaco o del hueso.

Otro aspecto de la invención es una secuencia de nucleótidos que es única de corina humana. Por secuencia única para una corina, se entiende un orden definido de nucleótidos que se presenta en la corina, por ejemplo, en la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1, pero rara vez o con muy poca frecuencia en otros ácidos nucleicos, especialmente no se presenta en un ácido nucleico de animal, de preferencia mamífero, tal como ser humano, rata, ratón, etc. Están incluidas ambas secuencias de nucleótidos, sentido y antisentido. Un ácido nucleico único según la presente invención puede determinarse de manera rutinaria. Un ácido nucleico que comprende tal secuencia única puede usarse como una sonda de hibridación para identificar la presencia de, por ejemplo, corina humana o de ratón, en una muestra que comprende una mezcla de ácidos nucleicos, por ejemplo, en una transferencia Northern. La hibridación puede realizarse bajo condiciones rigurosas (véase, anteriormente) para seleccionar ácidos nucleicos que tengan al menos 95% de similitud (es decir, complementariedad) con la sonda, pero pueden usarse también condiciones menos rigurosas. Una secuencia de nucleótidos única de corina puede también fusionarse en el marco, ya sea en el extremo 5' o en el extremo 3', a diversas secuencias de nucleótidos como se ha mencionado en la patente, incluidas secuencias de otras partes de corina, enzimas, GFP, etc., secuencias de control de expresión, etc.

La hibridación puede llevarse a cabo bajo diferentes condiciones, según la selectividad deseada, por ejemplo, como se describe en Sambrook y col., Molecular Cloning, 1989. Por ejemplo, para detectar específicamente corina humana o de ratón, puede hibridarse un oligonucleótido a un ácido nucleico diana bajo condiciones en las que el oligonucleótido sólo hibrida con él, por ejemplo, donde el oligonucleótido es 100% complementario con la diana. Pueden usarse diferentes condiciones si se desea seleccionar ácidos nucleicos que tienen menos del 100% de complementariedad de nucleótidos, al menos aproximadamente, por ejemplo, 99%, 97%, 95%, 90%, 70%, 67%.

Se describen oligonucleótidos que pueden comprender cualquier secuencia de nucleótidos contiguos de SEC ID Nº: 1. Estos oligonucleótidos (ácido nucleico) según la presente invención pueden ser de cualquier tamaño deseado, por ejemplo, aproximadamente 10-200 nucleótidos, 12-100, de preferencia 12-50, 12-25, 14-16, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, etc. Los oligonucleótidos pueden tener nucleótidos que no se presentan en la naturaleza, por ejemplo, inosina. Los oligonucleótidos pueden tener 100% de similitud o complementariedad con una secuencia de SEC ID Nº: 1, o pueden tener errores de apareamiento o sustituciones de nucleótidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4 ó 5 sustituciones. De acuerdo con la presente invención, el oligonucleótido puede comprender un kit, donde el kit incluye un tampón deseado (por ejemplo, fosfato, tris, etc.), composiciones de detección, etc. El oligonucleótido puede estar marcado o no marcado, con marcadores radioactivos o no radioactivos según se conoce en la técnica.

También puede prepararse ácido nucleico complementario a partir de un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, de preferencia un complementario a la secuencia codificadora de SEC ID Nº: 1. El ácido nucleico complementario puede usarse de diversas maneras, tales como para regular o modular la expresión de corina, por ejemplo, para inhibirla, para detectar su expresión, o para la hibridación in situ. Estos oligonucleótidos pueden usarse de manera análoga a la Patente de EEUU Nº 5.576.208. Para el objeto de regular o modular la expresión de corina, puede unirse un oligonucleótido complementario de manera operativa a una secuencia de control de expresión.

El ácido nucleico según la presente invención puede marcarse de acuerdo con cualquier procedimiento deseado. El ácido nucleico puede marcarse usando trazadores radioactivos tales como ^{32}P, ^{35}S, ^{125}I, ^{3}H ó ^{14}C, para mencionar algunos trazadores comúnmente usados. La marcación radioactiva puede llevarse a cabo según cualquier procedimiento conocido tal como, por ejemplo, marcación terminal en el extremo 3' ó 5' usando un nucleótido radiomarcado, polinucleótido cinasa (con o sin desfosforilación con una fosfatasa) o una ligasa (según el extremo a marcar). Puede usarse también una marcación no radioactiva, combinando un ácido nucleico de la presente invención con residuos que tengan propiedades inmunológicas (antígenos, haptenos), una afinidad específica por ciertos reagentes (ligandos), propiedades que permiten que tengan lugar reacciones enzimáticas detectables (enzimas o coenzimas, sustratos de enzimas, u otras sustancias implicadas en una reacción enzimática), o propiedades físicas características, tales como fluorescencia o emisión o absorción de luz a una longitud de onda deseada, etc.

Un ácido nucleico según la presente invención puede usarse para detectar la expresión de corina en órganos completos, tejidos, células, etc., por medio de diversas técnicas, incluidas la transferencia Northern, PCR, RACE, hibridación in situ, etc. Tales ácidos nucleicos pueden ser particularmente útiles para detectar la expresión alterada, por ejemplo, alteraciones específicas celulares y/o subcelulares, de corina. Los niveles de corina pueden determinarse solos o en combinación con otros productos genéticos, especialmente productos de genes cardiacos específicos.

Un ácido nucleico según la presente invención puede expresarse en una diversidad de sistemas diferentes, in vitro e in vivo, según el objeto deseado. Por ejemplo, puede insertarse un ácido nucleico en un vector de expresión, introducirse en un huésped deseado, y cultivarse bajo condiciones eficaces para alcanzar la expresión de un polipéptido codificado por el ácido nucleico. Las condiciones eficaces incluyen cualquier condición de cultivo adecuada para conseguir la producción del polipéptido por medio de la célula huésped, incluidas temperaturas, pH, medios eficaces, aditivos para los medios en los que se cultiva la célula huésped (por ejemplo, aditivos que amplifican o inducen la expresión tales como butirato, o metotrexato si el ácido nucleico codificante está adyacente a un gen dhfr), cicloheximida, densidades celulares, placas de cultivo, etc. Puede introducirse un ácido nucleico en la célula por medio de cualquier procedimiento eficaz incluidos, por ejemplo, ADN desnudo, precipitación con fosfato de calcio, electroporación, inyección, transfección mediada por DEAE-Dextran, fusión con liposomas, asociación con agentes que potencian su captación por las células, transfección viral. Una célula en la que se ha introducido un ácido nucleico de la presente invención es una célula huésped transformada. El ácido nucleico puede ser extracromosómico o estar integrado en uno o varios cromosomas de la célula huésped. Puede ser estable o transitorio. Un vector de expresión se selecciona por su compatibilidad con la célula huésped. Las células huésped incluyen, células de mamíferos, por ejemplo, COS-7, CV1, BHK, CHO, HeLa, LTK, NIH 3T3, levaduras, células de insectos, tales como Sf9 (S. frugipeda) y Drosophila, bacterias, tales como E. coli, Streptococcus, bacillus, levaduras, células de hongos, células de plantas, células madre embrionarias (por ejemplo, de mamíferos, tales como ratón o ser humano), células óseas (tales como, osteoclastos o condrocitos), células cardiacas (por ejemplo, de un cultivo primario), células musculares, células neuronales, etc. Las secuencias de control de expresión se seleccionan de manera similar por su compatibilidad con el huésped y el objeto deseado, por ejemplo, gran número de copias, grandes cantidades, inducción, amplificación, expresión controlada. Otras secuencias que pueden usarse incluyen promotores tales como promotores de SV40, CMV, RSV, promotores inducibles, elementos específicos de tipos celulares, o secuencias que permiten la expresión selectiva o específica de células. Los promotores que pueden usarse para dirigir su expresión incluyen, por ejemplo, el promotor endógeno, MMTV, SV40; promotores trp, lac, tac o T7 para huéspedes bacterianos; o factor alfa, alcohol oxidasa, o promotores PGH para levaduras.

Puede introducirse otro gen de interés en el mismo huésped para el objeto de, por ejemplo, modular la función de corina. Tales genes pueden ser el gen normal, o una variación, por ejemplo, una mutación, quimera, polimorfismo, etc.

Puede usarse un ácido nucleico o un polipéptido de la presente invención como marcador de tamaño en la electroforesis de proteínas o ácidos nucleicos, cromatografía, etc. Los fragmentos de restricción definidos pueden determinarse por barrido de la secuencia en búsqueda de sitios de restricción, calculando el tamaño y llevando a cabo la digestión de restricción correspondiente. Puede usarse un ADNc de corina como se muestra en SEC ID Nº: 1 como marcador de peso molecular 4,8 kb en la electroforesis de ácidos nucleicos.

El ADNc de corina humana según se muestra en la SEC ID Nº: 1 se localiza en la posición cromosómica 4p12-13 en el ser humano. Puede usarse por consiguiente como un marcador en el mapeo de parentesco. Por ejemplo, esta región cromosómica parece segregarse con el retorno venoso pulmonar total anómalo (TAPVR) y por consiguiente podría usarse para mapear la enfermedad en combinación con otros marcadores genéticos. Véase, por ejemplo, Bleyl y col., Am. J. Hum. Genet., 56: 408-415, 1995.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a la regulación de las rutas biológicas en las que está involucrado un gen de corina, o un producto del gen de corina, particularmente afecciones patológicas y del desarrollo, y para el diagnóstico de tales afecciones al detectar ya sea el polipéptido o el ácido nucleico de corina. Por ejemplo, el FNA está involucrado en una diversidad de procesos fisiológicos relacionados con los sistemas cardiovascular y renal, incluidos, por ejemplo, la homeostasis de los líquidos corporales, la tensión arterial, vasodilatación, natriuresis, inhibición de la absorción de sodio en el conducto glomerular, aumento de la filtración glomerular, inhibición de la producción y secreción de aldosterona, mitogénesis, etc. La regulación de la actividad convertidora del pro-FNA de corina puede por consiguiente tener efectos profundos en la fisiología de un organismo. Por ejemplo, los niveles ventriculares de FNA son normalmente bajos en los miocitos ventriculares pero aumentan dramáticamente con las enfermedades cardiovasculares. En pacientes con insuficiencia cardiaca congestiva, los niveles plasmáticos de FNA son elevados. Las altas concentraciones se correlacionan con la gravedad de la disfunción ventricular. De manera similar, las concentraciones elevadas de FNA se asocian con arritmias cardiacas y compromiso hemodinámico. Véase, por ejemplo, Levin y col., New Engl. J. Med., 339: 321-328, 1998. Los niveles anormalmente elevados pueden reducirse inhibiendo la actividad de corina, por ejemplo, transcripcionalmente al inhibir la expresión genética o al administrar inhibidores enzimáticos, que actúen directamente en la actividad catalítica.

Como la corina se expresa extensamente en las células derivadas del cartílago y en células cardiacas, puede estar involucrada en enfermedades asociadas con estos tejidos, tales como la cardiomiopatía hipertrófica familiar, la osteopetrosis, y el síndrome de osteoporosis-pseudoglioma, osteoporosis, enfermedad de Paget, osteítis deformante, y el retorno venoso pulmonar total anómalo. Como se ha mencionado, los oligonucleótidos de corina pueden utilizarse en el mapeo de parentesco para estudiar la herencia familiar de estas enfermedades, en analogía al TAPVR, y para objeto diagnóstico (por ejemplo, prenatal) si la corina está asociada (ligado al gen o causante) con tal enfermedad. La corina puede también estar involucrada en el desarrollo cardiaco, en rutas del desarrollo que implican señalamiento con proteínas Wnt y otros factores de crecimiento, diferenciación celular (por ejemplo, diferenciación de condrocitos), y procesos relacionados. Además, la corina puede estar involucrada en las señales célula-célula, en la diferenciación (ósea y/o cardiaca) y otras rutas del desarrollo. Esta función puede estar mediada por actividad catalítica de serina proteasa, dominios frizzled, y/o dominios LDRL. La corina puede también estar involucrada en el procesamiento (por ejemplo, por escisión catalítica de un factor procrecimiento) de factores de crecimiento, tales como BMP o
TGF-\beta.

A lo largo de este documento la invención puede usarse para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares y renales, tales como la hipertensión, la enfermedad cardiaca congestiva o la insuficiencia renal (así como afecciones patológicas relacionadas con cualquier otra ruta en al que participa la corina), que comprende la administración, a un huésped que necesita del mismo, de una cantidad eficaz de un agente que modula la actividad de una corina de mamífero. Por el término "modula" se entiende: aumentar, extinguir, promover, estabilizar, disminuir, reducir, antagonizar, bloquear, inhibir, etc. La naturaleza del efecto modulador deseado puede determinarse de manera rutinaria, por ejemplo, si el efecto patológico se produce por cantidades elevadas o disminuidas del FNA. La actividad puede inhibirse por medio de la administración de un agente que bloquee directamente la actividad catalítica de corina (por ejemplo, un inhibidor enzimático, tal como leupeptina o fluorofosfato de diisopropilo) o por un agente, tal como un complementario, que bloquee la transcripción o traducción del gen correspondiente. La actividad de corina puede aumentarse, por ejemplo, por medio de la administración de un gen de corina eficaz en la producción del polipéptido de corina. El gen de corina puede administrarse de manera análoga a otras terapias genéticas. Véase, por ejemplo, Magovern y col., Hum. Gen. Ther., 8: 215-227, 1997; Springer y col., Mol. Cell., 2: 549-558, 1998.

La presente invención también se refiere a procedimientos para modular la actividad de corina in vitro, ya sea por modulación directa de su actividad, o por medio de la modulación de la expresión del gen que la codifica. La actividad enzimática puede medirse de manera convencional, por ejemplo, como se describe en Wu y col., J. Biol. Chem., 267: 24408-24412, 1992; Wu y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 6775-6779, 1991. La conversión de la actividad puede medirse como se describe en los ejemplo, o, por ejemplo, como describe Inagami, J. Biol. Chem., 264: 3043-3046, 1989. La invención se refiere por consiguiente a un procedimiento para identificar moduladores de la actividad mencionada anteriormente de un polipéptido de corina, un fragmento o muteína del mismo, que comprende: hacer reaccionar, en presencia de un compuesto de prueba, un polipéptido de corina y un sustrato para serina proteasa o la enzima convertidora, bajo condiciones eficaces para que dicho polipéptido escinda dicho sustrato; detectar dicha escisión; e identificar si el compuesto de prueba modula dicha actividad serina proteasa al comparar la cantidad de escisión en presencia y en ausencia del compuesto de prueba.

Cualquier sustrato es adecuado, y, puede utilizarse cualquier medio de detección, tal como uno cromogénico, fluorogénico, radioactivo, electroforético, etc. Por ejemplo, pueden detectarse los productos de escisión usando sustratos marcados en combinación con electroforesis en gel. En un ejemplo de preferencia, el sustrato es un sustrato cromogénico, es decir, un péptido que reacciona con la serina proteasa y que está diseñado para tener una selectividad similar a la del sustrato natural de la enzima. Unido a la parte peptídica del sustrato cromogénico hay un grupo químico que cuando se libera tras la escisión enzimática da lugar a un color detectable. El cambio de color puede seguirse por medio de espectrofotometría y es proporcional a la actividad proteolítica del dominio catalítico de serina proteasa. Estos sustratos pueden sintetizarse de manera rutinaria. La hidrólisis del sustrato (por ejemplo, que contiene 4-nitroanilina, pNA, como cromóforo) puede medirse a temperatura ambiente siguiendo la absorbancia a 405 nm. Los sustratos que pueden usarse para medir la actividad amidolítica de serina proteasas incluyen, S2302 (H-D-Pro-Phe-Arg-pNA.2HCl), S2444 (pyroGlu-Gly-Arg-pNA.HCl), y S2288 (H-D-Ile-Pro-Arg-pNA.2HCl), respectivamente. Otros cromóforos que pueden incorporarse en el sustrato incluyen, por ejemplo, ANBA, ADMP, derivados de tioléster, etc. Véase, por ejemplo, los catálogos de Chromogenix y sus páginas web para más información. Los valores de K_{m} y k_{cat} pueden calcularse por medio de la ecuación de Michaelis-Menton.

La invención también se refiere a un procedimiento para identificar compuestos que se unen específicamente a un polipéptido de corina, que comprende: poner un polipéptido de corina en contacto con un compuesto de prueba bajo condiciones eficaces para que dicho compuesto se una específicamente a dicho polipéptido de corina; y detectar la unión a dicho polipéptido de corina. Los ensayos de unión pueden realizarse de manera convencional. El polipéptido de corina comprende la secuencia codificadora completa.

El componente corina puede añadirse a la mezcla de reacción en una diversidad de formas, por ejemplo, sustancialmente purificado, como un componente de una célula, como un extracto soluble, o como un lisado. En cada caso, el polipéptido de corina puede obtenerse de una fuente natural, una fuente recombinante (es decir, un polipéptido "recombinante" es uno producido por ingeniería genética, por ejemplo, introducido en una línea celular en un plásmido, vector, ADN desnudo, etc., y expresado en la célula), o puede producirse sintéticamente (producido química o enzimáticamente). El polipéptido de corina puede expresarse en una célula de mamífero, una línea celular de insecto, o en bacterias, por ejemplo, como una proteína de fusión o no fusión.

De preferencia, la corina se expresa en una línea celular transformada con una secuencia codificadora de corina (por ejemplo, un ADNc, un gen, un fragmento genómico, etc.). En el último caso, la corina está presente como un componente heterólogo de la célula; por heterólogo, se entiende que la corina está codificada por una secuencia codificadora que se ha introducido en la célula por la mano de una persona, por ejemplo, por transfección, transformación, etc. De preferencia, la corina se expresa en niveles altos en la célula (bacteriana, levadura, insecto, mamífero, etc.) Una corina humana es una secuencia codificadora de preferencia. Véase, por ejemplo, SEC ID Nº: 1 y 2.

En un aspecto de preferencia de la invención, la corina se proporciona como un lisado celular, por ejemplo, se lisan células transformadas con corina humana y el lisado resultante se usa directamente en el ensayo, es decir, un lisado bruto. El lisado bruto que comprende la corina recombinante humana puede opcionalmente refinarse o enriquecerse para corina humana. Por ejemplo, pueden aislarse fracciones de membrana de manera convencional.

La corina puede también modularse en etapas más tempranas en su ruta de expresión, por ejemplo, al modular su transcripción, estabilidad del ARNm, traducción, modificaciones post traduccionales, procesamiento (tal como escisión en el sitio interno de escisión), etc. La expresión puede regularse usando diferentes agentes, por ejemplo, un ácido nucleico complementario, una ribozima, un aptámero, un compuesto sintético, o un compuesto que se presenta en la naturaleza.

Los compuestos identificados de esta u otras maneras pueden ser útiles para modular la actividad de la corina en una célula, un tejido, un organismo completo, in situ, in vitro (tubo de ensayos, un soporte sólido, etc.), in vivo, o en cualquier ambiente deseado. En general, un compuesto que tiene tal actividad in vitro será útil in vivo para modular una ruta biológica asociada con corina, por ejemplo, para tratar una afección patológica asociada con las actividades biológicas y celulares mencionadas anteriormente, incluidas enfermedades óseas y cardiacas y trastornos del desarrollo de los mismos, maduración de factor de crecimiento y proteínas por medio de actividad serina proteasa, etc.

Para tratar una enfermedad, el compuesto, o mezcla, puede formularse en una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y otros excipientes evidentes para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington's Phannaceutical Sciences, Eighteenth Edition, Mack Publishing Company, 1990. Tal composición puede contener adicionalmente cantidades eficaces de otros compuestos.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para modular, de preferencia inhibir, la expresión de un gen que codifica una corina de mamífero, que comprende: poner una célula que expresa una corina de mamífero de la presente invención, tal como una corina humana, en contacto con una cantidad de agente, tal como un oligonucleótido antisentido o un ARN antisentido de un gen de corina humana, que sea eficaz para inhibir específicamente la secuencia de dicho gen. La inhibición de la expresión de un gen de corina puede inhibir la maduración del FNA, y tener el consiguiente impacto en las rutas en las que está involucrado el FNA, incluidas las mencionadas anteriormente.

La inhibición específica de secuencia de un gen puede llevarse a cabo de manera convencional usando un ácido nucleico antisentido, tal como oligonucleótidos o ARN antisentido. Por ejemplo, pueden diseñarse oligonucleótidos antisentido, tales como fosfodiéster o fosforotioato desoxioligonucleótidos para regiones específicas de un ARN de corina, tales como el sitio de iniciación de la traducción, y pueden administrarse a las células que expresan tales genes en cantidades eficaces para inhibir su expresión. En general, un ácido nucleico antisentido es complementario con la hebra codificadora con sentido de un gen dado, y como resultado también son complementarios y hacen posible de esta manera hibridar específicamente con transcritos de ARNm del gen.

Para mejorar la estabilidad, puede modificarse el ácido nucleico modificado, por ejemplo, para hacerlo más resistente a las enzimas celulares, a la oxidación, reducción, nucleasas, etc. o para mejorar su captación en las células. Puede usarse cualquier modificación adecuada, incluidas, por ejemplo, fosforotioatos, metilfosfonatos, fosfodiéster oligonucleótidos unidos a un agente que intercala acridina y/o una cola hidrófoba, derivados de psoraleno, modificaciones de 2'-ribosa, derivados de azúcares pentosa, derivados de bases nitrogenadas, etc. Véase, por ejemplo la Patente de EEUU Nº 5.576.208 y la Patente de EEUU Nº 5.744.362. Véase, a continuación, para otros derivados, modificaciones, etc. que pueden ser útiles en la invención. En general, un ácido nucleico antisentido de la presente invención puede comprender monómeros de nucleótidos que se presentan en la naturaleza, nucleótidos que no se presentan en la naturaleza, y combinaciones de los mismos para mejorar la captación celular y/o la estabilidad.

El ácido nucleico antisentido puede administrarse como ácido nucleico desnudo, complejado o encapsulado con y por otros agentes que facilitan su captación en la célula, inyectado en las células, o cualquier medio de administración adecuado en asociación con vectores, tales como vectores virales y adenovectores. La terapia génica antisentido puede llevarse a cabo por medio de cualquier procedimiento adecuado. Véase, por ejemplo, Phillips, Am. J. Cardiol, 82: 605-625,1998; Haller y col., Kidney Int., 53: 1550-1558, 1998.

La presente invención se refiere también a anticuerpos que reconocen específicamente la corina de longitud completa. Un anticuerpo específico para corina significa que el anticuerpo reconoce una secuencia definida de aminoácidos dentro de o que incluyen una corina, por ejemplo, la secuencia humana de SEC ID Nº: 2. Por consiguiente, un anticuerpo específico se unirá generalmente con mayor afinidad a una secuencia de aminoácidos, es decir, un epítopo, que se encuentra en SEC ID Nº: 2 que a uno o varios diferentes epítopos, por ejemplo, como se detectan y/o miden por un ensayo de inmunotransferencia u otro inmunoensayo convencional. Por consiguiente, un anticuerpo que es específico para un epítopo de corina humana es útil para detectar la presencia de un epítopo en una muestra, por ejemplo, una muestra de tejido que contiene el producto del gen de corina humana, distinguiéndolo de otras muestras en las que el epítopo está ausente. Tales anticuerpos son útiles como se describe en Santa Cruz Biotechnology, Inc. Research Product Catalog, y por consiguiente puede formularse, por ejemplo, 100 \mug/ml.

Los anticuerpos, por ejemplo, policlonales, monoclonales, recombinantes, quiméricos, humanizados, pueden prepararse según cualquier procedimiento deseado. Véase también, bibliotecas de selección de inmunoglobulinas recombinantes (Orlandi y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 3833-3837, 1989; Huse y col., Science, 256: 1275-1281, 1989); estimulación in vitro de poblaciones de linfocitos; Winter and Milstein, Nature, 349: 293-299, 1991. Por ejemplo, para la producción de anticuerpos monoclonales, puede administrarse un polipéptido según la Fig. 2 ó Fig. 3 a ratones, cabras o conejos por vía subcutánea y/o intraperitoneal, con o sin adyuvante, en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmune. Los anticuerpos pueden también ser de cadena única o fragmentos Fab. Los anticuerpos pueden ser IgG, subtipos, IgG2a, IgG1, etc. Los anticuerpos y las respuestas inmunes pueden también generarse por la administración de ADN desnudo. Véase, por ejemplo las Patentes de EEUU Nº 5.703.055; 5.589.466; 5.580.859.

La corina, o fragmentos de la misma, para uso en la inducción de anticuerpos no necesitan tener actividad biológica; sin embargo, deben tener actividad inmunogénica. Los péptidos para uso en la inducción de anticuerpos específicos para corina pueden tener una secuencia de aminoácidos constituida por al menos cinco aminoácidos, de preferencia al menos 10 aminoácidos. Las extensiones cortas de aminoácidos de corina, por ejemplo, de cinco aminoácidos, pueden fusionarse con las de otra proteína tal como la hemocianina de lapa, u otro vehículo útil, y la molécula quimérica usada para la producción de anticuerpos.

Pueden usarse varios enfoques diferentes, como se mencionó, para preparar anticuerpos específicos para corina. Por ejemplo, en un enfoque, se obtiene corina desnaturalizada a partir de corina purificada (por ejemplo, purificada por separación por HPLC en fase inversa) en cantidades de hasta 75 mg. La proteína desnaturalizada puede usarse para inmunizar ratones o conejos usando protocolos convencionales; aproximadamente 100 microgramos resultan adecuados para la inmunización de un ratón, mientras que debe usarse hasta 1 mg para inmunizar a un conejo. Para identificar hibridomas de ratón, la proteína desnaturalizada puede radioyodinarse y usarse para seleccionar potenciales hibridomas murinos de células B para aquellos que producen anticuerpos. Este procedimiento necesita sólo pequeñas cantidades de proteína, tal que 20 mg podrían ser suficientes para marcar y seleccionar varios miles de clones.

En otro enfoque, se analiza una secuencia de aminoácidos de corina, deducida del ADNc, para determinar regiones de alta inmunogenicidad. Los polipéptidos que comprenden estas regiones se sintetizan y usan en protocolos de inmunización adecuados para elevar los niveles de anticuerpos. Los análisis para seleccionar epítopos adecuados están descritos por Ausubel FM y col. (1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol 2. John Wiley & Sons). Las secuencias de aminoácidos óptimas para la inmunización están usualmente en los extremos C-terminal, N-terminal y aquellos que intervienen, regiones hidrófilas de los polipéptidos que tienen probabilidad de estar expuestos al ambiente externo cuando la proteína está en su conformación natural. Típicamente, los péptidos seleccionados, con una longitud de aproximadamente 15 residuos, se sintetizan usando un Sintetizador de Péptidos Applied Biosystems Modelo 431A usando química fmoc y acoplado a hemocianina de lapa (KLF, Sigma) por reacción con éster de M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS; cf. Ausubel FM y col., supra). Si es necesario, puede introducirse una cisteína en el extremo N-terminal del péptido para permitir el acoplamiento a la KLH. Los conejos se inmunizan con un complejo péptido-KLH en adyuvante completo de Freund. Los antisueros resultantes se prueban para analizar la actividad antipéptido por medio de unión del péptido a plástico, bloqueo con SAB al 1%, y reacción con el antisuero, lavado y reacción con IgG de cabra anti-conejo específica, marcada (radioactiva o fluorescente), purificada por afinidad.

También pueden generarse anticuerpos contra cualquier región deseada, o subregión de la misma, por ejemplo, aproximadamente, o que comprenda, los aminoácidos 46-66; 134-259; 450-573; 268-415; 579-690; 713-801; 802-1402.

También pueden prepararse y seleccionarse hibridomas usando técnicas convencionales. Los hibridomas de interés se detectan por selección con corina marcada para identificar aquellas fusiones que producen el anticuerpo monoclonal con la especificidad deseada. En un protocolo típico, se recubren pocillos de placas (FAST, Becton Dickinson, Palo Alto, California) con anticuerpos específicos de conejo anti-ratón (o Ig anti-especie adecuada), purificados por afinidad, en una concentración de 10 mg/ml. Los pocillos recubiertos se bloquean con SAB al 1%, se lavan y exponen a sobrenadantes de hibridomas. Tras la incubación se exponen los pocillos a corina marcada, 1 mg/ml. Los clones que producen anticuerpos unirán una cantidad de corina marcada que es detectable por encima del fondo. Tales clones se expanden y se someten a 2 ciclos de clonación en dilución limitada (1 célula/3 pocillos). Los hibridomas clonados se inyectan en ratones prístinos para producir ascitis, y los anticuerpos monoclonales se purifican del líquido ascítico del ratón por cromatografía de afinidad sobre Proteína A. Por medio de procedimientos convencionales se obtendrán típicamente anticuerpos monoclonales con afinidades de al menos 10^{8} M, de preferencia 10^{9} ó 10^{10}, o mayor, como se describe en Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, o en Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2º Ed. Academic Press N. Y.

Los anticuerpos particulares para corina son útiles para el diagnóstico de afecciones prepatológicas y enfermedades crónicas o agudas que se caracterizan por diferencias en la cantidad o distribución de corina. Las pruebas de diagnóstico para corina incluyen procedimientos que utilizan el anticuerpo y un marcador para detectar corina en líquidos corporales, tejidos o extractos de tales tejidos (tales como tejidos del corazón y cartílagos) humanos (o de ratón, etc., si se utilizan ratones, etc.).

Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención pueden usarse con o sin modificaciones. Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos se marcarán uniéndolos, ya sea de manera covalente o no covalente, con una sustancia que proporcione una señal detectable. Se conoce una gran diversidad de técnicas de marcación y conjugación y se han informado extensamente tanto en la bibliografía científica como en patentes. Los marcadores adecuados incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las patentes que enseñan el uso de tales marcadores incluyen las Patentes de EEUU Nº 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4,277,437; 4,275,149 y 4.366.241. También pueden producirse inmunoglobulinas recombinantes como se muestra en la Patente de EEUU Nº 4.816.567, que se incorpora en este documento por referencia.

En la técnica se conocen una diversidad de protocolos para medir corina soluble o unida a membrana, usando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para corina. Los ejemplos incluyen ensayos de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayos (RIA) y separación de células activadas por fluorescencia (FACS). Resulta de preferencia un inmunoensayo basado en anticuerpos monoclonales para dos sitios que utilice anticuerpos monoclonales reactivos para dos epítopos que no interfieran en EC, pero puede emplearse un ensayo de unión competitiva. Estos ensayos se describen, entre otros, en Maddox, Del. y col. (1983) J. Exp. Med. 158: 1211.

Pueden usarse anticuerpos u otros ligandos que se unen a corina en diversos ensayos, incluidos como herramientas terapéuticas, de diagnóstico y de investigación comercial, por ejemplo, para cuantificar los niveles de polipéptido de corina en animales, tejidos, células, etc., para identificar la localización celular y/o distribución de la misma, para purificarla, o un polipéptido que comprenda parte de la misma, para modular su función, en transferencias Western, ELISA, inmunoprecipitación, RIA, etc. La presente invención se refiere a tales ensayos, composiciones y kits para llevarlos a cabo, etc. Usando estos y otros procedimientos, puede usarse un anticuerpo según la presente invención para detectar un polipéptido de corina o fragmentos del mismo en diversas muestras, incluidos tejidos, células, líquidos corporales, sangre, orina, liquido cefalorraquídeo. Un procedimiento de la presente invención comprende: a) poner en contacto un ligando que se une a un péptido de SEC ID Nº: 2 bajo condiciones eficaces, según se conoce en la técnica, para conseguir la unión, y b) detectar la unión específica entre el ligando y el péptido. Por unión específica, se entiende que el ligando se une a una secuencia definida de aminoácidos, por ejemplo, dentro o que incluye la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 o derivados de la misma.

La corina nativa o recombinante puede purificarse por cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos específicos para corina. En general, se construye una columna de inmunoafinidad por acoplamiento covalente del anticuerpo anticorina con una resina cromatográfica activada.

Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a partir de suero inmune por medio de precipitación con sulfato de amonio o por purificación sobre Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N. J.). De la misma manera, los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de líquido de ascitis de ratón por medio de precipitación con sulfato de amonio o cromatografía sobre Proteína A inmovilizada. La Ig parcialmente purificada se une covalentemente a una resina de cromatografía tal como Sepharose activada con CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N. J.). El anticuerpo se acopla a la resina, la resina se bloquea, y se lava la resina derivada según las instrucciones del fabricante.

En la purificación de corina se utiliza una columna de inmunoafinidad preparando una fracción a partir de células que contienen corina. Esta preparación puede derivar de la solubilización de la célula completa o de una fracción subcelular obtenida por medio de centrifugación diferencial por medio de la adición de detergente o por medio de otros procedimientos bien conocidos en la técnica. Como alternativa, la corina soluble que contiene la secuencia señal puede secretarse en una cantidad útil en el medio en el que se cultivan las células.

Una preparación que contiene corina se hace pasar por la columna de inmunoafinidad, y se lava la columna bajo condiciones, por ejemplo, tampones con fuerza iónica elevada en presencia de detergente, que permiten la absorbancia de preferencia de corina. Posteriormente, se eluye la columna bajo condiciones que rompan la unión anticuerpo/corina (por ejemplo, un tampón de pH 2-3 o una alta concentración de un agente caotropo tal como urea o ión tiocianato), y se recoge la corina.

Además, los ligandos que se unen a un polipéptido de corina según la presente invención, o un derivado del mismo, pueden también prepararse, por ejemplo, usando bibliotecas de péptidos sintéticos o aptámetos (por ejemplo, Pitrung y col., Patente de EEUU Nº 5.143.854; Geysen y col., 1987, J. Immunol. Methods, 102: 259-274; Scott y col., 1990, Science, 249:386; Blackwell y col., 1990. Science, 250:1104; Tuerk y col., 1990, Science, 249:505.)

Los anticuerpos o derivados de los mismos pueden también usarse para inhibir la expresión de corina o de un fragmento de la misma. Los niveles del péptido de corina pueden determinarse solos o en combinación con otros productos genéticos. En particular, puede compararse la cantidad (por ejemplo, su nivel de expresión) de polipéptido de corina (por ejemplo, como una proporción) con respecto a las cantidades de otros polipéptidos en la misma muestra o en muestras diferentes, por ejemplo, actina. En general, los reagentes que son específicos para corina pueden usarse en estudios de diagnóstico y/o forenses según cualquier procedimiento deseado, por ejemplo, como las Patentes de EEUU Nº 5.397.712; 5.434.050; 5.429.947.

La presente invención también se refiere a un polipéptido de corina, preparado según un procedimiento deseado, por ejemplo, como se describe en la Patente de EEUU Nº 5.434.050. Puede usarse un polipéptido marcado, por ejemplo, en ensayos de unión, para identificar sustancias que unen o se unen a la corina, para hacer un seguimiento del movimiento de la corina en una célula, en un sistema in vitro, in vivo, o in situ.

Puede aislarse un ácido nucleico, un anticuerpo, ligando de corina, etc., según la presente invención. El término "aislado" significa que el material está en una forma en la que no se encuentra en su ambiente original, por ejemplo, más concentrado, más purificado, separado de componentes, etc. Un ácido nucleico aislado incluye, por ejemplo, un ácido nucleico que tiene la secuencia de corina separada del ADN cromosómico que se encuentra en un animal vivo. Este ácido nucleico puede ser parte de un vector o puede estar insertado en un cromosoma (por marcación específica de genes o por integración aleatoria en una posición diferente de su posición normal) y aún puede aislarse en una forma diferente a la que se encuentra en su ambiente natural. Un ácido nucleico o polipéptido de la presente invención puede también purificarse sustancialmente. Por sustancialmente purificado, se entiende que el ácido nucleico o polipéptido está separado y esencialmente libre de otros ácidos nucleicos y polipéptidos, es decir, el ácido nucleico o polipéptido es el constituyente principal y activo.

La presente invención también describe un animal transgénico no humano, por ejemplo un mamífero no humano, tal como un ratón, que comprende una corina o uno knock-out (desprovisto) de corina. Pueden prepararse animales transgénicos según los procedimientos conocidos, incluidos, por ejemplo, por inyección pronuclear de genes recombinantes en pronúcleos de embriones de 1 célula, incorporando un cromosoma artificial de levadura en células madre embrionarias, por procedimientos de marcación genética, por procedimientos embrionarios con células madre. Véase, por ejemplo, las Patentes de EEUU Nº 4.736.866; 4.873.191; 4.873.316; 5.082.779; 5,304.489; 5.174.986; 5.175.384; 5.175.385; 5.221.778; Gordon y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 77: 7380-7384 (1980); Palmiter y col., Cell, 41: 343-345 (1985); Palmiter y col., Ann. Rev. Genet., 20: 465-499 (1986); Askew y col., Mol. Cell. Bio., 13: 4115-4124, 1993; Games y col. Nature, 373: 523-527, 1995; Valancius y Smithies, Mol. Cell. Bio., 11: 1402-1408, 1991; Stacey y col., Mol. Cell. Bio., 14: 1009-1016, 1994; Hasty y col., Nature, 350: 243-246, 1995; Rubinstein y col., Nucl. Acid Res., 21: 2613-2617, 1993. Puede introducirse un ácido nucleico según la presente invención en un mamífero no humano, incluido un ratón (Hogan y col., 1986, en Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York), cerdo (Hammer y col. Nature, 315 : 343-345,1985), oveja (Hammer y col., Nature, 315: 343-345, 1985), vaca, rata, o primate. Véase también, por ejemplo, Church. 1987, Trends in Biotech. 5: 13-19; Clark y col., 1987, Trends in Biotech. 5: 20-24; y DePamphilis y col., 1988, BioTechniques. 6: 662-680. Además, por ejemplo, la producción de ratas y ratones transgénicos a medida está disponible comercialmente. Estos animales transgénicos son modelos de animales útiles para probar la función de corina, como alimento para una serpiente, como marcadores genéticos para detectar el origen de cepas, etc. Tales animales transgénicos pueden además comprender otros transgenes o carecer de los mismos (por ejemplo, en otras serina proteasas, péptidos natriuréticos, etc.).

Los animales transgénicos que comprenden múltiples copias del gen de corina, el gen de corina dirigido por potentes promotores, o knock-out de corina, pueden ser útiles como modelos animales para hipertensión, enfermedad renal y enfermedad cardiaca. Véase, por ejemplo, Steinhelper y col., Hypertension, 16: 301-307, 1990: John y col., Am. J. Physiol., 271: R109-R114, 1996.

La presente invención describe por consiguiente un animal transgénico, tal como un roedor, un ratón, o una rata, que comprende células que contienen un gen recombinante de corina integrado en un cromosoma de dicha célula en el locus del gen de corina nativo, dicho gen de corina recombinante comprende una secuencia de nucleótidos codificadora que codifica un polipéptido de corina recombinante que comprende al menos un aminoácido cuya identidad y/o posición no se presenta naturalmente en dicho gen de corina nativo. Tal gen recombinante puede producirse por recombinación homóloga, por ejemplo, entre un gen de corina humana y el de corina de un animal huésped en su locus nativo.

La presente invención también describe un animal transgénico, tal como un ratón o una rata, que comprende células que contienen al menos un gen de corina recombinante interrumpido funcionalmente en un locus del gen cromosómico de corina, en el que dicha interrupción evita la expresión funcional del polipéptido de corina codificado por el gen de corina. La inactivación o interrupción funcional se refiere, por ejemplo, a una reducción completa o parcial de la expresión de al menos una porción de un polipéptido codificado por un gen endógeno de serina proteasa de una única célula, células seleccionadas, o todas las células de un mamífero. Tal reducción puede dar lugar a la reducción concomitante de la actividad de la enzima convertidora de pro FNA, y causar una disminución en el FNA fisiológicamente activo. El término "knock-out" es un sinónimo para inactivación funcional del gen.

Se describe una estrategia de marcación de genes que facilita la introducción de una secuencia de nucleótidos deseada en un gen de corina. La estrategia de marcación de genes utiliza de preferencia recombinación recíproca doble y un marcador positivo seleccionable para ayudar en la inserción de la secuencia de nucleótidos en el ácido nucleico diana. El ácido nucleico diana es de preferencia un gen, de más preferencia un gen en su locus cromosómico particular. La secuencia de nucleótidos deseada se inserta en el gen de tal manera que se interrumpa funcionalmente el gen, es decir, su expresión se reduce parcial o completamente.

La modificación del gen de corina en su locus cromosómico puede realizarse según cualquier procedimiento adecuado, tal como la recombinación homóloga. La última puede usarse para interrumpir el gen de corina, introducir una mutación genética en el gen de corina, insertar o delecionar ADN, etc. La selección y uso de secuencias eficaces para recombinación homóloga se describe, por ejemplo, en Deng and Capecchi, Mol. Cell. Bio., 12: 3365-3371, 1992; Bollag y col., Annu. Rev. Genet., 23: 199-225, 1989; Waldman and Liskay, Mol. Cell. Bio., 8: 5350-5357, 1988; Rubinstein y col., Nucl. Acid Res., 21: 2613-2617, 1993; Documentos WO94/23049; WO95/14377.

El gen de corina puede interrumpirse funcionalmente por completo, por ejemplo, delecionando regiones 5' del gen. Como alternativa, pueden modificarse regiones específicas de corina. Por ejemplo, el dominio catalítico aproximadamente en las posiciones de los aminoácidos 802-1042 en el gen de corina humana, o las posiciones correspondientes en el gen del ratón, pueden alterarse genéticamente por recombinación para producir una corina con actividad modificada, incluida actividad nula, actividad aumentada, actividad reducida.

En general, los ácidos nucleicos, polipéptidos, anticuerpos, etc. de la presente invención pueden prepararse y usarse como se describe en las Patentes de EEUU Nº 5.501.969, 5.506.133, 5.441.870; en los Documentos WO 90/00607 y WO 91/15582.

Para otros aspectos de los ácidos nucleicos, polipéptidos, anticuerpos, etc., se hace referencia a libros de texto convencionales de biología molecular, ciencias de las proteínas e inmunología. Véase, por ejemplo, Davis y col. (1986), Basic Methods in Molecular Biology, Elsevir Sciences Publishing, Inc., Nueva York; Hames y col. (1985), Nucleic Acid Hybridization, IL Press, Molecular Cloning, Sambrook y col.; Current Protocols in Molecular Biology, Editado por F. M. Ausubel y col., John Wiley & Sons, Inc.; Current Protocols in Human Genetics, Editado por Nicholas C. Dracopoli y col., John Wiley & Sons, Inc.; Current Protocols in Protein Science; Editado por John E. Coligan y col., John Wiley & Sons, Inc.; Current Protocols in Immunology; Editado por John E. Coligan y col., John Wiley & Sons, Inc.

Ejemplos Aislamiento de clones de ADNc de corina humana

Se identificó una secuencia parcial EST basándose en análisis de la base de datos Incyte EST para ADNc de serina proteasas nuevas. El clon (307474) fue solicitado por Incyte. Se usó un fragmento EcoR1-Xhol de 2,1 kb del clon para seleccionar una biblioteca de ADNc de corazón humano (Clontech). Se obtuvo phagemid 14b2, que contiene un inserto de 3,8 kb de un clon de fagos positivo por escisión in vivo. Se usaron los oligocebadores derivados de phagemid 14b2 para clonar más el extremo 5' de la secuencia de ADNc por 5' RACE, usando ADNc de corazón humano preparado según Marathon (Clontech) como molde. Los productos de PCR se clonaron en el vector pCRII (Invitrogen) y se secuenció. Se obtuvo la secuencia de ADNc de corina humana de longitud total (es decir, con un codón de iniciación y un codón de terminación) compilando las secuencias obtenidas a partir del 5' RACE y phagemid usando el paquete de análisis de secuencias de ADN GCG.

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Oligocebadores usados en 5' RACE

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PrWY109: 5'-CAGTTGGTTTGAACAAGTGCAGGG-3'

PrWY110: 5'-TGCAAGGAGGGATACGCTCGCCTG-3'

PRWY111: 5'-AATCCCAAGAACAGACTCACAGCG-3'

PRWY118: 5'-CGGGTCACAGAGAGAGCTACCACC-3'

PRWY119: 5'-GGTCTCCTTCTTGACATGAATCTG-3'

5'-AACAAAACGATCCTTGGAGGTCGGACGAGT-3'

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Análisis Northern

Se marcó el fragmento EcoRI-XhoI de 2,1 kb del clon Incyte 307474 con ^{32}P dCTP usando un kit de marcación de cebadores aleatorio (Boehringer). Se hibridaron filtros Human Multiple Tissue Northern Blot I, Human Multiple Tissue Northern Blot II, Human Muscle Northern Blot (Clontech) con una sonda de ADNc de corina humana marcada. La hibridación Northern se llevó a cabo durante la noche a 42 EC con formamida al 40%, 5X solución de Denhardt, 6X SSC, ADN de esperma de salmón 100 \mug/ml, SDS al 0,1%. Se lavaron los filtros con 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 60 EC y se expusieron a placas para imágenes Fuji.

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Clonación de ADNc de corina de ratón

Se aislaron clones de ADNc de corina de ratón por medio de una estrategia basada en PCR. Se obtuvo una biblioteca de ADNc de corazón de ratón de Clontech y se usó como molde para amplificación por PCR (30 ciclos de 1,5 minutos de alineamiento a 55 EC, 1,5 minutos de extensión a 72 EC, y 1 minuto de desnaturalización a 94 EC). Las secuencias de los cebadores de PCR están basadas en las secuencias de ADNc de corina humana. Los cebadores usados para la amplificación del ADNc de ratón incluyen:

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Cor09: 5'-TCTTCTGTGTACTAAACAAGACTG-3'

Cor12: 5'-AGGCCCCAGGACTTTGGAAAAGCA-3'

Cor02: 5'-ACAGTGGCCTGAAGACACAGATTG-3'

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Prwy128: 5'-ACAGAGCATCGCTGCGGGGACGGG-3'

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Se clonaron fragmentos de ADN de las reacciones de PCR in el vector pCRII. Se usaron vectores de plásmidos derivados de reacciones independientes de PCR para otra secuenciación. Los ADNc de corina humana y de ratón comparten más del 85% de similitud de secuencia.

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Hibridación in situ

Se aislaron muestras de ARNm de RT-PCR de células Hec-1-A, U2-OS, SK-LMS-1, y AN3-CA usando un kit comercial de preparación de ARN (Oligotex Direct mRNA Mini Kits, QIAGEN). En primer lugar se sintetizaron hebras de ADNc usando transcriptasa inversa SuperScript II RNase (Life Technologies). Se usaron cebadores de oligonucleótidos específicos de corina humana (cebador con sentido: 5'-AACAAAAGGATCCTTGGAGGTCGGACGAGT-3' y cebador antisentido: 5'-CGGAGCCCCATGA AGTTAATCCA-3') para amplificar un fragmento de ADNc de corina de 630 pb entre los nucleótidos 1475 y 3105. Se usaron los cebadores de oligonucleótidos TFR1 (5'-GTCAATGTCC
CAAACGTCACCAGA-3') y TFR2 (5'-ATTTCGGGAATGCTGAGAAAACAGACAGA-3'), derivados del gen de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa humana (GAPDH) como control interno de cuantificación. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo con un termociclador (Perkin-Elmer, modelo 480). Los productos de PCR se separaron en genes de agarosa al 1% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio.

Hibridación in situ - Se desparafinizaron secciones de tejidos embrionarios y de corazón de ratón adulto en xileno, se rehidrataron y fijaron en paraformaldehído al 4%. Se digirieron los tejidos con proteinasa K (20 mg/ml), a continuación se trataron con trietanolamina/anhídrido acético y se deshidrataron. Se clonó un fragmento de ADNc de corina de ratón de 800 pb de la región codificadora en pCRII (Invitrogen) en dos orientaciones para dar plásmidos pM11 y pM41. Se linearizaron los plásmidos por digestión con HindIII. Se sintetizaron sondas con sentido y antisentido usando polimerasa de ARN T7 (kit de transcripción T7/SP6, Boheringer Mannheim) y se marcaron con [^{33}P]UTP (Amersham). La hibridación se realizó según se describe (Jen y col., Dev. Dyn., 208: 92-106, 1997). Se deshidrataron los portaobjetos y se sumergieron en emulsión NTB-2 Kodak y se expusieron durante 4 semana en cajas herméticas con luz a 4ºC. El revelado fotográfico se llevó a cabo en un revelador D-19 Kodak. Se tiñeron los portaobjetos con hematoxilina y eosina y se analizaron con microscopía óptica y en campo oscuro con un microscopio Zeiss.

Análisis de hibridación con fluorescencia in situ (FISH) - Se aislaron clones de fago P1 que contenían el gen de corina humana por hibridación con filtros usando ADNc de corina humana como sonda. Se confirmó un clon por secuenciación del ADN usando un cebador de ADNc de corina humana. Se marcó el fragmento de ADN de este fago P1 con digoxigenin-dUTP. La sonda marcada se combinó con ADN humano cortado y se hibridó con cromosomas en metafase derivados de linfocitos de sangre periférica estimulados con PHA en una solución con formamida al 50%, sulfato de dextrán al 10% y 2x SSC. Se detectaron señales de hibridación por medio de anticuerpos antidigoxigenina marcados fluorescentes y contratinción con DAPI (4,6-diaminoidino-2-fenilindol). Se analizaron un total de 80 células en metafase de las cuales 74 exhibieron marcación específica.

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Modelo de similitud del dominio proteasa de corina - Se construyó un modelo de dominio proteasa de corina (aminoácidos 802-1042) basándose en la estructura del quimotripsinógeno A bovino a una resolución de 1,8 \ring{A} (Wang y col., J. Mol. Biol., 185: 595-624, 1985; Ponder and Richards, J. Mol. Biol., 1987), usando el programa Homology (Insight II, 1995, MSI, San Diego, CA). Se usaron rotámeros para reemplazos de cadenas laterales no idénticas (Ponder y Richards, J. Mol. Biol., 1987). Se extrajeron coordinados para las inserciones de bucles del banco de datos de proteínas Brookhaven (Bernstein y col., Mol, Biol., 112: 535-542, 1977). Se mejoró el modelo por minimización de energía usando el campo de fuerzas de AMBER (Discover 95.0), con una constante dieléctrica dependiente de la distancia. La minimización usó los procedimientos de dirección del máximo gradiente de gradiente conjugado: primero para los bucles sólo donde se presentaban inserciones y deleciones, posteriormente cadenas laterales, y una ronda final de minimización manteniendo los átomos de Ca fijados. También se mantuvieron fijados los residuos de corina (His843, Asp892 y Ser985) correspondientes a la tríada catalítica de la estructura molde.

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Actividad biológica de corina

Se produjeron varias líneas celulares diferentes por medio de procedimientos convencionales para ensayar la actividad biológica de la corina. Se cotransfectaron 293 células con pro-FNA y plásmidos que expresaban corina. Se crearon otras dos líneas celulares cotransfectando 293 células con un plásmido que expresaba pro-FNA y un plásmido que expresaba hepsina o protrombina. Sólo las células que expresaron corina convirtieron pro-FNA en FNA según se demostró por transferencia Western usando anticuerpos para FNA.

Se realizó otro experimento en el que el medio acondicionado que contenía pro-FNA se puso en contacto con células que expresaban polipéptido de corina recombinante. Una vez más, el pro-FNA se convirtió en FNA. Las células de control que expresaban hepsina o protrombina no tuvieron efecto sobre el pro-FNA.

Los fragmentos de ácidos nucleicos, citados anteriormente y en las figuras, pueden encontrarse en las bases de datos Unigene, PubEST y GeneBank de la siguiente manera: Hs.62794 (AA126468 [1686098], AA126648 [1686206], AA625395 [2537780], AA046682 [1524579], AA249850 [1881137], y AA046793 [1524691]), y Hs.71798
(AA147031 [1716421]); Hs.121626 (AA771958), Hs.1657 (M69297), y Hs.47712 (AA203291), g1231787; g1312726; g1337948; y g942724.

<110> Morser, John

\hskip1.05cmWu, Qingyu

\hskip1.05cmYan, Wei

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<120> ÁCIDOS NUCLEICOS Y POLIPÉPTIDOS DE SERINA PROTEASAS NUEVAS

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<130> SCHERING AG

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<140>

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<141>

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<150> 09/092.029

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<151> 05-06-1998

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<160> 18

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 4933

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<212> ADN

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<213> Corina de Homo sapiens

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<400> 1

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1

2

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<210> 2

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<211> 1042

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<212> PRT

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<213> Corina de Homo sapiens

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<400> 2

4

5

6

7

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<210> 3

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<211> 3547

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<212> ADN

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<213> Corina murina

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<400> 3

8

9

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<210> 4

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<211> 1113

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<212> PRT

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<213> Corina murina

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<400> 4

10

11

12

13

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<210> 5

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Corina humana

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<400> 5

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14

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<210> 6

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Corina humana

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<400> 6

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15

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<210> 7

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Corina humana

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<400> 7

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150

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<210> 8

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Corina humana

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<400> 8

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16

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<210> 9

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Corina humana

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<400> 9

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17

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<210> 10

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Corina humana

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<400> 10

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18

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<210> 11

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Corina humana

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<400> 11

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19

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<210> 12

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Corina de ratón

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<400> 12

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20

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<210> 13

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Corina de ratón

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<400> 13

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21

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<210> 14

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Corina humana

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<400> 14

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22

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<210> 15

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Corina humana

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<400> 15

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23

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<210> 16

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Corina humana

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<400> 16

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24

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<210> 17

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> GAPDH humana

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<400> 17

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25

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<210> 18

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> GAPDH humana

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<400> 18

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26

Claims (10)

1. Un polipéptido de corina humana de longitud completa aislado que comprende desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 1042 según se establece en SEC ID Nº: 2.

2. El polipéptido de corina humana de longitud completa aislado según la reivindicación 1, codificado por la secuencia de ADN establecida en SEC ID Nº: 1.

3. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de corina de longitud completa que comprende desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 1042 según se establece en SEC ID Nº: 2.

4. El ácido nucleico aislado según la reivindicación 3, que tiene la secuencia de nucleótidos establecida en SEC ID Nº: 1.

5. Un vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 3.

6. Un procedimiento para expresar en células huésped transformadas, una corina humana de longitud completa establecida en SEC ID Nº: 2, codificado por un ácido nucleico establecido en SEC ID Nº: 1 que comprende: cultivar células huésped transformadas que contienen un ácido nucleico de SEC ID Nº: 1 bajo condiciones eficaces para expresar el polipéptido de SEC ID Nº: 2; y aislar la fracción de membrana de dichas células huésped que comprenden dicho polipéptido.

7. Un procedimiento para identificar moduladores de la actividad catalítica serina proteasa de una actividad del polipéptido de corina humana que comprende:

hacer reaccionar, en presencia de un compuesto de prueba, un polipéptido de corina humana de las reivindicaciones 1 ó 2, y un sustrato cromogénico para serina proteasa, bajo condiciones eficaces para que dicho polipéptido escinda dicho sustrato, que da como resultado la aparición de un color detectable;

detectar dicha escisión; e

identificar si el compuesto de prueba modula dicha actividad serina proteasa comparando la cantidad de escisión en presencia y en ausencia del compuesto de prueba.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicho polipéptido de corina humana tiene la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 1042 según se establece en SEC ID Nº: 2.

9. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicho polipéptido de corina humana está codificado por la secuencia del ácido nucleico establecida en SEC ID Nº: 1.

10. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el sustrato es pro-FNA.