JP2000270874A - 新規な膜結合型メタロプロテアーゼ - Google Patents
新規な膜結合型メタロプロテアーゼInfo
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- JP2000270874A JP2000270874A JP11082516A JP8251699A JP2000270874A JP 2000270874 A JP2000270874 A JP 2000270874A JP 11082516 A JP11082516 A JP 11082516A JP 8251699 A JP8251699 A JP 8251699A JP 2000270874 A JP2000270874 A JP 2000270874A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 結合組織の改変、細胞外マトリックスの生成
・代謝などに関与し、アテローム性動脈硬化症、アルツ
ハイマー病、肺気腫、リウマチ性関節炎、筋ジストロフ
ィー、骨粗鬆症、神経変性疾患および癌の浸潤・転移な
どの多くの疾患に重要な役割を果たしていると考えら
れ、膜結合型メタロプロテアーゼファミリーに属し、新
規なヒト由来の膜結合型メタロプロテアーゼタンパク質
およびそれをコードする遺伝子、さらにはそれに対する
抗体を提供し、種々の疾患、特には癌に関連したメタロ
プロテアーゼの機能を明らかにし、これら疾患の発症機
序の解明、治療及び治療薬の開発に資する。 【解決手段】 ヒト由来cDNAライブラリーよりクローニ
ングされた新規の膜結合型メタロプロテアーゼ（特には
ヒトMT5-MMP)、それをコードする塩基配列を含有するDN
A 、該DNA で形質転換せしめた宿主細胞、該宿主細胞を
用いる該ヒト由来の膜結合型メタロプロテアーゼタンパ
ク質の製造方法、該膜結合型メタロプロテアーゼタンパ
ク質に結合するモノクローナル抗体、さらにはそれらタ
ンパク質、抗体および核酸の用途。
・代謝などに関与し、アテローム性動脈硬化症、アルツ
ハイマー病、肺気腫、リウマチ性関節炎、筋ジストロフ
ィー、骨粗鬆症、神経変性疾患および癌の浸潤・転移な
どの多くの疾患に重要な役割を果たしていると考えら
れ、膜結合型メタロプロテアーゼファミリーに属し、新
規なヒト由来の膜結合型メタロプロテアーゼタンパク質
およびそれをコードする遺伝子、さらにはそれに対する
抗体を提供し、種々の疾患、特には癌に関連したメタロ
プロテアーゼの機能を明らかにし、これら疾患の発症機
序の解明、治療及び治療薬の開発に資する。 【解決手段】 ヒト由来cDNAライブラリーよりクローニ
ングされた新規の膜結合型メタロプロテアーゼ（特には
ヒトMT5-MMP)、それをコードする塩基配列を含有するDN
A 、該DNA で形質転換せしめた宿主細胞、該宿主細胞を
用いる該ヒト由来の膜結合型メタロプロテアーゼタンパ
ク質の製造方法、該膜結合型メタロプロテアーゼタンパ
ク質に結合するモノクローナル抗体、さらにはそれらタ
ンパク質、抗体および核酸の用途。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規に同定された
ポリヌクレオチド（あるいは核酸）及びポリペプチド
（あるいはタンパク質）（又はその一部）あるいはその
塩；該ポリヌクレオチド（あるいは核酸）及びポリペプ
チド（あるいはタンパク質）の変異体及び誘導体；該ポ
リヌクレオチド（あるいは核酸）及びポリペプチド（あ
るいはタンパク質）、並びにそれらの変異体及び誘導体
の製造法；該ポリペプチド（あるいはタンパク質）のア
ゴニスト及びアンタゴニスト；該ポリペプチド（あるい
はタンパク質）に対する抗体、特にはモノクローナル抗
体；並びに該ポリヌクレオチド（あるいは核酸）、ポリ
ペプチド（あるいはタンパク質）、変異体、誘導体、ア
ゴニスト及びアンタゴニストの用途に関するものであ
る。本発明は癌細胞の有無、癌の悪性度の診断等の癌の
診断治療に関わる研究に有用な診断手段として、あるい
はその他の医学的生理学的用途に有用な、新規なタンパ
ク質、特にはプロゼラチナーゼ A活性化能を有するヒト
膜結合型メタロプロテアーゼ（またはその一部）又はそ
の塩及びそれをコードする遺伝子に関するものである。
さらに詳しくは、本発明は、MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MM
P, MT4-MMP以外のプロゼラチナーゼ A活性化因子である
新規な膜結合型タンパク質、ヒト細胞表層などで特異的
に発現している新規マトリックスメタロプロテアーゼ
〔本発明で明らかにされた新規マトリックスメタロプロ
テアーゼをMT5-MMP (Membrane-Type Matrix metallopro
teinase-5)と命名する〕、それをコードする塩基配列を
含有するDNA 、該DNA で形質転換せしめた宿主細胞、該
宿主細胞を用いる該マトリックスメタロプロテアーゼの
製造方法、該マトリックスメタロプロテアーゼタンパク
質に特異的に結合するモノクローナル抗体、さらにはそ
れらタンパク質、核酸及び抗体の用途に関するものであ
る。
ポリヌクレオチド（あるいは核酸）及びポリペプチド
（あるいはタンパク質）（又はその一部）あるいはその
塩；該ポリヌクレオチド（あるいは核酸）及びポリペプ
チド（あるいはタンパク質）の変異体及び誘導体；該ポ
リヌクレオチド（あるいは核酸）及びポリペプチド（あ
るいはタンパク質）、並びにそれらの変異体及び誘導体
の製造法；該ポリペプチド（あるいはタンパク質）のア
ゴニスト及びアンタゴニスト；該ポリペプチド（あるい
はタンパク質）に対する抗体、特にはモノクローナル抗
体；並びに該ポリヌクレオチド（あるいは核酸）、ポリ
ペプチド（あるいはタンパク質）、変異体、誘導体、ア
ゴニスト及びアンタゴニストの用途に関するものであ
る。本発明は癌細胞の有無、癌の悪性度の診断等の癌の
診断治療に関わる研究に有用な診断手段として、あるい
はその他の医学的生理学的用途に有用な、新規なタンパ
ク質、特にはプロゼラチナーゼ A活性化能を有するヒト
膜結合型メタロプロテアーゼ（またはその一部）又はそ
の塩及びそれをコードする遺伝子に関するものである。
さらに詳しくは、本発明は、MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MM
P, MT4-MMP以外のプロゼラチナーゼ A活性化因子である
新規な膜結合型タンパク質、ヒト細胞表層などで特異的
に発現している新規マトリックスメタロプロテアーゼ
〔本発明で明らかにされた新規マトリックスメタロプロ
テアーゼをMT5-MMP (Membrane-Type Matrix metallopro
teinase-5)と命名する〕、それをコードする塩基配列を
含有するDNA 、該DNA で形質転換せしめた宿主細胞、該
宿主細胞を用いる該マトリックスメタロプロテアーゼの
製造方法、該マトリックスメタロプロテアーゼタンパク
質に特異的に結合するモノクローナル抗体、さらにはそ
れらタンパク質、核酸及び抗体の用途に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】マトリックスメタロプロテアーゼ(MMPs)
は、細胞外マトリックスと基底膜成分のさまざまな構成
タンパク質を分解する亜鉛依存性のエンドペプチダーゼ
のファミリーである。これらの酵素群は、正常な胚の発
生、骨の成長あるいは創傷の治癒など、結合組織の再構
成に関連している(Woessner, J.F., FASEB J., 5, 2145
-2154 (1991); Matrisian, L. M., BioEssays, 14, 455
-463 (1992); Birkedal-Hansen, H., Moore W.G.I., Bo
dden, M.K., Windsor, L.J., Birkedal-Hansen,B., DeC
arlo, A., and Engler, J.A., Crit. Rev. Oral Biol.
Med., 4, 197-250 (1993)) 。また、アテローム性動脈
硬化症(Henney, A.M., Wakeley, P.R., Davies, M.J.,
Foster, K., Hembry, R., Murphy, G., and Humphries,
S., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 88, 8154-8158 (199
1))、肺気腫(Hautamaki, R.D., Kobayashi, D.K., Seni
or, R.M., and Shapiro, S.D., Science, 277, 2002-20
04(1997)) 、リウマチ性関節炎(Murphy, G., and Hembr
y, R.M., J. Rheumatol.,19, 61-64 (1992)) および癌
の浸潤・転移（Stetler-Stevenson, W.G., Aznavooria
n, S., and Liotta, L.A., Annu. Rev. Cell Biol., 9,
541-573 (1993)) などさなざまな病的な過程における
関与が知られるようになってきた。今日までに、アミノ
酸レベルまで解析された17種のMMPsが知られている(Woe
ssner, J.F., FASEB J., 5, 2145-2154 (1991); Matris
ian, L. M., BioEssays, 14, 455-463 (1992); Birkeda
l-Hansen, H., Moore W.G.I., Bodden, M.K., Windsor,
L.J., Birkedal-Hansen, B., DeCarlo, A., and Engle
r, J.A., Crit. Rev. Oral Biol.Med., 4, 197-250 (19
93); Gururajan, R., Grenet, J., Lahti, J.M., and K
idd, V.J., Genomics, 52, 101-106 (1998); Velasco,
G., Pendas, A.M., Fueyo, A., Knauper, V., Murphy,
G., and Lopez-Otin, C., J. Biol. Chem., 274,4570-4
576 (1999)) 。１次構造、基質特異性および細胞分布に
より、これらのMMPsは少なくとも4 種のサブファミリ
ー：コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシンお
よび膜型MMPs(MT-MMPs) に分類されている。
は、細胞外マトリックスと基底膜成分のさまざまな構成
タンパク質を分解する亜鉛依存性のエンドペプチダーゼ
のファミリーである。これらの酵素群は、正常な胚の発
生、骨の成長あるいは創傷の治癒など、結合組織の再構
成に関連している(Woessner, J.F., FASEB J., 5, 2145
-2154 (1991); Matrisian, L. M., BioEssays, 14, 455
-463 (1992); Birkedal-Hansen, H., Moore W.G.I., Bo
dden, M.K., Windsor, L.J., Birkedal-Hansen,B., DeC
arlo, A., and Engler, J.A., Crit. Rev. Oral Biol.
Med., 4, 197-250 (1993)) 。また、アテローム性動脈
硬化症(Henney, A.M., Wakeley, P.R., Davies, M.J.,
Foster, K., Hembry, R., Murphy, G., and Humphries,
S., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 88, 8154-8158 (199
1))、肺気腫(Hautamaki, R.D., Kobayashi, D.K., Seni
or, R.M., and Shapiro, S.D., Science, 277, 2002-20
04(1997)) 、リウマチ性関節炎(Murphy, G., and Hembr
y, R.M., J. Rheumatol.,19, 61-64 (1992)) および癌
の浸潤・転移（Stetler-Stevenson, W.G., Aznavooria
n, S., and Liotta, L.A., Annu. Rev. Cell Biol., 9,
541-573 (1993)) などさなざまな病的な過程における
関与が知られるようになってきた。今日までに、アミノ
酸レベルまで解析された17種のMMPsが知られている(Woe
ssner, J.F., FASEB J., 5, 2145-2154 (1991); Matris
ian, L. M., BioEssays, 14, 455-463 (1992); Birkeda
l-Hansen, H., Moore W.G.I., Bodden, M.K., Windsor,
L.J., Birkedal-Hansen, B., DeCarlo, A., and Engle
r, J.A., Crit. Rev. Oral Biol.Med., 4, 197-250 (19
93); Gururajan, R., Grenet, J., Lahti, J.M., and K
idd, V.J., Genomics, 52, 101-106 (1998); Velasco,
G., Pendas, A.M., Fueyo, A., Knauper, V., Murphy,
G., and Lopez-Otin, C., J. Biol. Chem., 274,4570-4
576 (1999)) 。１次構造、基質特異性および細胞分布に
より、これらのMMPsは少なくとも4 種のサブファミリ
ー：コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシンお
よび膜型MMPs(MT-MMPs) に分類されている。
【０００３】MT-MMPs サブファミリーは、最も新しくMM
Psのサブクラスとして報告されたもので、MMPsに保存さ
れた領域に対するディジェネレートプライマーとRT-PCR
によって単離された４種のメンバーで構成されている(S
ato, H., Takino, T., Okada, Y., Cao, J., Shinagaw
a, A., Yamamoto, E., and Seiki, M., Nature, 370,61
-65 (1994); Will, H., and Hinzmann, B., Eur. J. Bi
ochem., 231, 602-608(1995); Takino, T., Sato, H.,
Shinagawa, A., and Seiki, M., J. Biol. Chem., 270,
23013-23020 (1995); Puente X.S., Pendas, A.M., Ll
ano, E., Velasco G., and Lopez-Otin, C., Cancer Re
s, 56, 944-949 (1996)) 。MT-MMPs は、多くのMMPsに
特徴的なホモペキシンドメインの後方に、単一の膜貫通
領域と短い細胞内テールを持つＩ型の膜タンパク質であ
る。さらに、これらはプロペプチドと活性ドメインの間
に塩基性アミノ酸の挿入が共通して存在し、フィウリン
(furin) あるいはフィウリン様酵素による切断で、これ
らの膜タンパク質の活性化がおきる(Pei, D., and Weis
s, S. J., J. Biol. Chem., 271, 9135-9140 (1996); S
ato, H., Kinoshita, T., Takino, T., Nakayama, K.,
and Seiki, M., FEBS Lett., 393, 101-104 (1996); Ca
o, J., Rehemtulla, A:, Bahou, W., and Zucker, S.,
J. Biol. Chem., 271, 30174-30180 (1996))。
Psのサブクラスとして報告されたもので、MMPsに保存さ
れた領域に対するディジェネレートプライマーとRT-PCR
によって単離された４種のメンバーで構成されている(S
ato, H., Takino, T., Okada, Y., Cao, J., Shinagaw
a, A., Yamamoto, E., and Seiki, M., Nature, 370,61
-65 (1994); Will, H., and Hinzmann, B., Eur. J. Bi
ochem., 231, 602-608(1995); Takino, T., Sato, H.,
Shinagawa, A., and Seiki, M., J. Biol. Chem., 270,
23013-23020 (1995); Puente X.S., Pendas, A.M., Ll
ano, E., Velasco G., and Lopez-Otin, C., Cancer Re
s, 56, 944-949 (1996)) 。MT-MMPs は、多くのMMPsに
特徴的なホモペキシンドメインの後方に、単一の膜貫通
領域と短い細胞内テールを持つＩ型の膜タンパク質であ
る。さらに、これらはプロペプチドと活性ドメインの間
に塩基性アミノ酸の挿入が共通して存在し、フィウリン
(furin) あるいはフィウリン様酵素による切断で、これ
らの膜タンパク質の活性化がおきる(Pei, D., and Weis
s, S. J., J. Biol. Chem., 271, 9135-9140 (1996); S
ato, H., Kinoshita, T., Takino, T., Nakayama, K.,
and Seiki, M., FEBS Lett., 393, 101-104 (1996); Ca
o, J., Rehemtulla, A:, Bahou, W., and Zucker, S.,
J. Biol. Chem., 271, 30174-30180 (1996))。
【０００４】MT-MMPs は、他のプロMMPsで起こり得るよ
うなセリンプロテアーゼによる活性化によってはその活
性化がなされないところのプロゼラチナーゼ Aの活性化
を膜上で行う(Okada, Y., Morodomi, T., Enghild, J.
J., Suzuki, K., Yasui, A.,Nakanishi, I., Salvese
n, G., and Nagase, H., Eur. J. Biochem., 194, 721-
730 (1990))。ゼラチナーゼ Aは、IV型コラーゲンの分
解活性を持つ基底膜浸潤における重要な酵素であるた
め、癌細胞表層でのMT-MMPs によるその活性化は、癌細
胞の転移性に重大な役割を果たすと考えられている。MT
-MMPs によるプロゼラチナーゼ Aの活性化は、他のMMPs
と同様、2 ステップで進行する。最初にプロゼラチナー
ゼ AのプロペプチドドメインがMT-MMPs の直接的な作用
によって切断され、さらに続いて、自己分解によって切
断、活性化する。この活性化過程においてプロゼラチナ
ーゼ A、MT1-MMP およびTIMP-2の3 種の分子は、複合体
を形成し細胞表面における活性型ゼラチナーゼ Aの集積
メカニズムとして機能する(Strongin, A.Y., Collier,
I., Bannikov, G., Marmer, B.L., Grants, G.A., andG
oldberg, G., J. Biol. Chem., 270, 5331-5338 (199
5); Atkinson, S.J., Crabbe, T., Cowel, S., Ward,
R.V., Butler, M.J., Sato, H., Seiki, M., Reynolds,
J.J., and Murphy, G., J. Biol. Chem., 270, 30479-
30485 (1995); Butler, G.S., Butler, M.J., Atkinso
n, S.J., Will, H., Tamura, T., Schade vanWestrum,
S., Crabbe, T., Clements, J., d'Ortho, M-P., and M
urphy, G., J. Biol. Chem., 273, 871-880 (1998); Zu
cker, S., Drews, M., Conner, C., Foda, H.D., DeCle
rk, Y.A., Langley, K.E., Bahous, W.F., Docherty,
A.J.P.,and Cao, J., J. Biol. Chem., 273, 1216-1222
(1998); Fernandez-Catalan,C., Bode, W., Huber,
R., Turk, D., Calvete, J.J., Lichte, A., Tschesch
e,H., and Maskos, K., EMBO J., 17, 5238-5248 (199
8)) 。
うなセリンプロテアーゼによる活性化によってはその活
性化がなされないところのプロゼラチナーゼ Aの活性化
を膜上で行う(Okada, Y., Morodomi, T., Enghild, J.
J., Suzuki, K., Yasui, A.,Nakanishi, I., Salvese
n, G., and Nagase, H., Eur. J. Biochem., 194, 721-
730 (1990))。ゼラチナーゼ Aは、IV型コラーゲンの分
解活性を持つ基底膜浸潤における重要な酵素であるた
め、癌細胞表層でのMT-MMPs によるその活性化は、癌細
胞の転移性に重大な役割を果たすと考えられている。MT
-MMPs によるプロゼラチナーゼ Aの活性化は、他のMMPs
と同様、2 ステップで進行する。最初にプロゼラチナー
ゼ AのプロペプチドドメインがMT-MMPs の直接的な作用
によって切断され、さらに続いて、自己分解によって切
断、活性化する。この活性化過程においてプロゼラチナ
ーゼ A、MT1-MMP およびTIMP-2の3 種の分子は、複合体
を形成し細胞表面における活性型ゼラチナーゼ Aの集積
メカニズムとして機能する(Strongin, A.Y., Collier,
I., Bannikov, G., Marmer, B.L., Grants, G.A., andG
oldberg, G., J. Biol. Chem., 270, 5331-5338 (199
5); Atkinson, S.J., Crabbe, T., Cowel, S., Ward,
R.V., Butler, M.J., Sato, H., Seiki, M., Reynolds,
J.J., and Murphy, G., J. Biol. Chem., 270, 30479-
30485 (1995); Butler, G.S., Butler, M.J., Atkinso
n, S.J., Will, H., Tamura, T., Schade vanWestrum,
S., Crabbe, T., Clements, J., d'Ortho, M-P., and M
urphy, G., J. Biol. Chem., 273, 871-880 (1998); Zu
cker, S., Drews, M., Conner, C., Foda, H.D., DeCle
rk, Y.A., Langley, K.E., Bahous, W.F., Docherty,
A.J.P.,and Cao, J., J. Biol. Chem., 273, 1216-1222
(1998); Fernandez-Catalan,C., Bode, W., Huber,
R., Turk, D., Calvete, J.J., Lichte, A., Tschesch
e,H., and Maskos, K., EMBO J., 17, 5238-5248 (199
8)) 。
【０００５】MT-MMPs は、プロゼラチナーゼ A活性化能
によって特徴付けられていたが、最近、プロコラゲナー
ゼ-3がMT1-MMP で効果的に活性化されるといった様に、
他のMMPsファミリーの活性化能を有することが知られた
きた(Knauper, V., Will, H., Lopez-Otin, C., Smith,
B., Atkinson, S.J., Stanton, H., Hembry, R.M.,and
Murphy, G., J. Biol. Chem., 271, 17124-17131 (199
6))。このことから、MT1-MMP 、ゼラチナーゼ Aおよび
コラゲナーゼ-3が協調して発現するところの生理学的、
病理学的過程においてこれら３酵素が、ある種のタンパ
ク質分解経路を機能させると考えられる(Stahle-Backda
hl, M., Sandsted, B., Bruce, K., Lindahl, A., Jime
nez, M.G., Vega, J.A., and Lopez-Otin, C., Lab. In
vest., 76, 717-728 (1997); Cazorla, M., Hernandez,
L., Nadal, A., Balbin, M., Lopez, J.M., Vizoso,
F., Fernandez, P.L., Iwata, K., Cardesa, A., Lopez
-Otin, C., and Campo, E., J. Pathol., 186, 144-150
(1998)) 。
によって特徴付けられていたが、最近、プロコラゲナー
ゼ-3がMT1-MMP で効果的に活性化されるといった様に、
他のMMPsファミリーの活性化能を有することが知られた
きた(Knauper, V., Will, H., Lopez-Otin, C., Smith,
B., Atkinson, S.J., Stanton, H., Hembry, R.M.,and
Murphy, G., J. Biol. Chem., 271, 17124-17131 (199
6))。このことから、MT1-MMP 、ゼラチナーゼ Aおよび
コラゲナーゼ-3が協調して発現するところの生理学的、
病理学的過程においてこれら３酵素が、ある種のタンパ
ク質分解経路を機能させると考えられる(Stahle-Backda
hl, M., Sandsted, B., Bruce, K., Lindahl, A., Jime
nez, M.G., Vega, J.A., and Lopez-Otin, C., Lab. In
vest., 76, 717-728 (1997); Cazorla, M., Hernandez,
L., Nadal, A., Balbin, M., Lopez, J.M., Vizoso,
F., Fernandez, P.L., Iwata, K., Cardesa, A., Lopez
-Otin, C., and Campo, E., J. Pathol., 186, 144-150
(1998)) 。
【０００６】他のMMPsに対する膜結合型活性化因子とし
ての機能に加えて、MT-MMPs は細胞外マトリックス成分
すなわちゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチ
ン、繊維性コラーゲンあるいはアグルカンなどを分解す
ることができる(Imai, K., Ouchi, E., Aoki, T., Nomu
ra, H., Fujii, Y., Sato, H., Seiki, M., and Okada,
Y., Cancer Res., 56, 2707-2710 (1996); Ohuchi, E.,
Imai, K., Fujii, Y.,Sato, H., Seiki, M., and Okad
a, Y., J. Biol. Chem., 272, 2446-2451 (1997); D'Or
tho, M-P., Will, H., Atkinson, S., Butler, G., Mes
sent, A., Gavrilovic, J., Smith, B., Timpl, R., Za
rdi, L., and Murphy, G., Eur. J. Biochem., 250, 75
1-757 (1997); Fosang, A.J., Last, K., Fujii, Y., S
eiki, M., and Okada, Y., FEBS Lett., 430, 186-190
(1998); Buttner, F.H., Hughes,C.E., Margerie, D.,
Lichte, A., Tschesche, H., Caterson, B., and Bartn
ik, E., Biochem. J., 333, 159-165 (1998))。さら
に、MT1-MMP がフィブリノリシンとして機能することで
血管新生を制御することができることも示されている(H
iraoka, N., Allen, E., Apel, I.J., Gyetko, M.R., a
nd Weiss, S.J., Cell, 95, 365-377 (1998)) 。癌細胞
の持つ潜在的浸潤能は、MT-MMPs が多様な生物学的活性
を持つ事実から、MT-MMPs の細胞表層におけるプロゼラ
チナーゼ Aの活性化が必須でない可能性もある。
ての機能に加えて、MT-MMPs は細胞外マトリックス成分
すなわちゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチ
ン、繊維性コラーゲンあるいはアグルカンなどを分解す
ることができる(Imai, K., Ouchi, E., Aoki, T., Nomu
ra, H., Fujii, Y., Sato, H., Seiki, M., and Okada,
Y., Cancer Res., 56, 2707-2710 (1996); Ohuchi, E.,
Imai, K., Fujii, Y.,Sato, H., Seiki, M., and Okad
a, Y., J. Biol. Chem., 272, 2446-2451 (1997); D'Or
tho, M-P., Will, H., Atkinson, S., Butler, G., Mes
sent, A., Gavrilovic, J., Smith, B., Timpl, R., Za
rdi, L., and Murphy, G., Eur. J. Biochem., 250, 75
1-757 (1997); Fosang, A.J., Last, K., Fujii, Y., S
eiki, M., and Okada, Y., FEBS Lett., 430, 186-190
(1998); Buttner, F.H., Hughes,C.E., Margerie, D.,
Lichte, A., Tschesche, H., Caterson, B., and Bartn
ik, E., Biochem. J., 333, 159-165 (1998))。さら
に、MT1-MMP がフィブリノリシンとして機能することで
血管新生を制御することができることも示されている(H
iraoka, N., Allen, E., Apel, I.J., Gyetko, M.R., a
nd Weiss, S.J., Cell, 95, 365-377 (1998)) 。癌細胞
の持つ潜在的浸潤能は、MT-MMPs が多様な生物学的活性
を持つ事実から、MT-MMPs の細胞表層におけるプロゼラ
チナーゼ Aの活性化が必須でない可能性もある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】MMPsのサブファミリー
である新規のMT-MMPを調べることは、MT-MMPs の特徴、
すなわち他のMMPsファミリーと異なる活性や機能をより
理解するために重要である。特に、正常な胚の発生、骨
の成長あるいは創傷の治癒など、結合組織の再構成、細
胞外マトリックスの分解・構築などに関連した研究の発
展、結合組織や細胞外マトリックスの形成異常・代謝不
全など、さらにアテローム性動脈硬化症、肺気腫、リウ
マチ性関節炎、癌の浸潤・転移などに関連した疾患の発
症機序の解明、それらの予防や治療、さらには治療薬の
開発のための調査・研究において、新規の膜結合型タン
パク質であるMT-MMPについて研究することは、おおいに
役立つと予測される。本発明は、プロゼラチナーゼ Aの
活性化能を有するMT-MMPs の一種であり且つMT1-MMP, M
T2-MMP, MT3-MMP 及び MT4-MMP以外のプロゼラチナーゼ
A活性化因子である天然のヒト膜結合型の新規なタンパ
ク質及びそれをコードする遺伝子、該プロゼラチナーゼ
A活性化因子である新規なタンパク質の製造方法及び該
タンパク質及び該遺伝子の用途等を提供することを目的
とする。
である新規のMT-MMPを調べることは、MT-MMPs の特徴、
すなわち他のMMPsファミリーと異なる活性や機能をより
理解するために重要である。特に、正常な胚の発生、骨
の成長あるいは創傷の治癒など、結合組織の再構成、細
胞外マトリックスの分解・構築などに関連した研究の発
展、結合組織や細胞外マトリックスの形成異常・代謝不
全など、さらにアテローム性動脈硬化症、肺気腫、リウ
マチ性関節炎、癌の浸潤・転移などに関連した疾患の発
症機序の解明、それらの予防や治療、さらには治療薬の
開発のための調査・研究において、新規の膜結合型タン
パク質であるMT-MMPについて研究することは、おおいに
役立つと予測される。本発明は、プロゼラチナーゼ Aの
活性化能を有するMT-MMPs の一種であり且つMT1-MMP, M
T2-MMP, MT3-MMP 及び MT4-MMP以外のプロゼラチナーゼ
A活性化因子である天然のヒト膜結合型の新規なタンパ
ク質及びそれをコードする遺伝子、該プロゼラチナーゼ
A活性化因子である新規なタンパク質の製造方法及び該
タンパク質及び該遺伝子の用途等を提供することを目的
とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、MT1-MMP,
MT2-MMP, MT3-MMP 及び MT4-MMP以外にも、プロゼラチ
ナーゼ Aの活性化能を有するMT-MMPs の一種である因子
がさらに存在するのではないかと考え、遺伝子工学的手
法を用い種々研究した結果、新たな膜結合型のプロゼラ
チナーゼ A活性化因子をコードする遺伝子を単離するこ
とに成功し、該遺伝子塩基配列およびアミノ酸配列の全
てを明らかにし、本発明を完成させるに至った。本発明
者により新規なプロゼラチナーゼ A活性化因子たるMT-M
MPの遺伝子がクローニングされ、遺伝子塩基配列および
アミノ酸配列の全てが明らかにされるに至った。本発明
者らは、この新規MT-MMPメンバーを"MT5-MMP" と命名し
た。したがって、本発明は、プロゼラチナーゼ A活性化
能を有するヒト由来因子である新規なヒト膜結合型メタ
ロプロテアーゼタンパク質、特に本明細書において、MT
5-MMP と称するポリペプチド（あるいはタンパク質）、
その製造方法およびその用途、該タンパク質をコードす
る遺伝子（あるいはポリヌクレオチド又は核酸）および
その用途等を提供する。
MT2-MMP, MT3-MMP 及び MT4-MMP以外にも、プロゼラチ
ナーゼ Aの活性化能を有するMT-MMPs の一種である因子
がさらに存在するのではないかと考え、遺伝子工学的手
法を用い種々研究した結果、新たな膜結合型のプロゼラ
チナーゼ A活性化因子をコードする遺伝子を単離するこ
とに成功し、該遺伝子塩基配列およびアミノ酸配列の全
てを明らかにし、本発明を完成させるに至った。本発明
者により新規なプロゼラチナーゼ A活性化因子たるMT-M
MPの遺伝子がクローニングされ、遺伝子塩基配列および
アミノ酸配列の全てが明らかにされるに至った。本発明
者らは、この新規MT-MMPメンバーを"MT5-MMP" と命名し
た。したがって、本発明は、プロゼラチナーゼ A活性化
能を有するヒト由来因子である新規なヒト膜結合型メタ
ロプロテアーゼタンパク質、特に本明細書において、MT
5-MMP と称するポリペプチド（あるいはタンパク質）、
その製造方法およびその用途、該タンパク質をコードす
る遺伝子（あるいはポリヌクレオチド又は核酸）および
その用途等を提供する。
【０００９】本発明では、さらに、該新規なヒト膜結合
型メタロプロテアーゼタンパク質遺伝子に対して特異的
なハイブリダイゼーションプローブを提供する。また、
本発明は、該新規なヒト膜結合型メタロプロテアーゼに
対して特異的に反応する抗体、抗体を用いた該ヒト膜結
合型タンパク質の免疫学的測定方法およびその測定試薬
を提供する。本発明は新規なヒト膜結合型タンパク質遺
伝子およびヒト由来のタンパク質MT5-MMP 、およびその
類縁体に関わるものである。さらに本発明は新規な該膜
結合型タンパク質の全体または一部をコードするDNA 配
列、このようなDNA 配列を有するベクターおよびこのよ
うなベクターで形質転換またはトランスフェクションさ
れた宿主細胞にも関する。さらに組換えヒトMT5-MMP の
製造法およびその用途も包含している。また該膜結合型
タンパク質遺伝子にハイブリダイズする核酸、たとえば
DNA 、RNA プローブに関する。さらに、該膜結合型タン
パク質に結合する抗体、特にはモノクローナル抗体およ
びその抗体を産生するハイブリドーマ細胞にも関する。
さらに上記の産物を用いた該膜結合型タンパク質の検出
・測定試薬、その試薬を用いた検出・測定方法を提供す
る。
型メタロプロテアーゼタンパク質遺伝子に対して特異的
なハイブリダイゼーションプローブを提供する。また、
本発明は、該新規なヒト膜結合型メタロプロテアーゼに
対して特異的に反応する抗体、抗体を用いた該ヒト膜結
合型タンパク質の免疫学的測定方法およびその測定試薬
を提供する。本発明は新規なヒト膜結合型タンパク質遺
伝子およびヒト由来のタンパク質MT5-MMP 、およびその
類縁体に関わるものである。さらに本発明は新規な該膜
結合型タンパク質の全体または一部をコードするDNA 配
列、このようなDNA 配列を有するベクターおよびこのよ
うなベクターで形質転換またはトランスフェクションさ
れた宿主細胞にも関する。さらに組換えヒトMT5-MMP の
製造法およびその用途も包含している。また該膜結合型
タンパク質遺伝子にハイブリダイズする核酸、たとえば
DNA 、RNA プローブに関する。さらに、該膜結合型タン
パク質に結合する抗体、特にはモノクローナル抗体およ
びその抗体を産生するハイブリドーマ細胞にも関する。
さらに上記の産物を用いた該膜結合型タンパク質の検出
・測定試薬、その試薬を用いた検出・測定方法を提供す
る。
【００１０】さらに、本発明では、ヒトMT5-MMP アゴニ
ストを提供する。とりわけ好ましいアゴニストは、MT5-
MMP 結合分子あるいはMT5-MMP 受容体分子に結合する
か、及び／又はMT5-MMP 誘起反応を引き起こすか、ある
いはそれを増強するようなMT5-MMP 擬似分子である。ま
た、好ましいアゴニストは、MT5-MMP もしくはMT5-MMP
ポリペプチド、又はその他のMT5-MMP 活性制御物質と相
互作用し、MT5-MMP の作用・効果あるいはそれ以上の作
用・効果を可能にするか又は増強する分子である。本発
明では、ヒトMT5-MMP アンタゴニストを提供する。とり
わけ好ましいアンタゴニストは、MT5-MMP 結合分子ある
いはMT5-MMP 受容体分子に結合するが、一つ又はそれ以
上のMT5-MMP 誘起反応を引き起こさないか、あるいはそ
れを阻害するようなMT5-MMP 擬似分子である。また、好
ましいアンタゴニストは、MT5-MMPもしくはMT5-MMP ポ
リペプチド、又はその他のMT5-MMP 活性制御物質と相互
作用し、一つ又はそれ以上のMT5-MMP の作用・効果を阻
害するか、あるいは抑制する分子である。さらに、ヒト
MT5-MMP の有するメタロプロテアーゼ活性を阻害する物
質および蛋白質分解活性を阻害する物質を検出する手法
を提供し、その物質あるいは誘導体を有効成分とする薬
剤、たとえばメタロプロテアーゼ活性あるいは蛋白質分
解活性を阻害する中和抗体、特には、該膜結合型タンパ
ク質に結合するモノクローナル抗体にも関する。さら
に、ヒトMT5-MMP に対する抗体に結合し且つヒトMT5-MM
P 活性を有しないヒトMT5-MMP の部分ペプチドおよびそ
の誘導体またはそれらの塩にも関する。また、ヒトMT5-
MMP の転写あるいは翻訳を阻止するアンチセンスオリゴ
マーおよびその誘導体、それを有効成分とする薬剤に関
するものである。
ストを提供する。とりわけ好ましいアゴニストは、MT5-
MMP 結合分子あるいはMT5-MMP 受容体分子に結合する
か、及び／又はMT5-MMP 誘起反応を引き起こすか、ある
いはそれを増強するようなMT5-MMP 擬似分子である。ま
た、好ましいアゴニストは、MT5-MMP もしくはMT5-MMP
ポリペプチド、又はその他のMT5-MMP 活性制御物質と相
互作用し、MT5-MMP の作用・効果あるいはそれ以上の作
用・効果を可能にするか又は増強する分子である。本発
明では、ヒトMT5-MMP アンタゴニストを提供する。とり
わけ好ましいアンタゴニストは、MT5-MMP 結合分子ある
いはMT5-MMP 受容体分子に結合するが、一つ又はそれ以
上のMT5-MMP 誘起反応を引き起こさないか、あるいはそ
れを阻害するようなMT5-MMP 擬似分子である。また、好
ましいアンタゴニストは、MT5-MMPもしくはMT5-MMP ポ
リペプチド、又はその他のMT5-MMP 活性制御物質と相互
作用し、一つ又はそれ以上のMT5-MMP の作用・効果を阻
害するか、あるいは抑制する分子である。さらに、ヒト
MT5-MMP の有するメタロプロテアーゼ活性を阻害する物
質および蛋白質分解活性を阻害する物質を検出する手法
を提供し、その物質あるいは誘導体を有効成分とする薬
剤、たとえばメタロプロテアーゼ活性あるいは蛋白質分
解活性を阻害する中和抗体、特には、該膜結合型タンパ
ク質に結合するモノクローナル抗体にも関する。さら
に、ヒトMT5-MMP に対する抗体に結合し且つヒトMT5-MM
P 活性を有しないヒトMT5-MMP の部分ペプチドおよびそ
の誘導体またはそれらの塩にも関する。また、ヒトMT5-
MMP の転写あるいは翻訳を阻止するアンチセンスオリゴ
マーおよびその誘導体、それを有効成分とする薬剤に関
するものである。
【００１１】本発明は、 〔１〕 プロゼラチナーゼ A活性化能を有するヒト膜結
合型メタロプロテアーゼの一種であり且つMT1-MMP, MT2
-MMP, MT3-MMP, MT4-MMP以外のプロゼラチナーゼ A活性
化因子である天然のヒト膜結合型タンパク質若しくは該
ヒト膜結合型タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも64
％の相同性を有し且つマトリックスメタロプロテアーゼ
活性、プロゼラチナーゼ A活性化能あるいは同等の抗原
性を有するものであることを特徴とする新規ヒト膜結合
型タンパク質またはその塩； 〔２〕 配列表の配列番号:1で表されるアミノ酸配列の
うち、第156 番目〜第327 番目のアミノ酸配列を有する
もの、同第80番目〜第327 番目のアミノ酸配列を有する
もの、同第1 番目〜第327 番目のアミノ酸配列を有する
もの、同第156 番目〜第569 番目のアミノ酸配列を有す
るもの、同第80番目〜第569 番目のアミノ酸配列を有す
るもの、同第１番目〜第569 番目のアミノ酸配列を有す
るもの、第156 番目〜第645 番目のアミノ酸配列を有す
るもの、同第80番目〜第645 番目のアミノ酸配列を有す
るもの、同第１番目〜第645 番目のアミノ酸配列を有す
るもの、及びそれらのいずれか一つと実質的に同等のア
ミノ酸配列を有するものからなる群から選ばれたアミノ
酸配列を少なくとも一つ含有するタンパク質であること
を特徴とするタンパク質またはその塩； 〔３〕 上記〔１〕または〔２〕記載のタンパク質の部
分ペプチドまたはその塩；
合型メタロプロテアーゼの一種であり且つMT1-MMP, MT2
-MMP, MT3-MMP, MT4-MMP以外のプロゼラチナーゼ A活性
化因子である天然のヒト膜結合型タンパク質若しくは該
ヒト膜結合型タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも64
％の相同性を有し且つマトリックスメタロプロテアーゼ
活性、プロゼラチナーゼ A活性化能あるいは同等の抗原
性を有するものであることを特徴とする新規ヒト膜結合
型タンパク質またはその塩； 〔２〕 配列表の配列番号:1で表されるアミノ酸配列の
うち、第156 番目〜第327 番目のアミノ酸配列を有する
もの、同第80番目〜第327 番目のアミノ酸配列を有する
もの、同第1 番目〜第327 番目のアミノ酸配列を有する
もの、同第156 番目〜第569 番目のアミノ酸配列を有す
るもの、同第80番目〜第569 番目のアミノ酸配列を有す
るもの、同第１番目〜第569 番目のアミノ酸配列を有す
るもの、第156 番目〜第645 番目のアミノ酸配列を有す
るもの、同第80番目〜第645 番目のアミノ酸配列を有す
るもの、同第１番目〜第645 番目のアミノ酸配列を有す
るもの、及びそれらのいずれか一つと実質的に同等のア
ミノ酸配列を有するものからなる群から選ばれたアミノ
酸配列を少なくとも一つ含有するタンパク質であること
を特徴とするタンパク質またはその塩； 〔３〕 上記〔１〕または〔２〕記載のタンパク質の部
分ペプチドまたはその塩；
【００１２】〔４〕 上記〔１〕または〔２〕記載のタ
ンパク質又はその部分ペプチドをコードする塩基配列を
有することを特徴とする核酸； 〔５〕 配列表の配列番号:2又は9 で表される塩基配列
のうち、オープンリーディングフレーム部分またはそれ
と実質的に同等な塩基配列を有することを特徴とする上
記〔４〕記載の核酸； 〔６〕 上記〔４〕または〔５〕記載の核酸を含有する
ことを特徴とするベクター； 〔７〕 上記〔４〕または〔５〕記載の核酸あるいは上
記〔６〕記載のベクターを含有することを特徴とする形
質転換体； 〔８〕 宿主細胞が大腸菌、酵母、CHO 細胞およびCOS
細胞からなる群から選ばれたものであることを特徴とす
る上記〔７〕記載の形質転換体；
ンパク質又はその部分ペプチドをコードする塩基配列を
有することを特徴とする核酸； 〔５〕 配列表の配列番号:2又は9 で表される塩基配列
のうち、オープンリーディングフレーム部分またはそれ
と実質的に同等な塩基配列を有することを特徴とする上
記〔４〕記載の核酸； 〔６〕 上記〔４〕または〔５〕記載の核酸を含有する
ことを特徴とするベクター； 〔７〕 上記〔４〕または〔５〕記載の核酸あるいは上
記〔６〕記載のベクターを含有することを特徴とする形
質転換体； 〔８〕 宿主細胞が大腸菌、酵母、CHO 細胞およびCOS
細胞からなる群から選ばれたものであることを特徴とす
る上記〔７〕記載の形質転換体；
〔９〕 上記〔８〕記載の形質転換体によって発現させ
て得たものであることを特徴とする上記〔１〕または
〔２〕記載のタンパク質；
て得たものであることを特徴とする上記〔１〕または
〔２〕記載のタンパク質；
【００１３】〔１０〕 次のものに対する抗体： (i) 上記〔１〕記載のタンパク質またはその塩、(ii)
上記〔２〕記載のタンパク質またはその塩、あるいは
(iii) 上記〔３〕記載のその部分ペプチドまたはその
塩； 〔１１〕 上記〔１〕または〔２〕記載のタンパク質ま
たはその塩と特異的に免疫反応する抗体を測定試薬とし
て用いることを特徴とする上記〔１〕または〔２〕記載
のタンパク質またはその塩の免疫学的測定方法； 〔１２〕 上記〔１〕または〔２〕記載のタンパク質ま
たはその塩と特異的に免疫反応する抗体を含むことを特
徴とする上記〔１〕または〔２〕記載のタンパク質また
はその塩の免疫学的測定試薬； 〔１３〕 上記〔１〕または〔２〕記載のタンパク質又
はその部分ペプチドをコードする塩基配列を有すること
を特徴とする、プロゼラチナーゼ A活性化能を有するヒ
ト膜結合型メタロプロテアーゼの一種であり且つMT1-MM
P, MT2-MMP,MT3-MMP, MT4-MMP以外のプロゼラチナーゼ
A活性化因子であるヒト膜結合型タンパク質遺伝子に対
するハイブリダイゼーションプローブ；
上記〔２〕記載のタンパク質またはその塩、あるいは
(iii) 上記〔３〕記載のその部分ペプチドまたはその
塩； 〔１１〕 上記〔１〕または〔２〕記載のタンパク質ま
たはその塩と特異的に免疫反応する抗体を測定試薬とし
て用いることを特徴とする上記〔１〕または〔２〕記載
のタンパク質またはその塩の免疫学的測定方法； 〔１２〕 上記〔１〕または〔２〕記載のタンパク質ま
たはその塩と特異的に免疫反応する抗体を含むことを特
徴とする上記〔１〕または〔２〕記載のタンパク質また
はその塩の免疫学的測定試薬； 〔１３〕 上記〔１〕または〔２〕記載のタンパク質又
はその部分ペプチドをコードする塩基配列を有すること
を特徴とする、プロゼラチナーゼ A活性化能を有するヒ
ト膜結合型メタロプロテアーゼの一種であり且つMT1-MM
P, MT2-MMP,MT3-MMP, MT4-MMP以外のプロゼラチナーゼ
A活性化因子であるヒト膜結合型タンパク質遺伝子に対
するハイブリダイゼーションプローブ；
【００１４】〔１４〕 配列表の配列番号:2又は9 で表
される塩基配列の全部又はその一部を含むことを特徴と
する、プロゼラチナーゼ A活性化能を有するヒト膜結合
型メタロプロテアーゼの一種であり且つMT1-MMP, MT2-M
MP, MT3-MMP, MT4-MMP以外のプロゼラチナーゼ A活性化
因子であるヒト膜結合型タンパク質遺伝子に対するハイ
ブリダイゼーションプローブ； 〔１５〕 上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一記載のタン
パク質、その一部のペプチドまたはそれらの塩；あるい
は上記〔４〕または〔５〕記載の核酸；あるいは上記
〔１０〕記載の抗体を含有していることを特徴とする医
薬； 〔１６〕 上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一記載のタン
パク質、その一部のペプチドまたはそれらの塩の生物学
的活性を促進または阻害する化合物またはその塩を含有
していることを特徴とする医薬；及び 〔１７〕 上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一記載のタン
パク質、その一部のペプチドまたはそれらの塩の生物学
的活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方
法およびスクリーニングキットを提供する。
される塩基配列の全部又はその一部を含むことを特徴と
する、プロゼラチナーゼ A活性化能を有するヒト膜結合
型メタロプロテアーゼの一種であり且つMT1-MMP, MT2-M
MP, MT3-MMP, MT4-MMP以外のプロゼラチナーゼ A活性化
因子であるヒト膜結合型タンパク質遺伝子に対するハイ
ブリダイゼーションプローブ； 〔１５〕 上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一記載のタン
パク質、その一部のペプチドまたはそれらの塩；あるい
は上記〔４〕または〔５〕記載の核酸；あるいは上記
〔１０〕記載の抗体を含有していることを特徴とする医
薬； 〔１６〕 上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一記載のタン
パク質、その一部のペプチドまたはそれらの塩の生物学
的活性を促進または阻害する化合物またはその塩を含有
していることを特徴とする医薬；及び 〔１７〕 上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一記載のタン
パク質、その一部のペプチドまたはそれらの塩の生物学
的活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方
法およびスクリーニングキットを提供する。
【００１５】さらに、別の態様に従えば、本発明は、 〔１８〕 配列表の配列番号:1で表されるアミノ酸配列
のうち、第156 番目〜第327 番目のアミノ酸配列を有す
るもの、同第80番目〜第327 番目のアミノ酸配列を有す
るもの、同第1 番目〜第327 番目のアミノ酸配列を有す
るもの、同第156 番目〜第569 番目のアミノ酸配列を有
するもの、同第80番目〜第569 番目のアミノ酸配列を有
するもの、同第１番目〜第569 番目のアミノ酸配列を有
するもの、及びそれらのいずれか一つと実質的に同等の
アミノ酸配列を有するものからなる群から選ばれたアミ
ノ酸配列を少なくとも一つ含有するタンパク質であり且
つ膜貫通と細胞内領域を含む領域を欠いている可溶性タ
ンパク質であることを特徴とする上記〔１〕または
〔２〕記載のタンパク質またはその塩； 〔１９〕 天然のヒトMT5-MMP またはその塩であるか、
それと実質的に同等なマトリックスメタロプロテアーゼ
活性（あるいは、プロゼラチナーゼ A活性化能）または
抗原活性を有するものか、あるいはそれと実質的に同等
の一次構造コンフォメーションを持つものであることを
特徴とする上記〔１〕、〔２〕または〔１８〕記載のタ
ンパク質若しくはその塩またはその一部；
のうち、第156 番目〜第327 番目のアミノ酸配列を有す
るもの、同第80番目〜第327 番目のアミノ酸配列を有す
るもの、同第1 番目〜第327 番目のアミノ酸配列を有す
るもの、同第156 番目〜第569 番目のアミノ酸配列を有
するもの、同第80番目〜第569 番目のアミノ酸配列を有
するもの、同第１番目〜第569 番目のアミノ酸配列を有
するもの、及びそれらのいずれか一つと実質的に同等の
アミノ酸配列を有するものからなる群から選ばれたアミ
ノ酸配列を少なくとも一つ含有するタンパク質であり且
つ膜貫通と細胞内領域を含む領域を欠いている可溶性タ
ンパク質であることを特徴とする上記〔１〕または
〔２〕記載のタンパク質またはその塩； 〔１９〕 天然のヒトMT5-MMP またはその塩であるか、
それと実質的に同等なマトリックスメタロプロテアーゼ
活性（あるいは、プロゼラチナーゼ A活性化能）または
抗原活性を有するものか、あるいはそれと実質的に同等
の一次構造コンフォメーションを持つものであることを
特徴とする上記〔１〕、〔２〕または〔１８〕記載のタ
ンパク質若しくはその塩またはその一部；
【００１６】〔２０〕 配列表の配列番号:1で表される
アミノ酸配列のうち、第156 番目〜第327 番目のアミノ
酸配列を有するもの、同第80番目〜第327 番目のアミノ
酸配列を有するもの、同第1 番目〜第327 番目のアミノ
酸配列を有するもの、同第156 番目〜第569 番目のアミ
ノ酸配列を有するもの、同第80番目〜第569 番目のアミ
ノ酸配列を有するもの、同第１番目〜第569 番目のアミ
ノ酸配列を有するもの、第156 番目〜第645 番目のアミ
ノ酸配列を有するもの、同第80番目〜第645番目のアミ
ノ酸配列を有するもの、及び同第１番目〜第645 番目の
アミノ酸配列を有するものからなる群から選ばれたアミ
ノ酸配列に対し、40% より高い相同性、さらには64% よ
り高い相同性、好ましくは80% 以上の相同性、より好ま
しくは90% 以上の相同性、さらにより好ましくは95% 以
上の相同性、もっと好ましくは97% 以上の相同性、さら
にもっと好ましくは99% 以上の相同性を有するものであ
ることを特徴とする上記〔１〕記載のタンパク質若しく
はその塩またはその一部； 〔２１〕 配列表の配列番号:1で表されるアミノ酸配列
のうち、第156 番目〜第327 番目のアミノ酸配列を有す
るもの、同第80番目〜第327 番目のアミノ酸配列を有す
るもの、同第1 番目〜第327 番目のアミノ酸配列を有す
るもの、同第156 番目〜第569 番目のアミノ酸配列を有
するもの、同第80番目〜第569 番目のアミノ酸配列を有
するもの、同第１番目〜第569 番目のアミノ酸配列を有
するもの、第156 番目〜第645 番目のアミノ酸配列を有
するもの、同第80番目〜第645番目のアミノ酸配列を有
するもの、及び同第１番目〜第645 番目のアミノ酸配列
を有するものからなる群から選ばれたアミノ酸配列を有
するプロゼラチナーゼ A活性化能を有する新規ヒト膜結
合型メタロプロテアーゼタンパク質、あるいは該タンパ
ク質に特有なアミノ酸残基が１個以上（例えば、１〜73
個、好ましくは１〜60個、さらに好ましくは１〜40個、
さらに好ましくは１〜20個、特には１〜10個など）欠け
ている欠失類縁体、該ヒト膜結合型メタロプロテアーゼ
に特有のアミノ酸残基の１個以上（例えば、１〜73個、
好ましくは１〜60個、さらに好ましくは１〜40個、さら
に好ましくは１〜20個、特には１〜10個など）が他の残
基で置換されている置換類縁体、及び１個以上（例え
ば、１〜80個、好ましくは１〜60個、さらに好ましくは
１〜40個、さらに好ましくは１〜20個、特には１〜10個
など）のアミノ酸残基が付加されている付加類縁体から
なる群から選ばれたものであることを特徴とする上記
〔１〕記載のタンパク質若しくはその塩またはその一
部；
アミノ酸配列のうち、第156 番目〜第327 番目のアミノ
酸配列を有するもの、同第80番目〜第327 番目のアミノ
酸配列を有するもの、同第1 番目〜第327 番目のアミノ
酸配列を有するもの、同第156 番目〜第569 番目のアミ
ノ酸配列を有するもの、同第80番目〜第569 番目のアミ
ノ酸配列を有するもの、同第１番目〜第569 番目のアミ
ノ酸配列を有するもの、第156 番目〜第645 番目のアミ
ノ酸配列を有するもの、同第80番目〜第645番目のアミ
ノ酸配列を有するもの、及び同第１番目〜第645 番目の
アミノ酸配列を有するものからなる群から選ばれたアミ
ノ酸配列に対し、40% より高い相同性、さらには64% よ
り高い相同性、好ましくは80% 以上の相同性、より好ま
しくは90% 以上の相同性、さらにより好ましくは95% 以
上の相同性、もっと好ましくは97% 以上の相同性、さら
にもっと好ましくは99% 以上の相同性を有するものであ
ることを特徴とする上記〔１〕記載のタンパク質若しく
はその塩またはその一部； 〔２１〕 配列表の配列番号:1で表されるアミノ酸配列
のうち、第156 番目〜第327 番目のアミノ酸配列を有す
るもの、同第80番目〜第327 番目のアミノ酸配列を有す
るもの、同第1 番目〜第327 番目のアミノ酸配列を有す
るもの、同第156 番目〜第569 番目のアミノ酸配列を有
するもの、同第80番目〜第569 番目のアミノ酸配列を有
するもの、同第１番目〜第569 番目のアミノ酸配列を有
するもの、第156 番目〜第645 番目のアミノ酸配列を有
するもの、同第80番目〜第645番目のアミノ酸配列を有
するもの、及び同第１番目〜第645 番目のアミノ酸配列
を有するものからなる群から選ばれたアミノ酸配列を有
するプロゼラチナーゼ A活性化能を有する新規ヒト膜結
合型メタロプロテアーゼタンパク質、あるいは該タンパ
ク質に特有なアミノ酸残基が１個以上（例えば、１〜73
個、好ましくは１〜60個、さらに好ましくは１〜40個、
さらに好ましくは１〜20個、特には１〜10個など）欠け
ている欠失類縁体、該ヒト膜結合型メタロプロテアーゼ
に特有のアミノ酸残基の１個以上（例えば、１〜73個、
好ましくは１〜60個、さらに好ましくは１〜40個、さら
に好ましくは１〜20個、特には１〜10個など）が他の残
基で置換されている置換類縁体、及び１個以上（例え
ば、１〜80個、好ましくは１〜60個、さらに好ましくは
１〜40個、さらに好ましくは１〜20個、特には１〜10個
など）のアミノ酸残基が付加されている付加類縁体から
なる群から選ばれたものであることを特徴とする上記
〔１〕記載のタンパク質若しくはその塩またはその一
部；
【００１７】〔２２〕 上記〔１８〕〜〔２１〕のいず
れか一記載のタンパク質をコードする塩基配列を有する
ことを特徴とする核酸； 〔２３〕 配列表の配列番号:2で表される塩基配列と少
なくとも40% の相同性を持つ配列；配列表の配列番号:2
で表される塩基配列と少なくとも50% の相同性を持つ配
列；配列表の配列番号:2で表される塩基配列と少なくと
も64% の相同性を持つ配列；配列表の配列番号:2で表さ
れる塩基配列と少なくとも70% の相同性を持つ配列；配
列表の配列番号:2で表される塩基配列と少なくとも80%
の相同性を持つ配列；配列表の配列番号:2で表される塩
基配列と少なくとも85% の相同性を持つ配列；配列表の
配列番号:2で表される塩基配列と少なくとも90% の相同
性を持つ配列；配列表の配列番号:2で表される塩基配列
と少なくとも95% の相同性を持つ配列；配列表の配列番
号:2で表される塩基配列と少なくとも97% の相同性を持
つ配列；配列表の配列番号:2で表される塩基配列と少な
くとも98% の相同性を持つ配列；及び配列表の配列番
号:2で表される塩基配列と少なくとも99% の相同性を持
つ配列；からなる群から選ばれた領域を有してなること
を特徴とする核酸； 〔２４〕 上記〔２２〕又は〔２３〕記載の核酸を含有
することを特徴とするベクター；
れか一記載のタンパク質をコードする塩基配列を有する
ことを特徴とする核酸； 〔２３〕 配列表の配列番号:2で表される塩基配列と少
なくとも40% の相同性を持つ配列；配列表の配列番号:2
で表される塩基配列と少なくとも50% の相同性を持つ配
列；配列表の配列番号:2で表される塩基配列と少なくと
も64% の相同性を持つ配列；配列表の配列番号:2で表さ
れる塩基配列と少なくとも70% の相同性を持つ配列；配
列表の配列番号:2で表される塩基配列と少なくとも80%
の相同性を持つ配列；配列表の配列番号:2で表される塩
基配列と少なくとも85% の相同性を持つ配列；配列表の
配列番号:2で表される塩基配列と少なくとも90% の相同
性を持つ配列；配列表の配列番号:2で表される塩基配列
と少なくとも95% の相同性を持つ配列；配列表の配列番
号:2で表される塩基配列と少なくとも97% の相同性を持
つ配列；配列表の配列番号:2で表される塩基配列と少な
くとも98% の相同性を持つ配列；及び配列表の配列番
号:2で表される塩基配列と少なくとも99% の相同性を持
つ配列；からなる群から選ばれた領域を有してなること
を特徴とする核酸； 〔２４〕 上記〔２２〕又は〔２３〕記載の核酸を含有
することを特徴とするベクター；
【００１８】〔２５〕 上記〔２２〕又は〔２３〕記載
の核酸又は上記〔２４〕記載のベクターを含有すること
を特徴とする形質転換体； 〔２６〕 宿主細胞が大腸菌、酵母、CHO 細胞およびCO
S 細胞からなる群から選ばれたものであることを特徴と
する上記〔２５〕記載の形質転換体； 〔２７〕 上記〔２６〕記載の形質転換体によって発現
させて得たものであることを特徴とする上記〔１８〕〜
〔２１〕のいずれか一記載のタンパク質； 〔２８〕 配列表の配列番号：２で表される塩基配列の
うち、少なくともその一部を含有し、ストリンジェント
な条件下で、ヒトMT1-MMP 、MT2-MMP 、MT3-MMP 及び M
T4-MMP遺伝子とはハイブリダイズしないが、ヒトMT5-MM
P 遺伝子とはハイブリダイズすることのできる塩基配列
を含有していることを特徴とする標識化されていてよい
ハイブリダイゼーションプローブ； 〔２９〕 試料中のヒト由来のMT5-MMP をコードする核
酸の測定法であって、(i) ヒト由来のMT5-MMP をコード
する核酸に対して特異的なプローブを、該核酸と特異的
にハイブリダイズするのに有効な条件下に、試料とハイ
ブリッド形成処理せしめ、(ii)該試料中の核酸に対する
該プローブのハイブリダイゼーションを測定する工程か
らなり、且つ該プローブは配列表の配列番号：2 で表さ
れる塩基配列と少なくとも40% の相同性を持つ10個又は
それ以上の塩基対の領域の配列を有することを特徴とす
る測定法；
の核酸又は上記〔２４〕記載のベクターを含有すること
を特徴とする形質転換体； 〔２６〕 宿主細胞が大腸菌、酵母、CHO 細胞およびCO
S 細胞からなる群から選ばれたものであることを特徴と
する上記〔２５〕記載の形質転換体； 〔２７〕 上記〔２６〕記載の形質転換体によって発現
させて得たものであることを特徴とする上記〔１８〕〜
〔２１〕のいずれか一記載のタンパク質； 〔２８〕 配列表の配列番号：２で表される塩基配列の
うち、少なくともその一部を含有し、ストリンジェント
な条件下で、ヒトMT1-MMP 、MT2-MMP 、MT3-MMP 及び M
T4-MMP遺伝子とはハイブリダイズしないが、ヒトMT5-MM
P 遺伝子とはハイブリダイズすることのできる塩基配列
を含有していることを特徴とする標識化されていてよい
ハイブリダイゼーションプローブ； 〔２９〕 試料中のヒト由来のMT5-MMP をコードする核
酸の測定法であって、(i) ヒト由来のMT5-MMP をコード
する核酸に対して特異的なプローブを、該核酸と特異的
にハイブリダイズするのに有効な条件下に、試料とハイ
ブリッド形成処理せしめ、(ii)該試料中の核酸に対する
該プローブのハイブリダイゼーションを測定する工程か
らなり、且つ該プローブは配列表の配列番号：2 で表さ
れる塩基配列と少なくとも40% の相同性を持つ10個又は
それ以上の塩基対の領域の配列を有することを特徴とす
る測定法；
【００１９】〔３０〕 固相化されたモノクローナル抗
体であることを特徴とする上記〔１０〕記載の抗体； 〔３１〕 標識化されたモノクローナル抗体であること
を特徴とする上記〔１０〕記載の抗体； 〔３２〕 酵素で標識化されたものであることを特徴と
する上記〔１０〕記載の抗体； 〔３３〕 モノクローナル抗体のFab'を標識化されたも
のであることを特徴とする上記〔１０〕記載の抗体； 〔３４〕 上記〔１〕または〔２〕記載のタンパク質の
メタロプロテアーゼ活性、プロゼラチナーゼ A活性化能
あるいは抗原性などの生物学的活性を阻害する方法；及
び 〔３５〕 阻害剤が、ペプチド、タンパク質、非ペプチ
ド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植
物抽出液、動物組織抽出液及び抗体、例えば、モノクロ
ーナル抗体からなる群から選ばれたものであることを特
徴とする上記〔３４〕記載の方法を提供する。
体であることを特徴とする上記〔１０〕記載の抗体； 〔３１〕 標識化されたモノクローナル抗体であること
を特徴とする上記〔１０〕記載の抗体； 〔３２〕 酵素で標識化されたものであることを特徴と
する上記〔１０〕記載の抗体； 〔３３〕 モノクローナル抗体のFab'を標識化されたも
のであることを特徴とする上記〔１０〕記載の抗体； 〔３４〕 上記〔１〕または〔２〕記載のタンパク質の
メタロプロテアーゼ活性、プロゼラチナーゼ A活性化能
あるいは抗原性などの生物学的活性を阻害する方法；及
び 〔３５〕 阻害剤が、ペプチド、タンパク質、非ペプチ
ド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植
物抽出液、動物組織抽出液及び抗体、例えば、モノクロ
ーナル抗体からなる群から選ばれたものであることを特
徴とする上記〔３４〕記載の方法を提供する。
【００２０】また、別の態様に従えば、本発明は、 〔３６〕 上記〔１〕〜〔３〕及び〔１８〕〜〔２１〕
のいずれか一記載のタンパク質、その一部のペプチド及
びそれらの塩からなる群から選ばれたものを使用するこ
とを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕及び〔１８〕〜〔２
１〕のいずれか一記載のタンパク質、その一部のペプチ
ドまたはそれらの塩の生物学的活性を促進または阻害す
る化合物のスクリーニング方法； 〔３７〕 上記〔１〕〜〔３〕及び〔１８〕〜〔２１〕
のいずれか一記載のタンパク質、その一部のペプチドま
たはそれらの塩の生物学的活性を促進または阻害する化
合物のスクリーニング方法であって、(i) 上記〔１〕〜
〔３〕及び〔１８〕〜〔２１〕のいずれか一記載のタン
パク質、その一部のペプチドまたはそれらの塩に基質を
接触させた場合と、(ii)上記〔１〕〜〔３〕及び〔１
８〕〜〔２１〕のいずれか一記載のタンパク質、その一
部のペプチドまたはそれらの塩に基質及び試験化合物を
接触させた場合との比較を行うことを特徴とするスクリ
ーニング方法；
のいずれか一記載のタンパク質、その一部のペプチド及
びそれらの塩からなる群から選ばれたものを使用するこ
とを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕及び〔１８〕〜〔２
１〕のいずれか一記載のタンパク質、その一部のペプチ
ドまたはそれらの塩の生物学的活性を促進または阻害す
る化合物のスクリーニング方法； 〔３７〕 上記〔１〕〜〔３〕及び〔１８〕〜〔２１〕
のいずれか一記載のタンパク質、その一部のペプチドま
たはそれらの塩の生物学的活性を促進または阻害する化
合物のスクリーニング方法であって、(i) 上記〔１〕〜
〔３〕及び〔１８〕〜〔２１〕のいずれか一記載のタン
パク質、その一部のペプチドまたはそれらの塩に基質を
接触させた場合と、(ii)上記〔１〕〜〔３〕及び〔１
８〕〜〔２１〕のいずれか一記載のタンパク質、その一
部のペプチドまたはそれらの塩に基質及び試験化合物を
接触させた場合との比較を行うことを特徴とするスクリ
ーニング方法；
【００２１】〔３８〕 上記〔１〕〜〔３〕及び〔１
８〕〜〔２１〕のいずれか一記載のタンパク質、その一
部のペプチド及びそれらの塩からなる群から選ばれたも
のを含有することを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕及び
〔１８〕〜〔２１〕のいずれか一記載のタンパク質、そ
の一部のペプチドまたはそれらの塩の生物学的活性を促
進または阻害する化合物のスクリーニングキット； 〔３９〕 (i) 上記〔１７〕、〔３６〕または〔３７〕
記載のスクリーニング方法または(ii)上記〔17〕または
〔３８〕記載のスクリーニングキットを用いて得られる
ことを特徴とする、上記〔１〕〜〔３〕及び〔１８〕〜
〔２１〕のいずれか一記載のタンパク質、その一部のペ
プチドまたはそれらの塩の生物学的活性を促進または阻
害する化合物またはその塩；及び 〔４０〕 (i) 上記〔１７〕、〔３６〕または〔３７〕
記載のスクリーニング方法または(ii)上記〔１７〕また
は〔３８〕記載のスクリーニングキットを用いて得られ
る、上記〔１〕〜〔３〕及び〔１８〕〜〔２１〕のいず
れか一記載のタンパク質、その一部のペプチドまたはそ
れらの塩の生物学的活性を促進または阻害する化合物ま
たはその塩を含有していることを特徴とする医薬を提供
する。
８〕〜〔２１〕のいずれか一記載のタンパク質、その一
部のペプチド及びそれらの塩からなる群から選ばれたも
のを含有することを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕及び
〔１８〕〜〔２１〕のいずれか一記載のタンパク質、そ
の一部のペプチドまたはそれらの塩の生物学的活性を促
進または阻害する化合物のスクリーニングキット； 〔３９〕 (i) 上記〔１７〕、〔３６〕または〔３７〕
記載のスクリーニング方法または(ii)上記〔17〕または
〔３８〕記載のスクリーニングキットを用いて得られる
ことを特徴とする、上記〔１〕〜〔３〕及び〔１８〕〜
〔２１〕のいずれか一記載のタンパク質、その一部のペ
プチドまたはそれらの塩の生物学的活性を促進または阻
害する化合物またはその塩；及び 〔４０〕 (i) 上記〔１７〕、〔３６〕または〔３７〕
記載のスクリーニング方法または(ii)上記〔１７〕また
は〔３８〕記載のスクリーニングキットを用いて得られ
る、上記〔１〕〜〔３〕及び〔１８〕〜〔２１〕のいず
れか一記載のタンパク質、その一部のペプチドまたはそ
れらの塩の生物学的活性を促進または阻害する化合物ま
たはその塩を含有していることを特徴とする医薬を提供
する。
【００２２】さらに、別の態様に従えば、本発明は、 〔４１〕 上記〔１〕又は〔２〕記載のタンパク質また
はその塩と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を
測定試薬として用いることを特徴とする上記〔１〕又は
〔２〕のタンパク質またはその塩の免疫学的測定方法； 〔４２〕 上記〔１〕又は〔２〕記載のタンパク質また
はその塩と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を
含むことを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕記載のタン
パク質またはその塩の免疫学的測定試薬； 〔４３〕 上記〔１０〕記載の抗体であって、(i) 固相
化されたものと (ii) 標識化されたものとの少なくとも
二種を用いることを特徴とする上記〔１１〕記載の方
法； 〔４４〕 上記〔１〕又は〔２〕記載のタンパク質また
はその塩を定量的に測定することを特徴とする上記〔４
３〕記載の方法； 〔４５〕 測定検体が、血液、血清、血漿、関節液、
尿、唾液、脳脊髄液、羊水、組織抽出液、培養細胞抽出
液及び細胞培養上清からなる群から選ばれたものである
ことを特徴とする上記〔４３〕又は〔４４〕記載の方
法；
はその塩と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を
測定試薬として用いることを特徴とする上記〔１〕又は
〔２〕のタンパク質またはその塩の免疫学的測定方法； 〔４２〕 上記〔１〕又は〔２〕記載のタンパク質また
はその塩と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を
含むことを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕記載のタン
パク質またはその塩の免疫学的測定試薬； 〔４３〕 上記〔１０〕記載の抗体であって、(i) 固相
化されたものと (ii) 標識化されたものとの少なくとも
二種を用いることを特徴とする上記〔１１〕記載の方
法； 〔４４〕 上記〔１〕又は〔２〕記載のタンパク質また
はその塩を定量的に測定することを特徴とする上記〔４
３〕記載の方法； 〔４５〕 測定検体が、血液、血清、血漿、関節液、
尿、唾液、脳脊髄液、羊水、組織抽出液、培養細胞抽出
液及び細胞培養上清からなる群から選ばれたものである
ことを特徴とする上記〔４３〕又は〔４４〕記載の方
法；
【００２３】〔４６〕 上記〔４３〕〜〔４５〕のいず
れか一記載の方法に用いられるものであって、(i) 上記
〔１０〕記載の抗体であり且つ固相化されたものを含有
する試薬と (ii) 上記〔１０〕記載の抗体であり且つ標
識化されたものを含有する試薬との少なくとも二種の試
薬を有するヒトMT5-MMP 測定用試薬セット； 〔４７〕 (a) 上記〔１〕又は〔２〕記載のタンパク質
またはその塩及び(b) その部分ペプチドまたはその塩か
らなる群から選ばれたものに対するモノクローナル抗体
を産生し、且つ(a) 上記〔１〕又は〔２〕記載のタンパ
ク質またはその塩及び(b) その部分ペプチドまたはその
塩からなる群から選ばれたもので免疫したマウスなどの
動物の脾臓細胞とマウスなどの動物のミエローマ細胞な
どの永代培養可能な細胞との細胞融合によって得られる
ことを特徴とするハイブリドーマ；及び 〔４８〕 (a) 上記〔１〕又は〔２〕記載のタンパク質
またはその塩及び(b) その部分ペプチドまたはその塩か
らなる群から選ばれたもので免疫したマウスなどの動物
の脾臓細胞とマウスなどの動物のミエローマ細胞などの
永代培養可能な細胞とを細胞融合せしめ、(a) 上記
〔１〕又は〔２〕記載のタンパク質またはその塩及び
(b) その部分ペプチドまたはその塩からなる群から選ば
れたものに対するモノクローナル抗体を産生する永代培
養可能な細胞を選択することを特徴とする上記〔４７〕
記載のハイブリドーマの作製法を提供する。
れか一記載の方法に用いられるものであって、(i) 上記
〔１０〕記載の抗体であり且つ固相化されたものを含有
する試薬と (ii) 上記〔１０〕記載の抗体であり且つ標
識化されたものを含有する試薬との少なくとも二種の試
薬を有するヒトMT5-MMP 測定用試薬セット； 〔４７〕 (a) 上記〔１〕又は〔２〕記載のタンパク質
またはその塩及び(b) その部分ペプチドまたはその塩か
らなる群から選ばれたものに対するモノクローナル抗体
を産生し、且つ(a) 上記〔１〕又は〔２〕記載のタンパ
ク質またはその塩及び(b) その部分ペプチドまたはその
塩からなる群から選ばれたもので免疫したマウスなどの
動物の脾臓細胞とマウスなどの動物のミエローマ細胞な
どの永代培養可能な細胞との細胞融合によって得られる
ことを特徴とするハイブリドーマ；及び 〔４８〕 (a) 上記〔１〕又は〔２〕記載のタンパク質
またはその塩及び(b) その部分ペプチドまたはその塩か
らなる群から選ばれたもので免疫したマウスなどの動物
の脾臓細胞とマウスなどの動物のミエローマ細胞などの
永代培養可能な細胞とを細胞融合せしめ、(a) 上記
〔１〕又は〔２〕記載のタンパク質またはその塩及び
(b) その部分ペプチドまたはその塩からなる群から選ば
れたものに対するモノクローナル抗体を産生する永代培
養可能な細胞を選択することを特徴とする上記〔４７〕
記載のハイブリドーマの作製法を提供する。
【００２４】さらに、別の態様に従えば、本発明は、 〔４９〕 配列番号:2で表される塩基配列とストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する
ことを特徴とする核酸; 〔５０〕 上記〔４９〕記載の核酸を含有することを特
徴とするベクター； 〔５１〕 上記〔５０〕記載のベクターを含有すること
を特徴とする形質転換体； 〔５２〕 上記〔５１〕記載の形質転換体を発現させる
ことによって得たものであることを特徴とするタンパク
質又はその塩； 〔５３〕 核酸が DNAであることを特徴とする、上記
〔４〕、〔５〕、〔２２〕、〔２３〕及び〔４９〕のい
ずれか一記載の核酸; 〔５４〕 上記〔７〕、〔８〕、〔２５〕、〔２６〕又
は〔５１〕記載の形質転換体を培養し、(a) 上記〔１〕
又は〔２〕記載のタンパク質またはその塩及び(b) その
部分ペプチドまたはその塩からなる群から選ばれたもの
を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする
該生成物の製造方法;
ェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する
ことを特徴とする核酸; 〔５０〕 上記〔４９〕記載の核酸を含有することを特
徴とするベクター； 〔５１〕 上記〔５０〕記載のベクターを含有すること
を特徴とする形質転換体； 〔５２〕 上記〔５１〕記載の形質転換体を発現させる
ことによって得たものであることを特徴とするタンパク
質又はその塩； 〔５３〕 核酸が DNAであることを特徴とする、上記
〔４〕、〔５〕、〔２２〕、〔２３〕及び〔４９〕のい
ずれか一記載の核酸; 〔５４〕 上記〔７〕、〔８〕、〔２５〕、〔２６〕又
は〔５１〕記載の形質転換体を培養し、(a) 上記〔１〕
又は〔２〕記載のタンパク質またはその塩及び(b) その
部分ペプチドまたはその塩からなる群から選ばれたもの
を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする
該生成物の製造方法;
【００２５】〔５５〕 (i) 上記〔１７〕、〔３６〕又
は〔３７〕記載のスクリーニング方法または(ii)上記
〔１７〕又は〔３８〕記載のスクリーニングキットを用
いて得られることを特徴とする、上記〔１〕〜〔３〕の
いずれか一記載のタンパク質、その一部のペプチドまた
はそれらの塩の生物学的活性を促進する化合物またはそ
の塩； 〔５６〕 (i) 上記〔１７〕、〔３６〕又は〔３７〕記
載のスクリーニング方法または(ii)上記〔１７〕又は
〔３８〕記載のスクリーニングキットを用いて得られる
ことを特徴とする、上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一記
載のタンパク質、その一部のペプチドまたはそれらの塩
の生物学的活性を阻害する化合物またはその塩； 〔５７〕 上記〔１７〕記載の生物学的活性がプロテア
ーゼ活性であることを特徴とする上記〔１７〕記載のス
クリーニング方法； 〔５８〕 上記〔１７〕記載の生物学的活性がプロテア
ーゼ活性であることを特徴とする上記〔１７〕記載のス
クリーニングキット；
は〔３７〕記載のスクリーニング方法または(ii)上記
〔１７〕又は〔３８〕記載のスクリーニングキットを用
いて得られることを特徴とする、上記〔１〕〜〔３〕の
いずれか一記載のタンパク質、その一部のペプチドまた
はそれらの塩の生物学的活性を促進する化合物またはそ
の塩； 〔５６〕 (i) 上記〔１７〕、〔３６〕又は〔３７〕記
載のスクリーニング方法または(ii)上記〔１７〕又は
〔３８〕記載のスクリーニングキットを用いて得られる
ことを特徴とする、上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一記
載のタンパク質、その一部のペプチドまたはそれらの塩
の生物学的活性を阻害する化合物またはその塩； 〔５７〕 上記〔１７〕記載の生物学的活性がプロテア
ーゼ活性であることを特徴とする上記〔１７〕記載のス
クリーニング方法； 〔５８〕 上記〔１７〕記載の生物学的活性がプロテア
ーゼ活性であることを特徴とする上記〔１７〕記載のス
クリーニングキット；
【００２６】〔５９〕 上記〔３９〕記載の生物学的活
性がプロテアーゼ活性であることを特徴とする上記〔３
９〕記載の化合物またはその塩； 〔６０〕 上記〔１６〕記載の生物学的活性がプロテア
ーゼ活性であることを特徴とする上記〔１６〕記載の医
薬； 〔６１〕 上記〔１０〕記載の抗体と、被検試料及び標
識化された上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一記載のタン
パク質、その一部のペプチドまたはそれらの塩とを競合
的に反応させ、該抗体に結合した標識化された上記
〔１〕〜〔３〕のいずれか一記載のタンパク質、その一
部のペプチドまたはそれらの塩の割合を測定することを
特徴とする被検試料中の上記〔１〕〜〔３〕のいずれか
一記載のタンパク質、その一部のペプチドまたはそれら
の塩の定量方法；及び 〔６２〕 被検試料と担体上に不溶化した上記〔１０〕
記載の抗体及び標識化された上記〔１０〕記載の抗体と
を反応せしめ、不溶化担体上の標識あるいは不溶化担体
と結合しない標識を測定することを特徴とする被検試料
中の上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一記載のタンパク
質、その一部のペプチドまたはそれらの塩の定量方法を
提供する。
性がプロテアーゼ活性であることを特徴とする上記〔３
９〕記載の化合物またはその塩； 〔６０〕 上記〔１６〕記載の生物学的活性がプロテア
ーゼ活性であることを特徴とする上記〔１６〕記載の医
薬； 〔６１〕 上記〔１０〕記載の抗体と、被検試料及び標
識化された上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一記載のタン
パク質、その一部のペプチドまたはそれらの塩とを競合
的に反応させ、該抗体に結合した標識化された上記
〔１〕〜〔３〕のいずれか一記載のタンパク質、その一
部のペプチドまたはそれらの塩の割合を測定することを
特徴とする被検試料中の上記〔１〕〜〔３〕のいずれか
一記載のタンパク質、その一部のペプチドまたはそれら
の塩の定量方法；及び 〔６２〕 被検試料と担体上に不溶化した上記〔１０〕
記載の抗体及び標識化された上記〔１０〕記載の抗体と
を反応せしめ、不溶化担体上の標識あるいは不溶化担体
と結合しない標識を測定することを特徴とする被検試料
中の上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一記載のタンパク
質、その一部のペプチドまたはそれらの塩の定量方法を
提供する。
【００２７】本発明のその他の目的、特徴、優秀性及び
その有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明
白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実
施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ま
しい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されて
いるものであることを理解されたい。本明細書に開示し
た本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改
変（あるいは修飾）をなすことは、以下の記載及び本明
細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易
に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特
許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているも
ので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに
含めて解釈されるべきものである。本明細書において、
用語「及び／又は」とは、 (1)併合的接続関係と (2)選
択的接続関係の両方が存在することを意味しており、例
えば「治療及び／又は予防」の場合では (1)治療及び予
防並びに (2)治療又は予防の両方を包含する意味で使用
されている。その他においても用語「及び／又は」は同
様に (1)併合的接続関係と (2)選択的接続関係の両方を
包含する意味で使用されている。
その有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明
白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実
施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ま
しい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されて
いるものであることを理解されたい。本明細書に開示し
た本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改
変（あるいは修飾）をなすことは、以下の記載及び本明
細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易
に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特
許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているも
ので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに
含めて解釈されるべきものである。本明細書において、
用語「及び／又は」とは、 (1)併合的接続関係と (2)選
択的接続関係の両方が存在することを意味しており、例
えば「治療及び／又は予防」の場合では (1)治療及び予
防並びに (2)治療又は予防の両方を包含する意味で使用
されている。その他においても用語「及び／又は」は同
様に (1)併合的接続関係と (2)選択的接続関係の両方を
包含する意味で使用されている。
【００２８】
【発明の実施の形態】本発明に従い、プロゼラチナーゼ
A活性化能を有するヒト膜結合型メタロプロテアーゼの
一種であり且つMT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP 及びMT4-MM
P 以外のプロゼラチナーゼ A活性化因子である天然のヒ
ト膜結合型タンパク質MT-MMP（例えば、MT5-MMP ）若し
くは該膜結合型タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも
40％の相同性を有し且つメタロプロテアーゼ活性、プロ
ゼラチナーゼ A活性化能あるいは同等の抗原性を有する
ものであるタンパク質またはその塩、そのタンパク質の
特徴的な部分ペプチドまたはその塩、それらをコードす
る遺伝子、例えばDNA 、RNA など、その遺伝子を遺伝子
組換え技術で操作することが可能なように含有している
ベクターあるいはプラスミド、こうしたベクターなどで
形質転換された宿主細胞、さらにはその遺伝子を含有す
るトランスジェニックマウス等のトランスジェニック動
物、その遺伝子を特異的に欠失（欠損) するノックアウ
トマウス等のノックアウト動物、その宿主細胞を、培養
して該タンパク質またはその塩を製造する方法、こうし
て得られた該タンパク質またはその塩やそのタンパク質
の特徴的な部分ペプチドまたはその塩を用いて得られた
抗体、特にはモノクローナル抗体、その抗体を産生する
ハイブリドーマ細胞、該単離された遺伝子、例えばDNA
、RNA などをプローブとして用いたり、あるいは該抗
体を用いた測定・診断手段並びに試薬が提供される。さ
らには、本明細書で開示され説明されている活性成分の
利用を提供し、例えば、該活性成分を含有する医薬ある
いは試薬などが提供され、そうした活性成分を用いた疾
患、疾病あるいは異常な状態の治療及び／又は予防方
法、さらにはスクリーニング方法などが提供される。
A活性化能を有するヒト膜結合型メタロプロテアーゼの
一種であり且つMT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP 及びMT4-MM
P 以外のプロゼラチナーゼ A活性化因子である天然のヒ
ト膜結合型タンパク質MT-MMP（例えば、MT5-MMP ）若し
くは該膜結合型タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも
40％の相同性を有し且つメタロプロテアーゼ活性、プロ
ゼラチナーゼ A活性化能あるいは同等の抗原性を有する
ものであるタンパク質またはその塩、そのタンパク質の
特徴的な部分ペプチドまたはその塩、それらをコードす
る遺伝子、例えばDNA 、RNA など、その遺伝子を遺伝子
組換え技術で操作することが可能なように含有している
ベクターあるいはプラスミド、こうしたベクターなどで
形質転換された宿主細胞、さらにはその遺伝子を含有す
るトランスジェニックマウス等のトランスジェニック動
物、その遺伝子を特異的に欠失（欠損) するノックアウ
トマウス等のノックアウト動物、その宿主細胞を、培養
して該タンパク質またはその塩を製造する方法、こうし
て得られた該タンパク質またはその塩やそのタンパク質
の特徴的な部分ペプチドまたはその塩を用いて得られた
抗体、特にはモノクローナル抗体、その抗体を産生する
ハイブリドーマ細胞、該単離された遺伝子、例えばDNA
、RNA などをプローブとして用いたり、あるいは該抗
体を用いた測定・診断手段並びに試薬が提供される。さ
らには、本明細書で開示され説明されている活性成分の
利用を提供し、例えば、該活性成分を含有する医薬ある
いは試薬などが提供され、そうした活性成分を用いた疾
患、疾病あるいは異常な状態の治療及び／又は予防方
法、さらにはスクリーニング方法などが提供される。
【００２９】本発明のMT5-MMP としては、プロゼラチナ
ーゼ A活性化能を有するメタロプロテアーゼの一種であ
り且つMT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP, MT4-MMP以外のヒト
膜結合型タンパク質であり、かつ新規なアミノ酸配列を
有するものであればよい。より具体的には、本発明のヒ
トMT5-MMP としては、配列表の配列番号:1で表されるア
ミノ酸配列のうち、第156 番目〜第327 番目のアミノ酸
配列を有するもの、同第80番目〜第327 番目のアミノ酸
配列を有するもの、同第1 番目〜第327 番目のアミノ酸
配列を有するもの、同第156 番目〜第569 番目のアミノ
酸配列を有するもの、同第80番目〜第569 番目のアミノ
酸配列を有するもの、同第１番目〜第569 番目のアミノ
酸配列を有するもの、第156 番目〜第645 番目のアミノ
酸配列を有するもの、同第80番目〜第645 番目のアミノ
酸配列を有するもの、同第１番目〜第645 番目のアミノ
酸配列を有するもの、及びそれらのいずれか一つと少な
くとも40% より高い相同性、好ましくは64% 以上の相同
性、さらに好ましくは80%以上の相同性、また好ましく
は85% 以上の相同性、もっと好ましくは90% 以上の相同
性、より好ましくは95% 以上の相同性、特に好ましくは
97% 以上の相同性を有し且つメタロプロテアーゼ活性、
プロゼラチナーゼ A活性化能あるいは同等の抗原性など
といった実質的に同等の生物学的活性を有するアミノ酸
配列を有するものがすべて挙げられる。
ーゼ A活性化能を有するメタロプロテアーゼの一種であ
り且つMT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP, MT4-MMP以外のヒト
膜結合型タンパク質であり、かつ新規なアミノ酸配列を
有するものであればよい。より具体的には、本発明のヒ
トMT5-MMP としては、配列表の配列番号:1で表されるア
ミノ酸配列のうち、第156 番目〜第327 番目のアミノ酸
配列を有するもの、同第80番目〜第327 番目のアミノ酸
配列を有するもの、同第1 番目〜第327 番目のアミノ酸
配列を有するもの、同第156 番目〜第569 番目のアミノ
酸配列を有するもの、同第80番目〜第569 番目のアミノ
酸配列を有するもの、同第１番目〜第569 番目のアミノ
酸配列を有するもの、第156 番目〜第645 番目のアミノ
酸配列を有するもの、同第80番目〜第645 番目のアミノ
酸配列を有するもの、同第１番目〜第645 番目のアミノ
酸配列を有するもの、及びそれらのいずれか一つと少な
くとも40% より高い相同性、好ましくは64% 以上の相同
性、さらに好ましくは80%以上の相同性、また好ましく
は85% 以上の相同性、もっと好ましくは90% 以上の相同
性、より好ましくは95% 以上の相同性、特に好ましくは
97% 以上の相同性を有し且つメタロプロテアーゼ活性、
プロゼラチナーゼ A活性化能あるいは同等の抗原性など
といった実質的に同等の生物学的活性を有するアミノ酸
配列を有するものがすべて挙げられる。
【００３０】より好ましくは、本発明のヒトMT5-MMP と
しては、配列表の配列番号:1で表されるアミノ酸配列の
全部あるいは一部を含有するもの、それと実質的に同一
のアミノ酸配列を有するものがすべて挙げられる。さら
に本発明のMT5-MMP としては、プレプロ部分としてアミ
ノ酸番号155 位のArg までのアミノ酸配列の一部または
全部を有していてもよいし、C-末端側の疎水性膜貫通領
域と細胞内領域、例えば、アミノ酸番号570 位のAsn か
ら645 位のVal までのアミノ酸配列の一部または全部を
有していてもよいし、活性な触媒活性領域を含む部分と
して、例えば、アミノ酸番号156 位のTyr から569 位の
Cys までのアミノ酸配列の一部または全部を有していて
もよいし、アミノ酸番号156 位のTyr から645 位のVal
までのアミノ酸配列の一部または全部を有していてもよ
いし、アミノ酸番号89位のGly から645 位のVal までの
アミノ酸配列の一部または全部を有していてもよいし、
さらにアミノ酸番号87位のSer から391 位のArg までの
アミノ酸配列の一部または全部を有していてもよいし、
さらにそれらのいずれか一つと実質的に同等のアミノ酸
配列を有するもの、あるいはその塩であってよい。こう
した配列を有するものはすべて包含されてよい。
しては、配列表の配列番号:1で表されるアミノ酸配列の
全部あるいは一部を含有するもの、それと実質的に同一
のアミノ酸配列を有するものがすべて挙げられる。さら
に本発明のMT5-MMP としては、プレプロ部分としてアミ
ノ酸番号155 位のArg までのアミノ酸配列の一部または
全部を有していてもよいし、C-末端側の疎水性膜貫通領
域と細胞内領域、例えば、アミノ酸番号570 位のAsn か
ら645 位のVal までのアミノ酸配列の一部または全部を
有していてもよいし、活性な触媒活性領域を含む部分と
して、例えば、アミノ酸番号156 位のTyr から569 位の
Cys までのアミノ酸配列の一部または全部を有していて
もよいし、アミノ酸番号156 位のTyr から645 位のVal
までのアミノ酸配列の一部または全部を有していてもよ
いし、アミノ酸番号89位のGly から645 位のVal までの
アミノ酸配列の一部または全部を有していてもよいし、
さらにアミノ酸番号87位のSer から391 位のArg までの
アミノ酸配列の一部または全部を有していてもよいし、
さらにそれらのいずれか一つと実質的に同等のアミノ酸
配列を有するもの、あるいはその塩であってよい。こう
した配列を有するものはすべて包含されてよい。
【００３１】本明細書中、「相同性」とは、ポリペプチ
ド配列（あるいはアミノ酸配列）又はポリヌクレオチド
配列（あるいは塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖
を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同志の互
いの適合関係において同一であると決定できるようなも
のの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二
つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意
味するものである。相同性は容易に算出できる。二つの
ポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の相同性
を測定する方法は数多く知られており、「相同性」
（「同一性」とも言われる）なる用語は、当業者には周
知である (例えば、Lesk, A. M. (Ed.), Computational
Molecular Biology, Oxford University Press, New Y
ork, (1988);Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Info
rmatics and Genome Projects, Academic Press, New Y
ork, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.),
Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human
Press, New Jersey, (1994);von Heinje, G., Sequence
Analysis in Molecular Biology, Academic Press,New
York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.),
Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New Yo
rk, (1991) 等) 。二つの配列の相同性を測定するのに
用いる一般的な方法には、Martin, J. Bishop (Ed.), G
uide to Huge Computers, Academic Press, San Diego,
(1994); Carillo, H. & Lipman, D., SIAM J. Applied
Math., 48: 1073 (1988) 等に開示されているものが挙
げられるが、これらに限定されるものではない。相同性
を測定するための好ましい方法としては、試験する二つ
の配列間の最も大きな適合関係部分を得るように設計し
たものが挙げられる。このような方法は、コンピュータ
ープログラムとして組み立てられているものが挙げられ
る。二つの配列間の相同性を測定するための好ましいコ
ンピュータープログラム法としては、GCG プログラムパ
ッケージ (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Resea
rch, 12(1): 387 (1984)) 、BLASTP、BLASTN、FASTA (A
tschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403 (1
990)) 等が挙げられるが、これらに限定されるものでな
く、当該分野で公知の方法を使用することができる。
ド配列（あるいはアミノ酸配列）又はポリヌクレオチド
配列（あるいは塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖
を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同志の互
いの適合関係において同一であると決定できるようなも
のの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二
つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意
味するものである。相同性は容易に算出できる。二つの
ポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の相同性
を測定する方法は数多く知られており、「相同性」
（「同一性」とも言われる）なる用語は、当業者には周
知である (例えば、Lesk, A. M. (Ed.), Computational
Molecular Biology, Oxford University Press, New Y
ork, (1988);Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Info
rmatics and Genome Projects, Academic Press, New Y
ork, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.),
Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human
Press, New Jersey, (1994);von Heinje, G., Sequence
Analysis in Molecular Biology, Academic Press,New
York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.),
Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New Yo
rk, (1991) 等) 。二つの配列の相同性を測定するのに
用いる一般的な方法には、Martin, J. Bishop (Ed.), G
uide to Huge Computers, Academic Press, San Diego,
(1994); Carillo, H. & Lipman, D., SIAM J. Applied
Math., 48: 1073 (1988) 等に開示されているものが挙
げられるが、これらに限定されるものではない。相同性
を測定するための好ましい方法としては、試験する二つ
の配列間の最も大きな適合関係部分を得るように設計し
たものが挙げられる。このような方法は、コンピュータ
ープログラムとして組み立てられているものが挙げられ
る。二つの配列間の相同性を測定するための好ましいコ
ンピュータープログラム法としては、GCG プログラムパ
ッケージ (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Resea
rch, 12(1): 387 (1984)) 、BLASTP、BLASTN、FASTA (A
tschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403 (1
990)) 等が挙げられるが、これらに限定されるものでな
く、当該分野で公知の方法を使用することができる。
【００３２】本発明のヒトMT5-MMP をコードする遺伝子
は、代表的には配列表の配列番号:2又は9 で表される塩
基配列を含有するもの、及び配列表の配列番号:2又は9
で表される塩基配列の1-3 位のATG から1936-1938 位の
TGA より構成される塩基配列を含有するもの（1936-193
8 の終止コドンTGA は、TAA またはTAC であってもよ
い）であることができるし、配列表の配列番号:2又は9
で表される塩基配列の238 位から1938位の塩基配列を含
有するもの、配列表の配列番号:2又は9 で表される塩基
配列の466 位から1938位の塩基配列を含有するもの、配
列表の配列番号:2又は9 で表される塩基配列の466 位か
ら1707位の塩基配列を含有するもの、配列表の配列番
号:2又は9 で表される塩基配列の265 位から1707位の塩
基配列を含有するもの、配列表の配列番号:2又は9 で表
される塩基配列の265 位から1938位の塩基配列を含有す
るもの、配列表の配列番号:2又は9 で表される塩基配列
の259位から1173位の塩基配列を含有するもの、配列表
の配列番号:2又は9 で表される塩基配列の259 位から17
07位の塩基配列を含有するもの、それらの塩基配列に開
始コドン、例えば、Met をコードするコドンを付加した
もの、また、該塩基配列がコードするタンパク質と少な
くとも40％の相同性を有するアミノ酸配列を持ち且つメ
タロプロテアーゼ活性、プロゼラチナーゼ A活性化能あ
るいは同等の抗原性などのそれと実質的に同等の生物学
的活性を有するタンパク質をコードするといったそれと
同効の塩基配列を含有するものであれば如何なるもので
あってもよい。該MT5-MMP をコードする遺伝子は、一本
鎖DNA 、二本鎖DNA 、RNA 、DNA:RNA ハイブリッド、合
成DNA などの核酸であり、またヒトゲノムDNA 、ヒトジ
ェノミックDNA ライブラリー、ヒト組織・細胞由来のcD
NA、合成DNA のいずれであってもよい。該MT5-MMP をコ
ードする遺伝子の塩基配列は、修飾（例えば、付加、除
去、置換など）されることもでき、そうした修飾された
ものも包含されてよい。さらには、以下説明するよう
に、本発明の核酸は、本発明のタンパク質あるいはその
一部をコードするものであってよく、好ましいものとし
てはDNA が挙げられる。また上記「同効の塩基配列」と
は、例えばストリンジェントな条件で配列表の配列番
号:2又は9 で表される塩基配列とハイブリダイズするも
の、ヒトMT5-MMP と実質的に同等のアミノ酸配列をコー
ドするものなどが挙げられる。
は、代表的には配列表の配列番号:2又は9 で表される塩
基配列を含有するもの、及び配列表の配列番号:2又は9
で表される塩基配列の1-3 位のATG から1936-1938 位の
TGA より構成される塩基配列を含有するもの（1936-193
8 の終止コドンTGA は、TAA またはTAC であってもよ
い）であることができるし、配列表の配列番号:2又は9
で表される塩基配列の238 位から1938位の塩基配列を含
有するもの、配列表の配列番号:2又は9 で表される塩基
配列の466 位から1938位の塩基配列を含有するもの、配
列表の配列番号:2又は9 で表される塩基配列の466 位か
ら1707位の塩基配列を含有するもの、配列表の配列番
号:2又は9 で表される塩基配列の265 位から1707位の塩
基配列を含有するもの、配列表の配列番号:2又は9 で表
される塩基配列の265 位から1938位の塩基配列を含有す
るもの、配列表の配列番号:2又は9 で表される塩基配列
の259位から1173位の塩基配列を含有するもの、配列表
の配列番号:2又は9 で表される塩基配列の259 位から17
07位の塩基配列を含有するもの、それらの塩基配列に開
始コドン、例えば、Met をコードするコドンを付加した
もの、また、該塩基配列がコードするタンパク質と少な
くとも40％の相同性を有するアミノ酸配列を持ち且つメ
タロプロテアーゼ活性、プロゼラチナーゼ A活性化能あ
るいは同等の抗原性などのそれと実質的に同等の生物学
的活性を有するタンパク質をコードするといったそれと
同効の塩基配列を含有するものであれば如何なるもので
あってもよい。該MT5-MMP をコードする遺伝子は、一本
鎖DNA 、二本鎖DNA 、RNA 、DNA:RNA ハイブリッド、合
成DNA などの核酸であり、またヒトゲノムDNA 、ヒトジ
ェノミックDNA ライブラリー、ヒト組織・細胞由来のcD
NA、合成DNA のいずれであってもよい。該MT5-MMP をコ
ードする遺伝子の塩基配列は、修飾（例えば、付加、除
去、置換など）されることもでき、そうした修飾された
ものも包含されてよい。さらには、以下説明するよう
に、本発明の核酸は、本発明のタンパク質あるいはその
一部をコードするものであってよく、好ましいものとし
てはDNA が挙げられる。また上記「同効の塩基配列」と
は、例えばストリンジェントな条件で配列表の配列番
号:2又は9 で表される塩基配列とハイブリダイズするも
の、ヒトMT5-MMP と実質的に同等のアミノ酸配列をコー
ドするものなどが挙げられる。
【００３３】配列表の配列番号:2又は9 で表される塩基
配列またはそれと同効の塩基配列を含有する本発明のDN
A は、例えば以下に示す方法によって取得できる。な
お、遺伝子組換え技術は、例えば J. Sambrook, E. F.
Fritsch & T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Labor
atory Manual (2nd edition)", Cold SpringHarbor Lab
oratory Press, Cold Spring Harbor, New York (198
9); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd e
d., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series),
IRL Press, Oxford University Press (1995);日本生化
学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東
京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講
座２、核酸 III（組換えDNA 技術）」、東京化学同人
(1992); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 6
8 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (198
0); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology",Vol.
100 (Recombinant DNA, Part B) & 101 (Recombinant
DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R.
Wu et al. ed., "Methods in Enzymology",Vol. 153 (R
ecombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Par
t E) & 155(Recombinant DNA, Part F), Academic Pres
s, New York (1987); J. H. Millered., "Methods in E
nzymology", Vol. 204, Academic Press, New York (19
91); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vo
l. 218, Academic Press, New York (1993)などに記載
の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるい
はそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うこと
ができる (それらの中にある記載はそれを参照すること
により本明細書の開示に含められる) 。
配列またはそれと同効の塩基配列を含有する本発明のDN
A は、例えば以下に示す方法によって取得できる。な
お、遺伝子組換え技術は、例えば J. Sambrook, E. F.
Fritsch & T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Labor
atory Manual (2nd edition)", Cold SpringHarbor Lab
oratory Press, Cold Spring Harbor, New York (198
9); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd e
d., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series),
IRL Press, Oxford University Press (1995);日本生化
学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東
京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講
座２、核酸 III（組換えDNA 技術）」、東京化学同人
(1992); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 6
8 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (198
0); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology",Vol.
100 (Recombinant DNA, Part B) & 101 (Recombinant
DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R.
Wu et al. ed., "Methods in Enzymology",Vol. 153 (R
ecombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Par
t E) & 155(Recombinant DNA, Part F), Academic Pres
s, New York (1987); J. H. Millered., "Methods in E
nzymology", Vol. 204, Academic Press, New York (19
91); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vo
l. 218, Academic Press, New York (1993)などに記載
の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるい
はそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うこと
ができる (それらの中にある記載はそれを参照すること
により本明細書の開示に含められる) 。
【００３４】先ず、その全配列あるいは部分配列がクロ
ーニングされている既知のヒトメタロプロテアーゼファ
ミリー（より好ましくは膜結合型メタロプロテアーゼフ
ァミリーなど）のアミノ酸配列と有意の類似性を示す配
列を遺伝子データベースから検索により同定する。有意
の類似性を示す配列としては、好ましくは動物由来のcD
NA配列が挙げられ、より好ましくはヘモペキシンドメイ
ン領域と有意の類似性を示す配列を示すヒト由来のcDNA
配列（例えば、大脳cDNA由来配列など）が挙げられる。
こうして同定された配列に基づいて適切なプライマーを
設計・合成し、好ましくは同定された配列のオリジンで
ある動物由来のcDNAライブラリーを用い、目的の配列を
PCR 増幅する。得られたDNA 断片をプローブに種々のヒ
ト組織あるいは培養細胞等から構築されたヒトジェノミ
ック DNAライブラリーあるいはヒト由来cDNAライブラリ
ーをスクリーニングし、プローブにハイブリダイズする
クローンを選択し、該クローン中の DNAの挿入配列の塩
基配列を決定し、新規なヒト膜結合型メタロプロテアー
ゼ遺伝子配列を有するDNA 断片を決定・取得する。必要
に応じて該クローン中の DNAの挿入配列はサブクローニ
ングすることができる。塩基配列の決定は、ダイデオキ
シ法、例えば M13ダイデオキシ法など、Maxam-Gilbert
法などを用いて行うことができるが、市販のシークエン
シングキット、例えば Taqダイプライマーサイクルシー
クエンシングキット、Sequenase v 2.0 kit などを用い
たり、自動塩基配列決定装置、例えば蛍光DNA シーケン
サー装置などを用いて行うことが出来る。ダイデオキシ
法に用いられるポリメラーゼとしては、例えば、DNA ポ
リメラーゼ Iのクレノー・フラグメント、AMV 逆転写酵
素、Taq DNA ポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、修飾
T7 DNA ポリメラーゼなどが挙げられる。
ーニングされている既知のヒトメタロプロテアーゼファ
ミリー（より好ましくは膜結合型メタロプロテアーゼフ
ァミリーなど）のアミノ酸配列と有意の類似性を示す配
列を遺伝子データベースから検索により同定する。有意
の類似性を示す配列としては、好ましくは動物由来のcD
NA配列が挙げられ、より好ましくはヘモペキシンドメイ
ン領域と有意の類似性を示す配列を示すヒト由来のcDNA
配列（例えば、大脳cDNA由来配列など）が挙げられる。
こうして同定された配列に基づいて適切なプライマーを
設計・合成し、好ましくは同定された配列のオリジンで
ある動物由来のcDNAライブラリーを用い、目的の配列を
PCR 増幅する。得られたDNA 断片をプローブに種々のヒ
ト組織あるいは培養細胞等から構築されたヒトジェノミ
ック DNAライブラリーあるいはヒト由来cDNAライブラリ
ーをスクリーニングし、プローブにハイブリダイズする
クローンを選択し、該クローン中の DNAの挿入配列の塩
基配列を決定し、新規なヒト膜結合型メタロプロテアー
ゼ遺伝子配列を有するDNA 断片を決定・取得する。必要
に応じて該クローン中の DNAの挿入配列はサブクローニ
ングすることができる。塩基配列の決定は、ダイデオキ
シ法、例えば M13ダイデオキシ法など、Maxam-Gilbert
法などを用いて行うことができるが、市販のシークエン
シングキット、例えば Taqダイプライマーサイクルシー
クエンシングキット、Sequenase v 2.0 kit などを用い
たり、自動塩基配列決定装置、例えば蛍光DNA シーケン
サー装置などを用いて行うことが出来る。ダイデオキシ
法に用いられるポリメラーゼとしては、例えば、DNA ポ
リメラーゼ Iのクレノー・フラグメント、AMV 逆転写酵
素、Taq DNA ポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、修飾
T7 DNA ポリメラーゼなどが挙げられる。
【００３５】こうして解析された新規なヒト膜結合型メ
タロプロテアーゼ遺伝子を有していると考えられるDNA
配列を基に、該ヒト膜結合型メタロプロテアーゼをコー
ドする遺伝子を取得する。該解析された新規なヒト膜結
合型メタロプロテアーゼ遺伝子の有しているDNA 配列を
基にセンスプライマーとアンチセンスプライマーを合成
する。プライマーの作製は、当該分野で知られた方法で
行うことができ、例えば自動DNA 合成装置を用い、フォ
スフォジエステル法、フォスフォトリエステル法、フォ
スフォアミダイト法などにより合成できる。種々のヒト
由来の組織あるいは培養細胞（特には、ヒトの脳、腎
臓、膵臓、肺、胎盤、心臓、胸腺、精巣、腸などの組織
・細胞等、癌、腫瘍、あるいはそれらの株化細胞等）cD
NAライブラリーと前記のセンスプライマー及びアンチセ
ンスプライマーを用いてポリメラーゼ・チェイン・リア
クション(polymerase chain reaction: PCR)を行い、cD
NAを増幅する。また、当該遺伝子の取得には、上記のよ
うにして同定されたクローンから特異的なハイブリダイ
ゼーションプローブを調製し、ヒト由来DNA ライブラリ
ーをスクリーニングし、プローブにハイブリダイズする
クローンを選択することにより行うことができる。さら
に鋳型として用いるcDNAライブラリーは、下記のように
して調製したもの、あるいは市販の種々の組織由来cDNA
ライブラリーを直接使用することもでき、例えばStrata
gene, Invitrogen, Clontechなどから市販されたcDNAラ
イブラリーを用いることができる。
タロプロテアーゼ遺伝子を有していると考えられるDNA
配列を基に、該ヒト膜結合型メタロプロテアーゼをコー
ドする遺伝子を取得する。該解析された新規なヒト膜結
合型メタロプロテアーゼ遺伝子の有しているDNA 配列を
基にセンスプライマーとアンチセンスプライマーを合成
する。プライマーの作製は、当該分野で知られた方法で
行うことができ、例えば自動DNA 合成装置を用い、フォ
スフォジエステル法、フォスフォトリエステル法、フォ
スフォアミダイト法などにより合成できる。種々のヒト
由来の組織あるいは培養細胞（特には、ヒトの脳、腎
臓、膵臓、肺、胎盤、心臓、胸腺、精巣、腸などの組織
・細胞等、癌、腫瘍、あるいはそれらの株化細胞等）cD
NAライブラリーと前記のセンスプライマー及びアンチセ
ンスプライマーを用いてポリメラーゼ・チェイン・リア
クション(polymerase chain reaction: PCR)を行い、cD
NAを増幅する。また、当該遺伝子の取得には、上記のよ
うにして同定されたクローンから特異的なハイブリダイ
ゼーションプローブを調製し、ヒト由来DNA ライブラリ
ーをスクリーニングし、プローブにハイブリダイズする
クローンを選択することにより行うことができる。さら
に鋳型として用いるcDNAライブラリーは、下記のように
して調製したもの、あるいは市販の種々の組織由来cDNA
ライブラリーを直接使用することもでき、例えばStrata
gene, Invitrogen, Clontechなどから市販されたcDNAラ
イブラリーを用いることができる。
【００３６】本明細書中、「ポリメラーゼ・チェイン・
リアクション」又は「PCR 」とは、一般的に、米国特許
第 4683195号明細書に記載されたような方法を指し、例
えば、所望のヌクレオチド配列をインビトロで酵素的に
増幅するための方法を指している。一般に、PCR 法は、
鋳型核酸と優先的にハイブリダイズすることのできる２
個のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プライ
マー伸長合成を行うところのサイクルを繰り返し行うこ
とを含むものである。典型的には、PCR 法で用いられる
プライマーは、鋳型内部の増幅されるべきヌクレオチド
配列に対して相補的なプライマーを使用することがで
き、例えば、該増幅されるべきヌクレオチド配列とその
両端において相補的であるか、あるいは該増幅されるべ
きヌクレオチド配列に隣接しているものを好ましく使用
され得る。PCR 反応は、当該分野で公知の方法あるいは
それと実質的に同様な方法や改変法により行うことがで
きるが、例えば R. Saiki, et al., Science, 230:135
0, 1985; R. Saiki, et al., Science, 239: 487, 1988
; H. A. Erliched., PCR Technology, Stockton Pres
s, 1989 ; D. M. Glover et al. ed.,"DNA Cloning", 2
nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), I
RLPress, Oxford University Press (1995) ; M. A. In
nis et al. ed., "PCRProtocols: a guide to methods
and applications", Academic Press, New York (199
0)); M. J. McPherson, P. Quirke and G. R. Taylor
(Ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, Oxfor
d (1991); M. A. Frohman et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988) などに記載された方
法あるいはそれを修飾したり、改変した方法に従って行
うことができる。また、PCR 法は、それに適した市販の
キットを用いて行うことができ、キット製造業者あるい
はキット販売業者により明らかにされているプロトコル
に従って実施することもできる。
リアクション」又は「PCR 」とは、一般的に、米国特許
第 4683195号明細書に記載されたような方法を指し、例
えば、所望のヌクレオチド配列をインビトロで酵素的に
増幅するための方法を指している。一般に、PCR 法は、
鋳型核酸と優先的にハイブリダイズすることのできる２
個のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プライ
マー伸長合成を行うところのサイクルを繰り返し行うこ
とを含むものである。典型的には、PCR 法で用いられる
プライマーは、鋳型内部の増幅されるべきヌクレオチド
配列に対して相補的なプライマーを使用することがで
き、例えば、該増幅されるべきヌクレオチド配列とその
両端において相補的であるか、あるいは該増幅されるべ
きヌクレオチド配列に隣接しているものを好ましく使用
され得る。PCR 反応は、当該分野で公知の方法あるいは
それと実質的に同様な方法や改変法により行うことがで
きるが、例えば R. Saiki, et al., Science, 230:135
0, 1985; R. Saiki, et al., Science, 239: 487, 1988
; H. A. Erliched., PCR Technology, Stockton Pres
s, 1989 ; D. M. Glover et al. ed.,"DNA Cloning", 2
nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), I
RLPress, Oxford University Press (1995) ; M. A. In
nis et al. ed., "PCRProtocols: a guide to methods
and applications", Academic Press, New York (199
0)); M. J. McPherson, P. Quirke and G. R. Taylor
(Ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, Oxfor
d (1991); M. A. Frohman et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988) などに記載された方
法あるいはそれを修飾したり、改変した方法に従って行
うことができる。また、PCR 法は、それに適した市販の
キットを用いて行うことができ、キット製造業者あるい
はキット販売業者により明らかにされているプロトコル
に従って実施することもできる。
【００３７】本明細書中、「オリゴヌクレオチド」と
は、比較的短い一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチド
で、好ましくはポリデオキシヌクレオチドが挙げられ、
Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., Vol.28, p.716-734 (19
89) に記載されているような既知の方法、例えば、トリ
エステル法、ホスファイト法、ホスホアミダイト法、ホ
スホネート法などの方法により化学合成されることがで
きる。通常合成は、修飾された固体支持体上で合成を便
利に行うことができることが知られており、例えば、自
動化された合成装置を用いて行うことができ、該装置は
市販されている。該オリゴヌクレオチドは、一つ又はそ
れ以上の修飾された塩基を含有していてよく、例えば、
イノシンなどの天然においては普通でない塩基あるいは
トリチル化された塩基などを含有していてよい。得られ
た PCR産物をクローニングし、得られた PCR産物の塩基
配列を決定し、新規なヒト膜結合型メタロプロテアーゼ
遺伝子配列を有する DNA断片を取得することもできる。
また、この DNA断片をプローブに同様にして種々のcDNA
ライブラリーをスクリーニングし、目的とするDNA を単
離することもできる。PCR 産物のクローニングには、例
えば、p-Direct (Clontech), pCR-Script TM SK(+) (St
ratagene), pGEM-T (Promega), pAmp TM (Gibco-BRL)な
どの市販のプラスミドベクターを用いることが出来る。
は、比較的短い一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチド
で、好ましくはポリデオキシヌクレオチドが挙げられ、
Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., Vol.28, p.716-734 (19
89) に記載されているような既知の方法、例えば、トリ
エステル法、ホスファイト法、ホスホアミダイト法、ホ
スホネート法などの方法により化学合成されることがで
きる。通常合成は、修飾された固体支持体上で合成を便
利に行うことができることが知られており、例えば、自
動化された合成装置を用いて行うことができ、該装置は
市販されている。該オリゴヌクレオチドは、一つ又はそ
れ以上の修飾された塩基を含有していてよく、例えば、
イノシンなどの天然においては普通でない塩基あるいは
トリチル化された塩基などを含有していてよい。得られ
た PCR産物をクローニングし、得られた PCR産物の塩基
配列を決定し、新規なヒト膜結合型メタロプロテアーゼ
遺伝子配列を有する DNA断片を取得することもできる。
また、この DNA断片をプローブに同様にして種々のcDNA
ライブラリーをスクリーニングし、目的とするDNA を単
離することもできる。PCR 産物のクローニングには、例
えば、p-Direct (Clontech), pCR-Script TM SK(+) (St
ratagene), pGEM-T (Promega), pAmp TM (Gibco-BRL)な
どの市販のプラスミドベクターを用いることが出来る。
【００３８】完全なオープン・リーディング・フレーム
を含む全長の新規なヒト膜結合型メタロプロテアーゼ遺
伝子配列を取得するには、必要に応じて、上記の様にし
て得られた新規なヒト膜結合型メタロプロテアーゼ遺伝
子を構成している DNA断片をプローブに用いて、上記し
たような種々のヒト組織あるいは培養細胞から構築され
たcDNAライブラリーをスクリーニングし、プローブにハ
イブリダイズするクローンを選択し、該クローン中のcD
NAの挿入配列の塩基配列を決定し、該新規なヒト膜結合
型メタロプロテアーゼ遺伝子を構成している新規なDNA
断片を同定し取得する。もちろん、必要に応じて該クロ
ーン中のcDNAの挿入配列はサブクローニングすることが
できる。決定された塩基配列を基にして、目的とするDN
A を単離することができる。好ましくはヒト脳由来cDNA
ライブラリーをスクリーニングし、塩基配列の決定をし
て目的とするDNA を単離する。場合によっては、染色体
歩行（クロモゾームウォーキング）を行い、所望のゲノ
ム領域をクローニングすることもできる。なお、プロー
ブなどを放射性同位体などによって標識するには、市販
の標識キット、例えばランダムプライムドDNA ラベリン
グキット (Boehringer Mannheim)などを使用して行うこ
とが出来る。
を含む全長の新規なヒト膜結合型メタロプロテアーゼ遺
伝子配列を取得するには、必要に応じて、上記の様にし
て得られた新規なヒト膜結合型メタロプロテアーゼ遺伝
子を構成している DNA断片をプローブに用いて、上記し
たような種々のヒト組織あるいは培養細胞から構築され
たcDNAライブラリーをスクリーニングし、プローブにハ
イブリダイズするクローンを選択し、該クローン中のcD
NAの挿入配列の塩基配列を決定し、該新規なヒト膜結合
型メタロプロテアーゼ遺伝子を構成している新規なDNA
断片を同定し取得する。もちろん、必要に応じて該クロ
ーン中のcDNAの挿入配列はサブクローニングすることが
できる。決定された塩基配列を基にして、目的とするDN
A を単離することができる。好ましくはヒト脳由来cDNA
ライブラリーをスクリーニングし、塩基配列の決定をし
て目的とするDNA を単離する。場合によっては、染色体
歩行（クロモゾームウォーキング）を行い、所望のゲノ
ム領域をクローニングすることもできる。なお、プロー
ブなどを放射性同位体などによって標識するには、市販
の標識キット、例えばランダムプライムドDNA ラベリン
グキット (Boehringer Mannheim)などを使用して行うこ
とが出来る。
【００３９】cDNAライブラリーを構築するためには、cD
NAを入手する必要があるが、これは、例えば次のように
して得られる。先ず上記したような種々のヒトの組織あ
るいは培養細胞（特には、ヒトの脳、腎臓、膵臓、肺、
胎盤、心臓、胸腺、精巣、腸などの組織・細胞等、胃
癌、脳腫瘍、腎臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、結
腸・直腸癌、それらから誘導された培養株化細胞等）か
らmRNAを単離する。mRNAの単離は、当該分野で公知の方
法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行
うことができるが、J. Sambrook et al.,"Molecular Cl
oning", 2nd ed.,Chapter 7, Cold Spring Harbor Labo
ratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) ; D. M. G
lover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1,
(The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford
University Press (1995) ; L. Grossman et al. ed.,
"Methods in Enzymology", Vol. 12, Part A & B, Aca
demic Press, New York (1968); S. L. Berger et al.
ed., "Methods in Enzymology", Vol. 152, p.33 & p.2
15, Academic Press, New York (1987);Biochemistry,
18: 5294-5299, 1979などに記載の方法、例えばグアニ
ジン−塩化セシウム法、チオシアン酸グアニジン法、フ
ェノール法などの方法で行うことが出来る。mRNAの単離
に用いられるキットとしては、例えば、Pharmacia, Str
atagene, Gibco-BRLなどから市販されているものが挙げ
られる。必要に応じ、得られた全RNA はオリゴ(dT)−セ
ルロースカラム、スピンカラム、オリゴ(dT)結合磁性ビ
ーズなどを使用して精製してポリ (A)+ mRNAを得ること
が出来る。
NAを入手する必要があるが、これは、例えば次のように
して得られる。先ず上記したような種々のヒトの組織あ
るいは培養細胞（特には、ヒトの脳、腎臓、膵臓、肺、
胎盤、心臓、胸腺、精巣、腸などの組織・細胞等、胃
癌、脳腫瘍、腎臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、結
腸・直腸癌、それらから誘導された培養株化細胞等）か
らmRNAを単離する。mRNAの単離は、当該分野で公知の方
法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行
うことができるが、J. Sambrook et al.,"Molecular Cl
oning", 2nd ed.,Chapter 7, Cold Spring Harbor Labo
ratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) ; D. M. G
lover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1,
(The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford
University Press (1995) ; L. Grossman et al. ed.,
"Methods in Enzymology", Vol. 12, Part A & B, Aca
demic Press, New York (1968); S. L. Berger et al.
ed., "Methods in Enzymology", Vol. 152, p.33 & p.2
15, Academic Press, New York (1987);Biochemistry,
18: 5294-5299, 1979などに記載の方法、例えばグアニ
ジン−塩化セシウム法、チオシアン酸グアニジン法、フ
ェノール法などの方法で行うことが出来る。mRNAの単離
に用いられるキットとしては、例えば、Pharmacia, Str
atagene, Gibco-BRLなどから市販されているものが挙げ
られる。必要に応じ、得られた全RNA はオリゴ(dT)−セ
ルロースカラム、スピンカラム、オリゴ(dT)結合磁性ビ
ーズなどを使用して精製してポリ (A)+ mRNAを得ること
が出来る。
【００４０】このmRNA及び逆転写酵素(RNA依存性DNA ポ
リメラーゼ) を用いて、cDNAを作製する。逆転写反応で
は、オリゴ(dT)プライマーを用いることができる。オリ
ゴ(dT)プライマーは、好適には12〜18個のＴ残基を持つ
ものが使用できる。指向性クローニングを行う場合に
は、12〜18個のＴ残基の5'側に制限酵素部位を連結した
合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いることも好ま
しい。こうしたプライマーの例としては、Xba I オリゴ
(dT)プライマーアダプターなどが挙げられる。またラン
ダムヘキサマープライマーを用いると、mRNAの5'末端側
が得られる可能性が増大し、このランダムヘキサマープ
ライマーは単独で、あるいはオリゴ(dT)プライマーと混
合して使用できる。逆転写反応では、必要に応じてRNas
e 阻害剤、例えば、RNasin (Boehringer) を加えること
ができる。mRNA及び逆転写酵素を用いてのcDNA合成は当
該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法
や改変法により行うことができるが、H. Land et al.,
Nucleic Acids Res., 9: 2251, 1981; U. Gubler et a
l., Gene, 25: 263-269, 1983; S. L. Berger et al.e
d., "Methods in Enzymology", Vol. 152, p.307, Acad
emic Press, New York(1987) などに記載の方法が挙げ
られる。
リメラーゼ) を用いて、cDNAを作製する。逆転写反応で
は、オリゴ(dT)プライマーを用いることができる。オリ
ゴ(dT)プライマーは、好適には12〜18個のＴ残基を持つ
ものが使用できる。指向性クローニングを行う場合に
は、12〜18個のＴ残基の5'側に制限酵素部位を連結した
合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いることも好ま
しい。こうしたプライマーの例としては、Xba I オリゴ
(dT)プライマーアダプターなどが挙げられる。またラン
ダムヘキサマープライマーを用いると、mRNAの5'末端側
が得られる可能性が増大し、このランダムヘキサマープ
ライマーは単独で、あるいはオリゴ(dT)プライマーと混
合して使用できる。逆転写反応では、必要に応じてRNas
e 阻害剤、例えば、RNasin (Boehringer) を加えること
ができる。mRNA及び逆転写酵素を用いてのcDNA合成は当
該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法
や改変法により行うことができるが、H. Land et al.,
Nucleic Acids Res., 9: 2251, 1981; U. Gubler et a
l., Gene, 25: 263-269, 1983; S. L. Berger et al.e
d., "Methods in Enzymology", Vol. 152, p.307, Acad
emic Press, New York(1987) などに記載の方法が挙げ
られる。
【００４１】こうして作製された cDNA を基に、ファー
ジベクター、プラスミドベクターを使用するなどしてcD
NAライブラリーを構築できる。またファージベクターを
使用する以外で、大腸菌などの宿主細胞の形質転換をす
るには、例えばカルシウム法、ルビジウム／カルシウム
法、カルシウム／マンガン法、TFB 高効率法、FSB 凍結
コンピテント細胞法、迅速コロニー法、エレクトロポレ
ーションなど当該分野で知られた方法あるいはそれと実
質的に同様な方法で行うことができる（D. Hanahan, J.
Mol. Biol., Vol. 166, p.557 (1983) など）。また、
こうして作製されたcDNAを鋳型に、該新規なヒト膜結合
型メタロプロテアーゼ遺伝子を構成している新規なDNA
断片であって、決定された塩基配列を基にして、プライ
マーを設計し、さらに PCRを行うことによっても本発明
のヒトMT5-MMP をコードする遺伝子を得ることが可能で
ある。典型的な場合、その全配列あるいは部分配列がク
ローニングされている既知のメタロプロテアーゼ酵素
（特には膜結合型メタロプロテアーゼ酵素）より得られ
たアミノ酸配列、より好ましくは配列決定されたあるい
は推定されたヒトMT5-MMP のアミノ酸配列から選択し
た、高度に保存されているアミノ酸配列（例えば、前駆
体（プロ体）と活性型の切断部位近傍の配列など）や膜
結合型メタロプロテアーゼに特異的に存在する領域のア
ミノ酸配列（例えば、Ｃ末端側領域のうちのアミノ酸配
列、プロペプチド・ドメインと触媒ドメインの間に存在
する領域のうちのアミノ酸配列、触媒ドメインの活性部
位領域のうちのアミノ酸配列、ヘモペキシン領域のうち
のアミノ酸配列、ヒンジ領域のうちのアミノ酸配列、疎
水性膜貫通領域と細胞内領域のうちのアミノ酸配列な
ど）を基に、デジェネレイテッド・プライマーを作製す
る。このプライマーと上記作製したcDNAとを用い、PCR
を行う。PCR は、上記したようにして行うことができ
る。得られたPCR 産物を上記と同様にクローニングし、
得られたPCR 産物の塩基配列を決定し、新規なヒトMT5-
MMP 遺伝子配列を有するDNA 断片を取得することもでき
る。また、このDNA 断片をプローブに同様にして種々の
cDNAライブラリーをスクリーニングし、目的とするDNA
を単離することもできる。
ジベクター、プラスミドベクターを使用するなどしてcD
NAライブラリーを構築できる。またファージベクターを
使用する以外で、大腸菌などの宿主細胞の形質転換をす
るには、例えばカルシウム法、ルビジウム／カルシウム
法、カルシウム／マンガン法、TFB 高効率法、FSB 凍結
コンピテント細胞法、迅速コロニー法、エレクトロポレ
ーションなど当該分野で知られた方法あるいはそれと実
質的に同様な方法で行うことができる（D. Hanahan, J.
Mol. Biol., Vol. 166, p.557 (1983) など）。また、
こうして作製されたcDNAを鋳型に、該新規なヒト膜結合
型メタロプロテアーゼ遺伝子を構成している新規なDNA
断片であって、決定された塩基配列を基にして、プライ
マーを設計し、さらに PCRを行うことによっても本発明
のヒトMT5-MMP をコードする遺伝子を得ることが可能で
ある。典型的な場合、その全配列あるいは部分配列がク
ローニングされている既知のメタロプロテアーゼ酵素
（特には膜結合型メタロプロテアーゼ酵素）より得られ
たアミノ酸配列、より好ましくは配列決定されたあるい
は推定されたヒトMT5-MMP のアミノ酸配列から選択し
た、高度に保存されているアミノ酸配列（例えば、前駆
体（プロ体）と活性型の切断部位近傍の配列など）や膜
結合型メタロプロテアーゼに特異的に存在する領域のア
ミノ酸配列（例えば、Ｃ末端側領域のうちのアミノ酸配
列、プロペプチド・ドメインと触媒ドメインの間に存在
する領域のうちのアミノ酸配列、触媒ドメインの活性部
位領域のうちのアミノ酸配列、ヘモペキシン領域のうち
のアミノ酸配列、ヒンジ領域のうちのアミノ酸配列、疎
水性膜貫通領域と細胞内領域のうちのアミノ酸配列な
ど）を基に、デジェネレイテッド・プライマーを作製す
る。このプライマーと上記作製したcDNAとを用い、PCR
を行う。PCR は、上記したようにして行うことができ
る。得られたPCR 産物を上記と同様にクローニングし、
得られたPCR 産物の塩基配列を決定し、新規なヒトMT5-
MMP 遺伝子配列を有するDNA 断片を取得することもでき
る。また、このDNA 断片をプローブに同様にして種々の
cDNAライブラリーをスクリーニングし、目的とするDNA
を単離することもできる。
【００４２】目的とするDNA を単離するためには、逆転
写PCR (polymerase chain reactioncoupled reverse tr
anscription; RT-PCR) 、RACE (rapid amplification o
f cDNA ends) を適用することが出来る。RACEは、例え
ば、M. A. Innis et al. ed., "PCR Protocols" (M. A.
Frohman, "a guide to methods and applicarions"),
pp.28-38, Academic Press, New York (1990) などに記
載された方法に従って行うことができる。RT-PCR産物は
プラスミドベクターにクローニングすることができ、そ
れを高効率のコンピテント細胞に導入できる。更に、微
量の細胞あるいは組織からmRNAを単離精製できる方法、
例えば、REXkit, United States Biochemical; Glass M
AX TM RNA spin cartridge system,Gibco-BRL などの市
販のキットを利用し、得られたmRNAをオリゴ(dT)プライ
マーを用いて逆転写して、1st strand DNAを合成し、つ
いで1st strand DNAの3'末端にホモポリマーテール (例
えば、Ｇ残基）を付けた後、あるいは該 DNAにアダプタ
ーを付けた後、オリゴ(dT)プライマーとオリゴ(dC)プラ
イマーあるいはアダプタープライマーを用いてcDNAを P
CR増幅することもできる。これに適した市販のキットと
しては、SuperScript TM pre-amplification system (G
ibco-BRL); cDNA Cycle TM kit (Invitrogen) などが挙
げられる。
写PCR (polymerase chain reactioncoupled reverse tr
anscription; RT-PCR) 、RACE (rapid amplification o
f cDNA ends) を適用することが出来る。RACEは、例え
ば、M. A. Innis et al. ed., "PCR Protocols" (M. A.
Frohman, "a guide to methods and applicarions"),
pp.28-38, Academic Press, New York (1990) などに記
載された方法に従って行うことができる。RT-PCR産物は
プラスミドベクターにクローニングすることができ、そ
れを高効率のコンピテント細胞に導入できる。更に、微
量の細胞あるいは組織からmRNAを単離精製できる方法、
例えば、REXkit, United States Biochemical; Glass M
AX TM RNA spin cartridge system,Gibco-BRL などの市
販のキットを利用し、得られたmRNAをオリゴ(dT)プライ
マーを用いて逆転写して、1st strand DNAを合成し、つ
いで1st strand DNAの3'末端にホモポリマーテール (例
えば、Ｇ残基）を付けた後、あるいは該 DNAにアダプタ
ーを付けた後、オリゴ(dT)プライマーとオリゴ(dC)プラ
イマーあるいはアダプタープライマーを用いてcDNAを P
CR増幅することもできる。これに適した市販のキットと
しては、SuperScript TM pre-amplification system (G
ibco-BRL); cDNA Cycle TM kit (Invitrogen) などが挙
げられる。
【００４３】以下にさらに詳細に記述する。プローブDN
A を使用して、遺伝子ライブラリーから新規ヒト膜結合
型メタロプロテアーゼ遺伝子をスクリーニングして同定
し、クローニングして得られた新規ヒトMT5-MMP 遺伝子
をコードするDNA インサートの塩基配列を決定する。プ
ローブDNA としては、例えば、ヒト大脳cDNA配列(AA324
134)に基づいて設計したプライマーを使用し、市販ヒト
ライブラリー (脳、Clontech (Palo Alto, CA)) のλgt
11−ファージDNA を鋳型として用いてPCR 増幅して得ら
れたヒト由来AA324134配列をコードするcDNAを用い、そ
れを標識してプローブとして用いることができる。標識
には、DNA ラベリングキットを用いることができ、例え
ば、random-primingキット (Pharmacia LKB, Uppsala,
Sweden) などを使用してプローブ用DNA を [α-32P]dCT
P (Amersham ,UK)などを用いて標識し、放射活性を持つ
プローブを得ることができる。該標識DNA 断片とヒト組
織・細胞から調製した遺伝子ライブラリー、例えばヒト
P1 artificial chromosomeゲノミックライブラリー(PA
C: Human Genome Mapping Resource Center) 、ヒト ba
cterial artificial chromosomeゲノミックライブラリ
ー(BAC: Dr. P.J. de Jong, Roswell Park Cancer Inst
itute, US)、ヒト脳cDNAライブラリー (例えば、Clonte
ch, Palo Alto, CA)などから入手可能) を用い、ハイブ
リダイゼーションを行う。ヒト脳cDNAライブラリーは、
例えば、λgt10、λgt11などのファージ中に構築するこ
とができ、それを大腸菌C600hfl 株などの宿主大腸菌に
感染させ、プラークを形成させて得ることができる。
A を使用して、遺伝子ライブラリーから新規ヒト膜結合
型メタロプロテアーゼ遺伝子をスクリーニングして同定
し、クローニングして得られた新規ヒトMT5-MMP 遺伝子
をコードするDNA インサートの塩基配列を決定する。プ
ローブDNA としては、例えば、ヒト大脳cDNA配列(AA324
134)に基づいて設計したプライマーを使用し、市販ヒト
ライブラリー (脳、Clontech (Palo Alto, CA)) のλgt
11−ファージDNA を鋳型として用いてPCR 増幅して得ら
れたヒト由来AA324134配列をコードするcDNAを用い、そ
れを標識してプローブとして用いることができる。標識
には、DNA ラベリングキットを用いることができ、例え
ば、random-primingキット (Pharmacia LKB, Uppsala,
Sweden) などを使用してプローブ用DNA を [α-32P]dCT
P (Amersham ,UK)などを用いて標識し、放射活性を持つ
プローブを得ることができる。該標識DNA 断片とヒト組
織・細胞から調製した遺伝子ライブラリー、例えばヒト
P1 artificial chromosomeゲノミックライブラリー(PA
C: Human Genome Mapping Resource Center) 、ヒト ba
cterial artificial chromosomeゲノミックライブラリ
ー(BAC: Dr. P.J. de Jong, Roswell Park Cancer Inst
itute, US)、ヒト脳cDNAライブラリー (例えば、Clonte
ch, Palo Alto, CA)などから入手可能) を用い、ハイブ
リダイゼーションを行う。ヒト脳cDNAライブラリーは、
例えば、λgt10、λgt11などのファージ中に構築するこ
とができ、それを大腸菌C600hfl 株などの宿主大腸菌に
感染させ、プラークを形成させて得ることができる。
【００４４】ハイブリダイゼーションは、上記のように
形成されたプラークをナイロンフィルターなどの膜に転
写せしめ、必要に応じ変成処理、固定化処理、洗浄処理
などを施した後、その膜に転写せしめられたものを、必
要に応じ変成させた標識プローブDNA 断片と、ハイブリ
ダイゼーション用バッファ中で反応させて行われる。ハ
イブリダイゼーション処理は、普通約35℃〜約80℃、よ
り好適には約50℃〜約65℃で、約15分〜約36時間、より
好適には約1 時間〜約24時間行われるが、適宜最適な条
件を選択して行うことができる。例えば、ハイブリダイ
ゼーション処理は、約55℃で約18時間行われる。ハイブ
リダイゼーション用バッファとしては、当該分野で普通
に使用されるものの中から選んで用いることができ、例
えば、Rapid hybridization buffer（Amersham）などを
用いることができる。転写した膜の変成処理としては、
アルカリ変性液を使用する方法が挙げられ、その処理後
中和液や緩衝液で処理するのが好ましい。また膜の固定
化処理としては、普通約40℃〜約 100℃、より好適には
約70℃〜約90℃で、約15分〜約24時間、より好適には約
1 時間〜約4 時間ベーキングすることにより行われる
が、適宜好ましい条件を選択して行うことができる。例
えば、フィルターを約80℃で約2 時間ベーキングするこ
とにより固定化が行われる。転写した膜の洗浄処理とし
ては、当該分野で普通に使用される洗浄液、例えば1M N
aCl 、1mM EDTAおよび 0.1％ SodiumDodecyl sulfate
(SDS) 含有 50mM Tris-HC1緩衝液，pH8.0 などで洗うこ
とにより行うことができる。ナイロンフィルターなどの
膜としては、当該分野で普通に使用されるものの中から
選んで用いることができ、例えば、ナイロンフィルター
［ハイボンド（Hybond）-N、Amersham］などを挙げるこ
とができる。
形成されたプラークをナイロンフィルターなどの膜に転
写せしめ、必要に応じ変成処理、固定化処理、洗浄処理
などを施した後、その膜に転写せしめられたものを、必
要に応じ変成させた標識プローブDNA 断片と、ハイブリ
ダイゼーション用バッファ中で反応させて行われる。ハ
イブリダイゼーション処理は、普通約35℃〜約80℃、よ
り好適には約50℃〜約65℃で、約15分〜約36時間、より
好適には約1 時間〜約24時間行われるが、適宜最適な条
件を選択して行うことができる。例えば、ハイブリダイ
ゼーション処理は、約55℃で約18時間行われる。ハイブ
リダイゼーション用バッファとしては、当該分野で普通
に使用されるものの中から選んで用いることができ、例
えば、Rapid hybridization buffer（Amersham）などを
用いることができる。転写した膜の変成処理としては、
アルカリ変性液を使用する方法が挙げられ、その処理後
中和液や緩衝液で処理するのが好ましい。また膜の固定
化処理としては、普通約40℃〜約 100℃、より好適には
約70℃〜約90℃で、約15分〜約24時間、より好適には約
1 時間〜約4 時間ベーキングすることにより行われる
が、適宜好ましい条件を選択して行うことができる。例
えば、フィルターを約80℃で約2 時間ベーキングするこ
とにより固定化が行われる。転写した膜の洗浄処理とし
ては、当該分野で普通に使用される洗浄液、例えば1M N
aCl 、1mM EDTAおよび 0.1％ SodiumDodecyl sulfate
(SDS) 含有 50mM Tris-HC1緩衝液，pH8.0 などで洗うこ
とにより行うことができる。ナイロンフィルターなどの
膜としては、当該分野で普通に使用されるものの中から
選んで用いることができ、例えば、ナイロンフィルター
［ハイボンド（Hybond）-N、Amersham］などを挙げるこ
とができる。
【００４５】上記アルカリ変性液、中和液、緩衝液とし
ては、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで
用いることができ、アルカリ変性液としては、例えば、
0.5MNaOH および1.5M NaCl を含有する液などを挙げる
ことができ、中和液としては、例えば、1.5M NaCl 含有
0.5M Tris−HCl 緩衝液，pH8.0 などを挙げることがで
き、緩衝液としては、例えば、 2×SSPE（0.36M NaCl、
20mM NaH2PO4および2mM EDTA）などを挙げることができ
る。またハイブリダイゼーション処理に先立ち、非特異
的なハイブリダイゼーション反応を防ぐために、必要に
応じて転写した膜はプレハイブリダイゼーション処理す
ることが好ましい。このプレハイブリダイゼーション処
理は、例えば、プレハイブリダイゼーション溶液［50％
formamide、 5×Denhardt's溶液（0.2 ％ウシ血清アル
ブミン、0.2 ％ polyvinyl pyrrolidone）、 5×SSPE、
0.1 ％ SDS、100 μg/ml 熱変性サケ精子DNA ］などに
浸し、約35℃〜50℃、好ましくは約42℃で、約 4〜24時
間、好ましくは約 6〜8 時間反応させることにより行う
ことができるが、こうした条件は当業者であれば適宜実
験を繰り返し、より好ましい条件を決めることができ
る。ハイブリダイゼーションに用いる標識プローブDNA
断片の変成は、例えば、約70℃〜100 ℃、好ましくは約
100 ℃で、約1 分間〜約60分間、好ましくは約 5分間加
熱するなどして行うことができる。なお、ハイブリダイ
ゼーションは、それ自体公知の方法あるいはそれに準じ
た方法で行うことができるが、本明細書でストリンジェ
ントな条件とは、例えばナトリウム濃度に関し、約15〜
50mM、好ましくは約19〜40mM、より好ましくは約19〜20
mMで、温度については約35〜85℃、好ましくは約50〜70
℃、より好ましくは約60〜65℃の条件を示す。
ては、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで
用いることができ、アルカリ変性液としては、例えば、
0.5MNaOH および1.5M NaCl を含有する液などを挙げる
ことができ、中和液としては、例えば、1.5M NaCl 含有
0.5M Tris−HCl 緩衝液，pH8.0 などを挙げることがで
き、緩衝液としては、例えば、 2×SSPE（0.36M NaCl、
20mM NaH2PO4および2mM EDTA）などを挙げることができ
る。またハイブリダイゼーション処理に先立ち、非特異
的なハイブリダイゼーション反応を防ぐために、必要に
応じて転写した膜はプレハイブリダイゼーション処理す
ることが好ましい。このプレハイブリダイゼーション処
理は、例えば、プレハイブリダイゼーション溶液［50％
formamide、 5×Denhardt's溶液（0.2 ％ウシ血清アル
ブミン、0.2 ％ polyvinyl pyrrolidone）、 5×SSPE、
0.1 ％ SDS、100 μg/ml 熱変性サケ精子DNA ］などに
浸し、約35℃〜50℃、好ましくは約42℃で、約 4〜24時
間、好ましくは約 6〜8 時間反応させることにより行う
ことができるが、こうした条件は当業者であれば適宜実
験を繰り返し、より好ましい条件を決めることができ
る。ハイブリダイゼーションに用いる標識プローブDNA
断片の変成は、例えば、約70℃〜100 ℃、好ましくは約
100 ℃で、約1 分間〜約60分間、好ましくは約 5分間加
熱するなどして行うことができる。なお、ハイブリダイ
ゼーションは、それ自体公知の方法あるいはそれに準じ
た方法で行うことができるが、本明細書でストリンジェ
ントな条件とは、例えばナトリウム濃度に関し、約15〜
50mM、好ましくは約19〜40mM、より好ましくは約19〜20
mMで、温度については約35〜85℃、好ましくは約50〜70
℃、より好ましくは約60〜65℃の条件を示す。
【００４６】ハイブリダイゼーション完了後、フィルタ
ーを十分に洗浄処理し、特異的なハイブリダイゼーショ
ン反応をした標識プローブDNA 断片以外の標識プローブ
を取り除く。フィルターの洗浄処理は、当該分野で普通
に使用されるものの中から選んで用いて行うことがで
き、例えば、0.1 ％ SDS含有 0.5×SSC ( O.15M NaCl、
15mM クエン酸）溶液などで洗うことにより実施でき
る。ハイブリダイズしたプラークは、代表的にはオート
ラジオグラフィーにより検出することができるが、当該
分野で用いられる方法の中から適宜選択してプラーク検
出に用いることもできる。検出したシグナルに相当する
プラークを、適切な緩衝液、例えば、SM溶液（ 100mM N
aCl および10mM MgSO4含有50mM Tris-HCl 緩衝液、pH7.
5 ）などに懸濁し、ついでこのファージ懸濁液を適度に
希釈して、大腸菌に感染させ、得られた大腸菌を培養し
て、その培養された大腸菌から目的組換え体ファージを
得る。なお、必要に応じて上記プローブDNA を使用し
て、ハイブリダイゼーション処理により遺伝子ライブラ
リーやcDNAライブラリーから目的組換え体ファージをス
クリーニングする処理は、繰り返して行うことができ
る。また目的組換え体ファージは、培養された大腸菌か
ら抽出処理、遠心分離処理などを施して得ることができ
る。
ーを十分に洗浄処理し、特異的なハイブリダイゼーショ
ン反応をした標識プローブDNA 断片以外の標識プローブ
を取り除く。フィルターの洗浄処理は、当該分野で普通
に使用されるものの中から選んで用いて行うことがで
き、例えば、0.1 ％ SDS含有 0.5×SSC ( O.15M NaCl、
15mM クエン酸）溶液などで洗うことにより実施でき
る。ハイブリダイズしたプラークは、代表的にはオート
ラジオグラフィーにより検出することができるが、当該
分野で用いられる方法の中から適宜選択してプラーク検
出に用いることもできる。検出したシグナルに相当する
プラークを、適切な緩衝液、例えば、SM溶液（ 100mM N
aCl および10mM MgSO4含有50mM Tris-HCl 緩衝液、pH7.
5 ）などに懸濁し、ついでこのファージ懸濁液を適度に
希釈して、大腸菌に感染させ、得られた大腸菌を培養し
て、その培養された大腸菌から目的組換え体ファージを
得る。なお、必要に応じて上記プローブDNA を使用し
て、ハイブリダイゼーション処理により遺伝子ライブラ
リーやcDNAライブラリーから目的組換え体ファージをス
クリーニングする処理は、繰り返して行うことができ
る。また目的組換え体ファージは、培養された大腸菌か
ら抽出処理、遠心分離処理などを施して得ることができ
る。
【００４７】得られたファージ粒子は、当該分野で普通
に使用される方法で精製分離することができ、例えば、
グリセロールグラジエント超遠心分離法（Molecular cl
oning, a laboratory manual, ed. T. Maniatis, Cold
Spring Harbor Laboratory,2nd ed. 78, 1989）などに
より精製することができる。ファージ粒子からは、当該
分野で普通に使用される方法でDNA を精製分離すること
ができ、例えば、得られたファージをTM溶液（10mM MgS
O4含有50mM Tris-HCl 緩衝液、pH7.8 ）などに懸濁し、
DNase I およびRNase A などで処理後、20mM EDTA 、50
μg/ml Proteinase K 及び0.5 ％SDS 混合液などを加
え、約65℃、約1 時間保温した後、これをフェノール抽
出ジエチルエーテル抽出後、エタノール沈殿によりDNA
を沈殿させ、次に得られたDNA を70％エタノールで洗浄
後乾燥し、TE溶液（10mM EDTA 含有10mM Tris-HC1 緩衝
液、pH8.0 ）に溶解するなどして得られる。また、目的
としているDNA は、サブクローニングなどにより大量に
得ることも可能であり、例えばサブクローニングは、宿
主として大腸菌を用いプラスミドベクターなどを用いて
行うことができる。こうしたサブクローニングにより得
られたDNA も、上記と同様にして遠心分離、フェノール
抽出、エタノール沈殿などの方法により精製分離でき
る。
に使用される方法で精製分離することができ、例えば、
グリセロールグラジエント超遠心分離法（Molecular cl
oning, a laboratory manual, ed. T. Maniatis, Cold
Spring Harbor Laboratory,2nd ed. 78, 1989）などに
より精製することができる。ファージ粒子からは、当該
分野で普通に使用される方法でDNA を精製分離すること
ができ、例えば、得られたファージをTM溶液（10mM MgS
O4含有50mM Tris-HCl 緩衝液、pH7.8 ）などに懸濁し、
DNase I およびRNase A などで処理後、20mM EDTA 、50
μg/ml Proteinase K 及び0.5 ％SDS 混合液などを加
え、約65℃、約1 時間保温した後、これをフェノール抽
出ジエチルエーテル抽出後、エタノール沈殿によりDNA
を沈殿させ、次に得られたDNA を70％エタノールで洗浄
後乾燥し、TE溶液（10mM EDTA 含有10mM Tris-HC1 緩衝
液、pH8.0 ）に溶解するなどして得られる。また、目的
としているDNA は、サブクローニングなどにより大量に
得ることも可能であり、例えばサブクローニングは、宿
主として大腸菌を用いプラスミドベクターなどを用いて
行うことができる。こうしたサブクローニングにより得
られたDNA も、上記と同様にして遠心分離、フェノール
抽出、エタノール沈殿などの方法により精製分離でき
る。
【００４８】こうして得られたDNA の塩基配列、例えば
１本鎖DNA の塩基配列は、上記と同様にしてシークエン
シングすることができ、例えば、蛍光DNA シーケンサMo
del373A（Applied Biosystems）、Taq ダイプライマー
サイクルシークエンシングキット（Applied Biosystem
s）などを使用しその配列を決定することができる。決
定された配列を解析することにより、既知のヒト膜結合
型メタロプロテアーゼの配列に見出されるのと類似した
特徴を有してはいるが、新規なヒト膜結合型メタロプロ
テアーゼと推定される遺伝子を同定して、解析できる。
解析された遺伝子の塩基配列を基に、該新規なヒト膜結
合型メタロプロテアーゼと推定される遺伝子のcDNA入手
のため、プライマーをデザインする。センスプライマー
は、好ましくは解析された該新規なヒト膜結合型メタロ
プロテアーゼと推定される遺伝子の5'端側のエクソン部
位から選んで合成することができ、アンチセンスプライ
マーは、好ましくは解析された該新規なヒト膜結合型メ
タロプロテアーゼと推定される遺伝子の3'端側のエクソ
ン部位から選んで合成することができ、より好ましくは
該センスプライマー合成に利用したエクソン部位以外か
ら選ぶことができる。遺伝子のcDNAは、その全長を一度
に入手することを目指してもよいが、解析されたエクソ
ン部位 (複数のエクソン部位) を利用して、複数のプラ
イマーをデザインして合成し、複数のPCR をデザインし
て行い、こうして塩基配列決定されたDNA 断片を解析し
て、当該遺伝子のcDNAの全塩基配列を決定し、それに基
づいてクローニングしたDNA 断片から当該遺伝子のcDNA
を得ることができる。プライマーは、好ましくは 5個以
上の塩基からなるオリゴヌクレオチド、より好ましくは
18〜25個の塩基からなるオリゴヌクレオチドが挙げられ
る。プライマーの合成は、上記したように、自動DNA 合
成装置、例えば、model 381A DNA synthesizer, Applie
d Biosystemsなどを用いて合成される。
１本鎖DNA の塩基配列は、上記と同様にしてシークエン
シングすることができ、例えば、蛍光DNA シーケンサMo
del373A（Applied Biosystems）、Taq ダイプライマー
サイクルシークエンシングキット（Applied Biosystem
s）などを使用しその配列を決定することができる。決
定された配列を解析することにより、既知のヒト膜結合
型メタロプロテアーゼの配列に見出されるのと類似した
特徴を有してはいるが、新規なヒト膜結合型メタロプロ
テアーゼと推定される遺伝子を同定して、解析できる。
解析された遺伝子の塩基配列を基に、該新規なヒト膜結
合型メタロプロテアーゼと推定される遺伝子のcDNA入手
のため、プライマーをデザインする。センスプライマー
は、好ましくは解析された該新規なヒト膜結合型メタロ
プロテアーゼと推定される遺伝子の5'端側のエクソン部
位から選んで合成することができ、アンチセンスプライ
マーは、好ましくは解析された該新規なヒト膜結合型メ
タロプロテアーゼと推定される遺伝子の3'端側のエクソ
ン部位から選んで合成することができ、より好ましくは
該センスプライマー合成に利用したエクソン部位以外か
ら選ぶことができる。遺伝子のcDNAは、その全長を一度
に入手することを目指してもよいが、解析されたエクソ
ン部位 (複数のエクソン部位) を利用して、複数のプラ
イマーをデザインして合成し、複数のPCR をデザインし
て行い、こうして塩基配列決定されたDNA 断片を解析し
て、当該遺伝子のcDNAの全塩基配列を決定し、それに基
づいてクローニングしたDNA 断片から当該遺伝子のcDNA
を得ることができる。プライマーは、好ましくは 5個以
上の塩基からなるオリゴヌクレオチド、より好ましくは
18〜25個の塩基からなるオリゴヌクレオチドが挙げられ
る。プライマーの合成は、上記したように、自動DNA 合
成装置、例えば、model 381A DNA synthesizer, Applie
d Biosystemsなどを用いて合成される。
【００４９】ヒトの組織、特には、ヒト脳などから単離
したmRNAを用いて、逆転写酵素により1st strand cDNA
を作製する。脳組織を、Trizol Reagent (Life Technol
ogies)などの市販のmRNA抽出分離キットあるいはcDNA合
成キット（mRNA抽出分離試薬やシステムが添付されてい
る）等を用いて処理し、mRNAは調製する。1st strandcD
NA は、オリゴdT12-18 プライマーを使用し、Super Scr
ipt kit (Life Technologies)などの市販のcDNA合成キ
ットを用い、該mRNAを鋳型にして合成できる。1st stra
nd cDNA 合成は、例えば、ポリ (A)+ RNA を５×RT緩衝
液 (250mM Tris-HCl (pH8.3), 50mM MgCl2, 375mM KCl,
50mM DTT 含有) 、dNTPs ( デオキシヌクレオシド三リ
ン酸dATP, dGTP, dCTP, dTTPの混合物）、オリゴdT16プ
ライマー、RNase 阻害剤 (Boehringer) 、MMLV RT (Gib
co-BRL) あるいはSuperscript RTplus (Life Technolog
ies) 及び脱イオン蒸留水と混合し、約37℃で約1 時間
インキュベートすることにより達成できる。
したmRNAを用いて、逆転写酵素により1st strand cDNA
を作製する。脳組織を、Trizol Reagent (Life Technol
ogies)などの市販のmRNA抽出分離キットあるいはcDNA合
成キット（mRNA抽出分離試薬やシステムが添付されてい
る）等を用いて処理し、mRNAは調製する。1st strandcD
NA は、オリゴdT12-18 プライマーを使用し、Super Scr
ipt kit (Life Technologies)などの市販のcDNA合成キ
ットを用い、該mRNAを鋳型にして合成できる。1st stra
nd cDNA 合成は、例えば、ポリ (A)+ RNA を５×RT緩衝
液 (250mM Tris-HCl (pH8.3), 50mM MgCl2, 375mM KCl,
50mM DTT 含有) 、dNTPs ( デオキシヌクレオシド三リ
ン酸dATP, dGTP, dCTP, dTTPの混合物）、オリゴdT16プ
ライマー、RNase 阻害剤 (Boehringer) 、MMLV RT (Gib
co-BRL) あるいはSuperscript RTplus (Life Technolog
ies) 及び脱イオン蒸留水と混合し、約37℃で約1 時間
インキュベートすることにより達成できる。
【００５０】得られた1st strand DNAと解析された遺伝
子のエクソンに基づいてデザインされたプライマーと
を、10×反応緩衝液 (Taq DNA ポリメラーゼに添付され
ている) 、dNTPs ( デオキシヌクレオシド三リン酸dAT
P, dGTP, dCTP, dTTPの混合物）、Taq DNA ポリメラー
ゼ及び脱イオン蒸留水と混合する。混合物を、例えば、
GeneAmp 2400 PCR system, Perkin-Elmer/Cetus などの
自動サーマルサイクラーを用いて一般的なPCR サイクル
条件下にそのサイクルを25〜60回繰り返すが、増幅のた
めのサイクル数は適宜目的に応じて適当な回数とするこ
とができる。PCR サイクル条件としては、例えば、変性
90〜95℃ 5〜100 秒、アニーリング40〜60℃5〜150
秒、伸長65〜75℃ 30 〜300 秒のサイクル、好ましくは
変性 94 ℃ 15秒、アニーリング 58 ℃ 15 秒、伸長 72
℃ 45 秒のサイクルが挙げられるが、アニーリングの
反応温度及び時間は適宜実験によって適当な値を選択で
きるし、変性反応及び伸長反応の時間も、予想されるPC
R 産物の鎖長に応じて適当な値を選択できる。アニーリ
ングの反応温度は、通常プライマーと鋳型DNA とのハイ
ブリッドのTm値に応じて変えることが好ましい。伸長反
応の時間は、通常1000bpの鎖長当たり1 分程度がおおよ
その目安であるが、より短い時間を選択することも場合
により可能である。
子のエクソンに基づいてデザインされたプライマーと
を、10×反応緩衝液 (Taq DNA ポリメラーゼに添付され
ている) 、dNTPs ( デオキシヌクレオシド三リン酸dAT
P, dGTP, dCTP, dTTPの混合物）、Taq DNA ポリメラー
ゼ及び脱イオン蒸留水と混合する。混合物を、例えば、
GeneAmp 2400 PCR system, Perkin-Elmer/Cetus などの
自動サーマルサイクラーを用いて一般的なPCR サイクル
条件下にそのサイクルを25〜60回繰り返すが、増幅のた
めのサイクル数は適宜目的に応じて適当な回数とするこ
とができる。PCR サイクル条件としては、例えば、変性
90〜95℃ 5〜100 秒、アニーリング40〜60℃5〜150
秒、伸長65〜75℃ 30 〜300 秒のサイクル、好ましくは
変性 94 ℃ 15秒、アニーリング 58 ℃ 15 秒、伸長 72
℃ 45 秒のサイクルが挙げられるが、アニーリングの
反応温度及び時間は適宜実験によって適当な値を選択で
きるし、変性反応及び伸長反応の時間も、予想されるPC
R 産物の鎖長に応じて適当な値を選択できる。アニーリ
ングの反応温度は、通常プライマーと鋳型DNA とのハイ
ブリッドのTm値に応じて変えることが好ましい。伸長反
応の時間は、通常1000bpの鎖長当たり1 分程度がおおよ
その目安であるが、より短い時間を選択することも場合
により可能である。
【００５１】得られたPCR 産物は、通常 1〜2% アガロ
ースゲル電気泳動にかけて、特異なバンドとしてゲルか
ら切り出し、例えば、gene clean kit (Bio 101)などの
市販の抽出キットを用いてDNA を抽出する。抽出された
DNA は適当な制限酵素で切断し、必要に応じ精製処理し
たり、さらには必要に応じ5'末端をT4ポリヌクレオチド
キナーゼなどによりリン酸化した後、pUC18 などのpUC
系ベクターといった適当なプラスミドベクターにライゲ
ーションし、適当なコンピテント細胞を形質転換する。
クローニングされたPCR 産物はその塩基配列を解析され
る。塩基配列の解析の結果、さらに5'端側及び／又は3'
端側の配列を得る必要がある場合には、クロモゾームウ
ォーキング、cDNA末端の迅速増幅法 (RACE: rapidampli
fication of cDNA ends) などを適用して達成すること
ができる。また、当該遺伝子のエクソン部位のうち解析
した5'端側のエクソン部位の塩基配列に基づいてデザイ
ンされたプライマーを利用して、当該遺伝子のcDNAの5'
端側のcDNAを取得し、一方当該遺伝子のエクソン部位の
うち解析した3'端側のエクソン部位の塩基配列に基づい
てデザインされたプライマーを利用して、当該遺伝子の
cDNAの3'端側のcDNAを取得し、次に必要に応じてこれら
プライマーや得られた当該遺伝子のcDNAの5'端側のcDNA
並びに3'端側のcDNAの塩基配列の情報を利用してデザイ
ンしたプライマーを用い、ヒトの組織、特には、ヒト脳
組織などから単離したmRNAから逆転写酵素により作製さ
れた1st strand cDNA を鋳型にしてPCR により増幅し
て、当該遺伝子のcDNAを得ることができる。
ースゲル電気泳動にかけて、特異なバンドとしてゲルか
ら切り出し、例えば、gene clean kit (Bio 101)などの
市販の抽出キットを用いてDNA を抽出する。抽出された
DNA は適当な制限酵素で切断し、必要に応じ精製処理し
たり、さらには必要に応じ5'末端をT4ポリヌクレオチド
キナーゼなどによりリン酸化した後、pUC18 などのpUC
系ベクターといった適当なプラスミドベクターにライゲ
ーションし、適当なコンピテント細胞を形質転換する。
クローニングされたPCR 産物はその塩基配列を解析され
る。塩基配列の解析の結果、さらに5'端側及び／又は3'
端側の配列を得る必要がある場合には、クロモゾームウ
ォーキング、cDNA末端の迅速増幅法 (RACE: rapidampli
fication of cDNA ends) などを適用して達成すること
ができる。また、当該遺伝子のエクソン部位のうち解析
した5'端側のエクソン部位の塩基配列に基づいてデザイ
ンされたプライマーを利用して、当該遺伝子のcDNAの5'
端側のcDNAを取得し、一方当該遺伝子のエクソン部位の
うち解析した3'端側のエクソン部位の塩基配列に基づい
てデザインされたプライマーを利用して、当該遺伝子の
cDNAの3'端側のcDNAを取得し、次に必要に応じてこれら
プライマーや得られた当該遺伝子のcDNAの5'端側のcDNA
並びに3'端側のcDNAの塩基配列の情報を利用してデザイ
ンしたプライマーを用い、ヒトの組織、特には、ヒト脳
組織などから単離したmRNAから逆転写酵素により作製さ
れた1st strand cDNA を鋳型にしてPCR により増幅し
て、当該遺伝子のcDNAを得ることができる。
【００５２】5'端側のプライマーとしては、少なくとも
開始コドンを含有するか、あるいは該開始コドンを含め
て増幅できるように選択し、また3'端側のプライマーと
しては、少なくともストップコドンを含有するか、ある
いは該ストップコドンを含めて増幅できるように選択す
ることが好ましい。当該遺伝子の全長のcDNAを得るにあ
たり、PCR は上記したようにして行なうことができ、ま
た好ましいPCR サイクル条件としては、例えば、変性92
〜95℃ 10 〜20秒、アニーリング55〜60℃ 10〜30秒、
伸長65〜75℃ 10 〜300 秒のサイクル、より好ましくは
変性 94 ℃ 15秒、アニーリング57〜64℃ 15 秒、伸長
68 〜72℃ 30 秒〜2 分のサイクルが挙げられる。得ら
れたPCR 産物は、上記と同様にしてクローニングしてそ
の塩基配列を解析され決定される。また決定されたDNA
の塩基配列を基にプライマーをデザインし、これらプラ
イマーと各種の動物細胞由来のcDNAライブラリー（例え
ば、各種のヒト細胞由来のcDNAライブラリー）を用い
て、スクリーニングを行うことにより、同様に目的とす
るクローンを得ることができる。またこれらプライマー
を用いてPCR 増幅を行い、目的とする遺伝子や、新規な
遺伝子、それらの断片などを得ることができる。こうし
てヒトMT5-MMP と相同性を有するが、配列が新規なPCR
産物を検索することもできる。
開始コドンを含有するか、あるいは該開始コドンを含め
て増幅できるように選択し、また3'端側のプライマーと
しては、少なくともストップコドンを含有するか、ある
いは該ストップコドンを含めて増幅できるように選択す
ることが好ましい。当該遺伝子の全長のcDNAを得るにあ
たり、PCR は上記したようにして行なうことができ、ま
た好ましいPCR サイクル条件としては、例えば、変性92
〜95℃ 10 〜20秒、アニーリング55〜60℃ 10〜30秒、
伸長65〜75℃ 10 〜300 秒のサイクル、より好ましくは
変性 94 ℃ 15秒、アニーリング57〜64℃ 15 秒、伸長
68 〜72℃ 30 秒〜2 分のサイクルが挙げられる。得ら
れたPCR 産物は、上記と同様にしてクローニングしてそ
の塩基配列を解析され決定される。また決定されたDNA
の塩基配列を基にプライマーをデザインし、これらプラ
イマーと各種の動物細胞由来のcDNAライブラリー（例え
ば、各種のヒト細胞由来のcDNAライブラリー）を用い
て、スクリーニングを行うことにより、同様に目的とす
るクローンを得ることができる。またこれらプライマー
を用いてPCR 増幅を行い、目的とする遺伝子や、新規な
遺伝子、それらの断片などを得ることができる。こうし
てヒトMT5-MMP と相同性を有するが、配列が新規なPCR
産物を検索することもできる。
【００５３】こうして本発明に従って、目的とするDNA
を含有するクローン（例えば、組換え体ファージなどと
して）を得ることができる。例えば、このクローン化し
た組換え体ファージより単離された遺伝子のDNA の決定
した塩基配列の全長は2118bpであり、その配列は配列表
の配列番号:9で示されたものが得られていることが認め
られる。この同定された約2.1kb のDNA 配列中には、推
定645 個のアミノ酸をコードするオープンリーディング
フレームの存在が認められ、その推定されるアミノ酸配
列は、配列表の配列番号:1で示されるようなものと認め
られる。 GenBankTM /EMBL DNA Data Baseを使用し、配
列表の配列番号:2に記載した塩基配列を検索したとこ
ろ、新規な配列を有しているものであることが認められ
た。この推定されるタンパク質は、ヒトMT3-MMP と約63
％という相同性を示し、新規なヒト膜結合型メタロプロ
テアーゼであり、それを「MT5-MMP 」と名付けた（(Mem
brane-Type Matrix metalloproteinase-5)とも呼称され
る）。配列表の配列番号:2又は9 で表される塩基配列と
同一の配列は、GeneBankTM/EMBL DNA Data Base に基づ
くチェックで、新規な塩基配列を有するDNA であること
が認められた。該コードタンパク質は、開始コドンのす
ぐ下流から推定されるシグナル配列が続き、プロペプチ
ド領域に続いて、触媒ドメイン、ヒンジ領域、ヘモペキ
シン様領域が存在し、Ｃ末端側に疎水性アミノ酸の連続
した膜結合型タンパク質に特徴的な疎水性領域の存在が
認められた。こうして得られた新規MT-MMPを「MT5-MMP
」と命名した。図１に示すように、MT5-MMP では、こ
れまでに見出されている膜結合型メタロプロテアーゼと
同じくＣ末端領域に疎水性アミノ酸の連続した配列が存
在することから、膜結合型のMMP であることが示唆され
た。このような疎水性アミノ酸の連続した配列は、膜結
合型MMP 以外のMMP ファミリーには存在しない。また、
図２に示すように既知のMT-MMPファミリーのアミノ酸配
列との相同性を調査した結果、MT5-MMP は既知のMT-MMP
ファミリーと高い相同性を示した。MT-MMPファミリーで
保存されている前駆体と成熟体のプロセッシング部位近
傍の配列、および活性部位の配列はMT5-MMP 中でも良好
に保存されていた。また、MMP の１次構造上の特徴であ
るプロペプチドドメイン、Zn2+結合触媒ドメイン、プロ
リンに富んだヒンジドメイン、C-末端のヘモペキシン凝
血酵素様ドメインは良好に保存されていた。
を含有するクローン（例えば、組換え体ファージなどと
して）を得ることができる。例えば、このクローン化し
た組換え体ファージより単離された遺伝子のDNA の決定
した塩基配列の全長は2118bpであり、その配列は配列表
の配列番号:9で示されたものが得られていることが認め
られる。この同定された約2.1kb のDNA 配列中には、推
定645 個のアミノ酸をコードするオープンリーディング
フレームの存在が認められ、その推定されるアミノ酸配
列は、配列表の配列番号:1で示されるようなものと認め
られる。 GenBankTM /EMBL DNA Data Baseを使用し、配
列表の配列番号:2に記載した塩基配列を検索したとこ
ろ、新規な配列を有しているものであることが認められ
た。この推定されるタンパク質は、ヒトMT3-MMP と約63
％という相同性を示し、新規なヒト膜結合型メタロプロ
テアーゼであり、それを「MT5-MMP 」と名付けた（(Mem
brane-Type Matrix metalloproteinase-5)とも呼称され
る）。配列表の配列番号:2又は9 で表される塩基配列と
同一の配列は、GeneBankTM/EMBL DNA Data Base に基づ
くチェックで、新規な塩基配列を有するDNA であること
が認められた。該コードタンパク質は、開始コドンのす
ぐ下流から推定されるシグナル配列が続き、プロペプチ
ド領域に続いて、触媒ドメイン、ヒンジ領域、ヘモペキ
シン様領域が存在し、Ｃ末端側に疎水性アミノ酸の連続
した膜結合型タンパク質に特徴的な疎水性領域の存在が
認められた。こうして得られた新規MT-MMPを「MT5-MMP
」と命名した。図１に示すように、MT5-MMP では、こ
れまでに見出されている膜結合型メタロプロテアーゼと
同じくＣ末端領域に疎水性アミノ酸の連続した配列が存
在することから、膜結合型のMMP であることが示唆され
た。このような疎水性アミノ酸の連続した配列は、膜結
合型MMP 以外のMMP ファミリーには存在しない。また、
図２に示すように既知のMT-MMPファミリーのアミノ酸配
列との相同性を調査した結果、MT5-MMP は既知のMT-MMP
ファミリーと高い相同性を示した。MT-MMPファミリーで
保存されている前駆体と成熟体のプロセッシング部位近
傍の配列、および活性部位の配列はMT5-MMP 中でも良好
に保存されていた。また、MMP の１次構造上の特徴であ
るプロペプチドドメイン、Zn2+結合触媒ドメイン、プロ
リンに富んだヒンジドメイン、C-末端のヘモペキシン凝
血酵素様ドメインは良好に保存されていた。
【００５４】本発明で得られたDNA 断片を、下記で詳し
く説明するような適当なベクター、例えば、プラスミド
pEX 、pMAMneo 、pKG5などのベクターに組込み、下記で
詳しく説明するような適当な宿主細胞、例えば、大腸
菌、酵母、CHO 細胞、COS 細胞などで発現させることが
できる。また、該DNA 断片は、そのままあるいは適当な
制御配列を付加したDNA 断片として、または適当なベク
ターに組込み、そして動物に導入して、MT5-MMP 遺伝
子、例えば、ヒトMT5-MMP を発現するトランスジェニッ
ク動物を作成することができる。動物としては、温血動
物が挙げられ、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モル
モット、ウシなどが挙げられる。好ましくは、マウスな
どの動物の受精卵に該DNA 断片を導入して、トランスジ
ェニック動物を作成することができる。配列表の配列番
号:2又は9 で示される塩基配列の全部あるいは一部を有
する核酸は、化学合成によって得ることも可能である。
その場合断片を化学合成し、それらを酵素により結合す
ることによってもよい。また、化学合成断片を上記した
ようにして、プライマーあるいはプローブとして用いて
目的とする配列を得ることも可能である。PCR 法で用い
るプライマーとしては、上記の部位を含むDNA 断片を増
幅できるものであれば、特に限定されない。代表的に
は、プライマーは (a)配列表の配列番号:2又は9 に示さ
れた塩基配列のうちの任意の領域に相当する塩基配列を
有するオリゴヌクレオチド及び (b)配列表の配列番号:2
又は9 に示された塩基配列のうちの任意の領域に対する
相補塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用するこ
とができ、より好ましくは(1) 配列表の配列番号:2又は
9 に示された塩基配列のうちの5'端側の任意の領域に相
当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び (2)配
列表の配列番号:2又は9 に示された塩基配列のうちの3'
端側の任意の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドを使用することができ、例えば、３〜100
個、好ましくは10〜50個、さらに好ましくは15〜35個の
ヌクレオチドを含有するものが挙げられる。また、PCR
条件も特に限定されず、通常行われる公知の条件でよ
く、例えば、上記した文献の記載を参考に選択すること
ができる。PCR においては、DNA 鎖の熱変性、プライマ
ーのアニーリング及びポリメラーゼによる相補鎖の合成
からなる一つのサイクルが、例えば、10〜50回、好まし
くは20〜35回、より好ましくは25〜30回繰り返して行わ
れる。
く説明するような適当なベクター、例えば、プラスミド
pEX 、pMAMneo 、pKG5などのベクターに組込み、下記で
詳しく説明するような適当な宿主細胞、例えば、大腸
菌、酵母、CHO 細胞、COS 細胞などで発現させることが
できる。また、該DNA 断片は、そのままあるいは適当な
制御配列を付加したDNA 断片として、または適当なベク
ターに組込み、そして動物に導入して、MT5-MMP 遺伝
子、例えば、ヒトMT5-MMP を発現するトランスジェニッ
ク動物を作成することができる。動物としては、温血動
物が挙げられ、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モル
モット、ウシなどが挙げられる。好ましくは、マウスな
どの動物の受精卵に該DNA 断片を導入して、トランスジ
ェニック動物を作成することができる。配列表の配列番
号:2又は9 で示される塩基配列の全部あるいは一部を有
する核酸は、化学合成によって得ることも可能である。
その場合断片を化学合成し、それらを酵素により結合す
ることによってもよい。また、化学合成断片を上記した
ようにして、プライマーあるいはプローブとして用いて
目的とする配列を得ることも可能である。PCR 法で用い
るプライマーとしては、上記の部位を含むDNA 断片を増
幅できるものであれば、特に限定されない。代表的に
は、プライマーは (a)配列表の配列番号:2又は9 に示さ
れた塩基配列のうちの任意の領域に相当する塩基配列を
有するオリゴヌクレオチド及び (b)配列表の配列番号:2
又は9 に示された塩基配列のうちの任意の領域に対する
相補塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用するこ
とができ、より好ましくは(1) 配列表の配列番号:2又は
9 に示された塩基配列のうちの5'端側の任意の領域に相
当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び (2)配
列表の配列番号:2又は9 に示された塩基配列のうちの3'
端側の任意の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドを使用することができ、例えば、３〜100
個、好ましくは10〜50個、さらに好ましくは15〜35個の
ヌクレオチドを含有するものが挙げられる。また、PCR
条件も特に限定されず、通常行われる公知の条件でよ
く、例えば、上記した文献の記載を参考に選択すること
ができる。PCR においては、DNA 鎖の熱変性、プライマ
ーのアニーリング及びポリメラーゼによる相補鎖の合成
からなる一つのサイクルが、例えば、10〜50回、好まし
くは20〜35回、より好ましくは25〜30回繰り返して行わ
れる。
【００５５】MT5-MMP 遺伝子産物の確認を、MT5-MMP 遺
伝子をトランスフェクションしたCOS-1 細胞などの適し
た動物細胞などを用いて行うことができる。この外来遺
伝子を哺乳動物などの動物細胞に導入する方法としては
当該分野で知られた方法あるいはそれと実質的に同様な
方法で行うことができ、例えばリン酸カルシウム法（例
えば、F. L. Graham et al., Virology, 52: 456, 1973
など）、DEAE- デキストラン法（例えば、D. Warden et
al., J. Gen. Virol., 3: 371, 1968など）、エレクト
ロポレーション法（例えば、E. Neumann et al., EMBO
J, 1: 841, 1982 など）、マイクロインジェクション
法、リボソーム法、ウイルス感染法、ファージ粒子法な
どが挙げられる。こうしてMT5-MMP 遺伝子をトランスフ
ェクションされた動物細胞の産生する遺伝子産物は、そ
れを解析することもできる。解析には、例えば、遺伝子
産物（例えば、融合タンパク質など）中の特定領域（例
えば、融合タグ部など）に特異的に反応することが知ら
れている抗体、抗ヒトMT5-MMP モノクローナル抗体など
を用いた免疫沈降実験あるいはウェスタンブロッティン
グなどを用いることができる。例えば、本発明に従い得
られた形質転換動物細胞の産生する遺伝子産物（ヘマグ
ルチニン(HA)融合タンパク質として発現されている）を
抗HAモノクローナル抗体を用いた免疫沈降実験で解析し
た結果、MT5-MMP 遺伝子産物は分泌されることなく、細
胞表層上で発現していることが示唆された。したがっ
て、MT5-MMP 遺伝子は、新規な膜結合型メタロプロテア
ーゼタンパク質をコードしていることは明白であり、MT
5-MMP 遺伝子を用いて作製した組換え体プラスミドは全
て新規な組換え体であり、そのプラスミドで形質転換あ
るいはトランスフェクトされ得られた形質転換体あるい
はトランスフェクタントも新規なものである。
伝子をトランスフェクションしたCOS-1 細胞などの適し
た動物細胞などを用いて行うことができる。この外来遺
伝子を哺乳動物などの動物細胞に導入する方法としては
当該分野で知られた方法あるいはそれと実質的に同様な
方法で行うことができ、例えばリン酸カルシウム法（例
えば、F. L. Graham et al., Virology, 52: 456, 1973
など）、DEAE- デキストラン法（例えば、D. Warden et
al., J. Gen. Virol., 3: 371, 1968など）、エレクト
ロポレーション法（例えば、E. Neumann et al., EMBO
J, 1: 841, 1982 など）、マイクロインジェクション
法、リボソーム法、ウイルス感染法、ファージ粒子法な
どが挙げられる。こうしてMT5-MMP 遺伝子をトランスフ
ェクションされた動物細胞の産生する遺伝子産物は、そ
れを解析することもできる。解析には、例えば、遺伝子
産物（例えば、融合タンパク質など）中の特定領域（例
えば、融合タグ部など）に特異的に反応することが知ら
れている抗体、抗ヒトMT5-MMP モノクローナル抗体など
を用いた免疫沈降実験あるいはウェスタンブロッティン
グなどを用いることができる。例えば、本発明に従い得
られた形質転換動物細胞の産生する遺伝子産物（ヘマグ
ルチニン(HA)融合タンパク質として発現されている）を
抗HAモノクローナル抗体を用いた免疫沈降実験で解析し
た結果、MT5-MMP 遺伝子産物は分泌されることなく、細
胞表層上で発現していることが示唆された。したがっ
て、MT5-MMP 遺伝子は、新規な膜結合型メタロプロテア
ーゼタンパク質をコードしていることは明白であり、MT
5-MMP 遺伝子を用いて作製した組換え体プラスミドは全
て新規な組換え体であり、そのプラスミドで形質転換あ
るいはトランスフェクトされ得られた形質転換体あるい
はトランスフェクタントも新規なものである。
【００５６】MT5-MMP 遺伝子を組込むプラスミドとして
は遺伝子工学的に常用される宿主細胞（例えば、大腸
菌、枯草菌等の原核細胞宿主、酵母、CHO 細胞、COS 細
胞等の真核細胞宿主、Sf21等の昆虫細胞宿主）中で該DN
A が発現できるプラスミドであればどのようなプラスミ
ドでもよい。こうした配列内には、例えば選択した宿主
細胞で発現するのに好適なコドンが導入されていること
ができるし、制限酵素部位が設けられていることもでき
るし、目的とする遺伝子の発現を容易にするための制御
配列、促進配列など、目的とする遺伝子を結合するのに
役立つリンカー、アダプターなど、さらには抗生物質耐
性などを制御したり、代謝を制御したりし、選別などに
有用な配列等を含んでいることができる。好ましくは、
適当なプロモーター、例えば大腸菌を宿主とするプラス
ミドでは、トリプトファン(trp) プロモーター、ラクト
ース(lac) プロモーター、トリプトファン・ラクトース
(tac) プロモーター、リポプロテイン(lpp) プロモータ
ー、λファージ PL プロモーター等を、動物細胞を宿主
とするプラスミドでは、SV40レートプロモーター、MMTV
LTRプロモーター、RSV LTR プロモーター、CMV プロモ
ーター、SRαプロモーター等を、酵母を宿主とするプラ
スミドでは、GAL1、GAL10 プロモーター等を使用し得
る。大腸菌を宿主とするプラスミドとしては、例えばpB
R322, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pSP64, pSP65,
pTZ-18R/-18U,pTZ-19R/-19U, pGEM-3, pGEM-4, pGEM-3
Z, pGEM-4Z, pGEM-5Zf(-), pBluescriptKS TM (Stratag
ene) などが挙げられる。大腸菌での発現に適したプラ
スミドベクターとしては、pAS, pKK223 (Pharmacia), p
MC1403, pMC931, pKC30, pRSET-B(Invitrogen) なども
挙げられる。動物細胞を宿主とするプラスミドとして
は、SV40ベクター、ポリオーマ・ウイルスベクター、ワ
クシニア・ウイルスベクター、レトロウイルスベクター
などが挙げられ、例えばpcD, pcD-SRα, CDM8, pCEV4,
pME18S, pBC12BI, pSG5 (Stratagene) などが挙げられ
る。酵母を宿主とするプラスミドとしては、YIp 型ベク
ター、YEp 型ベクター、YRp 型ベクター、YCp型ベクタ
ーなどが挙げられ、例えばpGPD-2などが挙げられる。宿
主細胞としては、宿主細胞が大腸菌の場合、例えば大腸
菌K12 株に由来するものが挙げられ、例えばNM533 XL1-
Blue, C600, DH1, DH5, DH11S, DH12S, DH5α, DH10B,
HB101,MC1061, JM109, STBL2, BL21(DE3)pLysSなどが
挙げられる。宿主細胞が動物細胞の場合、例えばアフリ
カミドリザル線維芽細胞由来のCOS-7 細胞、COS-1 細
胞、CV-1細胞、マウス線維芽細胞由来のCOP 細胞、MOP
細胞、WOP 細胞、チャイニーズ・ハムスター細胞由来の
CHO 細胞、CHO DHFR- 細胞、ヒトHeLa細胞、マウス細胞
由来C127細胞、マウス細胞由来NIH 3T3 細胞などが挙げ
られる。昆虫細胞としては、カイコ核多角体病ウイルス
(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus)あるいは
それに由来するものをベクターとし、カイコ幼虫あるい
はカイコ培養細胞、例えばBM-N細胞などを用いることが
挙げられる。植物細胞を宿主細胞として使用することも
可能であり、それに適するベクターと共に、それらは当
該分野で広く知られている。
は遺伝子工学的に常用される宿主細胞（例えば、大腸
菌、枯草菌等の原核細胞宿主、酵母、CHO 細胞、COS 細
胞等の真核細胞宿主、Sf21等の昆虫細胞宿主）中で該DN
A が発現できるプラスミドであればどのようなプラスミ
ドでもよい。こうした配列内には、例えば選択した宿主
細胞で発現するのに好適なコドンが導入されていること
ができるし、制限酵素部位が設けられていることもでき
るし、目的とする遺伝子の発現を容易にするための制御
配列、促進配列など、目的とする遺伝子を結合するのに
役立つリンカー、アダプターなど、さらには抗生物質耐
性などを制御したり、代謝を制御したりし、選別などに
有用な配列等を含んでいることができる。好ましくは、
適当なプロモーター、例えば大腸菌を宿主とするプラス
ミドでは、トリプトファン(trp) プロモーター、ラクト
ース(lac) プロモーター、トリプトファン・ラクトース
(tac) プロモーター、リポプロテイン(lpp) プロモータ
ー、λファージ PL プロモーター等を、動物細胞を宿主
とするプラスミドでは、SV40レートプロモーター、MMTV
LTRプロモーター、RSV LTR プロモーター、CMV プロモ
ーター、SRαプロモーター等を、酵母を宿主とするプラ
スミドでは、GAL1、GAL10 プロモーター等を使用し得
る。大腸菌を宿主とするプラスミドとしては、例えばpB
R322, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pSP64, pSP65,
pTZ-18R/-18U,pTZ-19R/-19U, pGEM-3, pGEM-4, pGEM-3
Z, pGEM-4Z, pGEM-5Zf(-), pBluescriptKS TM (Stratag
ene) などが挙げられる。大腸菌での発現に適したプラ
スミドベクターとしては、pAS, pKK223 (Pharmacia), p
MC1403, pMC931, pKC30, pRSET-B(Invitrogen) なども
挙げられる。動物細胞を宿主とするプラスミドとして
は、SV40ベクター、ポリオーマ・ウイルスベクター、ワ
クシニア・ウイルスベクター、レトロウイルスベクター
などが挙げられ、例えばpcD, pcD-SRα, CDM8, pCEV4,
pME18S, pBC12BI, pSG5 (Stratagene) などが挙げられ
る。酵母を宿主とするプラスミドとしては、YIp 型ベク
ター、YEp 型ベクター、YRp 型ベクター、YCp型ベクタ
ーなどが挙げられ、例えばpGPD-2などが挙げられる。宿
主細胞としては、宿主細胞が大腸菌の場合、例えば大腸
菌K12 株に由来するものが挙げられ、例えばNM533 XL1-
Blue, C600, DH1, DH5, DH11S, DH12S, DH5α, DH10B,
HB101,MC1061, JM109, STBL2, BL21(DE3)pLysSなどが
挙げられる。宿主細胞が動物細胞の場合、例えばアフリ
カミドリザル線維芽細胞由来のCOS-7 細胞、COS-1 細
胞、CV-1細胞、マウス線維芽細胞由来のCOP 細胞、MOP
細胞、WOP 細胞、チャイニーズ・ハムスター細胞由来の
CHO 細胞、CHO DHFR- 細胞、ヒトHeLa細胞、マウス細胞
由来C127細胞、マウス細胞由来NIH 3T3 細胞などが挙げ
られる。昆虫細胞としては、カイコ核多角体病ウイルス
(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus)あるいは
それに由来するものをベクターとし、カイコ幼虫あるい
はカイコ培養細胞、例えばBM-N細胞などを用いることが
挙げられる。植物細胞を宿主細胞として使用することも
可能であり、それに適するベクターと共に、それらは当
該分野で広く知られている。
【００５７】本発明の遺伝子工学的手法においては、当
該分野で知られたあるいは汎用されている制限酵素、逆
転写酵素、DNA 断片をクローン化するのに適した構造に
修飾したりあるいは変換するための酵素であるDNA 修飾
・分解酵素、DNA ポリメラーゼ、末端ヌクレオチジルト
ランスフェラーゼ、DNA リガーゼなどを用いることが出
来る。制限酵素としては、例えば、R. J. Roberts, Nuc
leic Acids Res., 13:r165, 1985; S. Linn et al. ed.
Nucleases, p. 109, Cold Spring Harbor Lab., Cold
Spring Harbor, New York, 1982; R. J. Roberts, D. M
acelis, Nucleic Acids Res., 19: Suppl. 2077, 1991
などに記載のものが挙げられる。逆転写酵素としては、
例えばマウスモロネイ白血病ウイルス (mouse Moloney
leukemiavirus; MMLV) 由来の逆転写酵素 (reverse tra
nscriptase)、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス (avian mye
loblastosis virus; AMV)由来の逆転写酵素などが挙げ
られる。逆転写酵素は、RNase H 欠損体などは好ましく
用いることができ、特にはRNase H 活性を欠いた修飾MM
LV RT が好ましく使用でき、さらには熱安定性の高いも
のが好ましい。適した逆転写酵素としては、MMLV RT (G
ibco-BRL) 、Superscript RT plus (Life Technologie
s) などが挙げられる。DNA ポリメラーゼとしては、例
えば大腸菌DNA ポリメラーゼ、その誘導体であるクレノ
ー・フラグメント、大腸菌ファージT4 DNAポリメラー
ゼ、大腸菌ファージT7 DNAポリメラーゼ、耐熱菌DNA ポ
リメラーゼなどが挙げられる。末端ヌクレオチジルトラ
ンスフェラーゼとしては、例えばR. Wu et al. ed., "M
ethods inEnzymology", Vol. 100, p. 96, Academic Pr
ess, New York (1983) に記載の3'-OH 末端にデオキシ
ヌクレオチド(dNMP)を付加するTdTaseなどが挙げられ
る。DNA 修飾・分解酵素としては、エキソヌクレアー
ゼ、エンドヌクレアーゼなどが挙げられ、例えばヘビ毒
ホスホジエステラーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、大
腸菌DNA エキソヌクレアーゼ I、大腸菌DNA エキソヌク
レアーゼIII 、大腸菌DNAエキソヌクレアーゼ VII、λ
エキソヌクレアーゼ、DNase I 、ヌクレアーゼS1、ミク
ロコッカス (Micrococcus) ヌクレアーゼなどが挙げら
れる。DNA リガーゼとしては、例えば大腸菌DNA リガー
ゼ、T4 DNAリガーゼなどが挙げられる。DNA 遺伝子をク
ローニングしてDNA ライブラリーを構築するのに適した
ベクターとしては、プラスミド、λファージ、コスミ
ド、P1ファージ、Ｆ因子、YAC などが挙げられ、好まし
くはλファージ由来のベクターが挙げられ、例えばChar
on4A 、Charon 21A、λgt10、λgt11、λDASHII、λFIX
II 、λEMBL3 、λZAPII TM (Stratagene) などが挙げら
れる。
該分野で知られたあるいは汎用されている制限酵素、逆
転写酵素、DNA 断片をクローン化するのに適した構造に
修飾したりあるいは変換するための酵素であるDNA 修飾
・分解酵素、DNA ポリメラーゼ、末端ヌクレオチジルト
ランスフェラーゼ、DNA リガーゼなどを用いることが出
来る。制限酵素としては、例えば、R. J. Roberts, Nuc
leic Acids Res., 13:r165, 1985; S. Linn et al. ed.
Nucleases, p. 109, Cold Spring Harbor Lab., Cold
Spring Harbor, New York, 1982; R. J. Roberts, D. M
acelis, Nucleic Acids Res., 19: Suppl. 2077, 1991
などに記載のものが挙げられる。逆転写酵素としては、
例えばマウスモロネイ白血病ウイルス (mouse Moloney
leukemiavirus; MMLV) 由来の逆転写酵素 (reverse tra
nscriptase)、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス (avian mye
loblastosis virus; AMV)由来の逆転写酵素などが挙げ
られる。逆転写酵素は、RNase H 欠損体などは好ましく
用いることができ、特にはRNase H 活性を欠いた修飾MM
LV RT が好ましく使用でき、さらには熱安定性の高いも
のが好ましい。適した逆転写酵素としては、MMLV RT (G
ibco-BRL) 、Superscript RT plus (Life Technologie
s) などが挙げられる。DNA ポリメラーゼとしては、例
えば大腸菌DNA ポリメラーゼ、その誘導体であるクレノ
ー・フラグメント、大腸菌ファージT4 DNAポリメラー
ゼ、大腸菌ファージT7 DNAポリメラーゼ、耐熱菌DNA ポ
リメラーゼなどが挙げられる。末端ヌクレオチジルトラ
ンスフェラーゼとしては、例えばR. Wu et al. ed., "M
ethods inEnzymology", Vol. 100, p. 96, Academic Pr
ess, New York (1983) に記載の3'-OH 末端にデオキシ
ヌクレオチド(dNMP)を付加するTdTaseなどが挙げられ
る。DNA 修飾・分解酵素としては、エキソヌクレアー
ゼ、エンドヌクレアーゼなどが挙げられ、例えばヘビ毒
ホスホジエステラーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、大
腸菌DNA エキソヌクレアーゼ I、大腸菌DNA エキソヌク
レアーゼIII 、大腸菌DNAエキソヌクレアーゼ VII、λ
エキソヌクレアーゼ、DNase I 、ヌクレアーゼS1、ミク
ロコッカス (Micrococcus) ヌクレアーゼなどが挙げら
れる。DNA リガーゼとしては、例えば大腸菌DNA リガー
ゼ、T4 DNAリガーゼなどが挙げられる。DNA 遺伝子をク
ローニングしてDNA ライブラリーを構築するのに適した
ベクターとしては、プラスミド、λファージ、コスミ
ド、P1ファージ、Ｆ因子、YAC などが挙げられ、好まし
くはλファージ由来のベクターが挙げられ、例えばChar
on4A 、Charon 21A、λgt10、λgt11、λDASHII、λFIX
II 、λEMBL3 、λZAPII TM (Stratagene) などが挙げら
れる。
【００５８】本発明のタンパク質をコードする核酸を含
有する発現ベクターで形質転換された形質転換体は、必
要に応じて適当な選択マーカーを用い、繰り返しクロー
ニングを行うことにより、高い発現能を安定して有する
細胞株を得ることができる。例えば、宿主細胞として動
物細胞を用いた形質転換体において、dhfr遺伝子を選択
マーカーとして利用した場合、MTX 濃度を徐々に上げて
培養し、耐性株を選択することにより、本発明のタンパ
ク質をコードするDNA を増幅させ、より高い発現を得ら
れる細胞株を得ることができる。本発明の形質転換体
は、本発明のタンパク質をコードする核酸が発現可能な
条件下で培養し、目的物を生成、蓄積せしめることがで
きる。該形質転換体は、当該分野で汎用されている培地
中で培養することができる。例えば、大腸菌、枯草菌等
の原核細胞宿主、酵母などを宿主としている形質転換体
は、液体培地を好適に使用することができる。培地中に
は、該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機
物その他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえ
ばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖な
ど、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸
塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、
肉エキス、麦芽エキス、大豆粕、バレイショ抽出液など
の無機または有機物質、無機物としては，例えば、塩化
カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウ
ム、炭酸カルシウムなどが挙げられる。また、酵母、ビ
タミン類、カザミノ酸、生長促進因子などを添加しても
よい。また、必要によりプロモーターを効率よく働かせ
るために、例えば、３β−インドリル アクリル酸のよ
うな薬剤を加えることができる。培地のpHは約５〜８が
望ましい。
有する発現ベクターで形質転換された形質転換体は、必
要に応じて適当な選択マーカーを用い、繰り返しクロー
ニングを行うことにより、高い発現能を安定して有する
細胞株を得ることができる。例えば、宿主細胞として動
物細胞を用いた形質転換体において、dhfr遺伝子を選択
マーカーとして利用した場合、MTX 濃度を徐々に上げて
培養し、耐性株を選択することにより、本発明のタンパ
ク質をコードするDNA を増幅させ、より高い発現を得ら
れる細胞株を得ることができる。本発明の形質転換体
は、本発明のタンパク質をコードする核酸が発現可能な
条件下で培養し、目的物を生成、蓄積せしめることがで
きる。該形質転換体は、当該分野で汎用されている培地
中で培養することができる。例えば、大腸菌、枯草菌等
の原核細胞宿主、酵母などを宿主としている形質転換体
は、液体培地を好適に使用することができる。培地中に
は、該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機
物その他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえ
ばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖な
ど、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸
塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、
肉エキス、麦芽エキス、大豆粕、バレイショ抽出液など
の無機または有機物質、無機物としては，例えば、塩化
カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウ
ム、炭酸カルシウムなどが挙げられる。また、酵母、ビ
タミン類、カザミノ酸、生長促進因子などを添加しても
よい。また、必要によりプロモーターを効率よく働かせ
るために、例えば、３β−インドリル アクリル酸のよ
うな薬剤を加えることができる。培地のpHは約５〜８が
望ましい。
【００５９】培養は、例えば大腸菌では通常約15〜45℃
で約３〜75時間行い、必要により、通気や攪拌を加える
こともできる。宿主が動物細胞である形質転換体を培養
する際、培地としては、たとえば約５〜20％の胎児牛血
清を含むMEM 培地、PRMI1640培地、DMEM培地などが用い
られる。pHは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常
約30℃〜40℃で約15〜72時間行い、必要に応じて通気や
攪拌を加える。上記培養細胞から抽出するに際しては、
培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを
適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／ま
たは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した
のち、遠心分離やろ過により粗抽出液を得る方法などを
適宜用いることができる。緩衝液の中には尿素や塩酸グ
アニジンなどの蛋白変性剤や、トリトン X-100（商品
名）、ツウィーン-80 （商品名）などの界面活性剤を加
えてあってもよい。培養液中に目的生成物が分泌される
場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体ある
いは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このように
して得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる目
的生成物は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わ
せてその精製を行なうことができ、例えば硫酸アンモニ
ウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによるゲル
ろ過法、例えばジエチルアミノエチル基あるいはカルボ
キシメチル基などを持つ担体などを用いたイオン交換ク
ロマトグラフィー法、例えばブチル基、オクチル基、フ
ェニル基など疎水性基を持つ担体などを用いた疎水性ク
ロマトグラフィー法、色素ゲルクロマトグラフィー法、
電気泳動法、透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマ
トグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法などに
より精製して得ることができる。好ましくは、ポリアク
リルアミド電気泳動、モノクローナル抗体などの抗原と
特異的に反応する抗体などを固定化したアフィニティー
・クロマトグラフィーなどで処理し精製分離処理でき
る。例えば、ゼラチン−アガロース・アフィニティー・
クロマトグラフィー、ヘパリン−アガロース・クロマト
グラフィーなどが挙げられる。
で約３〜75時間行い、必要により、通気や攪拌を加える
こともできる。宿主が動物細胞である形質転換体を培養
する際、培地としては、たとえば約５〜20％の胎児牛血
清を含むMEM 培地、PRMI1640培地、DMEM培地などが用い
られる。pHは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常
約30℃〜40℃で約15〜72時間行い、必要に応じて通気や
攪拌を加える。上記培養細胞から抽出するに際しては、
培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを
適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／ま
たは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した
のち、遠心分離やろ過により粗抽出液を得る方法などを
適宜用いることができる。緩衝液の中には尿素や塩酸グ
アニジンなどの蛋白変性剤や、トリトン X-100（商品
名）、ツウィーン-80 （商品名）などの界面活性剤を加
えてあってもよい。培養液中に目的生成物が分泌される
場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体ある
いは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このように
して得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる目
的生成物は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わ
せてその精製を行なうことができ、例えば硫酸アンモニ
ウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによるゲル
ろ過法、例えばジエチルアミノエチル基あるいはカルボ
キシメチル基などを持つ担体などを用いたイオン交換ク
ロマトグラフィー法、例えばブチル基、オクチル基、フ
ェニル基など疎水性基を持つ担体などを用いた疎水性ク
ロマトグラフィー法、色素ゲルクロマトグラフィー法、
電気泳動法、透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマ
トグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法などに
より精製して得ることができる。好ましくは、ポリアク
リルアミド電気泳動、モノクローナル抗体などの抗原と
特異的に反応する抗体などを固定化したアフィニティー
・クロマトグラフィーなどで処理し精製分離処理でき
る。例えば、ゼラチン−アガロース・アフィニティー・
クロマトグラフィー、ヘパリン−アガロース・クロマト
グラフィーなどが挙げられる。
【００６０】さらに、本発明に係わるMT5-MMP の遺伝子
塩基配列を基に遺伝子工学的に常用される方法を用いる
ことにより、MT5-MMP のアミノ酸配列中に適宜、１個な
いし複数個以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、転移あ
るいは付加したごとき変異を導入した相当するタンパク
質を製造することができる。こうした変異・変換・修飾
法としては、日本生化学会編、「続生化学実験講座１、
遺伝子研究法 II 」、p105（広瀬進）、東京化学同人(1
986); 日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 I
II（組換えDNA 技術）」、p233（広瀬進）、東京化学同
人(1992); R. Wu, L. Grossman, ed., "Methods in Enz
ymology", Vol. 154, p. 350 & p. 367,Academic Pres
s, New York (1987); R. Wu, L. Grossman, ed., "Meth
ods in Enzymology", Vol. 100, p. 457 & p. 468, Aca
demic Press, New York (1983);J. A. Wells et al.,
Gene, 34: 315, 1985; T. Grundstroem et al., Nuclei
cAcids Res., 13: 3305, 1985; J. Taylor et al., Nuc
leic Acids Res., 13: 8765, 1985; R. Wu ed., "Metho
ds in Enzymology", Vol. 155, p. 568, Academic Pres
s, New York （1987); A. R. Oliphant et al., Gene,
44: 177, 1986 などに記載の方法が挙げられる。例えば
合成オリゴヌクレオチドなどを利用する位置指定変異導
入法（部位特異的変異導入法）、 Kunkel 法、 dNTP[α
S]法（Eckstein) 、亜硫酸や亜硝酸などを用いる領域指
定変異導入法等の方法が挙げられる。
塩基配列を基に遺伝子工学的に常用される方法を用いる
ことにより、MT5-MMP のアミノ酸配列中に適宜、１個な
いし複数個以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、転移あ
るいは付加したごとき変異を導入した相当するタンパク
質を製造することができる。こうした変異・変換・修飾
法としては、日本生化学会編、「続生化学実験講座１、
遺伝子研究法 II 」、p105（広瀬進）、東京化学同人(1
986); 日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 I
II（組換えDNA 技術）」、p233（広瀬進）、東京化学同
人(1992); R. Wu, L. Grossman, ed., "Methods in Enz
ymology", Vol. 154, p. 350 & p. 367,Academic Pres
s, New York (1987); R. Wu, L. Grossman, ed., "Meth
ods in Enzymology", Vol. 100, p. 457 & p. 468, Aca
demic Press, New York (1983);J. A. Wells et al.,
Gene, 34: 315, 1985; T. Grundstroem et al., Nuclei
cAcids Res., 13: 3305, 1985; J. Taylor et al., Nuc
leic Acids Res., 13: 8765, 1985; R. Wu ed., "Metho
ds in Enzymology", Vol. 155, p. 568, Academic Pres
s, New York （1987); A. R. Oliphant et al., Gene,
44: 177, 1986 などに記載の方法が挙げられる。例えば
合成オリゴヌクレオチドなどを利用する位置指定変異導
入法（部位特異的変異導入法）、 Kunkel 法、 dNTP[α
S]法（Eckstein) 、亜硫酸や亜硝酸などを用いる領域指
定変異導入法等の方法が挙げられる。
【００６１】さらに得られた本発明のタンパク質は、化
学的な手法でその含有されるアミノ酸残基を修飾するこ
ともできるし、ペプチダーゼ、例えばペプシン、キモト
リプシン、パパイン、ブロメライン、エンドペプチダー
ゼ、エキソペプチダーゼなどの酵素を用いて修飾した
り、部分分解したりしてその誘導体などにすることがで
きる。本発明のタンパク質は、C 末端が通常カルボキシ
ル基(-COOH) またはカルボキシレート (-COO- ) である
が、C 末端がアミド(-CONH2)またはエステル(-COOR) で
あってもよい。ここでエステルにおけるR としては、例
えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピルもし
くはn-ブチルなどのC1-6アルキル基、例えば、シクロペ
ンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8 シクロアルキル
基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのC6-12 アリ
ール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル
−C1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα
−ナフチル-C1-2 アルキル基などのC7-14 アラルキル基
のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオ
キシメチル基などが用いられる。本発明のタンパク質が
C末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレー
ト）を有している場合、カルボキシル基がアミド化また
はエステル化されているものも本発明のタンパク質に含
まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記した
C 末端のエステルなどが用いられる。
学的な手法でその含有されるアミノ酸残基を修飾するこ
ともできるし、ペプチダーゼ、例えばペプシン、キモト
リプシン、パパイン、ブロメライン、エンドペプチダー
ゼ、エキソペプチダーゼなどの酵素を用いて修飾した
り、部分分解したりしてその誘導体などにすることがで
きる。本発明のタンパク質は、C 末端が通常カルボキシ
ル基(-COOH) またはカルボキシレート (-COO- ) である
が、C 末端がアミド(-CONH2)またはエステル(-COOR) で
あってもよい。ここでエステルにおけるR としては、例
えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピルもし
くはn-ブチルなどのC1-6アルキル基、例えば、シクロペ
ンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8 シクロアルキル
基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのC6-12 アリ
ール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル
−C1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα
−ナフチル-C1-2 アルキル基などのC7-14 アラルキル基
のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオ
キシメチル基などが用いられる。本発明のタンパク質が
C末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレー
ト）を有している場合、カルボキシル基がアミド化また
はエステル化されているものも本発明のタンパク質に含
まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記した
C 末端のエステルなどが用いられる。
【００６２】さらに、本発明のタンパク質には、上記し
たタンパク質において、N 末端のメチオニン残基のアミ
ノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ
1-5アルキル−カルボニル基などのC1-6アシル基など）
で保護されているもの、N 端側が生体内で切断され生成
したグルタミル基がピログルタミル化したもの、分子内
のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、-OH 、-COOH 、
アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ
基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチ
ル基などのC1-6アシル基など）で保護されているもの、
あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複
合タンパク質なども含まれる。また遺伝子組換え法で製
造する時に融合タンパク質として発現させ、生体内ある
いは生体外で天然のMT5-MMP と実質的に同等の生物学的
活性を有しているものに変換・加工してもよい。遺伝子
工学的に常用される融合産生法を用いることができる
が、こうした融合タンパク質はその融合部を利用してア
フィニティクロマトグラフィーなどで精製することも可
能である。本発明の好ましい態様において、精製を好適
に実施するのに役立つマーカー配列、例えばヘキサ−ヒ
スチジンペプチドを融合したものなどが使用できる。タ
ンパク質の構造の修飾・改変などは、例えば日本生化学
会編、「新生化学実験講座１、タンパク質VII 、タンパ
ク質工学」、東京化学同人(1993)を参考にし、そこに記
載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法、さ
らにはそれらと実質的に同様な方法で行うことができ
る。また下記するようにその生物学的活性のうちには、
免疫的に活性、例えば抗原性を有するということも含ま
れてよい。
たタンパク質において、N 末端のメチオニン残基のアミ
ノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ
1-5アルキル−カルボニル基などのC1-6アシル基など）
で保護されているもの、N 端側が生体内で切断され生成
したグルタミル基がピログルタミル化したもの、分子内
のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、-OH 、-COOH 、
アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ
基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチ
ル基などのC1-6アシル基など）で保護されているもの、
あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複
合タンパク質なども含まれる。また遺伝子組換え法で製
造する時に融合タンパク質として発現させ、生体内ある
いは生体外で天然のMT5-MMP と実質的に同等の生物学的
活性を有しているものに変換・加工してもよい。遺伝子
工学的に常用される融合産生法を用いることができる
が、こうした融合タンパク質はその融合部を利用してア
フィニティクロマトグラフィーなどで精製することも可
能である。本発明の好ましい態様において、精製を好適
に実施するのに役立つマーカー配列、例えばヘキサ−ヒ
スチジンペプチドを融合したものなどが使用できる。タ
ンパク質の構造の修飾・改変などは、例えば日本生化学
会編、「新生化学実験講座１、タンパク質VII 、タンパ
ク質工学」、東京化学同人(1993)を参考にし、そこに記
載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法、さ
らにはそれらと実質的に同様な方法で行うことができ
る。また下記するようにその生物学的活性のうちには、
免疫的に活性、例えば抗原性を有するということも含ま
れてよい。
【００６３】かくして本発明のヒト由来のタンパク質
は、１個以上のアミノ酸残基が同一性の点で天然のもの
と異なるもの、１個以上のアミノ酸残基の位置が天然の
ものと異なるものであってもよい。本発明のヒト由来の
タンパク質は、MT5-MMP に特有なアミノ酸残基が１個以
上（例えば、１〜80個、好ましくは１〜60個、さらに好
ましくは１〜40個、さらに好ましくは１〜20個、特には
１〜10個など）欠けている欠失類縁体、特有のアミノ酸
残基の１個以上（例えば、１〜80個、好ましくは１〜60
個、さらに好ましくは１〜40個、さらに好ましくは１〜
20個、特には１〜10個など）が他の残基で置換されてい
る置換類縁体、１個以上（例えば、１〜80個、好ましく
は１〜60個、さらに好ましくは１〜40個、さらに好まし
くは１〜20個、特には１〜10個など）のアミノ酸残基が
付加されている付加類縁体も包含する。MMP の共通の特
徴であるドメイン構造やＣ末端のトランスメンブレンド
メイン構造が維持、又は酵素活性中心構造が維持されて
いれば、上記のごとき変異体は、全て本発明に包含され
てよい。特には、天然のヒトMT5-MMP の特徴であるドメ
イン構造やＣ末端のトランスメンブレンドメイン構造が
維持、又は酵素活性中心構造が維持されていれば、上記
のごとき変異体、誘導体、類縁体等は、全て本発明に包
含される。また本発明のMT5-MMP は天然のMT5-MMP と実
質的に同等の一次構造コンフォメーションあるいはその
一部を有しているものも含まれてよいと考えられ、さら
に天然のMT5-MMP と実質的に同等の生物学的活性を有し
ているものも含まれてよいと考えられる。さらに天然に
生ずる変異体の一つであることもできる。
は、１個以上のアミノ酸残基が同一性の点で天然のもの
と異なるもの、１個以上のアミノ酸残基の位置が天然の
ものと異なるものであってもよい。本発明のヒト由来の
タンパク質は、MT5-MMP に特有なアミノ酸残基が１個以
上（例えば、１〜80個、好ましくは１〜60個、さらに好
ましくは１〜40個、さらに好ましくは１〜20個、特には
１〜10個など）欠けている欠失類縁体、特有のアミノ酸
残基の１個以上（例えば、１〜80個、好ましくは１〜60
個、さらに好ましくは１〜40個、さらに好ましくは１〜
20個、特には１〜10個など）が他の残基で置換されてい
る置換類縁体、１個以上（例えば、１〜80個、好ましく
は１〜60個、さらに好ましくは１〜40個、さらに好まし
くは１〜20個、特には１〜10個など）のアミノ酸残基が
付加されている付加類縁体も包含する。MMP の共通の特
徴であるドメイン構造やＣ末端のトランスメンブレンド
メイン構造が維持、又は酵素活性中心構造が維持されて
いれば、上記のごとき変異体は、全て本発明に包含され
てよい。特には、天然のヒトMT5-MMP の特徴であるドメ
イン構造やＣ末端のトランスメンブレンドメイン構造が
維持、又は酵素活性中心構造が維持されていれば、上記
のごとき変異体、誘導体、類縁体等は、全て本発明に包
含される。また本発明のMT5-MMP は天然のMT5-MMP と実
質的に同等の一次構造コンフォメーションあるいはその
一部を有しているものも含まれてよいと考えられ、さら
に天然のMT5-MMP と実質的に同等の生物学的活性を有し
ているものも含まれてよいと考えられる。さらに天然に
生ずる変異体の一つであることもできる。
【００６４】本発明のヒト由来のタンパク質は、例え
ば、配列表の配列番号:1で表されるアミノ酸配列のう
ち、第156 番目〜第569 番目のアミノ酸配列を有するも
の、同第156 番目〜第645 番目のアミノ酸配列を有する
もの、同第87番目〜第391 番目のアミノ酸配列を有する
もの、同第89番目〜第645 番目のアミノ酸配列を有する
もの、同第１番目〜第569 番目のアミノ酸配列を有する
もの及び同第１番目〜第645 番目のアミノ酸配列を有す
るものからなる群から選ばれたアミノ酸配列に対し、64
% より高い相同性を有しているものが挙げられ、より好
ましくはそれに対し、90% 以上の相同アミノ酸配列を有
するものが挙げられる。本発明のヒト由来のタンパク質
の一部のものとは、該ヒト由来のタンパク質の一部のペ
プチド（すなわち、該タンパク質の部分ペプチド）であ
って、本発明のヒトMT5-MMP と実質的に同等な活性を有
するものであればいずれのものであってもよい。例え
ば、該本発明のタンパク質の部分ペプチドは、本発明の
ヒトMT5-MMP の構成アミノ酸配列のうち少なくとも５個
以上、好ましくは20個以上、さらに好ましくは50個以
上、より好ましくは70個以上、もっと好ましくは100 個
以上、ある場合には200 個以上のアミノ酸配列を有する
ペプチドが挙げられ、例えば、配列表の配列番号:1で示
されるアミノ酸配列のうち対応する領域に対する相同性
に関して、上記と同様の相同性を有するものが挙げられ
る。
ば、配列表の配列番号:1で表されるアミノ酸配列のう
ち、第156 番目〜第569 番目のアミノ酸配列を有するも
の、同第156 番目〜第645 番目のアミノ酸配列を有する
もの、同第87番目〜第391 番目のアミノ酸配列を有する
もの、同第89番目〜第645 番目のアミノ酸配列を有する
もの、同第１番目〜第569 番目のアミノ酸配列を有する
もの及び同第１番目〜第645 番目のアミノ酸配列を有す
るものからなる群から選ばれたアミノ酸配列に対し、64
% より高い相同性を有しているものが挙げられ、より好
ましくはそれに対し、90% 以上の相同アミノ酸配列を有
するものが挙げられる。本発明のヒト由来のタンパク質
の一部のものとは、該ヒト由来のタンパク質の一部のペ
プチド（すなわち、該タンパク質の部分ペプチド）であ
って、本発明のヒトMT5-MMP と実質的に同等な活性を有
するものであればいずれのものであってもよい。例え
ば、該本発明のタンパク質の部分ペプチドは、本発明の
ヒトMT5-MMP の構成アミノ酸配列のうち少なくとも５個
以上、好ましくは20個以上、さらに好ましくは50個以
上、より好ましくは70個以上、もっと好ましくは100 個
以上、ある場合には200 個以上のアミノ酸配列を有する
ペプチドが挙げられ、例えば、配列表の配列番号:1で示
されるアミノ酸配列のうち対応する領域に対する相同性
に関して、上記と同様の相同性を有するものが挙げられ
る。
【００６５】本明細書において、「実質的に同等」とは
蛋白質の活性、例えば、触媒活性、生理的な活性、生物
学的な活性が実質的に同じであることを意味する。さら
にまた、その用語の意味の中には、実質的に同質の活性
を有する場合を包含していてよく、該実質的に同質の活
性としては、例えば、プロテアーゼ活性、メタロプロテ
アーゼ用合成基質に対する分解活性などを挙げることが
できる。該実質的に同質の活性とは、それらの活性が性
質的に同質であることを示し、例えば、生理的に、薬理
学的に、あるいは生物学的に同質であることを示す。例
えば、プロテアーゼ活性などの活性が、同等 (例えば、
約 0.001〜1000倍、好ましくは約0.01〜100 倍、より好
ましくは約 0.1〜20倍、さらに好ましくは約 0.5〜2
倍) であることが好ましいが、これらの活性の程度、タ
ンパク質の分子量などの量的な要素は異なっていてもよ
い。次に、アミノ酸の置換、欠失、あるいは挿入は、し
ばしばポリペプチドの生理的な特性や化学的な特性に大
きな変化を生ぜしめないし、こうした場合、その置換、
欠失、あるいは挿入を施されたポリペプチドは、そうし
た置換、欠失、あるいは挿入のされていないものと実質
的に同一であるとされるであろう。該アミノ酸配列中の
アミノ酸の実質的に同一な置換体としては、そのアミノ
酸が属するところのクラスのうちの他のアミノ酸類から
選ぶことができうる。例えば、非極性（疎水性）アミノ
酸としては、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、
イソロイシン、バリン、プロリン、トリプトファン、メ
チオニンなどが挙げられ、極性（中性）としては、グリ
シン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、ア
スパラギン、グルタミンなどが挙げられ、陽電荷をもつ
アミノ酸（塩基性アミノ酸）としては、アルギニン、リ
ジン、ヒスチジンなどが挙げられ、陰電荷をもつアミノ
酸（酸性アミノ酸）としては、アスパラギン酸、グルタ
ミン酸などが挙げられる。
蛋白質の活性、例えば、触媒活性、生理的な活性、生物
学的な活性が実質的に同じであることを意味する。さら
にまた、その用語の意味の中には、実質的に同質の活性
を有する場合を包含していてよく、該実質的に同質の活
性としては、例えば、プロテアーゼ活性、メタロプロテ
アーゼ用合成基質に対する分解活性などを挙げることが
できる。該実質的に同質の活性とは、それらの活性が性
質的に同質であることを示し、例えば、生理的に、薬理
学的に、あるいは生物学的に同質であることを示す。例
えば、プロテアーゼ活性などの活性が、同等 (例えば、
約 0.001〜1000倍、好ましくは約0.01〜100 倍、より好
ましくは約 0.1〜20倍、さらに好ましくは約 0.5〜2
倍) であることが好ましいが、これらの活性の程度、タ
ンパク質の分子量などの量的な要素は異なっていてもよ
い。次に、アミノ酸の置換、欠失、あるいは挿入は、し
ばしばポリペプチドの生理的な特性や化学的な特性に大
きな変化を生ぜしめないし、こうした場合、その置換、
欠失、あるいは挿入を施されたポリペプチドは、そうし
た置換、欠失、あるいは挿入のされていないものと実質
的に同一であるとされるであろう。該アミノ酸配列中の
アミノ酸の実質的に同一な置換体としては、そのアミノ
酸が属するところのクラスのうちの他のアミノ酸類から
選ぶことができうる。例えば、非極性（疎水性）アミノ
酸としては、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、
イソロイシン、バリン、プロリン、トリプトファン、メ
チオニンなどが挙げられ、極性（中性）としては、グリ
シン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、ア
スパラギン、グルタミンなどが挙げられ、陽電荷をもつ
アミノ酸（塩基性アミノ酸）としては、アルギニン、リ
ジン、ヒスチジンなどが挙げられ、陰電荷をもつアミノ
酸（酸性アミノ酸）としては、アスパラギン酸、グルタ
ミン酸などが挙げられる。
【００６６】本発明のタンパク質及びその一部のペプチ
ドの合成には、当該ペプチド合成分野で知られた方法、
例えば液相合成法、固相合成法などの化学合成法を使用
することができる。こうした方法では、例えばタンパク
質あるいはペプチド合成用樹脂を用い、適当に保護した
アミノ酸を、それ自体公知の各種縮合方法により所望の
アミノ酸配列に順次該樹脂上で結合させていく。縮合反
応には、好ましくはそれ自体公知の各種活性化試薬を用
いるが、そうした試薬としては、例えばジシクロヘキシ
ルカルボジイミドなどカルボジイミド類を好ましく使用
できる。生成物が保護基を有する場合には、適宜保護基
を除去することにより目的のものを得ることができる。
本発明のタンパク質及びその一部のペプチドは、それが
遊離型のものとして得られた場合には、それ自体公知の
方法あるいはそれに準じた方法で塩に変換することがで
き、またそれらは塩として得られた場合には、それ自体
公知の方法あるいはそれに準じた方法で遊離型のものあ
るいは他の塩に変換することができる。本発明のタンパ
ク質及びその一部のペプチドの塩としては、生理的に許
容されるものあるいは医薬として許容されるものが好ま
しいが、これらに限定されない。こうした塩としては、
例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無
機酸との塩、例えば酢酸、ギ酸、マレイン酸、フマール
酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、安息香
酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ベンゼ
ンスルホン酸などの有機酸との塩などが挙げられる。さ
らに該塩としては、アンモニウム塩、例えばエチルアミ
ン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ヒドロキシエ
チルアミンなどの有機塩基との塩なども挙げられる。
ドの合成には、当該ペプチド合成分野で知られた方法、
例えば液相合成法、固相合成法などの化学合成法を使用
することができる。こうした方法では、例えばタンパク
質あるいはペプチド合成用樹脂を用い、適当に保護した
アミノ酸を、それ自体公知の各種縮合方法により所望の
アミノ酸配列に順次該樹脂上で結合させていく。縮合反
応には、好ましくはそれ自体公知の各種活性化試薬を用
いるが、そうした試薬としては、例えばジシクロヘキシ
ルカルボジイミドなどカルボジイミド類を好ましく使用
できる。生成物が保護基を有する場合には、適宜保護基
を除去することにより目的のものを得ることができる。
本発明のタンパク質及びその一部のペプチドは、それが
遊離型のものとして得られた場合には、それ自体公知の
方法あるいはそれに準じた方法で塩に変換することがで
き、またそれらは塩として得られた場合には、それ自体
公知の方法あるいはそれに準じた方法で遊離型のものあ
るいは他の塩に変換することができる。本発明のタンパ
ク質及びその一部のペプチドの塩としては、生理的に許
容されるものあるいは医薬として許容されるものが好ま
しいが、これらに限定されない。こうした塩としては、
例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無
機酸との塩、例えば酢酸、ギ酸、マレイン酸、フマール
酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、安息香
酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ベンゼ
ンスルホン酸などの有機酸との塩などが挙げられる。さ
らに該塩としては、アンモニウム塩、例えばエチルアミ
ン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ヒドロキシエ
チルアミンなどの有機塩基との塩なども挙げられる。
【００６７】こうした本発明のヒトMT5-MMP 及びその変
異体、修飾体、誘導体などは、上記で説明したような分
離・精製処理を施すことができる。本発明では、「断
片」、「誘導体」及び「類縁体」なる用語は、配列番
号：１のポリペプチド、配列番号：２の配列から転写さ
れ且つスプライシングされていないか又は特異的にスプ
ライシングされた hnRNA又はmRNAによりコードされるポ
リペプチド、又は寄託ジェノミックDNA によりコードさ
れるポリペプチドに関連して、その「断片」、「誘導
体」又は「類縁体」と称した場合、このようなポリペプ
チドと本質的に同一の生物学的機能又は活性を有してい
るポリペプチドを意味する。従って、類似体にはプロタ
ンパク質部分が切断されて活性成熟ポリペプチドを産生
するような、活性化できるプロタンパク質等が包含され
る。本発明のポリペプチドは組換えポリペプチド、天然
ポリペプチド又は合成ポリペプチドでよい。特定の好ま
しい態様では、これは組換えポリペプチドである。
異体、修飾体、誘導体などは、上記で説明したような分
離・精製処理を施すことができる。本発明では、「断
片」、「誘導体」及び「類縁体」なる用語は、配列番
号：１のポリペプチド、配列番号：２の配列から転写さ
れ且つスプライシングされていないか又は特異的にスプ
ライシングされた hnRNA又はmRNAによりコードされるポ
リペプチド、又は寄託ジェノミックDNA によりコードさ
れるポリペプチドに関連して、その「断片」、「誘導
体」又は「類縁体」と称した場合、このようなポリペプ
チドと本質的に同一の生物学的機能又は活性を有してい
るポリペプチドを意味する。従って、類似体にはプロタ
ンパク質部分が切断されて活性成熟ポリペプチドを産生
するような、活性化できるプロタンパク質等が包含され
る。本発明のポリペプチドは組換えポリペプチド、天然
ポリペプチド又は合成ポリペプチドでよい。特定の好ま
しい態様では、これは組換えポリペプチドである。
【００６８】こうして得られた本発明のメタロプロテア
ーゼ活性を有する酵素の一種であり且つMT-MMP-1, MT-M
MP-2, MT-MMP-3及びMT-MMP-4以外の潜在型MMP-2 活性化
因子である天然の膜結合型MMP(特には、ヒトMT5-MMP)あ
るいはそれと実質的に同等な活性を有することを特徴と
するタンパク質またはその塩、あるいはその部分ペプチ
ドは、それを用いて酵素阻害剤の開発や探索などの研
究、医薬品の開発研究、ヒトMT5-MMP が関与すると考え
られる生物的な現象や反応の研究を行うことができる
し、さらにはそれに対する抗体を作成するのに用いるこ
とができるし、特定の分析あるいは測定対象物を調査研
究するのに使用することもできる。ヒトMT5-MMP は、メ
タロプロテアーゼの一種で、該メタロプロテアーゼが関
連すると考えられている、胎児の生育、骨の成長、傷の
修復などを含む、正常な細胞のプロセスにおける結合組
織の改変といった現象や反応の研究に有用である。ま
た、ヒトMT5-MMP は、アテローム性動脈硬化症、肺気
腫、リウマチ性関節炎および癌の浸潤・転移の様な多く
の疾患、特には癌に関連してのその機能の解明に有用で
あり、これら疾患の発症機序の解明、治療および治療薬
の開発に極めて有用であると期待される。
ーゼ活性を有する酵素の一種であり且つMT-MMP-1, MT-M
MP-2, MT-MMP-3及びMT-MMP-4以外の潜在型MMP-2 活性化
因子である天然の膜結合型MMP(特には、ヒトMT5-MMP)あ
るいはそれと実質的に同等な活性を有することを特徴と
するタンパク質またはその塩、あるいはその部分ペプチ
ドは、それを用いて酵素阻害剤の開発や探索などの研
究、医薬品の開発研究、ヒトMT5-MMP が関与すると考え
られる生物的な現象や反応の研究を行うことができる
し、さらにはそれに対する抗体を作成するのに用いるこ
とができるし、特定の分析あるいは測定対象物を調査研
究するのに使用することもできる。ヒトMT5-MMP は、メ
タロプロテアーゼの一種で、該メタロプロテアーゼが関
連すると考えられている、胎児の生育、骨の成長、傷の
修復などを含む、正常な細胞のプロセスにおける結合組
織の改変といった現象や反応の研究に有用である。ま
た、ヒトMT5-MMP は、アテローム性動脈硬化症、肺気
腫、リウマチ性関節炎および癌の浸潤・転移の様な多く
の疾患、特には癌に関連してのその機能の解明に有用で
あり、これら疾患の発症機序の解明、治療および治療薬
の開発に極めて有用であると期待される。
【００６９】一方では、こうして本発明は上記したポリ
ペプチドをコードするDNA 配列、そして天然の特性の全
部あるいは一部を有するヒトMT5-MMP のポリペプチド、
さらにその類縁体あるいは誘導体をコードするDNA 配列
も包含する。本発明のポリヌクレオチドは、アミノ末端
に付加アミノ酸又はカルボキシル末端に付加アミノ酸を
加えた成熟タンパク質、又は成熟タンパク質に内在する
ポリペプチド (例えば、成熟形態で一つ以上のポリペプ
チド鎖を有する場合) のアミノ酸をコードしているもの
であることができる。このような配列は、前駆体から成
熟形態のタンパク質へのプロセッシングにおいても何ら
かの働きをなすものであってよく、例えば、タンパク質
の移動や輸送を促進したり、タンパク質の半減期を延長
もしくは短縮したり、又はタンパク質を操作してその検
出もしくは産生を容易にすることができるものであって
よい。一般的には、例えば、付加アミノ酸は、細胞酵素
によりプロセッシングされ、成熟タンパク質から取り除
かれる。１又はそれ以上のプロ配列と融合した成熟形態
ポリペプチドを有する前駆タンパク質は、不活性形態ポ
リペプチドであることができる。プロ配列が除去される
と、このような不活性前駆体は、通常活性化される。プ
ロ配列のいくつか又は全ては、活性化の前に除去でき
る。通常、このような前駆体はプロタンパク質と称され
る。本発明のポリペプチドは、成熟タンパク質、リーダ
ー配列を付加してある成熟タンパク質 (プレタンパク質
と称することができる) 、プレタンパク質のリーダー配
列ではない１又はそれ以上のプロ配列を有する成熟タン
パク質の前駆体、又はリーダー配列及び１又はそれ以上
のプロ配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレ
プロタンパク質であってよい。また、該プロ配列は通常
活性形態ポリペプチド及び成熟形態ポリペプチドを産み
出すようなプロセッシングの段階で除去され得る。
ペプチドをコードするDNA 配列、そして天然の特性の全
部あるいは一部を有するヒトMT5-MMP のポリペプチド、
さらにその類縁体あるいは誘導体をコードするDNA 配列
も包含する。本発明のポリヌクレオチドは、アミノ末端
に付加アミノ酸又はカルボキシル末端に付加アミノ酸を
加えた成熟タンパク質、又は成熟タンパク質に内在する
ポリペプチド (例えば、成熟形態で一つ以上のポリペプ
チド鎖を有する場合) のアミノ酸をコードしているもの
であることができる。このような配列は、前駆体から成
熟形態のタンパク質へのプロセッシングにおいても何ら
かの働きをなすものであってよく、例えば、タンパク質
の移動や輸送を促進したり、タンパク質の半減期を延長
もしくは短縮したり、又はタンパク質を操作してその検
出もしくは産生を容易にすることができるものであって
よい。一般的には、例えば、付加アミノ酸は、細胞酵素
によりプロセッシングされ、成熟タンパク質から取り除
かれる。１又はそれ以上のプロ配列と融合した成熟形態
ポリペプチドを有する前駆タンパク質は、不活性形態ポ
リペプチドであることができる。プロ配列が除去される
と、このような不活性前駆体は、通常活性化される。プ
ロ配列のいくつか又は全ては、活性化の前に除去でき
る。通常、このような前駆体はプロタンパク質と称され
る。本発明のポリペプチドは、成熟タンパク質、リーダ
ー配列を付加してある成熟タンパク質 (プレタンパク質
と称することができる) 、プレタンパク質のリーダー配
列ではない１又はそれ以上のプロ配列を有する成熟タン
パク質の前駆体、又はリーダー配列及び１又はそれ以上
のプロ配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレ
プロタンパク質であってよい。また、該プロ配列は通常
活性形態ポリペプチド及び成熟形態ポリペプチドを産み
出すようなプロセッシングの段階で除去され得る。
【００７０】本発明のDNA 配列は、これまで知られてい
なかった哺乳動物のタンパク質のアミノ酸配列に関する
情報を提供しているから、こうした情報を利用すること
も本発明に包含される。こうした利用としては、例えば
MT5-MMP 及び関連タンパク質をコードする哺乳動物、特
に好ましくはヒトの、ゲノムDNA 及び cDNA の単離及び
検知のためのプローブの設計などが挙げられる。本発明
のDNA 配列は、例えばMT5-MMP 及び関連タンパク質をコ
ードする哺乳動物、特に好ましくはヒトの、ゲノムDNA
及び cDNA の単離及び検知のためのプローブとして有用
である。プローブは、必要に応じて、抗体に関連して挙
げた標識を付与しておくことができる。遺伝子の単離に
あたっては、PCR 法、さらには逆転写酵素(RT)を用いた
PCR 法(RT-PCR)を利用することが出来る。MT5-MMP cDNA
及びその関連DNA は、クローニングされ、配列決定され
たヒトMT5-MMP cDNA配列から推定されるアミノ酸配列に
基づき特徴的な配列領域を選び、DNA プライマーをデザ
インして化学合成し、得られたDNA プライマーを用い
て、PCR 法、RT-PCR、その他の方法を用いてMT5-MMP 関
連遺伝子の単離、検出などに利用することが出来る。例
えば、ヒトMT5-MMP mRNAのヒト組織中での発現を各種の
組織由来poly (A)+ RNA に対するノーザンブロット分析
により検討することができる。MT5-MMP mRNAのヒト組織
中での発現を各種の組織由来 Poly(A)+ RNA に対するノ
ーザンブロット分析により検討した。その結果、ヒト
脳、腎臓、膵臓、肺で高い発現が認められ、心臓、胎盤
等でも弱いながらその発現が検出された。
なかった哺乳動物のタンパク質のアミノ酸配列に関する
情報を提供しているから、こうした情報を利用すること
も本発明に包含される。こうした利用としては、例えば
MT5-MMP 及び関連タンパク質をコードする哺乳動物、特
に好ましくはヒトの、ゲノムDNA 及び cDNA の単離及び
検知のためのプローブの設計などが挙げられる。本発明
のDNA 配列は、例えばMT5-MMP 及び関連タンパク質をコ
ードする哺乳動物、特に好ましくはヒトの、ゲノムDNA
及び cDNA の単離及び検知のためのプローブとして有用
である。プローブは、必要に応じて、抗体に関連して挙
げた標識を付与しておくことができる。遺伝子の単離に
あたっては、PCR 法、さらには逆転写酵素(RT)を用いた
PCR 法(RT-PCR)を利用することが出来る。MT5-MMP cDNA
及びその関連DNA は、クローニングされ、配列決定され
たヒトMT5-MMP cDNA配列から推定されるアミノ酸配列に
基づき特徴的な配列領域を選び、DNA プライマーをデザ
インして化学合成し、得られたDNA プライマーを用い
て、PCR 法、RT-PCR、その他の方法を用いてMT5-MMP 関
連遺伝子の単離、検出などに利用することが出来る。例
えば、ヒトMT5-MMP mRNAのヒト組織中での発現を各種の
組織由来poly (A)+ RNA に対するノーザンブロット分析
により検討することができる。MT5-MMP mRNAのヒト組織
中での発現を各種の組織由来 Poly(A)+ RNA に対するノ
ーザンブロット分析により検討した。その結果、ヒト
脳、腎臓、膵臓、肺で高い発現が認められ、心臓、胎盤
等でも弱いながらその発現が検出された。
【００７１】本発明のcDNAをプローブとして用いれば、
例えばノーザン・ブロティング、サザン・ブロティン
グ、in situ ハイブリダイゼーションなどによりヒト組
織中でのヒトMT5-MMP mRNAの発現やヒトMT5-MMP 遺伝子
自体などを検出・測定でき、ヒト組織における結合組織
の改変を含む、多くの正常な細胞のプロセスに関与する
メタロプロテアーゼの役割、アテローム性動脈硬化症、
肺気腫、リウマチ性関節炎および癌の浸潤・転移の様な
多くの疾患等の研究の発展に貢献できる。ヒトMT5-MMP
に関連した疾患の遺伝子診断、ひいては癌細胞の有無、
癌の悪性度の診断等の癌の診断治療、またアルツハイマ
ー病の診断等の研究にも利用できる。そうした診断は、
当該ヒトMT5-MMP 及び関連タンパク質をコードする核酸
の異常、例えば損傷、突然変異、発現低下、発現過多な
どを診断するものであることができる。なお、本発明の
DNA も下記抗体と同様に処理することが出来、それ自体
公知の方法又はそれと実質的に同様な方法で標識された
り、測定に用いることができることは理解されるべきで
ある。
例えばノーザン・ブロティング、サザン・ブロティン
グ、in situ ハイブリダイゼーションなどによりヒト組
織中でのヒトMT5-MMP mRNAの発現やヒトMT5-MMP 遺伝子
自体などを検出・測定でき、ヒト組織における結合組織
の改変を含む、多くの正常な細胞のプロセスに関与する
メタロプロテアーゼの役割、アテローム性動脈硬化症、
肺気腫、リウマチ性関節炎および癌の浸潤・転移の様な
多くの疾患等の研究の発展に貢献できる。ヒトMT5-MMP
に関連した疾患の遺伝子診断、ひいては癌細胞の有無、
癌の悪性度の診断等の癌の診断治療、またアルツハイマ
ー病の診断等の研究にも利用できる。そうした診断は、
当該ヒトMT5-MMP 及び関連タンパク質をコードする核酸
の異常、例えば損傷、突然変異、発現低下、発現過多な
どを診断するものであることができる。なお、本発明の
DNA も下記抗体と同様に処理することが出来、それ自体
公知の方法又はそれと実質的に同様な方法で標識された
り、測定に用いることができることは理解されるべきで
ある。
【００７２】本発明で得られたDNA （例えば、ヒトMT5-
MMP をコードするDNA ）を対象動物に転移させるにあた
っては、それをDNA 断片としてあるいは該DNA を動物細
胞で発現させうるプロモーターの下流に結合して用いる
のが一般に有利である。たとえば、マウスにヒトMT5-MM
P DNA を導入する場合、これと相同性が高い動物由来の
ヒトMT5-MMP DNA を動物細胞で発現させうる各種プロモ
ーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトを、対象
動物の受精卵、たとえばマウス受精卵へマイクロインジ
ェクションすることによってヒトMT5-MMP を高産生する
遺伝子導入（トランスジェニック）マウスを作出でき
る。マウスとしては、特に純系のマウスに限定されない
が、例えば、C57BL/6 、Balb/C、C3H 、(C57BL/6×DBA/
2)F1(BDF1)などが挙げられる。このプロモーターとして
は、例えばウイルス由来プロモーター、メタロチオネイ
ン等のユビキタスな発現プロモーターなどが好ましく使
用しうる。また該ヒトMT5-MMP DNA を導入する場合、組
換えレトロウイルスに組み換えて、それを用いて行うこ
ともできる。好適には対象DNA を導入されたマウス受精
卵は、例えば、ICR のような仮親のマウスを使用して生
育せしめることができる。受精卵細胞段階における本発
明で得られたDNA （例えば、ヒトMT5-MMP をコードする
DNA ）の転移は、対象動物の生殖細胞および体細胞の全
てに存在するように確保される。DNA 転移後の作出動物
の生殖細胞においてヒトMT5-MMP をコードするDNA が存
在することは、作出動物の子孫が全てその生殖細胞およ
び体細胞の全てに該ヒトMT5-MMP をコードするDNA を有
することを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の動物
の子孫はその生殖細胞および体細胞の全てにおいて、該
ヒトMT5-MMP を発現できる可能性を有している。
MMP をコードするDNA ）を対象動物に転移させるにあた
っては、それをDNA 断片としてあるいは該DNA を動物細
胞で発現させうるプロモーターの下流に結合して用いる
のが一般に有利である。たとえば、マウスにヒトMT5-MM
P DNA を導入する場合、これと相同性が高い動物由来の
ヒトMT5-MMP DNA を動物細胞で発現させうる各種プロモ
ーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトを、対象
動物の受精卵、たとえばマウス受精卵へマイクロインジ
ェクションすることによってヒトMT5-MMP を高産生する
遺伝子導入（トランスジェニック）マウスを作出でき
る。マウスとしては、特に純系のマウスに限定されない
が、例えば、C57BL/6 、Balb/C、C3H 、(C57BL/6×DBA/
2)F1(BDF1)などが挙げられる。このプロモーターとして
は、例えばウイルス由来プロモーター、メタロチオネイ
ン等のユビキタスな発現プロモーターなどが好ましく使
用しうる。また該ヒトMT5-MMP DNA を導入する場合、組
換えレトロウイルスに組み換えて、それを用いて行うこ
ともできる。好適には対象DNA を導入されたマウス受精
卵は、例えば、ICR のような仮親のマウスを使用して生
育せしめることができる。受精卵細胞段階における本発
明で得られたDNA （例えば、ヒトMT5-MMP をコードする
DNA ）の転移は、対象動物の生殖細胞および体細胞の全
てに存在するように確保される。DNA 転移後の作出動物
の生殖細胞においてヒトMT5-MMP をコードするDNA が存
在することは、作出動物の子孫が全てその生殖細胞およ
び体細胞の全てに該ヒトMT5-MMP をコードするDNA を有
することを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の動物
の子孫はその生殖細胞および体細胞の全てにおいて、該
ヒトMT5-MMP を発現できる可能性を有している。
【００７３】該ヒトMT5-MMP DNA 導入動物は、交配によ
り遺伝子を安定に保持することを確認して、該DNA 保有
動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うことができ
る。さらに、目的DNA を保有する雌雄の動物を交配する
ことにより、導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモ
ザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配するこ
とによりすべての子孫が該DNA を有するように繁殖継代
することができる。該ヒトMT5-MMP DNA が導入された動
物は、該ヒトMT5-MMP タンパク質が高発現させられてい
るので、該ヒトMT5-MMP タンパク質に対する阻害剤（イ
ンヒビター）のスクリーニング用の動物などとして有用
である。またヒトMT5-MMP 遺伝子の複製を阻害すること
のできるアンチセンス オリゴヌクレオチド、例えば、
アンチセンスDNA などのスクリーニング用の動物などと
して有用である。この遺伝子導入動物を、組織培養のた
めの細胞源として使用することもできる。例えば、遺伝
子導入マウスの組織中のDNA もしくはRNA を直接分析す
るかあるいは遺伝子により発現されたタンパク質組織を
分析することにより、メタロプロテアーゼファミリー関
連のタンパク質について分析することができる。該MT5-
MMP を有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養
し、これらを使用して、たとえば胸腺、精巣、脳、腸、
腎臓やその他の組織由来の一般に培養困難な組織からの
細胞についてその機能を研究することができる。また、
その細胞を用いることにより、たとえば各種組織の機能
を高めるような医薬開発に資することも可能である。ま
た、高発現細胞株があれば、そこから、MT5-MMP を単離
精製することも可能である。トランスジェニック マウ
スなどに関連した技術は、例えば、Brinster, R. L., e
t al.,; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 4438, 198
5; Costantini, F. & Jaenisch, R. (eds): Genetic ma
nipulation of the early mammalian embryo, Cold Spr
ing Harbor Laboratory, 1985などの文献に記載の方法
あるいはそこに引用された文献に記載の方法、さらには
それらの改変法により行うことができる。
り遺伝子を安定に保持することを確認して、該DNA 保有
動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うことができ
る。さらに、目的DNA を保有する雌雄の動物を交配する
ことにより、導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモ
ザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配するこ
とによりすべての子孫が該DNA を有するように繁殖継代
することができる。該ヒトMT5-MMP DNA が導入された動
物は、該ヒトMT5-MMP タンパク質が高発現させられてい
るので、該ヒトMT5-MMP タンパク質に対する阻害剤（イ
ンヒビター）のスクリーニング用の動物などとして有用
である。またヒトMT5-MMP 遺伝子の複製を阻害すること
のできるアンチセンス オリゴヌクレオチド、例えば、
アンチセンスDNA などのスクリーニング用の動物などと
して有用である。この遺伝子導入動物を、組織培養のた
めの細胞源として使用することもできる。例えば、遺伝
子導入マウスの組織中のDNA もしくはRNA を直接分析す
るかあるいは遺伝子により発現されたタンパク質組織を
分析することにより、メタロプロテアーゼファミリー関
連のタンパク質について分析することができる。該MT5-
MMP を有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養
し、これらを使用して、たとえば胸腺、精巣、脳、腸、
腎臓やその他の組織由来の一般に培養困難な組織からの
細胞についてその機能を研究することができる。また、
その細胞を用いることにより、たとえば各種組織の機能
を高めるような医薬開発に資することも可能である。ま
た、高発現細胞株があれば、そこから、MT5-MMP を単離
精製することも可能である。トランスジェニック マウ
スなどに関連した技術は、例えば、Brinster, R. L., e
t al.,; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 4438, 198
5; Costantini, F. & Jaenisch, R. (eds): Genetic ma
nipulation of the early mammalian embryo, Cold Spr
ing Harbor Laboratory, 1985などの文献に記載の方法
あるいはそこに引用された文献に記載の方法、さらには
それらの改変法により行うことができる。
【００７４】本発明で得られた遺伝子（例えば、ヒトMT
5-MMP に相当するマウスMT5-MMP をコードするDNA)に変
異をもち、マウスMT5-MMP を全く発現しない変異マウス
（ノックアウトマウス）を作出することができる。たと
えば、該遺伝子の翻訳開始コドンの前後4kb を含むおよ
そ8kb のゲノムDNA の中央近傍に位置し翻訳開始コドン
に近いエクソンにneo 耐性遺伝子-polyA付加シグナルか
らなる遺伝子カセットを挿入した変異遺伝子を持つター
ゲティングベクターを構築することができる。挿入する
遺伝子カセットはneo 耐性遺伝子カセット以外にDT-Aカ
セット、tkカセット、lacZカセットなどが挙げられる。
ターゲティングベクターを直鎖状に開き、樹立したマウ
ス胚性幹細胞（embryonic stem cells: ES細胞）にエレ
クトロポレーションで導入、さらに培養してneo 耐性を
獲得したES細胞を選別する。ES細胞は129 、C57BL/6 、
F1(C57BL/6×CBA)マウスなどのマウス系統から選択して
調製することができる。neo 耐性を獲得したES細胞は、
マウスMT5-MMP 遺伝子領域において遺伝子カセットを挿
入したターゲティングベクターと相同組換えを起こして
いると想定され、少なくともマウスMT5-MMP 遺伝子アレ
ルのうち一つは破壊しマウスMT5-MMP を正常に発現でき
なくなる。選別には挿入した遺伝子カセットによりそれ
ぞれ適当な方法が選択され、また、変異の導入はPCR 、
サザンハイブリダイゼーションあるいはノーザンハイブ
リダイゼーションなどの方法を用いて確認することがで
きる。
5-MMP に相当するマウスMT5-MMP をコードするDNA)に変
異をもち、マウスMT5-MMP を全く発現しない変異マウス
（ノックアウトマウス）を作出することができる。たと
えば、該遺伝子の翻訳開始コドンの前後4kb を含むおよ
そ8kb のゲノムDNA の中央近傍に位置し翻訳開始コドン
に近いエクソンにneo 耐性遺伝子-polyA付加シグナルか
らなる遺伝子カセットを挿入した変異遺伝子を持つター
ゲティングベクターを構築することができる。挿入する
遺伝子カセットはneo 耐性遺伝子カセット以外にDT-Aカ
セット、tkカセット、lacZカセットなどが挙げられる。
ターゲティングベクターを直鎖状に開き、樹立したマウ
ス胚性幹細胞（embryonic stem cells: ES細胞）にエレ
クトロポレーションで導入、さらに培養してneo 耐性を
獲得したES細胞を選別する。ES細胞は129 、C57BL/6 、
F1(C57BL/6×CBA)マウスなどのマウス系統から選択して
調製することができる。neo 耐性を獲得したES細胞は、
マウスMT5-MMP 遺伝子領域において遺伝子カセットを挿
入したターゲティングベクターと相同組換えを起こして
いると想定され、少なくともマウスMT5-MMP 遺伝子アレ
ルのうち一つは破壊しマウスMT5-MMP を正常に発現でき
なくなる。選別には挿入した遺伝子カセットによりそれ
ぞれ適当な方法が選択され、また、変異の導入はPCR 、
サザンハイブリダイゼーションあるいはノーザンハイブ
リダイゼーションなどの方法を用いて確認することがで
きる。
【００７５】変異を導入したES細胞は、C57BL/6 、BALB
/c、ICR マウスなどから取り出した８細胞期胚に注入、
１日培養し胚盤胞に発生したものをICR のような仮親に
移植することで個体まで生育させることができる。生ま
れる子マウスは変異をもつES細胞と正常な宿主胚に由来
するキメラマウスで、ES細胞に由来する細胞がどの程度
含まれるかは個体の毛色で判断する。従って、ES細胞と
宿主胚は毛色の異なった系統の組合わせが望ましい。得
られたキメラマウスの変異はヘテロであり、これらを適
宜交配することでホモ変異マウスを得ることができる。
このようにして得られたホモ変異マウスは生殖細胞およ
び体細胞の全てにおいて、マウスMT5-MMP 遺伝子のみが
破壊されマウスMT5-MMP を全く発現せず、繁殖継代され
る子孫もまた同様の表現系をもつ。このノックアウトマ
ウスは正常マウスとの比較において、発生、成長、生
殖、老化および死など個体のライフサイクルにおけるMT
5-MMP の役割や各臓器、組織におけるMT5-MMP の機能を
解析するのに有用である。また、メタロプロテアーゼに
関連した医薬品開発にも応用できる。ノックアウトマウ
スはこれらモデル動物としてだけではなく、組織培養の
ための細胞源として使用することもでき、細胞レベルで
のMT5-MMP の機能解析などに供することができる。ノッ
クアウトマウス等に関連した技術は、例えば、Mansour,
S. L., et al.,; Nature, 336: 348-352, 1988; Joyne
r, A. L., ed.; Gene targeting, IRL Press, 1993; 相
沢慎一,ジーンターゲティングES細胞を用いた変異マウ
スの作成，羊土社，1995などの文献に記載の方法あるい
はそこに引用された文献に記載の方法、さらにはそれら
の改変法により行うことができる。
/c、ICR マウスなどから取り出した８細胞期胚に注入、
１日培養し胚盤胞に発生したものをICR のような仮親に
移植することで個体まで生育させることができる。生ま
れる子マウスは変異をもつES細胞と正常な宿主胚に由来
するキメラマウスで、ES細胞に由来する細胞がどの程度
含まれるかは個体の毛色で判断する。従って、ES細胞と
宿主胚は毛色の異なった系統の組合わせが望ましい。得
られたキメラマウスの変異はヘテロであり、これらを適
宜交配することでホモ変異マウスを得ることができる。
このようにして得られたホモ変異マウスは生殖細胞およ
び体細胞の全てにおいて、マウスMT5-MMP 遺伝子のみが
破壊されマウスMT5-MMP を全く発現せず、繁殖継代され
る子孫もまた同様の表現系をもつ。このノックアウトマ
ウスは正常マウスとの比較において、発生、成長、生
殖、老化および死など個体のライフサイクルにおけるMT
5-MMP の役割や各臓器、組織におけるMT5-MMP の機能を
解析するのに有用である。また、メタロプロテアーゼに
関連した医薬品開発にも応用できる。ノックアウトマウ
スはこれらモデル動物としてだけではなく、組織培養の
ための細胞源として使用することもでき、細胞レベルで
のMT5-MMP の機能解析などに供することができる。ノッ
クアウトマウス等に関連した技術は、例えば、Mansour,
S. L., et al.,; Nature, 336: 348-352, 1988; Joyne
r, A. L., ed.; Gene targeting, IRL Press, 1993; 相
沢慎一,ジーンターゲティングES細胞を用いた変異マウ
スの作成，羊土社，1995などの文献に記載の方法あるい
はそこに引用された文献に記載の方法、さらにはそれら
の改変法により行うことができる。
【００７６】本発明に従えば、MT5-MMP 遺伝子の複製又
は発現を阻害することのできるアンチセンス・オリゴヌ
クレオチド（核酸）を、クローン化したあるいは決定さ
れたMT5-MMP をコードするDNA の塩基配列情報に基づき
設計し、合成しうる。そうしたオリゴヌクレオチド（核
酸）は、MT5-MMP 遺伝子のmRNA（あるいはDNA ）とハイ
ブリダイズすることができ、該mRNAの合成又は機能を阻
害することができるか、あるいはMT5-MMP 関連mRNAとの
相互作用などを介してMT5-MMP 遺伝子の発現を調節・制
御することができる。MT5-MMP 関連遺伝子の選択された
配列に相補的なオリゴヌクレオチド、及びMT5-MMP 関連
遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができるオリ
ゴヌクレオチドは、生体内及び生体外でMT5-MMP 遺伝子
の発現を調節・制御するのに有用であり、またそれに関
連した病気などの治療又は診断に有用である。用語「対
応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列
又は核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的
であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列又は核
酸とペプチド（タンパク質）との間で「対応する」と
は、ヌクレオチド（核酸）の配列又はその相補体から誘
導される指令にあるペプチド（タンパク質）のアミノ酸
を通常指している。当該遺伝子の5'端ヘアピンループ、
5'端6-ベースペア・リピート、5'端非翻訳領域、ポリペ
プチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ORF 翻
訳開始コドン、3'端非翻訳領域、3'端パリンドローム領
域、及び3'端ヘアピンループは、好ましい対象領域とし
て選択しうるが、当該遺伝子内の如何なる領域も対象と
して選択しうる。
は発現を阻害することのできるアンチセンス・オリゴヌ
クレオチド（核酸）を、クローン化したあるいは決定さ
れたMT5-MMP をコードするDNA の塩基配列情報に基づき
設計し、合成しうる。そうしたオリゴヌクレオチド（核
酸）は、MT5-MMP 遺伝子のmRNA（あるいはDNA ）とハイ
ブリダイズすることができ、該mRNAの合成又は機能を阻
害することができるか、あるいはMT5-MMP 関連mRNAとの
相互作用などを介してMT5-MMP 遺伝子の発現を調節・制
御することができる。MT5-MMP 関連遺伝子の選択された
配列に相補的なオリゴヌクレオチド、及びMT5-MMP 関連
遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができるオリ
ゴヌクレオチドは、生体内及び生体外でMT5-MMP 遺伝子
の発現を調節・制御するのに有用であり、またそれに関
連した病気などの治療又は診断に有用である。用語「対
応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列
又は核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的
であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列又は核
酸とペプチド（タンパク質）との間で「対応する」と
は、ヌクレオチド（核酸）の配列又はその相補体から誘
導される指令にあるペプチド（タンパク質）のアミノ酸
を通常指している。当該遺伝子の5'端ヘアピンループ、
5'端6-ベースペア・リピート、5'端非翻訳領域、ポリペ
プチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ORF 翻
訳開始コドン、3'端非翻訳領域、3'端パリンドローム領
域、及び3'端ヘアピンループは、好ましい対象領域とし
て選択しうるが、当該遺伝子内の如何なる領域も対象と
して選択しうる。
【００７７】目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に
相補的なオリゴヌクレオチドとの関係は、対象物とハイ
ブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドとの関
係を意味し、それは、「アンチセンス」であるというこ
とができる。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、2-
デオキシ-D- リボースを含有しているポリデオキシヌク
レオチド、D-リボースを含有しているポリデオキシヌク
レオチド、プリン又はピリミジン塩基のN-グリコシドで
あるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌ
クレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市
販のタンパク質核酸及び合成配列特異的な核酸ポリマ
ー）又は特殊な結合を含有するその他のポリマー（但
し、該ポリマーはDNA やRNA 中に見出されるような塩基
のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレ
オチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本
鎖DNA 、１本鎖DNA 、２本鎖RNA 、１本鎖RNA 、さらに
DNA ：RNA ハイブリッドであることができ、さらに非修
飾ポリヌクレオチド又は非修飾オリゴヌクレオチド、さ
らには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で
知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチ
ル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁
物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたも
の、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、
ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメー
トなど）を持つもの、電荷を有する結合又は硫黄含有結
合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエー
トなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌクレアー
ゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シ
グナルペプチド、ポリ-L- リジンなど）や糖（例えば、
モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているも
の、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プ
ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、
金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属な
ど）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修
飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸
など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌ
クレオチド」及び「核酸」とは、公知のプリン及びピリ
ミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の
複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こう
した修飾物は、メチル化されたプリン及びピリミジン、
アシル化されたプリン及びピリミジン、あるいはその他
の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオ
シド及び修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾さ
れていてよく、例えば１個以上の水酸基がハロゲンと
か、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテ
ル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
相補的なオリゴヌクレオチドとの関係は、対象物とハイ
ブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドとの関
係を意味し、それは、「アンチセンス」であるというこ
とができる。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、2-
デオキシ-D- リボースを含有しているポリデオキシヌク
レオチド、D-リボースを含有しているポリデオキシヌク
レオチド、プリン又はピリミジン塩基のN-グリコシドで
あるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌ
クレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市
販のタンパク質核酸及び合成配列特異的な核酸ポリマ
ー）又は特殊な結合を含有するその他のポリマー（但
し、該ポリマーはDNA やRNA 中に見出されるような塩基
のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレ
オチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本
鎖DNA 、１本鎖DNA 、２本鎖RNA 、１本鎖RNA 、さらに
DNA ：RNA ハイブリッドであることができ、さらに非修
飾ポリヌクレオチド又は非修飾オリゴヌクレオチド、さ
らには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で
知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチ
ル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁
物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたも
の、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、
ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメー
トなど）を持つもの、電荷を有する結合又は硫黄含有結
合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエー
トなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌクレアー
ゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シ
グナルペプチド、ポリ-L- リジンなど）や糖（例えば、
モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているも
の、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プ
ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、
金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属な
ど）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修
飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸
など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌ
クレオチド」及び「核酸」とは、公知のプリン及びピリ
ミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の
複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こう
した修飾物は、メチル化されたプリン及びピリミジン、
アシル化されたプリン及びピリミジン、あるいはその他
の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオ
シド及び修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾さ
れていてよく、例えば１個以上の水酸基がハロゲンと
か、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテ
ル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００７８】本発明のアンチセンス核酸は、RNA 、DNA
、あるいは修飾された核酸である。修飾された核酸の
具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘
導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオ
シドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それ
に限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸
は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、
細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、
アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とす
るセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そ
してもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより
小さなものにする。こうした修飾は当該分野で数多く知
られており、例えばJ. Kawakami et al.,Pharm Tech Ja
pan, 8: 247, 1992; 8: 395, 1992; S. T. Crooke et a
l. ed.,Antisense Research and Applications, CRC Pr
ess, 1993などに開示がある。本発明のアンチセンス核
酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合
を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのよ
うな特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用
されたり、付加された形態で与えられることができう
る。こうした付加形態で用いられるものとしては、リン
酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのよう
なポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核
酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホ
リピッド、コレステロールなど）といった疎水性のもの
が挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレ
ステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロ
ホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたも
のは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることが
でき、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着
させることができうる。その他の基としては、核酸の
３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用
の基で、エキソヌクレアーゼ、RNase などのヌクレアー
ゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こう
したキャップ用の基としては、ポリエチレングリコー
ル、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじ
めとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられ
るが、それに限定されるものではない。アンチセンス核
酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内
や生体外の遺伝子発現系、あるいはMT5-MMP の生体内や
生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸そ
れ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
、あるいは修飾された核酸である。修飾された核酸の
具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘
導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオ
シドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それ
に限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸
は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、
細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、
アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とす
るセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そ
してもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより
小さなものにする。こうした修飾は当該分野で数多く知
られており、例えばJ. Kawakami et al.,Pharm Tech Ja
pan, 8: 247, 1992; 8: 395, 1992; S. T. Crooke et a
l. ed.,Antisense Research and Applications, CRC Pr
ess, 1993などに開示がある。本発明のアンチセンス核
酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合
を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのよ
うな特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用
されたり、付加された形態で与えられることができう
る。こうした付加形態で用いられるものとしては、リン
酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのよう
なポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核
酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホ
リピッド、コレステロールなど）といった疎水性のもの
が挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレ
ステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロ
ホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたも
のは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることが
でき、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着
させることができうる。その他の基としては、核酸の
３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用
の基で、エキソヌクレアーゼ、RNase などのヌクレアー
ゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こう
したキャップ用の基としては、ポリエチレングリコー
ル、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじ
めとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられ
るが、それに限定されるものではない。アンチセンス核
酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内
や生体外の遺伝子発現系、あるいはMT5-MMP の生体内や
生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸そ
れ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
【００７９】以上述べた、本発明者らの研究成果により
MT5-MMP の遺伝子及び組換えDNA 分子を宿主に移入し、
MT5-MMP を発現させ、目的とするMT-MMPを得る方法が提
供される。こうして本発明によれば、MT5-MMP の遺伝子
を実質的に発現する組換え体あるいはトランスフェクタ
ント及びその製造法、さらにはその用途も提供される。
別の面では、本発明は潜在型MMP-2 の活性化能を有する
MMP の一種であり且つMT1-MMP 、MT2-MMP 、MT3-MMP 及
びMT4-MMP 以外の潜在型MMP-2 活性化因子である天然の
MT-MMPと実質的に同等な活性を有することを特徴とする
タンパク質またはその塩、より好ましくはMT5-MMP また
はその塩と、実質的に同等な活性を有するか、あるいは
実質的に同等の一次構造コンフォメーションを持つ該タ
ンパク質の少なくとも一部あるいは全部を有するポリペ
プチドを、大腸菌などの原核生物あるいは哺乳動物細胞
などの真核生物で発現させることを可能にするDNA やRN
Aなどの核酸に関するとすることができる。またこうし
た核酸、特にはDNA は、(a) 配列表の配列番号:1で表さ
れるアミノ酸配列をコードできる配列あるいはそれと相
補的な配列、(b) 該(a) のDNA 配列またはその断片とハ
イブリダイズすることのできる配列、及び(c) 該(a) 又
は(b) の配列にハイブリダイズすることのできる縮重コ
ードを持った配列であることができる。ここでハイブリ
ダイズの条件としては、ストリンジェントな条件である
ことができる。こうした核酸で形質転換され、本発明の
該ポリペプチドを発現できる大腸菌などの原核生物ある
いは COS細胞、 CHO細胞などの哺乳動物細胞、酵母など
の真核生物も本発明の特徴をなす。
MT5-MMP の遺伝子及び組換えDNA 分子を宿主に移入し、
MT5-MMP を発現させ、目的とするMT-MMPを得る方法が提
供される。こうして本発明によれば、MT5-MMP の遺伝子
を実質的に発現する組換え体あるいはトランスフェクタ
ント及びその製造法、さらにはその用途も提供される。
別の面では、本発明は潜在型MMP-2 の活性化能を有する
MMP の一種であり且つMT1-MMP 、MT2-MMP 、MT3-MMP 及
びMT4-MMP 以外の潜在型MMP-2 活性化因子である天然の
MT-MMPと実質的に同等な活性を有することを特徴とする
タンパク質またはその塩、より好ましくはMT5-MMP また
はその塩と、実質的に同等な活性を有するか、あるいは
実質的に同等の一次構造コンフォメーションを持つ該タ
ンパク質の少なくとも一部あるいは全部を有するポリペ
プチドを、大腸菌などの原核生物あるいは哺乳動物細胞
などの真核生物で発現させることを可能にするDNA やRN
Aなどの核酸に関するとすることができる。またこうし
た核酸、特にはDNA は、(a) 配列表の配列番号:1で表さ
れるアミノ酸配列をコードできる配列あるいはそれと相
補的な配列、(b) 該(a) のDNA 配列またはその断片とハ
イブリダイズすることのできる配列、及び(c) 該(a) 又
は(b) の配列にハイブリダイズすることのできる縮重コ
ードを持った配列であることができる。ここでハイブリ
ダイズの条件としては、ストリンジェントな条件である
ことができる。こうした核酸で形質転換され、本発明の
該ポリペプチドを発現できる大腸菌などの原核生物ある
いは COS細胞、 CHO細胞などの哺乳動物細胞、酵母など
の真核生物も本発明の特徴をなす。
【００８０】さらに、本発明では、本発明に係わるMT5-
MMP と特異的に結合する抗体（例えば、抗血清、モノク
ローナル抗体など）が提供される。本発明に係わるモノ
クローナル抗体などの抗体により、癌の診断はもとより
癌の浸潤、転移に係わる研究に有用な研究手段、さらに
はアテローム性動脈硬化症、肺気腫、リウマチ性関節
炎、アルツハイマー病の発症機作や診断方法に係わる研
究に有用な研究手段が提供される。本発明に係わる抗体
(例えば、抗血清、モノクローナル抗体など) は、本発
明により得られるヒトMT5-MMP あるいはその断片を免疫
原として公知の方法で動物を免疫したり、当該分野で知
られたあるいは汎用されている方法、例えばケーラー、
ミルシュタインの方法 (Nature, 256: 495〜497, 1975)
により製造することができる。この方法において、免疫
原としては、天然型ヒトMT5-MMP 、リコンビナントヒト
MT5-MMP 及びヒトMT5-MMP の中の他のメタロプロテアー
ゼとの相同性の低い領域から選択されたアミノ酸配列を
有する合成ペプチドあるいはタンパク質から得られた断
片、例えば連続した少なくとも３個のアミノ酸からなる
ヒトMT5-MMPの一部のアミノ酸配列を有する合成ペプチ
ド、例えば4 〜250 個、好ましくは6〜45個、より好ま
しくは10〜35個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を
有する合成ペプチド、好ましくはヒトMT5-MMP において
特徴的な配列部分を有するペプチド等の何れでも使用す
ることができる。例えば、ヒトMT5-MMP のプロペプチド
領域 (例えば、配列表の配列番号:1のうちの第80位〜第
155 の領域、第80位〜第146 の領域、第147 位〜第155
位の領域、そのうちの一部の領域あるいはそれらのいず
れかの近傍) 、プロペプチド切断部位を含む領域 (例え
ば、配列表の配列番号:1のうちの第147 位〜第165 位の
領域、第152 位〜第158 位の領域、そのうちの一部の領
域あるいはその近傍) 、活性型ヒトMT5-MMP の領域 (例
えば、配列表の配列番号:1のうちの第156 位〜第327 位
の領域、第207 位〜第214 位の領域、そのうちの一部の
領域あるいはそれらのいずれかの近傍) 、ヒンジ領域
(例えば、配列表の配列番号:1のうちの第328 位〜第379
位、そのうちの一部の領域あるいはそれらのいずれか
の近傍) 、ヘモペキシン領域 (例えば、配列表の配列番
号:1のうちの第380 位〜第569 位、そのうちの一部の領
域あるいはそれらのいずれかの近傍) などを選択するこ
とができる。また本発明で得られたヒトMT5-MMP遺伝子
の情報を基にペプチドを合成して、その合成ペプチドを
抗体（例えば、モノクローナル抗体）作製のための免疫
抗原として好適に使用できる。
MMP と特異的に結合する抗体（例えば、抗血清、モノク
ローナル抗体など）が提供される。本発明に係わるモノ
クローナル抗体などの抗体により、癌の診断はもとより
癌の浸潤、転移に係わる研究に有用な研究手段、さらに
はアテローム性動脈硬化症、肺気腫、リウマチ性関節
炎、アルツハイマー病の発症機作や診断方法に係わる研
究に有用な研究手段が提供される。本発明に係わる抗体
(例えば、抗血清、モノクローナル抗体など) は、本発
明により得られるヒトMT5-MMP あるいはその断片を免疫
原として公知の方法で動物を免疫したり、当該分野で知
られたあるいは汎用されている方法、例えばケーラー、
ミルシュタインの方法 (Nature, 256: 495〜497, 1975)
により製造することができる。この方法において、免疫
原としては、天然型ヒトMT5-MMP 、リコンビナントヒト
MT5-MMP 及びヒトMT5-MMP の中の他のメタロプロテアー
ゼとの相同性の低い領域から選択されたアミノ酸配列を
有する合成ペプチドあるいはタンパク質から得られた断
片、例えば連続した少なくとも３個のアミノ酸からなる
ヒトMT5-MMPの一部のアミノ酸配列を有する合成ペプチ
ド、例えば4 〜250 個、好ましくは6〜45個、より好ま
しくは10〜35個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を
有する合成ペプチド、好ましくはヒトMT5-MMP において
特徴的な配列部分を有するペプチド等の何れでも使用す
ることができる。例えば、ヒトMT5-MMP のプロペプチド
領域 (例えば、配列表の配列番号:1のうちの第80位〜第
155 の領域、第80位〜第146 の領域、第147 位〜第155
位の領域、そのうちの一部の領域あるいはそれらのいず
れかの近傍) 、プロペプチド切断部位を含む領域 (例え
ば、配列表の配列番号:1のうちの第147 位〜第165 位の
領域、第152 位〜第158 位の領域、そのうちの一部の領
域あるいはその近傍) 、活性型ヒトMT5-MMP の領域 (例
えば、配列表の配列番号:1のうちの第156 位〜第327 位
の領域、第207 位〜第214 位の領域、そのうちの一部の
領域あるいはそれらのいずれかの近傍) 、ヒンジ領域
(例えば、配列表の配列番号:1のうちの第328 位〜第379
位、そのうちの一部の領域あるいはそれらのいずれか
の近傍) 、ヘモペキシン領域 (例えば、配列表の配列番
号:1のうちの第380 位〜第569 位、そのうちの一部の領
域あるいはそれらのいずれかの近傍) などを選択するこ
とができる。また本発明で得られたヒトMT5-MMP遺伝子
の情報を基にペプチドを合成して、その合成ペプチドを
抗体（例えば、モノクローナル抗体）作製のための免疫
抗原として好適に使用できる。
【００８１】さらに該抗体（モノクローナル抗体を包含
する）は、常用される方法によって適宜標識することが
できる。標識としては、酵素、放射性同位体（放射性物
質）、化学ルミネッセンス化合物などの発光性物質、螢
光性物質、金属コロイド、補欠分子類、色素物質及びビ
オチン等を使用することができる。以下抗体の作製につ
き詳しく説明する。本発明のモノクローナル抗体は、ミ
エローマ細胞を用いての細胞融合技術を利用して得られ
たモノクローナル抗体であってよいことはいうまでもな
い。本発明のモノクローナル抗体は、例えば次のような
工程で作製できる。 １．免疫原性抗原の調製 ２．免疫原性抗原による動物の免疫 ３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製 ４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合 ５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクロー
ン化 ６．モノクローナル抗体の製造
する）は、常用される方法によって適宜標識することが
できる。標識としては、酵素、放射性同位体（放射性物
質）、化学ルミネッセンス化合物などの発光性物質、螢
光性物質、金属コロイド、補欠分子類、色素物質及びビ
オチン等を使用することができる。以下抗体の作製につ
き詳しく説明する。本発明のモノクローナル抗体は、ミ
エローマ細胞を用いての細胞融合技術を利用して得られ
たモノクローナル抗体であってよいことはいうまでもな
い。本発明のモノクローナル抗体は、例えば次のような
工程で作製できる。 １．免疫原性抗原の調製 ２．免疫原性抗原による動物の免疫 ３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製 ４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合 ５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクロー
ン化 ６．モノクローナル抗体の製造
【００８２】１．免疫原性抗原の調製 抗原としては、例えば天然由来のMT5-MMP 、本発明の方
法に従い調製したリコンビナントMT5-MMP を用いること
ができる。ヒトMT5-MMP としては、生体内外の産生細
胞、例えば、培養細胞、摘出組織、培養組織などから得
ることができ、例えば、胸腺、精巣、脳、腸、腎臓など
の細胞、組織など、乳癌、乳癌細胞株、例えば、ZR-75-
1, Hs-578T, MDA-MB435 など、卵巣癌、結腸・直腸癌 S
W480細胞等から得ることができる。さらに、ヒトMT5-MM
P は、リコンビナントヒトMT5-MMPとして得ることがで
き、上記したように、例えば、胸腺、精巣、脳の細胞、
組織などのヒトMT5-MMP 産生細胞・組織から取り出した
遺伝子を用い、遺伝子組換えの技術を利用して得ること
ができる。本発明で調製したヒトMT5-MMP あるいはそれ
から誘導されたものが免疫抗原として好適に使用でき
る。これらヒトMT5-MMPは、各種原料、例えば培養細
胞、培養組織など、形質転換体細胞などの抗原産生材料
から、上記したような従来公知の方法などで精製分離処
理できる。例えば、ゼラチン−アガロース・アフィニテ
ィー・クロマトグラフィー、ヘパリン−アガロース・ク
ロマトグラフィーなどにより、より精製された形態で得
ることができる。精製されたリコンビナントヒトMT5-MM
P は、抗血清だけでなく、モノクローナル抗体作製のた
めの免疫抗原として好適に使用できる。MT5-MMP は、プ
ロ体でも活性型のものであってもよく、さらに免疫原性
コンジュゲートなどにしてもよいが、そのまま適当なア
ジュバントと混合して動物を免疫するのに使用できる。
さらに免疫用抗原としては、例えば、MT5-MMP を断片化
したもの、あるいはクローニングされ配列決定されたMT
5-MMP cDNA配列から推定されるアミノ酸配列などの情報
を基に、適当なオリゴペプチド、例えば特徴的な配列領
域を選び、ポリペプチドをデザインして化学合成し、得
られた合成ポリペプチド断片であってもよい。また、そ
の断片は、適当な縮合剤を介して種々の担体タンパク質
類と結合させてハプテン−タンパク質の如き免疫原性コ
ンジュゲートとし、これを用いて特定の配列のみと反応
できる（あるいは特定の配列のみを認識できる）モノク
ローナル抗体をデザインするのに用いることもできる。
デザインされるポリペプチドには予めシステイン残基な
どを付加し、免疫原性コンジュゲートの調製を容易にで
きるようにしておくことができる。担体タンパク質類と
結合させるにあたっては、担体タンパク質類はまず活性
化されることができる。こうした活性化にあたり活性化
結合基を導入することが挙げられる。活性化結合基とし
ては、(1) 活性化エステルあるいは活性化カルボキシル
基、例えばニトロフェニルエステル基、ペンタフルオロ
フェニルエステル基、1-ベンゾトリアゾールエステル
基、N-スクシンイミドエステル基など、(2) 活性化ジチ
オ基、例えば2-ピリジルジチオ基などが挙げられる。担
体タンパク質類としては、キーホール・リンペット・ヘ
モシアニン (KLH)、牛血清アルブミン (BSA)、卵白アル
ブミン、グロブリン、ポリリジンなどのポリペプタイ
ド、細菌菌体成分、例えばBCG などが挙げられる。
法に従い調製したリコンビナントMT5-MMP を用いること
ができる。ヒトMT5-MMP としては、生体内外の産生細
胞、例えば、培養細胞、摘出組織、培養組織などから得
ることができ、例えば、胸腺、精巣、脳、腸、腎臓など
の細胞、組織など、乳癌、乳癌細胞株、例えば、ZR-75-
1, Hs-578T, MDA-MB435 など、卵巣癌、結腸・直腸癌 S
W480細胞等から得ることができる。さらに、ヒトMT5-MM
P は、リコンビナントヒトMT5-MMPとして得ることがで
き、上記したように、例えば、胸腺、精巣、脳の細胞、
組織などのヒトMT5-MMP 産生細胞・組織から取り出した
遺伝子を用い、遺伝子組換えの技術を利用して得ること
ができる。本発明で調製したヒトMT5-MMP あるいはそれ
から誘導されたものが免疫抗原として好適に使用でき
る。これらヒトMT5-MMPは、各種原料、例えば培養細
胞、培養組織など、形質転換体細胞などの抗原産生材料
から、上記したような従来公知の方法などで精製分離処
理できる。例えば、ゼラチン−アガロース・アフィニテ
ィー・クロマトグラフィー、ヘパリン−アガロース・ク
ロマトグラフィーなどにより、より精製された形態で得
ることができる。精製されたリコンビナントヒトMT5-MM
P は、抗血清だけでなく、モノクローナル抗体作製のた
めの免疫抗原として好適に使用できる。MT5-MMP は、プ
ロ体でも活性型のものであってもよく、さらに免疫原性
コンジュゲートなどにしてもよいが、そのまま適当なア
ジュバントと混合して動物を免疫するのに使用できる。
さらに免疫用抗原としては、例えば、MT5-MMP を断片化
したもの、あるいはクローニングされ配列決定されたMT
5-MMP cDNA配列から推定されるアミノ酸配列などの情報
を基に、適当なオリゴペプチド、例えば特徴的な配列領
域を選び、ポリペプチドをデザインして化学合成し、得
られた合成ポリペプチド断片であってもよい。また、そ
の断片は、適当な縮合剤を介して種々の担体タンパク質
類と結合させてハプテン−タンパク質の如き免疫原性コ
ンジュゲートとし、これを用いて特定の配列のみと反応
できる（あるいは特定の配列のみを認識できる）モノク
ローナル抗体をデザインするのに用いることもできる。
デザインされるポリペプチドには予めシステイン残基な
どを付加し、免疫原性コンジュゲートの調製を容易にで
きるようにしておくことができる。担体タンパク質類と
結合させるにあたっては、担体タンパク質類はまず活性
化されることができる。こうした活性化にあたり活性化
結合基を導入することが挙げられる。活性化結合基とし
ては、(1) 活性化エステルあるいは活性化カルボキシル
基、例えばニトロフェニルエステル基、ペンタフルオロ
フェニルエステル基、1-ベンゾトリアゾールエステル
基、N-スクシンイミドエステル基など、(2) 活性化ジチ
オ基、例えば2-ピリジルジチオ基などが挙げられる。担
体タンパク質類としては、キーホール・リンペット・ヘ
モシアニン (KLH)、牛血清アルブミン (BSA)、卵白アル
ブミン、グロブリン、ポリリジンなどのポリペプタイ
ド、細菌菌体成分、例えばBCG などが挙げられる。
【００８３】２．免疫原性抗原による動物の免疫 動物を免疫するには、例えば村松繁、他編、実験生物学
講座 14 、免疫生物学、丸善株式会社、昭和60年、日本
生化学会編、続生化学実験講座５、免疫生化学研究法、
東京化学同人、1986年、日本生化学会編、新生化学実験
講座 12 、分子免疫学 III、抗原・抗体・補体、東京化
学同人、1992年などに記載の方法に準じて行うことがで
きる。抗原と共に用いられるアジュバントとしては、例
えばフロイント完全アジュバント、リビ(Ribi)アジュバ
ント、百日咳ワクチン、BCG 、リピッド A、リポソー
ム、水酸化アルミニウム、シリカなどが挙げられる。免
疫は、例えばBALB/cなどのマウスをはじめとする動物を
使用して行われる。抗原の投与量は、例えばマウスに対
して約１〜400 μｇ／動物で、一般には宿主動物の腹腔
内や皮下に注射し、以後１〜４週間おきに、好ましくは
１〜２週間ごとに腹腔内、皮下、静脈内あるいは筋肉内
に追加免疫を２〜10回程度反復して行う。免疫用のマウ
スとしてはBALB/c系マウスの他、BALB/c系マウスと他系
マウスとのF1マウスなどを用いることもできる。必要に
応じ、抗体価測定系を調製し、抗体価を測定して動物免
疫の程度を確認できる。本発明の抗体は、こうして得ら
れ免疫された動物から得られたものであってよく、例え
ば、抗血清、ポリクローナル抗体等を包含する。一方で
は、本発明に従えばリコンビナントMT5-MMP を用い、MT
5-MMP に対するポリクローナル抗体及びその製造にも関
する。こうした場合、使用される動物としては、哺乳動
物や鳥類などが利用できるが、例えばウシ、ウマ、ヤ
ギ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、モルモッ
ト、サル、イヌ、ネコ、ニワトリなどが挙げられる。抗
体は抗血清であってもよく、より精製されたものであっ
てもよく、例えばその単離精製は下記モノクローナル抗
体と同様にして行うことができる。
講座 14 、免疫生物学、丸善株式会社、昭和60年、日本
生化学会編、続生化学実験講座５、免疫生化学研究法、
東京化学同人、1986年、日本生化学会編、新生化学実験
講座 12 、分子免疫学 III、抗原・抗体・補体、東京化
学同人、1992年などに記載の方法に準じて行うことがで
きる。抗原と共に用いられるアジュバントとしては、例
えばフロイント完全アジュバント、リビ(Ribi)アジュバ
ント、百日咳ワクチン、BCG 、リピッド A、リポソー
ム、水酸化アルミニウム、シリカなどが挙げられる。免
疫は、例えばBALB/cなどのマウスをはじめとする動物を
使用して行われる。抗原の投与量は、例えばマウスに対
して約１〜400 μｇ／動物で、一般には宿主動物の腹腔
内や皮下に注射し、以後１〜４週間おきに、好ましくは
１〜２週間ごとに腹腔内、皮下、静脈内あるいは筋肉内
に追加免疫を２〜10回程度反復して行う。免疫用のマウ
スとしてはBALB/c系マウスの他、BALB/c系マウスと他系
マウスとのF1マウスなどを用いることもできる。必要に
応じ、抗体価測定系を調製し、抗体価を測定して動物免
疫の程度を確認できる。本発明の抗体は、こうして得ら
れ免疫された動物から得られたものであってよく、例え
ば、抗血清、ポリクローナル抗体等を包含する。一方で
は、本発明に従えばリコンビナントMT5-MMP を用い、MT
5-MMP に対するポリクローナル抗体及びその製造にも関
する。こうした場合、使用される動物としては、哺乳動
物や鳥類などが利用できるが、例えばウシ、ウマ、ヤ
ギ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、モルモッ
ト、サル、イヌ、ネコ、ニワトリなどが挙げられる。抗
体は抗血清であってもよく、より精製されたものであっ
てもよく、例えばその単離精製は下記モノクローナル抗
体と同様にして行うことができる。
【００８４】３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製 細胞融合に使用される無限増殖可能株（腫瘍細胞株）と
しては免疫グロブリンを産生しない細胞株から選ぶこと
ができ、例えば P3-NS-1-Ag4-1 (NS-1, Eur.J. Immuno
l., 6: 511-519, 1976)、SP2/0-Ag14 (SP2, Nature, 27
6: 269 〜270,1978 )、マウスミエローマ MOPC-21セル
ライン由来のP3-X63-Ag8-U1 (P3U1,Curr. topics Micro
biol. Immunol., 81: 1-7, 1978 ) 、P3-X63-Ag8 (X63,
Nature, 256: 495-497, 1975 )、P3-X63-Ag8-653 (653,
J. Immunol., 123:1548-1550, 1979)などを用いること
ができる。8-アザグアニン耐性のマウスミエローマ細胞
株はダルベッコMEM 培地 (DMEM培地) 、RPMI-1640 培地
などの細胞培地に、例えばペニシリン、アミカシンなど
の抗生物質、牛胎児血清(FCS) などを加え、さらに８−
アザグアニン（例えば５〜45μg/ml) を加えた培地で継
代されるが、細胞融合の２〜５日前に正常培地で継代し
て所要数の細胞株を用意することができる。また使用細
胞株は、凍結保存株を約37℃で完全に解凍したのち RPM
I-1640培地などの正常培地で３回以上洗浄後、正常培地
で培養して所要数の細胞株を用意したものであってもよ
い。
しては免疫グロブリンを産生しない細胞株から選ぶこと
ができ、例えば P3-NS-1-Ag4-1 (NS-1, Eur.J. Immuno
l., 6: 511-519, 1976)、SP2/0-Ag14 (SP2, Nature, 27
6: 269 〜270,1978 )、マウスミエローマ MOPC-21セル
ライン由来のP3-X63-Ag8-U1 (P3U1,Curr. topics Micro
biol. Immunol., 81: 1-7, 1978 ) 、P3-X63-Ag8 (X63,
Nature, 256: 495-497, 1975 )、P3-X63-Ag8-653 (653,
J. Immunol., 123:1548-1550, 1979)などを用いること
ができる。8-アザグアニン耐性のマウスミエローマ細胞
株はダルベッコMEM 培地 (DMEM培地) 、RPMI-1640 培地
などの細胞培地に、例えばペニシリン、アミカシンなど
の抗生物質、牛胎児血清(FCS) などを加え、さらに８−
アザグアニン（例えば５〜45μg/ml) を加えた培地で継
代されるが、細胞融合の２〜５日前に正常培地で継代し
て所要数の細胞株を用意することができる。また使用細
胞株は、凍結保存株を約37℃で完全に解凍したのち RPM
I-1640培地などの正常培地で３回以上洗浄後、正常培地
で培養して所要数の細胞株を用意したものであってもよ
い。
【００８５】４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細
胞融合 上記２．の工程に従い免疫された動物、例えばマウスは
最終免疫後、２〜５日後にその脾臓が摘出され、それか
ら脾細胞懸濁液を得る。脾細胞の他、生体各所のリンパ
節細胞を得て、それを細胞融合に使用することもでき
る。こうして得られた脾細胞懸濁液と上記３．の工程に
従い得られたミエローマ細胞株を、例えば最小必須培地
(MEM培地) 、DMEM培地、RPMI-1640 培地などの細胞培地
中に置き、細胞融合剤、例えばポリエチレングリコール
を添加する。細胞融合剤としては、この他各種当該分野
で知られたものを用いることができ、この様なものとし
ては不活性化したセンダイウイルス(HVJ: Hemagglutina
ting Virus of Japan)なども挙げられる。好ましくは、
例えば30〜60％のポリエチレングリコールを 0.5〜２ml
加えることができ、分子量が 1,000〜8,000 のポリエチ
レングリコールを用いることができ、さらに分子量が
1,000〜4,000 のポリエチレングリコールがより好まし
く使用できる。融合培地中でのポリエチレングリコール
の濃度は、例えば30〜60％となるようにすることが好ま
しい。必要に応じ、例えばジメチルスルホキシドなどを
少量加え、融合を促進することもできる。融合に使用す
る脾細胞（リンパ球）: ミエローマ細胞株の割合は、例
えば 1:1〜20:1とすることが挙げられるが、より好まし
くは 4:1〜7:1 とすることができる。融合反応を１〜10
分間行い、次にRPMI-1640 培地などの細胞培地を加え
る。融合反応処理は複数回行うこともできる。融合反応
処理後、遠心などにより細胞を分離した後選択用培地に
移す。
胞融合 上記２．の工程に従い免疫された動物、例えばマウスは
最終免疫後、２〜５日後にその脾臓が摘出され、それか
ら脾細胞懸濁液を得る。脾細胞の他、生体各所のリンパ
節細胞を得て、それを細胞融合に使用することもでき
る。こうして得られた脾細胞懸濁液と上記３．の工程に
従い得られたミエローマ細胞株を、例えば最小必須培地
(MEM培地) 、DMEM培地、RPMI-1640 培地などの細胞培地
中に置き、細胞融合剤、例えばポリエチレングリコール
を添加する。細胞融合剤としては、この他各種当該分野
で知られたものを用いることができ、この様なものとし
ては不活性化したセンダイウイルス(HVJ: Hemagglutina
ting Virus of Japan)なども挙げられる。好ましくは、
例えば30〜60％のポリエチレングリコールを 0.5〜２ml
加えることができ、分子量が 1,000〜8,000 のポリエチ
レングリコールを用いることができ、さらに分子量が
1,000〜4,000 のポリエチレングリコールがより好まし
く使用できる。融合培地中でのポリエチレングリコール
の濃度は、例えば30〜60％となるようにすることが好ま
しい。必要に応じ、例えばジメチルスルホキシドなどを
少量加え、融合を促進することもできる。融合に使用す
る脾細胞（リンパ球）: ミエローマ細胞株の割合は、例
えば 1:1〜20:1とすることが挙げられるが、より好まし
くは 4:1〜7:1 とすることができる。融合反応を１〜10
分間行い、次にRPMI-1640 培地などの細胞培地を加え
る。融合反応処理は複数回行うこともできる。融合反応
処理後、遠心などにより細胞を分離した後選択用培地に
移す。
【００８６】５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及
びモノクローン化 選択用培地としては、例えばヒポキサンチン、アミノプ
テリン及びチミジンを含む、FCS 含有MEM 培地、RPMI-1
640 培地などの培地、所謂 HAT培地が挙げられる。選択
培地交換の方法は、一般的には培養プレートに分注した
容量と等容量を翌日加え、その後１〜３日ごとに HAT培
地で半量ずつ交換するというように処理することができ
るが、適宜これに変更を加えて行うこともできる。また
融合後８〜16日目には、アミノプテリンを除いた、所謂
HT培地で１〜４日ごとに培地交換をすることができる。
フィーダーとして、例えばマウス胸腺細胞を使用するこ
ともでき、それが好ましい場合がある。ハイブリドーマ
の増殖のさかんな培養ウェルの培養上清を、例えば放射
免疫分析(RIA) 、酵素免疫分析(ELISA) 、蛍光免疫分析
(FIA) などの測定系、あるいは蛍光惹起細胞分離装置(F
ACS)などで、MT5-MMP あるいはその断片ペプチドを抗原
として用いたり、あるいは標識抗マウス抗体を用いて目
的抗体を測定するなどして、スクリーニングしたりす
る。目的抗体を産生しているハイブリドーマをクローニ
ングする。クローニングは、寒天培地中でコロニーをピ
ック・アップするか、あるいは限界希釈法によりなされ
うる。限界希釈法でより好ましく行うことができる。ク
ローニングは複数回行うことが好ましい。
びモノクローン化 選択用培地としては、例えばヒポキサンチン、アミノプ
テリン及びチミジンを含む、FCS 含有MEM 培地、RPMI-1
640 培地などの培地、所謂 HAT培地が挙げられる。選択
培地交換の方法は、一般的には培養プレートに分注した
容量と等容量を翌日加え、その後１〜３日ごとに HAT培
地で半量ずつ交換するというように処理することができ
るが、適宜これに変更を加えて行うこともできる。また
融合後８〜16日目には、アミノプテリンを除いた、所謂
HT培地で１〜４日ごとに培地交換をすることができる。
フィーダーとして、例えばマウス胸腺細胞を使用するこ
ともでき、それが好ましい場合がある。ハイブリドーマ
の増殖のさかんな培養ウェルの培養上清を、例えば放射
免疫分析(RIA) 、酵素免疫分析(ELISA) 、蛍光免疫分析
(FIA) などの測定系、あるいは蛍光惹起細胞分離装置(F
ACS)などで、MT5-MMP あるいはその断片ペプチドを抗原
として用いたり、あるいは標識抗マウス抗体を用いて目
的抗体を測定するなどして、スクリーニングしたりす
る。目的抗体を産生しているハイブリドーマをクローニ
ングする。クローニングは、寒天培地中でコロニーをピ
ック・アップするか、あるいは限界希釈法によりなされ
うる。限界希釈法でより好ましく行うことができる。ク
ローニングは複数回行うことが好ましい。
【００８７】６．モノクローナル抗体の製造 得られたハイブリドーマ株は、FCS 含有MEM 培地、RPMI
-1640 培地などの適当な増殖用培地中で培養し、その培
地上清から所望のモノクローナル抗体を得ることが出来
る。大量の抗体を得るためには、ハイブリドーマを腹水
化することが挙げられる。この場合ミエローマ細胞由来
の動物と同系の組織適合性動物の腹腔内に各ハイブリド
ーマを移植し、増殖させるか、あるいは例えばヌード・
マウスなどに各ハイブリドーマを移植し、増殖させ、該
動物の腹水中に産生されたモノクローナル抗体を回収し
て得ることが出来る。動物はハイブリドーマの移植に先
立ち、プリスタン（2,6,10,14-テトラメチルペンタデカ
ン）などの鉱物油を腹腔内投与しておくことができ、そ
の処理後、ハイブリドーマを増殖させ、腹水を採取する
こともできる。腹水液はそのまま、あるいは従来公知の
方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セフ
ァデックスなどによるゲルろ過法、イオン交換クロマト
グラフィー法、電気泳動法、透析、限外ろ過法、アフィ
ニティ・クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラ
フィー法などにより精製してモノクローナル抗体として
用いることができる。好ましくは、モノクローナル抗体
を含有する腹水は、硫安分画した後、DEAE−セファロー
スの如き、陰イオン交換ゲル及びプロテイン Aカラムの
如きアフィニティ・カラムなどで処理し精製分離処理で
きる。特に好ましくは抗原又は抗原断片（例えば合成ペ
プチド、組換え抗原タンパク質あるいはペプチド、抗体
が特異的に認識する部位など）を固定化したアフィニテ
ィ・クロマトグラフィー、プロテイン Aを固定化したア
フィニティ・クロマトグラフィーなどが挙げられる。
-1640 培地などの適当な増殖用培地中で培養し、その培
地上清から所望のモノクローナル抗体を得ることが出来
る。大量の抗体を得るためには、ハイブリドーマを腹水
化することが挙げられる。この場合ミエローマ細胞由来
の動物と同系の組織適合性動物の腹腔内に各ハイブリド
ーマを移植し、増殖させるか、あるいは例えばヌード・
マウスなどに各ハイブリドーマを移植し、増殖させ、該
動物の腹水中に産生されたモノクローナル抗体を回収し
て得ることが出来る。動物はハイブリドーマの移植に先
立ち、プリスタン（2,6,10,14-テトラメチルペンタデカ
ン）などの鉱物油を腹腔内投与しておくことができ、そ
の処理後、ハイブリドーマを増殖させ、腹水を採取する
こともできる。腹水液はそのまま、あるいは従来公知の
方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セフ
ァデックスなどによるゲルろ過法、イオン交換クロマト
グラフィー法、電気泳動法、透析、限外ろ過法、アフィ
ニティ・クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラ
フィー法などにより精製してモノクローナル抗体として
用いることができる。好ましくは、モノクローナル抗体
を含有する腹水は、硫安分画した後、DEAE−セファロー
スの如き、陰イオン交換ゲル及びプロテイン Aカラムの
如きアフィニティ・カラムなどで処理し精製分離処理で
きる。特に好ましくは抗原又は抗原断片（例えば合成ペ
プチド、組換え抗原タンパク質あるいはペプチド、抗体
が特異的に認識する部位など）を固定化したアフィニテ
ィ・クロマトグラフィー、プロテイン Aを固定化したア
フィニティ・クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００８８】またこうして大量に得られた抗体の配列を
決定したり、ハイブリドーマ株から得られた抗体をコー
ドする核酸配列を利用して、遺伝子組換え技術により抗
体を作製することも可能である。さらにこれら抗体をト
リプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理し
て、場合により還元して得られるFab 、Fab'、F(ab')2
といった抗体フラグメントにして使用してもよい。標識
物を付与する抗体としては、IgG 画分、更にはペプシン
消化後還元して得られる特異的結合部Fab'を用いること
ができる。これらの場合の標識物の例としては、下記す
るように酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼあるいはβ-D- ガラクトシダーゼなど）、化学物
質、蛍光物質あるいは放射性同位元素などがある。本発
明での検知・測定は、イムノ染色、例えば組織あるいは
細胞染色、イムノアッセイ、例えば競合型イムノアッセ
イまたは非競合型イムノアッセイで行うことができ、ラ
ジオイムノアッセイ、ELISA などを用いることができ、
Ｂ−Ｆ分離を行ってもよいし、あるいは行わないでその
測定を行うことができる。好ましくは放射免疫測定法や
酵素免疫測定法であり、さらにサンドイッチ型アッセイ
が挙げられる。例えばサンドイッチ型アッセイでは、ヒ
トMT5-MMP に対する抗体の一方を検出可能に標識化す
る。同じ抗原を認識できる他の抗体を固相に固定化す
る。
決定したり、ハイブリドーマ株から得られた抗体をコー
ドする核酸配列を利用して、遺伝子組換え技術により抗
体を作製することも可能である。さらにこれら抗体をト
リプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理し
て、場合により還元して得られるFab 、Fab'、F(ab')2
といった抗体フラグメントにして使用してもよい。標識
物を付与する抗体としては、IgG 画分、更にはペプシン
消化後還元して得られる特異的結合部Fab'を用いること
ができる。これらの場合の標識物の例としては、下記す
るように酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼあるいはβ-D- ガラクトシダーゼなど）、化学物
質、蛍光物質あるいは放射性同位元素などがある。本発
明での検知・測定は、イムノ染色、例えば組織あるいは
細胞染色、イムノアッセイ、例えば競合型イムノアッセ
イまたは非競合型イムノアッセイで行うことができ、ラ
ジオイムノアッセイ、ELISA などを用いることができ、
Ｂ−Ｆ分離を行ってもよいし、あるいは行わないでその
測定を行うことができる。好ましくは放射免疫測定法や
酵素免疫測定法であり、さらにサンドイッチ型アッセイ
が挙げられる。例えばサンドイッチ型アッセイでは、ヒ
トMT5-MMP に対する抗体の一方を検出可能に標識化す
る。同じ抗原を認識できる他の抗体を固相に固定化す
る。
【００８９】検体と標識化抗体及び固相化抗体を必要に
応じ順次反応させるためインキュベーション処理し、こ
こで非結合抗体を分離後、標識物を測定する。測定され
た標識の量は抗原、すなわちヒトMT5-MMP の量と比例す
る。このアッセイでは、不溶化抗体や、標識化抗体の添
加の順序に応じて同時サンドイッチ型アッセイ、フォワ
ード（forward)サンドイッチ型アッセイあるいは逆サン
ドイッチ型アッセイなどと呼ばれる。例えば洗浄、撹
拌、震盪、ろ過あるいは抗原の予備抽出等は、特定の状
況のもとでそれら測定工程の中で適宜採用される。特定
の試薬、緩衝液等の濃度、温度あるいはインキュベーシ
ョン処理時間などのその他の測定条件は、検体中の抗原
の濃度、検体試料の性質等の要素に従い変えることがで
きる。当業者は通常の実験法を用いながら各測定に対し
て有効な最適の条件を適宜選定して測定を行うことが出
来る。
応じ順次反応させるためインキュベーション処理し、こ
こで非結合抗体を分離後、標識物を測定する。測定され
た標識の量は抗原、すなわちヒトMT5-MMP の量と比例す
る。このアッセイでは、不溶化抗体や、標識化抗体の添
加の順序に応じて同時サンドイッチ型アッセイ、フォワ
ード（forward)サンドイッチ型アッセイあるいは逆サン
ドイッチ型アッセイなどと呼ばれる。例えば洗浄、撹
拌、震盪、ろ過あるいは抗原の予備抽出等は、特定の状
況のもとでそれら測定工程の中で適宜採用される。特定
の試薬、緩衝液等の濃度、温度あるいはインキュベーシ
ョン処理時間などのその他の測定条件は、検体中の抗原
の濃度、検体試料の性質等の要素に従い変えることがで
きる。当業者は通常の実験法を用いながら各測定に対し
て有効な最適の条件を適宜選定して測定を行うことが出
来る。
【００９０】抗原あるいは抗体を固相化できる多くの担
体が知られており、本発明ではそれらから適宜選んで用
いることができる。担体としては、抗原抗体反応などに
使用されるものが種々知られており、本発明においても
勿論これらの公知のものの中から選んで使用できる。特
に好適に使用されるものとしては、例えばガラス、例え
ば活性化ガラス、多孔質ガラス、シリカゲル、シリカ−
アルミナ、アルミナ、磁化鉄、磁化合金などの無機材
料、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、
ポリフッ化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリ
レート、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合
体、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ス
チレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタ
クリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタ
クリレート共重合体など、架橋化アルブミン、コラーゲ
ン、ゼラチン、デキストラン、アガロース、架橋アガロ
ース、セルロース、微結晶セルロース、カルボキシメチ
ルセルロース、セルロースアセテートなどの天然または
変成セルロース、架橋デキストラン、ナイロンなどのポ
リアミド、ポリウレタン、ポリエポキシ樹脂などの有機
高分子物質、さらにそれらを乳化重合して得られたも
の、細胞、赤血球などで、必要に応じ、シランカップリ
ング剤などで官能性基を導入してあるものが挙げられ
る。さらに、ろ紙、ビーズ、試験容器の内壁、例えば試
験管、タイタープレート、タイターウェル、ガラスセ
ル、合成樹脂製セルなどの合成材料からなるセル、ガラ
ス棒、合成材料からなる棒、末端を太くしたりあるいは
細くしたりした棒、末端に丸い突起をつけたりあるいは
偏平な突起をつけた棒、薄板状にした棒などの固体物質
（物体）の表面などが挙げられる。
体が知られており、本発明ではそれらから適宜選んで用
いることができる。担体としては、抗原抗体反応などに
使用されるものが種々知られており、本発明においても
勿論これらの公知のものの中から選んで使用できる。特
に好適に使用されるものとしては、例えばガラス、例え
ば活性化ガラス、多孔質ガラス、シリカゲル、シリカ−
アルミナ、アルミナ、磁化鉄、磁化合金などの無機材
料、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、
ポリフッ化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリ
レート、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合
体、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ス
チレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタ
クリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタ
クリレート共重合体など、架橋化アルブミン、コラーゲ
ン、ゼラチン、デキストラン、アガロース、架橋アガロ
ース、セルロース、微結晶セルロース、カルボキシメチ
ルセルロース、セルロースアセテートなどの天然または
変成セルロース、架橋デキストラン、ナイロンなどのポ
リアミド、ポリウレタン、ポリエポキシ樹脂などの有機
高分子物質、さらにそれらを乳化重合して得られたも
の、細胞、赤血球などで、必要に応じ、シランカップリ
ング剤などで官能性基を導入してあるものが挙げられ
る。さらに、ろ紙、ビーズ、試験容器の内壁、例えば試
験管、タイタープレート、タイターウェル、ガラスセ
ル、合成樹脂製セルなどの合成材料からなるセル、ガラ
ス棒、合成材料からなる棒、末端を太くしたりあるいは
細くしたりした棒、末端に丸い突起をつけたりあるいは
偏平な突起をつけた棒、薄板状にした棒などの固体物質
（物体）の表面などが挙げられる。
【００９１】これら担体へは、抗体を結合させることが
でき、好ましくは本発明で得られるMT5-MMP に対し特異
的に結合するモノクローナル抗体を結合させることがで
きる。担体とこれら抗原抗体反応に関与するものとの結
合は、吸着などの物理的な手法、あるいは縮合剤などを
用いたり、活性化されたものなどを用いたりする化学的
な方法、さらには相互の化学的な結合反応を利用した手
法などにより行うことが出来る。標識としては、酵素、
酵素基質、酵素インヒビター、補欠分子類、補酵素、酵
素前駆体、アポ酵素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネ
ッセンス化合物、発光物質、発色物質、磁気物質、金属
粒子、例えば金コロイドなど、放射性物質などを挙げる
ことができる。酵素としては、脱水素酵素、還元酵素、
酸化酵素などの酸化還元酵素、例えばアミノ基、カルボ
キシル基、メチル基、アシル基、リン酸基などを転移す
るのを触媒する転移酵素、例えばエステル結合、グリコ
シド結合、エーテル結合、ペプチド結合などを加水分解
する加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ
などを挙げることができる。酵素は複数の酵素を複合的
に用いて検知に利用することもできる。例えば酵素的サ
イクリングを利用することもできる。
でき、好ましくは本発明で得られるMT5-MMP に対し特異
的に結合するモノクローナル抗体を結合させることがで
きる。担体とこれら抗原抗体反応に関与するものとの結
合は、吸着などの物理的な手法、あるいは縮合剤などを
用いたり、活性化されたものなどを用いたりする化学的
な方法、さらには相互の化学的な結合反応を利用した手
法などにより行うことが出来る。標識としては、酵素、
酵素基質、酵素インヒビター、補欠分子類、補酵素、酵
素前駆体、アポ酵素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネ
ッセンス化合物、発光物質、発色物質、磁気物質、金属
粒子、例えば金コロイドなど、放射性物質などを挙げる
ことができる。酵素としては、脱水素酵素、還元酵素、
酸化酵素などの酸化還元酵素、例えばアミノ基、カルボ
キシル基、メチル基、アシル基、リン酸基などを転移す
るのを触媒する転移酵素、例えばエステル結合、グリコ
シド結合、エーテル結合、ペプチド結合などを加水分解
する加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ
などを挙げることができる。酵素は複数の酵素を複合的
に用いて検知に利用することもできる。例えば酵素的サ
イクリングを利用することもできる。
【００９２】代表的な放射性物質の標識用同位体元素と
しては、[32P], [125I], [131I],[3H],[14 C],[35S] な
どが挙げられる。代表的な酵素標識としては、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ、大腸菌β
-D- ガラクトシダーゼなどのガラクトシダーゼ、マレエ
ート・デヒドロゲナーゼ、グルコース-6- フォスフェー
ト・デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グル
コアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、カタラー
ゼ、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、大腸菌アルカリ
ホスファターゼなどのアルカリフォスファターゼなどが
挙げられる。アルカリホスファターゼを用いた場合、4-
メチルウンベリフェリルフォスフェートなどのウンベリ
フェロン誘導体、ニトロフェニルホスフェートなどのリ
ン酸化フェノール誘導体、NADPを利用した酵素的サイク
リング系、ルシフェリン誘導体、ジオキセタン誘導体な
どの基質を使用したりして、生ずる蛍光、発光などによ
り測定できる。ルシフェリン、ルシフェラーゼ系を利用
したりすることもできる。カタラーゼを用いた場合、過
酸化水素と反応して酸素を生成するので、その酸素を電
極などで検知することもできる。電極としてはガラス電
極、難溶性塩膜を用いるイオン電極、液膜型電極、高分
子膜電極などであることもできる。酵素標識は、ビオチ
ン標識体と酵素標識アビジン（ストレプトアビジン）に
置き換えることも可能である。標識は、複数の異なった
種類の標識を使用することもできる。こうした場合、複
数の測定を連続的に、あるいは非連続的に、そして同時
にあるいは別々に行うことを可能にすることもできる。
しては、[32P], [125I], [131I],[3H],[14 C],[35S] な
どが挙げられる。代表的な酵素標識としては、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ、大腸菌β
-D- ガラクトシダーゼなどのガラクトシダーゼ、マレエ
ート・デヒドロゲナーゼ、グルコース-6- フォスフェー
ト・デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グル
コアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、カタラー
ゼ、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、大腸菌アルカリ
ホスファターゼなどのアルカリフォスファターゼなどが
挙げられる。アルカリホスファターゼを用いた場合、4-
メチルウンベリフェリルフォスフェートなどのウンベリ
フェロン誘導体、ニトロフェニルホスフェートなどのリ
ン酸化フェノール誘導体、NADPを利用した酵素的サイク
リング系、ルシフェリン誘導体、ジオキセタン誘導体な
どの基質を使用したりして、生ずる蛍光、発光などによ
り測定できる。ルシフェリン、ルシフェラーゼ系を利用
したりすることもできる。カタラーゼを用いた場合、過
酸化水素と反応して酸素を生成するので、その酸素を電
極などで検知することもできる。電極としてはガラス電
極、難溶性塩膜を用いるイオン電極、液膜型電極、高分
子膜電極などであることもできる。酵素標識は、ビオチ
ン標識体と酵素標識アビジン（ストレプトアビジン）に
置き換えることも可能である。標識は、複数の異なった
種類の標識を使用することもできる。こうした場合、複
数の測定を連続的に、あるいは非連続的に、そして同時
にあるいは別々に行うことを可能にすることもできる。
【００９３】本発明においては、信号の形成に4-ヒドロ
キシフェニル酢酸、1,2-フェニレンジアミン、テトラメ
チルベンジジンなどと西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ、
ウンベリフェリルガラクトシド、ニトロフェニルガラク
トシドなどとβ-D- ガラクトシダーゼ、グルコース-6-
リン酸・デヒドロゲナーゼなどの酵素試薬の組合わせも
利用でき、ヒドロキノン、ヒドロキシベンゾキノン、ヒ
ドロキシアントラキノンなどのキノール化合物、リポ
酸、グルタチオンなどのチオール化合物、フェノール誘
導体、フェロセン誘導体などを酵素などの働きで形成し
うるものが使用できる。蛍光物質あるいは化学ルミネッ
センス化合物としては、フルオレセインイソチオシアネ
ート、例えばローダミンＢイソチオシアネート、テトラ
メチルローダミンイソチオシアネートなどのローダミン
誘導体、ダンシルクロリド、ダンシルフルオリド、フル
オレスカミン、フィコビリプロテイン、アクリジニウム
塩、ルミフェリン、ルシフェラーゼ、エクォリンなどの
ルミノール、イミダゾール、シュウ酸エステル、希土類
キレート化合物、クマリン誘導体などが挙げられる。標
識するには、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジ
ルジスルフィド基とチオール基の反応、アミノ基とアル
デヒド基の反応などを利用して行うことができ、公知の
方法あるいは当該分野の当業者が容易になしうる方法、
さらにはそれらを修飾した方法の中から適宜選択して適
用できる。また上記免疫原性複合体作製に使用されるこ
とのできる縮合剤、担体との結合に使用されることので
きる縮合剤などを用いることができる。
キシフェニル酢酸、1,2-フェニレンジアミン、テトラメ
チルベンジジンなどと西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ、
ウンベリフェリルガラクトシド、ニトロフェニルガラク
トシドなどとβ-D- ガラクトシダーゼ、グルコース-6-
リン酸・デヒドロゲナーゼなどの酵素試薬の組合わせも
利用でき、ヒドロキノン、ヒドロキシベンゾキノン、ヒ
ドロキシアントラキノンなどのキノール化合物、リポ
酸、グルタチオンなどのチオール化合物、フェノール誘
導体、フェロセン誘導体などを酵素などの働きで形成し
うるものが使用できる。蛍光物質あるいは化学ルミネッ
センス化合物としては、フルオレセインイソチオシアネ
ート、例えばローダミンＢイソチオシアネート、テトラ
メチルローダミンイソチオシアネートなどのローダミン
誘導体、ダンシルクロリド、ダンシルフルオリド、フル
オレスカミン、フィコビリプロテイン、アクリジニウム
塩、ルミフェリン、ルシフェラーゼ、エクォリンなどの
ルミノール、イミダゾール、シュウ酸エステル、希土類
キレート化合物、クマリン誘導体などが挙げられる。標
識するには、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジ
ルジスルフィド基とチオール基の反応、アミノ基とアル
デヒド基の反応などを利用して行うことができ、公知の
方法あるいは当該分野の当業者が容易になしうる方法、
さらにはそれらを修飾した方法の中から適宜選択して適
用できる。また上記免疫原性複合体作製に使用されるこ
とのできる縮合剤、担体との結合に使用されることので
きる縮合剤などを用いることができる。
【００９４】縮合剤としては、例えばホルムアルデヒ
ド、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネ
ート、ヘキサメチレンジイソチオシアネート、N,N'- ポ
リメチレンビスヨードアセトアミド、N,N'- エチレンビ
スマレイミド、エチレングリコールビススクシニミジル
スクシネート、ビスジアゾベンジジン、1-エチル-3-(3-
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシンイ
ミジル 3-(2- ピリジルジチオ）プロピオネート(SPD
P)、N-スクシンイミジル 4-(N- マレイミドメチル）シ
クロヘキサン-1- カルボキシレート(SMCC)、N-スルホス
クシンイミジル 4-(N- マレイミドメチル）シクロヘキ
サン-1- カルボキシレート、N-スクシンイミジル (4-
ヨードアセチル）アミノベンゾエート、N-スクシンイミ
ジル 4-(1-マレイミドフェニル）ブチレート、 N-(ε
−マレイミドカプロイルオキシ）コハク酸イミド(EMC
S), イミノチオラン、S-アセチルメルカプトコハク酸無
水物、メチル-3-(4'- ジチオピリジル）プロピオンイミ
デート、メチル-4- メルカプトブチリルイミデート、メ
チル-3- メルカプトプロピオンイミデート、N-スクシン
イミジル-S- アセチルメルカプトアセテートなどが挙げ
られる。
ド、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネ
ート、ヘキサメチレンジイソチオシアネート、N,N'- ポ
リメチレンビスヨードアセトアミド、N,N'- エチレンビ
スマレイミド、エチレングリコールビススクシニミジル
スクシネート、ビスジアゾベンジジン、1-エチル-3-(3-
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシンイ
ミジル 3-(2- ピリジルジチオ）プロピオネート(SPD
P)、N-スクシンイミジル 4-(N- マレイミドメチル）シ
クロヘキサン-1- カルボキシレート(SMCC)、N-スルホス
クシンイミジル 4-(N- マレイミドメチル）シクロヘキ
サン-1- カルボキシレート、N-スクシンイミジル (4-
ヨードアセチル）アミノベンゾエート、N-スクシンイミ
ジル 4-(1-マレイミドフェニル）ブチレート、 N-(ε
−マレイミドカプロイルオキシ）コハク酸イミド(EMC
S), イミノチオラン、S-アセチルメルカプトコハク酸無
水物、メチル-3-(4'- ジチオピリジル）プロピオンイミ
デート、メチル-4- メルカプトブチリルイミデート、メ
チル-3- メルカプトプロピオンイミデート、N-スクシン
イミジル-S- アセチルメルカプトアセテートなどが挙げ
られる。
【００９５】本発明の測定法によれば、測定すべき物質
を酵素などで標識したモノクローナル抗体などの標識抗
体試薬と、担体に結合された抗体とを順次反応させるこ
とができるし、同時に反応させることもできる。試薬を
加える順序は選ばれた担体系の型により異なる。感作さ
れたプラスチックなどのビーズを用いた場合には、酵素
などで標識したモノクローナル抗体などの標識抗体試薬
を測定すべき物質を含む検体試料と共に最初適当な試験
管中に一緒に入れ、その後該感作されたプラスチックな
どのビーズを加えることにより測定を行うことができ
る。本発明の定量法においては、免疫学的測定法が用い
られるが、その際の固相担体としては、抗体などタンパ
ク質を良く吸着するポリスチレン製、ポリカーボネイト
製、ポリプロピレン製あるいはポリビニル製のボール、
マイクロプレート、スティック、微粒子あるいは試験管
などの種々の材料および形態を任意に選択し、使用する
ことができる。測定にあたっては至適pH、例えばpH約４
〜９に保つように適当な緩衝液系中で行うことができ
る。特に適切な緩衝剤としては、例えばアセテート緩衝
剤、クエン酸塩緩衝剤、フォスフェート緩衝剤、トリス
緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ボレート緩衝
剤、グリシン緩衝剤、炭酸塩緩衝剤、トリス−塩酸緩衝
剤などが挙げられる。緩衝剤は互いに任意の割合で混合
して用いることができる。抗原抗体反応は約０℃〜60℃
の間の温度で行うことが好ましい。
を酵素などで標識したモノクローナル抗体などの標識抗
体試薬と、担体に結合された抗体とを順次反応させるこ
とができるし、同時に反応させることもできる。試薬を
加える順序は選ばれた担体系の型により異なる。感作さ
れたプラスチックなどのビーズを用いた場合には、酵素
などで標識したモノクローナル抗体などの標識抗体試薬
を測定すべき物質を含む検体試料と共に最初適当な試験
管中に一緒に入れ、その後該感作されたプラスチックな
どのビーズを加えることにより測定を行うことができ
る。本発明の定量法においては、免疫学的測定法が用い
られるが、その際の固相担体としては、抗体などタンパ
ク質を良く吸着するポリスチレン製、ポリカーボネイト
製、ポリプロピレン製あるいはポリビニル製のボール、
マイクロプレート、スティック、微粒子あるいは試験管
などの種々の材料および形態を任意に選択し、使用する
ことができる。測定にあたっては至適pH、例えばpH約４
〜９に保つように適当な緩衝液系中で行うことができ
る。特に適切な緩衝剤としては、例えばアセテート緩衝
剤、クエン酸塩緩衝剤、フォスフェート緩衝剤、トリス
緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ボレート緩衝
剤、グリシン緩衝剤、炭酸塩緩衝剤、トリス−塩酸緩衝
剤などが挙げられる。緩衝剤は互いに任意の割合で混合
して用いることができる。抗原抗体反応は約０℃〜60℃
の間の温度で行うことが好ましい。
【００９６】酵素などで標識されたモノクローナル抗体
などの抗体試薬及び担体に結合せしめられた抗体試薬、
さらには測定すべき物質のインキュベーション処理は、
平衡に達するまで行うことができるが、抗原抗体反応の
平衡が達成されるよりもずっと早い時点で固相と液相と
を分離して限定されたインキュベーション処理の後に反
応を止めることができ、液相又は固相のいずれかにおけ
る酵素などの標識の存在の程度を測ることができる。測
定操作は、自動化された測定装置を用いて行うことが可
能であり、ルミネセンス・ディテクター、ホト・ディテ
クターなどを使用して基質が酵素の作用で変換されて生
ずる表示シグナルを検知して測定することもできる。抗
原抗体反応においては、それぞれ用いられる試薬、測定
すべき物質、さらには酵素などの標識を安定化したり、
抗原抗体反応自体を安定化するように適切な手段を講ず
ることができる。さらに、非特異的な反応を除去し、阻
害的に働く影響を減らしたり、あるいは測定反応を活性
化したりするため、タンパク質、安定化剤、界面活性化
剤、キレート化剤などをインキュベーション溶液中に加
えることもできる。キレート化剤としては、エチレンジ
アミン四酢酸塩 (EDTA) がより好ましい。当該分野で普
通に採用されていたりあるいは当業者に知られた非特異
的結合反応を防ぐためのブロッキング処理を施してもよ
く、例えば、哺乳動物などの正常血清タンパク質、アル
ブミン、スキムミルク、乳発酵物質、コラーゲン、ゼラ
チンなどで処理することができる。非特異的結合反応を
防ぐ目的である限り、それらの方法は特に限定されず用
いることが出来る。
などの抗体試薬及び担体に結合せしめられた抗体試薬、
さらには測定すべき物質のインキュベーション処理は、
平衡に達するまで行うことができるが、抗原抗体反応の
平衡が達成されるよりもずっと早い時点で固相と液相と
を分離して限定されたインキュベーション処理の後に反
応を止めることができ、液相又は固相のいずれかにおけ
る酵素などの標識の存在の程度を測ることができる。測
定操作は、自動化された測定装置を用いて行うことが可
能であり、ルミネセンス・ディテクター、ホト・ディテ
クターなどを使用して基質が酵素の作用で変換されて生
ずる表示シグナルを検知して測定することもできる。抗
原抗体反応においては、それぞれ用いられる試薬、測定
すべき物質、さらには酵素などの標識を安定化したり、
抗原抗体反応自体を安定化するように適切な手段を講ず
ることができる。さらに、非特異的な反応を除去し、阻
害的に働く影響を減らしたり、あるいは測定反応を活性
化したりするため、タンパク質、安定化剤、界面活性化
剤、キレート化剤などをインキュベーション溶液中に加
えることもできる。キレート化剤としては、エチレンジ
アミン四酢酸塩 (EDTA) がより好ましい。当該分野で普
通に採用されていたりあるいは当業者に知られた非特異
的結合反応を防ぐためのブロッキング処理を施してもよ
く、例えば、哺乳動物などの正常血清タンパク質、アル
ブミン、スキムミルク、乳発酵物質、コラーゲン、ゼラ
チンなどで処理することができる。非特異的結合反応を
防ぐ目的である限り、それらの方法は特に限定されず用
いることが出来る。
【００９７】本発明の測定方法で測定される試料として
は、あらゆる形態の溶液やコロイド溶液、非流体試料な
どが使用しうるが、好ましくは生物由来の試料、例えば
血液、血清、血漿、関節液、脳脊髄液、唾液、羊水、
尿、その他の体液、細胞培養液、組織培養液、組織ホモ
ジュネート、生検試料、組織、細胞などが挙げられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用
するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要と
されない。それぞれの方法における通常の条件、操作法
に当業者の通常の技術的配慮を加えて、本発明のプロテ
アーゼ活性を有する因子である天然のヒトMT5-MMP ある
いはそれと実質的に同等な活性を有するヒト由来のタン
パク質に関連した測定系を構築すればよい。これらの一
般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参
照することができる〔例えば、入江 寛編，「ラジオイ
ムノアッセイ」，講談社，昭和49年発行；入江 寛編，
「続ラジオイムノアッセイ」，講談社，昭和54年発行；
石川栄治ら編，「酵素免疫測定法」，医学書院，昭和53
年発行；石川栄治ら編，「酵素免疫測定法」（第２
版），医学書院，昭和57年発行；石川栄治ら編，「酵素
免疫測定法」（第３版），医学書院，昭和62年発行；H.
V. Vunakis et al. (ed.), "Methods in Enzymology",
Vol. 70 (Immunochemical Techniques, Part A), Acad
emic Press, NewYork (1980); J. J. Langone et al.
(ed.), "Methods in Enzymology", Vol.73 (Immunochem
ical Techniques, Part B), Academic Press, New York
(1981);J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in E
nzymology", Vol. 74 (Immunochemical Techniques, Pa
rt C), Academic Press, New York (1981); J. J. Lang
one et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 8
4 (Immunochemical Techniques, Part D: Selected Imm
unoassays), Academic Press, New York (1982);J. J.
Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vo
l. 92 (Immunochemical Techniques, Part E: Monoclon
al Antibodies and General ImmunoassayMethods), Aca
demic Press, New York (1983); J. J. Langone et a
l. (ed.),"Methods in Enzymology", Vol. 121 (Immuno
chemical Techniques, Part I: Hybridoma Technology
and Monoclonal Antibodies), Academic Press, New Yo
rk(1986)など参照〕。本発明の抗MT5-MMP 抗体、特にモ
ノクローナル抗体を用いて、エピトープマッピングを行
うこともでき、各エピトープを認識する抗体を用いれば
プロ酵素、活性型酵素などの検知・測定を行うことがで
きる。
は、あらゆる形態の溶液やコロイド溶液、非流体試料な
どが使用しうるが、好ましくは生物由来の試料、例えば
血液、血清、血漿、関節液、脳脊髄液、唾液、羊水、
尿、その他の体液、細胞培養液、組織培養液、組織ホモ
ジュネート、生検試料、組織、細胞などが挙げられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用
するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要と
されない。それぞれの方法における通常の条件、操作法
に当業者の通常の技術的配慮を加えて、本発明のプロテ
アーゼ活性を有する因子である天然のヒトMT5-MMP ある
いはそれと実質的に同等な活性を有するヒト由来のタン
パク質に関連した測定系を構築すればよい。これらの一
般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参
照することができる〔例えば、入江 寛編，「ラジオイ
ムノアッセイ」，講談社，昭和49年発行；入江 寛編，
「続ラジオイムノアッセイ」，講談社，昭和54年発行；
石川栄治ら編，「酵素免疫測定法」，医学書院，昭和53
年発行；石川栄治ら編，「酵素免疫測定法」（第２
版），医学書院，昭和57年発行；石川栄治ら編，「酵素
免疫測定法」（第３版），医学書院，昭和62年発行；H.
V. Vunakis et al. (ed.), "Methods in Enzymology",
Vol. 70 (Immunochemical Techniques, Part A), Acad
emic Press, NewYork (1980); J. J. Langone et al.
(ed.), "Methods in Enzymology", Vol.73 (Immunochem
ical Techniques, Part B), Academic Press, New York
(1981);J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in E
nzymology", Vol. 74 (Immunochemical Techniques, Pa
rt C), Academic Press, New York (1981); J. J. Lang
one et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 8
4 (Immunochemical Techniques, Part D: Selected Imm
unoassays), Academic Press, New York (1982);J. J.
Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vo
l. 92 (Immunochemical Techniques, Part E: Monoclon
al Antibodies and General ImmunoassayMethods), Aca
demic Press, New York (1983); J. J. Langone et a
l. (ed.),"Methods in Enzymology", Vol. 121 (Immuno
chemical Techniques, Part I: Hybridoma Technology
and Monoclonal Antibodies), Academic Press, New Yo
rk(1986)など参照〕。本発明の抗MT5-MMP 抗体、特にモ
ノクローナル抗体を用いて、エピトープマッピングを行
うこともでき、各エピトープを認識する抗体を用いれば
プロ酵素、活性型酵素などの検知・測定を行うことがで
きる。
【００９８】こうして典型的には本発明の目的は、ヒト
MT5-MMP 遺伝子、それから誘導されたプローブを用い、
又はヒトMT5-MMP に対するモノクローナル抗体及び固相
担体用としてヒトMT5-MMP に対するモノクローナル抗体
を用い、あるいはさらに必要に応じ、ヒトMT5-MMP に対
する阻害物質を用い、被検試料中の遊離のプロ体や活性
型ヒトMT5-MMP あるいはその遺伝子、さらには産生細胞
を検知・分別定量する優れた方法及びその為の試薬キッ
トを提供することにある。本発明はこうした遊離のプロ
体や活性型ヒトMT5-MMP あるいはその遺伝子、さらには
産生細胞を検知・分別定量することのできる試薬キット
のうちの各試薬をすべてその実施態様のうちに含むと理
解される。さらに本発明の目的は、上記方法を用いて遊
離のヒトプロMT5-MMP や活性型ヒトMT5-MMP あるいはそ
の遺伝子、さらには産生細胞を検知・分別定量すること
により、細胞外マトリックスの代謝・改変・形成、例え
ば結合組織の代謝・改変・形成など、老化を含め、多く
の正常な細胞のプロセスに関与するメタロプロテアーゼ
の役割、アテローム性動脈硬化症、例えばエーレルス−
ダンロー症候群 (Ehlers-Danlos syndrome) 、マルファ
ン症候群 (Marfan'ssyndrome)といったような先天性疾
患、アルツハイマー病、肺気腫、肺線維症、肝線維症、
リウマチ性関節炎および癌の浸潤・転移の様な多くの疾
患などをモニターし得る方法並びに試薬あるいは診断剤
を提供することにある。したがって、医学的・生理学的
分野における上記試薬の各種利用、腫瘍・癌といったヒ
トなどの動物の細胞・組織の研究・解析・測定などの目
的で上記試薬を使用することはすべて本発明のその実施
態様のうちに含まれると理解される。
MT5-MMP 遺伝子、それから誘導されたプローブを用い、
又はヒトMT5-MMP に対するモノクローナル抗体及び固相
担体用としてヒトMT5-MMP に対するモノクローナル抗体
を用い、あるいはさらに必要に応じ、ヒトMT5-MMP に対
する阻害物質を用い、被検試料中の遊離のプロ体や活性
型ヒトMT5-MMP あるいはその遺伝子、さらには産生細胞
を検知・分別定量する優れた方法及びその為の試薬キッ
トを提供することにある。本発明はこうした遊離のプロ
体や活性型ヒトMT5-MMP あるいはその遺伝子、さらには
産生細胞を検知・分別定量することのできる試薬キット
のうちの各試薬をすべてその実施態様のうちに含むと理
解される。さらに本発明の目的は、上記方法を用いて遊
離のヒトプロMT5-MMP や活性型ヒトMT5-MMP あるいはそ
の遺伝子、さらには産生細胞を検知・分別定量すること
により、細胞外マトリックスの代謝・改変・形成、例え
ば結合組織の代謝・改変・形成など、老化を含め、多く
の正常な細胞のプロセスに関与するメタロプロテアーゼ
の役割、アテローム性動脈硬化症、例えばエーレルス−
ダンロー症候群 (Ehlers-Danlos syndrome) 、マルファ
ン症候群 (Marfan'ssyndrome)といったような先天性疾
患、アルツハイマー病、肺気腫、肺線維症、肝線維症、
リウマチ性関節炎および癌の浸潤・転移の様な多くの疾
患などをモニターし得る方法並びに試薬あるいは診断剤
を提供することにある。したがって、医学的・生理学的
分野における上記試薬の各種利用、腫瘍・癌といったヒ
トなどの動物の細胞・組織の研究・解析・測定などの目
的で上記試薬を使用することはすべて本発明のその実施
態様のうちに含まれると理解される。
【００９９】本発明のヒトMT5-MMP あるいはその塩は、
プロテアーゼ活性を有し、例えば生体内で上記したよう
な、細胞外マトリックス、結合組織などの、代謝・改変
・形成などにおいて不可欠な因子であると考えられる。
そして、該タンパク質はヒトMT5-MMP 無形成症、MT5-MM
P 発現不全症、MT5-MMP 遺伝子欠損症など病状を呈する
ヒトMT5-MMP 関連機能不全疾患の治療に有用であると考
えられる。すなわち、ヒトMT5-MMP 、変異体、修飾体、
誘導体を含有する医薬を用いれば、MT5-MMP による活性
が不充分であることに起因する疾患患者を健常な状態に
することが可能である。本発明のタンパク質は、プロテ
アーゼの一つであり、該タンパク質の発現量やプロテア
ーゼ活性が減少している場合に生ずる種々の疾患の治療
及び／又は予防剤などの医薬として有用である。また本
発明のタンパク質は、タンパク質に対する分解活性が減
少している場合に生ずる種々の疾患の治療及び／又は予
防剤などの医薬として有用である。例えば、生体内にお
いてヒトMT5-MMP が減少あるいは欠損しているために、
細胞における当該生物学的活性が十分に得られていない
か、あるいは正常でない症状の患者の場合には、(A) 本
発明のタンパク質等を該患者に投与することによるか、
(B) 本発明のDNA などの核酸を該患者に投与して、生体
内で本発明のタンパク質等を発現させることによるか、
(C) 本発明のDNA などの核酸を発現可能に導入した細胞
を該患者に移植することによって、生体内に本発明のタ
ンパク質等を補充する等して、該患者における当該症状
を改善したりする。
プロテアーゼ活性を有し、例えば生体内で上記したよう
な、細胞外マトリックス、結合組織などの、代謝・改変
・形成などにおいて不可欠な因子であると考えられる。
そして、該タンパク質はヒトMT5-MMP 無形成症、MT5-MM
P 発現不全症、MT5-MMP 遺伝子欠損症など病状を呈する
ヒトMT5-MMP 関連機能不全疾患の治療に有用であると考
えられる。すなわち、ヒトMT5-MMP 、変異体、修飾体、
誘導体を含有する医薬を用いれば、MT5-MMP による活性
が不充分であることに起因する疾患患者を健常な状態に
することが可能である。本発明のタンパク質は、プロテ
アーゼの一つであり、該タンパク質の発現量やプロテア
ーゼ活性が減少している場合に生ずる種々の疾患の治療
及び／又は予防剤などの医薬として有用である。また本
発明のタンパク質は、タンパク質に対する分解活性が減
少している場合に生ずる種々の疾患の治療及び／又は予
防剤などの医薬として有用である。例えば、生体内にお
いてヒトMT5-MMP が減少あるいは欠損しているために、
細胞における当該生物学的活性が十分に得られていない
か、あるいは正常でない症状の患者の場合には、(A) 本
発明のタンパク質等を該患者に投与することによるか、
(B) 本発明のDNA などの核酸を該患者に投与して、生体
内で本発明のタンパク質等を発現させることによるか、
(C) 本発明のDNA などの核酸を発現可能に導入した細胞
を該患者に移植することによって、生体内に本発明のタ
ンパク質等を補充する等して、該患者における当該症状
を改善したりする。
【０１００】本発明のヒトMT5-MMP の生物学的活性など
の機能（例えば、プロテアーゼ活性など）を促進する化
合物（アゴニスト、あるいは促進剤）又はその塩は、ヒ
トMT5-MMP 機能不全症状、アテローム性動脈硬化症、例
えばエーレルス−ダンロー症候群、マルファン症候群と
いったような先天性疾患、アルツハイマー病、肺気腫、
肺線維症、肝線維症、リウマチ性関節炎および癌の浸潤
・転移などの各種の疾病の治療及び／又は予防剤として
有用な医薬として使用できる。一方、本発明のヒトMT5-
MMP の生物学的活性などの機能（例えば、プロテアーゼ
活性など）を阻害する化合物（アンタゴニスト、あるい
は阻害剤）又はその塩は、過ヒトMT5-MMP 機能症、アテ
ローム性動脈硬化症、例えばエーレルス−ダンロー症候
群、マルファン症候群といったような先天性疾患、アル
ツハイマー病、肺気腫、肺線維症、肝線維症、リウマチ
性関節炎および癌の浸潤・転移などの各種の疾病の治療
及び／又は予防剤などの医薬として使用できる。例えば
ヒトMT5-MMP はメタロプロテアーゼの基質に対して分解
活性を有するが、この活性は、メタロプロテアーゼに特
異的なインヒビターで阻害される。したがって、該イン
ヒビターは、MT5-MMP による過剰分解に起因する疾患の
治療用医薬として有用である。
の機能（例えば、プロテアーゼ活性など）を促進する化
合物（アゴニスト、あるいは促進剤）又はその塩は、ヒ
トMT5-MMP 機能不全症状、アテローム性動脈硬化症、例
えばエーレルス−ダンロー症候群、マルファン症候群と
いったような先天性疾患、アルツハイマー病、肺気腫、
肺線維症、肝線維症、リウマチ性関節炎および癌の浸潤
・転移などの各種の疾病の治療及び／又は予防剤として
有用な医薬として使用できる。一方、本発明のヒトMT5-
MMP の生物学的活性などの機能（例えば、プロテアーゼ
活性など）を阻害する化合物（アンタゴニスト、あるい
は阻害剤）又はその塩は、過ヒトMT5-MMP 機能症、アテ
ローム性動脈硬化症、例えばエーレルス−ダンロー症候
群、マルファン症候群といったような先天性疾患、アル
ツハイマー病、肺気腫、肺線維症、肝線維症、リウマチ
性関節炎および癌の浸潤・転移などの各種の疾病の治療
及び／又は予防剤などの医薬として使用できる。例えば
ヒトMT5-MMP はメタロプロテアーゼの基質に対して分解
活性を有するが、この活性は、メタロプロテアーゼに特
異的なインヒビターで阻害される。したがって、該イン
ヒビターは、MT5-MMP による過剰分解に起因する疾患の
治療用医薬として有用である。
【０１０１】かくして、本発明のヒトMT5-MMP などのタ
ンパク質等は、本発明のヒトMT5-MMP などのタンパク質
等の、生物学的活性などの機能（例えば、プロテアーゼ
活性など）を促進する化合物（アゴニスト）や阻害する
化合物（アンタゴニスト）又はそれらの塩をスクリーニ
ングするための試薬として有用である。かくして、本発
明のヒトMT5-MMP などのタンパク質、その一部のペプチ
ド又はそれらの塩を用いた、本発明のMT5-MMP といった
タンパク質、その一部のペプチド又はそれらの塩などの
生物学的活性などの機能（例えば、プロテアーゼ活性な
ど）を促進する化合物（アゴニスト）や阻害する化合物
（アンタゴニスト）又はそれらの塩のスクリーニング方
法も提供される。該スクリーニングでは、例えば(i) 本
発明のタンパク質、その一部のペプチド又はそれらの塩
（該タンパク質を発現する形質転換体を含んでいもよ
い、以下同様）などに基質を接触させた場合と、(ii)本
発明のタンパク質、その一部のペプチド又はそれらの塩
などに基質及び試験試料を接触させた場合との比較を行
う。具体的には、上記スクリーニングでは、当該生物学
的活性（例えば、プロテアーゼ活性など）を測定して、
比較する。基質としては、本発明のタンパク質等の基質
となることのできるものであれば何れのものであってよ
い。例えば、カゼイン、コラーゲン、ゼラチン、合成オ
リゴペプチド類などのプロテアーゼ活性を測定する目的
で使用されるもの中から選んで用いることができるが、
好ましくはメタロプロテアーゼ用の蛍光標識合成ペプチ
ド基質などを使用できるし、そうしたペプチド基質の例
としては、例えばDNP-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-
Arg 、Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH 2 などを挙
げることができる。基質は、そのまま使用できるが、好
ましくはフルオレッセインなどの蛍光、酵素や放射性物
質で標識したものを使用できる。
ンパク質等は、本発明のヒトMT5-MMP などのタンパク質
等の、生物学的活性などの機能（例えば、プロテアーゼ
活性など）を促進する化合物（アゴニスト）や阻害する
化合物（アンタゴニスト）又はそれらの塩をスクリーニ
ングするための試薬として有用である。かくして、本発
明のヒトMT5-MMP などのタンパク質、その一部のペプチ
ド又はそれらの塩を用いた、本発明のMT5-MMP といった
タンパク質、その一部のペプチド又はそれらの塩などの
生物学的活性などの機能（例えば、プロテアーゼ活性な
ど）を促進する化合物（アゴニスト）や阻害する化合物
（アンタゴニスト）又はそれらの塩のスクリーニング方
法も提供される。該スクリーニングでは、例えば(i) 本
発明のタンパク質、その一部のペプチド又はそれらの塩
（該タンパク質を発現する形質転換体を含んでいもよ
い、以下同様）などに基質を接触させた場合と、(ii)本
発明のタンパク質、その一部のペプチド又はそれらの塩
などに基質及び試験試料を接触させた場合との比較を行
う。具体的には、上記スクリーニングでは、当該生物学
的活性（例えば、プロテアーゼ活性など）を測定して、
比較する。基質としては、本発明のタンパク質等の基質
となることのできるものであれば何れのものであってよ
い。例えば、カゼイン、コラーゲン、ゼラチン、合成オ
リゴペプチド類などのプロテアーゼ活性を測定する目的
で使用されるもの中から選んで用いることができるが、
好ましくはメタロプロテアーゼ用の蛍光標識合成ペプチ
ド基質などを使用できるし、そうしたペプチド基質の例
としては、例えばDNP-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-
Arg 、Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH 2 などを挙
げることができる。基質は、そのまま使用できるが、好
ましくはフルオレッセインなどの蛍光、酵素や放射性物
質で標識したものを使用できる。
【０１０２】試験試料としては、例えばタンパク質、ペ
プチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産
物、植物抽出物、動物などの組織抽出物、細胞抽出物な
どが挙げられる。試験試料に使用される試験化合物の例
には、好ましくはメタロプロテアーゼ阻害剤、メタロプ
ロテアーゼファミリーに対するインヒビター活性を有す
る化合物、例えばTIMP-1、TIMP-2など、特には合成化合
物を含んでいてよい。これら化合物は、新規な化合物で
あってもよいし、公知の化合物であってもよい。該スク
リーニングは、通常のプロテアーゼ活性の測定法に準じ
て実施することができ、例えば Biochemistry, 32,pp.4
330-4337 (1993) に示されている方法などを参考にして
行うことができる。また、上記本発明の抗体を使用して
の測定法において説明した、各種標識、緩衝液系その他
適当な試薬等を使用したり、そこで説明した操作等に準
じて行うことができる。スクリーニングにあたっては、
本発明のタンパク質等をアミノフェニル酢酸水銀などの
活性化剤で処理したり、その前駆体あるいは潜在型のも
のを活性型のものに予め変換しておくこともできる。測
定は通常トリス塩酸緩衝液、リン酸塩緩衝液などの反応
に悪影響を与えないような緩衝液等の中で、例えば、pH
４〜10 (好ましくは、pH約６〜８）において行うことが
できる。これら個々のスクリーニングにあたっては、そ
れぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通
常の技術的配慮を加えて、本発明のヒトMT5-MMP あるい
はそれと実質的に同等な活性を有するタンパク質あるい
はペプチドに関連した測定系を構築すればよい。これら
の一般的な技術手段の詳細については、総説、成書など
を参照することができる〔例えば、Methods in Enzymol
ogy, Vol. 1, 2, 5& 6 (Preparation and Assay of Enz
ymes); 同書, Vol. 3 (Preparation and Assay of Subs
trates); 同書, Vol. 4 (Special Techniques for the
Enzymologist); 同書, Vol. 19 (Proteolytic Enzyme
s);同書, Vol. 45 (Proteolytic Enzymes, Part B) ；
同書, Vol. 80 (Proteolytic Enzymes, Part C)(以上、
AcademicPress社 (USA)発行) 、瓜谷郁三ら編，「生物
化学実験法 30, 蛋白質分解酵素I (鶴大典ら編) 」、
p.130-169 、学会出版センター、1993年など参照〕。
プチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産
物、植物抽出物、動物などの組織抽出物、細胞抽出物な
どが挙げられる。試験試料に使用される試験化合物の例
には、好ましくはメタロプロテアーゼ阻害剤、メタロプ
ロテアーゼファミリーに対するインヒビター活性を有す
る化合物、例えばTIMP-1、TIMP-2など、特には合成化合
物を含んでいてよい。これら化合物は、新規な化合物で
あってもよいし、公知の化合物であってもよい。該スク
リーニングは、通常のプロテアーゼ活性の測定法に準じ
て実施することができ、例えば Biochemistry, 32,pp.4
330-4337 (1993) に示されている方法などを参考にして
行うことができる。また、上記本発明の抗体を使用して
の測定法において説明した、各種標識、緩衝液系その他
適当な試薬等を使用したり、そこで説明した操作等に準
じて行うことができる。スクリーニングにあたっては、
本発明のタンパク質等をアミノフェニル酢酸水銀などの
活性化剤で処理したり、その前駆体あるいは潜在型のも
のを活性型のものに予め変換しておくこともできる。測
定は通常トリス塩酸緩衝液、リン酸塩緩衝液などの反応
に悪影響を与えないような緩衝液等の中で、例えば、pH
４〜10 (好ましくは、pH約６〜８）において行うことが
できる。これら個々のスクリーニングにあたっては、そ
れぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通
常の技術的配慮を加えて、本発明のヒトMT5-MMP あるい
はそれと実質的に同等な活性を有するタンパク質あるい
はペプチドに関連した測定系を構築すればよい。これら
の一般的な技術手段の詳細については、総説、成書など
を参照することができる〔例えば、Methods in Enzymol
ogy, Vol. 1, 2, 5& 6 (Preparation and Assay of Enz
ymes); 同書, Vol. 3 (Preparation and Assay of Subs
trates); 同書, Vol. 4 (Special Techniques for the
Enzymologist); 同書, Vol. 19 (Proteolytic Enzyme
s);同書, Vol. 45 (Proteolytic Enzymes, Part B) ；
同書, Vol. 80 (Proteolytic Enzymes, Part C)(以上、
AcademicPress社 (USA)発行) 、瓜谷郁三ら編，「生物
化学実験法 30, 蛋白質分解酵素I (鶴大典ら編) 」、
p.130-169 、学会出版センター、1993年など参照〕。
【０１０３】本発明のスクリーニング方法又はスクリー
ニングキットを用いて得られる化合物又はその塩は、上
記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク質、非
ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出
液、植物抽出液、動物組織抽出液などから選ばれた化合
物であり、本発明のタンパク質等の機能を促進あるいは
阻害する化合物である。該化合物の塩としては、例え
ば、薬学的に許容される塩などが挙げられる。例えば、
無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機
酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げ
られる。無機塩基との塩の好適な例としては、例えば、
ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カル
シウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、
並びにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられ
る。有機塩基との塩の好適な例としては、例えば、トリ
メチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリ
ン、2,6-ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールア
ミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、
ジシクロヘキシルアミン、N,N'- ジベンジルエチレンジ
アミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な
例としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸
などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例とし
ては、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、
シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、
リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安
息香酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩
の好適な例としては、例えば、アルギニン、リジン、オ
ルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の
好適な例としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミ
ン酸などとの塩が挙げられる。
ニングキットを用いて得られる化合物又はその塩は、上
記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク質、非
ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出
液、植物抽出液、動物組織抽出液などから選ばれた化合
物であり、本発明のタンパク質等の機能を促進あるいは
阻害する化合物である。該化合物の塩としては、例え
ば、薬学的に許容される塩などが挙げられる。例えば、
無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機
酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げ
られる。無機塩基との塩の好適な例としては、例えば、
ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カル
シウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、
並びにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられ
る。有機塩基との塩の好適な例としては、例えば、トリ
メチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリ
ン、2,6-ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールア
ミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、
ジシクロヘキシルアミン、N,N'- ジベンジルエチレンジ
アミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な
例としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸
などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例とし
ては、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、
シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、
リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安
息香酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩
の好適な例としては、例えば、アルギニン、リジン、オ
ルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の
好適な例としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミ
ン酸などとの塩が挙げられる。
【０１０４】本発明のタンパク質等の機能を促進若しく
は阻害する化合物またはその塩は、上記した本発明のタ
ンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩と同様に
各種疾病に対する安全で低毒性である治療及び／または
予防剤として有用である。本発明のスクリーニング方法
又はスクリーニングキットを用いて得られる化合物又は
その塩を上述の治療及び／または予防剤として使用する
場合、上記した本発明のタンパク質、その部分ペプチド
またはそれらの塩と同様に常套手段に従って実施するこ
とができる。本発明の活性成分〔例えば、(a) 本発明の
タンパク質、その一部のペプチドまたはそれらの塩等、
(b) 本発明のＤNAなどの核酸など、(c) 本発明のタンパ
ク質、その一部のペプチドに対する抗体 (モノクローナ
ル抗体を包含する) またはその誘導体、(d) 本発明のＤ
NAなどの核酸に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチ
ド、(e) 本発明のタンパク質、その一部のペプチドまた
はそれらの塩の生物学的活性を促進または阻害する化合
物またはその塩など〕を医薬として用いる場合、例えば
本発明のヒトMT5-MMP などのタンパク質、その一部のペ
プチドまたはそれらの塩等は、通常単独或いは薬理的に
許容される各種製剤補助剤と混合して、医薬組成物又は
医薬調製物などとして投与することができる。好ましく
は、経口投与、局所投与、または非経口投与等の使用に
適した製剤調製物の形態で投与され、目的に応じていず
れの投与形態（吸入法、あるいは直腸投与も包含され
る）によってもよい。
は阻害する化合物またはその塩は、上記した本発明のタ
ンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩と同様に
各種疾病に対する安全で低毒性である治療及び／または
予防剤として有用である。本発明のスクリーニング方法
又はスクリーニングキットを用いて得られる化合物又は
その塩を上述の治療及び／または予防剤として使用する
場合、上記した本発明のタンパク質、その部分ペプチド
またはそれらの塩と同様に常套手段に従って実施するこ
とができる。本発明の活性成分〔例えば、(a) 本発明の
タンパク質、その一部のペプチドまたはそれらの塩等、
(b) 本発明のＤNAなどの核酸など、(c) 本発明のタンパ
ク質、その一部のペプチドに対する抗体 (モノクローナ
ル抗体を包含する) またはその誘導体、(d) 本発明のＤ
NAなどの核酸に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチ
ド、(e) 本発明のタンパク質、その一部のペプチドまた
はそれらの塩の生物学的活性を促進または阻害する化合
物またはその塩など〕を医薬として用いる場合、例えば
本発明のヒトMT5-MMP などのタンパク質、その一部のペ
プチドまたはそれらの塩等は、通常単独或いは薬理的に
許容される各種製剤補助剤と混合して、医薬組成物又は
医薬調製物などとして投与することができる。好ましく
は、経口投与、局所投与、または非経口投与等の使用に
適した製剤調製物の形態で投与され、目的に応じていず
れの投与形態（吸入法、あるいは直腸投与も包含され
る）によってもよい。
【０１０５】そして、非経口的な投与形態としては、局
所、経皮、静脈内、筋肉内、皮下、皮内もしくは腹腔内
投与を包含し得るが、患部への直接投与も可能であり、
またある場合には好適でもある。好ましくはヒトを含む
哺乳動物に経口的に、あるいは非経口的（例、細胞内、
組織内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、胸腔
内、脊髄腔内、点滴法、注腸、経直腸、点耳、点眼や点
鼻、歯、皮膚や粘膜への塗布など）に投与することがで
きる。具体的な製剤調製物の形態としては、溶液製剤、
分散製剤、半固形製剤、粉粒体製剤、成型製剤、浸出製
剤などが挙げられ、例えば、錠剤、被覆錠剤、糖衣を施
した剤、丸剤、トローチ剤、硬カプセル剤、軟カプセル
剤、マイクロカプセル剤、埋込剤、粉末剤、散剤、顆粒
剤、細粒剤、注射剤、液剤、エリキシル剤、エマルジョ
ン剤、灌注剤、シロップ剤、水剤、乳剤、懸濁剤、リニ
メント剤、ローション剤、エアゾール剤、スプレー剤、
吸入剤、噴霧剤、軟膏製剤、硬膏製剤、貼付剤、パスタ
剤、パップ剤、クリーム剤、油剤、坐剤（例えば、直腸
坐剤）、チンキ剤、皮膚用水剤、点眼剤、点鼻剤、点耳
剤、塗布剤、輸液剤、注射用液剤などのための粉末剤、
凍結乾燥製剤、ゲル調整品等が挙げられる。
所、経皮、静脈内、筋肉内、皮下、皮内もしくは腹腔内
投与を包含し得るが、患部への直接投与も可能であり、
またある場合には好適でもある。好ましくはヒトを含む
哺乳動物に経口的に、あるいは非経口的（例、細胞内、
組織内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、胸腔
内、脊髄腔内、点滴法、注腸、経直腸、点耳、点眼や点
鼻、歯、皮膚や粘膜への塗布など）に投与することがで
きる。具体的な製剤調製物の形態としては、溶液製剤、
分散製剤、半固形製剤、粉粒体製剤、成型製剤、浸出製
剤などが挙げられ、例えば、錠剤、被覆錠剤、糖衣を施
した剤、丸剤、トローチ剤、硬カプセル剤、軟カプセル
剤、マイクロカプセル剤、埋込剤、粉末剤、散剤、顆粒
剤、細粒剤、注射剤、液剤、エリキシル剤、エマルジョ
ン剤、灌注剤、シロップ剤、水剤、乳剤、懸濁剤、リニ
メント剤、ローション剤、エアゾール剤、スプレー剤、
吸入剤、噴霧剤、軟膏製剤、硬膏製剤、貼付剤、パスタ
剤、パップ剤、クリーム剤、油剤、坐剤（例えば、直腸
坐剤）、チンキ剤、皮膚用水剤、点眼剤、点鼻剤、点耳
剤、塗布剤、輸液剤、注射用液剤などのための粉末剤、
凍結乾燥製剤、ゲル調整品等が挙げられる。
【０１０６】医薬用の組成物は通常の方法に従って製剤
化することができる。例えば、適宜必要に応じて、生理
学的に認められる担体、医薬として許容される担体、ア
ジュバント剤、賦形剤、補形剤、希釈剤、香味剤、香
料、甘味剤、ベヒクル、防腐剤、安定化剤、結合剤、ｐ
Ｈ調節剤、緩衝剤、界面活性剤、基剤、溶剤、充填剤、
増量剤、溶解補助剤、可溶化剤、等張化剤、乳化剤、懸
濁化剤、分散剤、増粘剤、ゲル化剤、硬化剤、吸収剤、
粘着剤、弾性剤、可塑剤、崩壊剤、噴射剤、保存剤、抗
酸化剤、遮光剤、保湿剤、緩和剤、帯電防止剤、無痛化
剤などを単独もしくは組合わせて用い、それとともに本
発明のタンパク質等を混和することによって、一般に認
められた製剤実施に要求される単位用量形態にして製造
することができる。非経口的使用に適した製剤として
は、活性成分と、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し
得る媒体との無菌性溶液、または懸濁液剤など、例えば
注射剤等が挙げられる。一般的には、水、食塩水、デキ
ストロース水溶液、その他関連した糖の溶液、エタノー
ル、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールな
どのグリコール類が好ましい注射剤用液体担体として挙
げられる。注射剤を調製する際は、蒸留水、リンゲル
液、生理食塩水のような担体、適当な分散化剤または湿
化剤及び懸濁化剤などを使用して当該分野で知られた方
法で、溶液、懸濁液、エマルジョンのごとき注射しうる
形に調製する。
化することができる。例えば、適宜必要に応じて、生理
学的に認められる担体、医薬として許容される担体、ア
ジュバント剤、賦形剤、補形剤、希釈剤、香味剤、香
料、甘味剤、ベヒクル、防腐剤、安定化剤、結合剤、ｐ
Ｈ調節剤、緩衝剤、界面活性剤、基剤、溶剤、充填剤、
増量剤、溶解補助剤、可溶化剤、等張化剤、乳化剤、懸
濁化剤、分散剤、増粘剤、ゲル化剤、硬化剤、吸収剤、
粘着剤、弾性剤、可塑剤、崩壊剤、噴射剤、保存剤、抗
酸化剤、遮光剤、保湿剤、緩和剤、帯電防止剤、無痛化
剤などを単独もしくは組合わせて用い、それとともに本
発明のタンパク質等を混和することによって、一般に認
められた製剤実施に要求される単位用量形態にして製造
することができる。非経口的使用に適した製剤として
は、活性成分と、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し
得る媒体との無菌性溶液、または懸濁液剤など、例えば
注射剤等が挙げられる。一般的には、水、食塩水、デキ
ストロース水溶液、その他関連した糖の溶液、エタノー
ル、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールな
どのグリコール類が好ましい注射剤用液体担体として挙
げられる。注射剤を調製する際は、蒸留水、リンゲル
液、生理食塩水のような担体、適当な分散化剤または湿
化剤及び懸濁化剤などを使用して当該分野で知られた方
法で、溶液、懸濁液、エマルジョンのごとき注射しうる
形に調製する。
【０１０７】注射用の水性液としては、例えば生理食塩
水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、D-ソルビトー
ル、D-マンニトール、塩化ナトリウムなど）を含む等張
液などが挙げられ、薬理的に許容される適当な溶解補助
剤、たとえばアルコール（たとえばエタノールなど）、
ポリアルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリ
エチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（た
とえばポリソルベート80 (TM), HCO-50など）などと併
用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などが挙
げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジル
アルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例え
ば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）又は
浸透圧調節のための試薬、無痛化剤（例えば、塩化ベン
ザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例え
ば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールな
ど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノー
ルなど）、アスコルビン酸などの酸化防止剤、吸収促進
剤などと配合してもよい。調整された注射液は通常、適
当なアンプルに充填される。
水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、D-ソルビトー
ル、D-マンニトール、塩化ナトリウムなど）を含む等張
液などが挙げられ、薬理的に許容される適当な溶解補助
剤、たとえばアルコール（たとえばエタノールなど）、
ポリアルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリ
エチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（た
とえばポリソルベート80 (TM), HCO-50など）などと併
用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などが挙
げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジル
アルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例え
ば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）又は
浸透圧調節のための試薬、無痛化剤（例えば、塩化ベン
ザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例え
ば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールな
ど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノー
ルなど）、アスコルビン酸などの酸化防止剤、吸収促進
剤などと配合してもよい。調整された注射液は通常、適
当なアンプルに充填される。
【０１０８】非経口投与には、界面活性剤及びその他の
薬学的に許容される助剤を加えるか、あるいは加えず
に、水、エタノール又は油のような無菌の薬学的に許容
される液体中の溶液あるいは懸濁液の形態に製剤化され
る。製剤に使用される油性ベヒクルあるいは溶剤として
は、天然あるいは合成あるいは半合成のモノあるいはジ
あるいはトリグリセリド類、天然、半合成あるいは合成
の油脂類あるいは脂肪酸類が挙げられ、例えばピーナッ
ツ油、トウモロコシ油、大豆油、ゴマ油などの植物油が
挙げられる。例えば、この注射剤は、通常本発明化合物
を0.1 〜10重量％程度含有するように調製されることが
できる。局所的、例えば口腔、又は直腸的使用に適した
製剤としては、例えば洗口剤、歯磨き剤、口腔噴霧剤、
吸入剤、軟膏剤、歯科充填剤、歯科コーティング剤、歯
科ペースト剤、坐剤等が挙げられる。洗口剤、その他歯
科用剤としては、薬理的に許容される担体を用いて慣用
の方法により調製される。口腔噴霧剤、吸入剤として
は、本発明化合物自体又は薬理的に許容される不活性担
体とともにエアゾール又はネブライザー用の溶液に溶解
させるかあるいは、吸入用微粉末として歯などへ投与で
きる。軟膏剤は、通常使用される基剤、例えば、軟膏基
剤（白色ワセリン、パラフィン、オリーブ油、マクロゴ
ール400 、マクロゴール軟膏など）等を添加し、慣用の
方法により調製される。
薬学的に許容される助剤を加えるか、あるいは加えず
に、水、エタノール又は油のような無菌の薬学的に許容
される液体中の溶液あるいは懸濁液の形態に製剤化され
る。製剤に使用される油性ベヒクルあるいは溶剤として
は、天然あるいは合成あるいは半合成のモノあるいはジ
あるいはトリグリセリド類、天然、半合成あるいは合成
の油脂類あるいは脂肪酸類が挙げられ、例えばピーナッ
ツ油、トウモロコシ油、大豆油、ゴマ油などの植物油が
挙げられる。例えば、この注射剤は、通常本発明化合物
を0.1 〜10重量％程度含有するように調製されることが
できる。局所的、例えば口腔、又は直腸的使用に適した
製剤としては、例えば洗口剤、歯磨き剤、口腔噴霧剤、
吸入剤、軟膏剤、歯科充填剤、歯科コーティング剤、歯
科ペースト剤、坐剤等が挙げられる。洗口剤、その他歯
科用剤としては、薬理的に許容される担体を用いて慣用
の方法により調製される。口腔噴霧剤、吸入剤として
は、本発明化合物自体又は薬理的に許容される不活性担
体とともにエアゾール又はネブライザー用の溶液に溶解
させるかあるいは、吸入用微粉末として歯などへ投与で
きる。軟膏剤は、通常使用される基剤、例えば、軟膏基
剤（白色ワセリン、パラフィン、オリーブ油、マクロゴ
ール400 、マクロゴール軟膏など）等を添加し、慣用の
方法により調製される。
【０１０９】歯、皮膚への局所塗布用の薬品は、適切に
殺菌した水または非水賦形剤の溶液または懸濁液に調剤
することができる。添加剤としては、例えば亜硫酸水素
ナトリウムまたはエデト酸二ナトリウムのような緩衝
剤；酢酸または硝酸フェニル水銀、塩化ベンザルコニウ
ムまたはクロロヘキシジンのような殺菌および抗真菌剤
を含む防腐剤およびヒプロメルローズのような濃厚剤が
挙げられる。坐剤は、当該分野において周知の担体、好
ましくは非刺激性の適当な補形剤、例えばポリエチレン
グリコール類、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセ
ライド等の、好ましくは常温では固体であるが腸管の温
度では液体で直腸内で融解し薬物を放出するものなどを
使用して、慣用の方法により調製されるが、通常本発明
化合物を0.1 〜95重量％程度含有するように調製され
る。使用する賦形剤および濃度によって薬品は、賦形剤
に懸濁させるかまたは溶解させることができる。局部麻
酔剤、防腐剤および緩衝剤のような補助薬は、賦形剤に
溶解可能である。経口的使用に適した製剤としては、例
えば錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、トロー
チのような固形組成物や、液剤、シロップ剤、懸濁剤の
ような液状組成物等が挙げられる。製剤調製する際は、
当該分野で知られた製剤補助剤などを用いる。錠剤及び
丸剤はさらにエンテリックコーティングされて製造され
ることもできる。調剤単位形態がカプセルである場合に
は、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を
含有することができる。
殺菌した水または非水賦形剤の溶液または懸濁液に調剤
することができる。添加剤としては、例えば亜硫酸水素
ナトリウムまたはエデト酸二ナトリウムのような緩衝
剤；酢酸または硝酸フェニル水銀、塩化ベンザルコニウ
ムまたはクロロヘキシジンのような殺菌および抗真菌剤
を含む防腐剤およびヒプロメルローズのような濃厚剤が
挙げられる。坐剤は、当該分野において周知の担体、好
ましくは非刺激性の適当な補形剤、例えばポリエチレン
グリコール類、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセ
ライド等の、好ましくは常温では固体であるが腸管の温
度では液体で直腸内で融解し薬物を放出するものなどを
使用して、慣用の方法により調製されるが、通常本発明
化合物を0.1 〜95重量％程度含有するように調製され
る。使用する賦形剤および濃度によって薬品は、賦形剤
に懸濁させるかまたは溶解させることができる。局部麻
酔剤、防腐剤および緩衝剤のような補助薬は、賦形剤に
溶解可能である。経口的使用に適した製剤としては、例
えば錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、トロー
チのような固形組成物や、液剤、シロップ剤、懸濁剤の
ような液状組成物等が挙げられる。製剤調製する際は、
当該分野で知られた製剤補助剤などを用いる。錠剤及び
丸剤はさらにエンテリックコーティングされて製造され
ることもできる。調剤単位形態がカプセルである場合に
は、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を
含有することができる。
【０１１０】さらに、本発明のDNA などの核酸を上記し
たような治療及び／又は予防剤として用いる場合、該核
酸はそれを単独で用いることもできるし、あるいは上記
したような遺伝子組換え技術で使用される適当なベクタ
ー、例えばレトロウイルス由来ベクターなどウイルス由
来のベクターなどに結合させるなどして用いることがで
きる。本発明のDNA などの核酸は通常の知られた方法で
投与でき、そのままで、あるいは、例えば細胞内への摂
取が促進されるように、適当な補助剤あるいは生理的に
許容される担体などと共に、製剤化されて用いることが
でき、上記したような、医薬組成物又は医薬調製物など
として投与することができる。また遺伝子治療として知
られた方法を適用することもできる。本発明の活性成分
は、その投与量を広範囲にわたって選択して投与できる
が、その投与量及び投与回数などは、処置患者の性別、
年齢、体重、一般的健康状態、食事、投与時間、投与方
法、排泄速度、薬物の組み合わせ、患者のその時に治療
を行なっている病状の程度に応じ、それらあるいはその
他の要因を考慮して決められる。医薬品製造にあたって
は、その添加剤等や調製法などは、例えば日本薬局方解
説書編集委員会編、第十三改正 日本薬局方解説書、平
成８年７月10日発行、株式会社廣川書店；一番ヶ瀬 尚
他編 医薬品の開発12巻（製剤素剤〔Ｉ〕）、平成２
年10月15日発行、株式会社廣川書店；同、医薬品の開発
12巻（製剤素材〔II〕）平成２年10月28日発行、株式会
社廣川書店などの記載を参考にしてそれらのうちから必
要に応じて適宜選択して適用することができる。
たような治療及び／又は予防剤として用いる場合、該核
酸はそれを単独で用いることもできるし、あるいは上記
したような遺伝子組換え技術で使用される適当なベクタ
ー、例えばレトロウイルス由来ベクターなどウイルス由
来のベクターなどに結合させるなどして用いることがで
きる。本発明のDNA などの核酸は通常の知られた方法で
投与でき、そのままで、あるいは、例えば細胞内への摂
取が促進されるように、適当な補助剤あるいは生理的に
許容される担体などと共に、製剤化されて用いることが
でき、上記したような、医薬組成物又は医薬調製物など
として投与することができる。また遺伝子治療として知
られた方法を適用することもできる。本発明の活性成分
は、その投与量を広範囲にわたって選択して投与できる
が、その投与量及び投与回数などは、処置患者の性別、
年齢、体重、一般的健康状態、食事、投与時間、投与方
法、排泄速度、薬物の組み合わせ、患者のその時に治療
を行なっている病状の程度に応じ、それらあるいはその
他の要因を考慮して決められる。医薬品製造にあたって
は、その添加剤等や調製法などは、例えば日本薬局方解
説書編集委員会編、第十三改正 日本薬局方解説書、平
成８年７月10日発行、株式会社廣川書店；一番ヶ瀬 尚
他編 医薬品の開発12巻（製剤素剤〔Ｉ〕）、平成２
年10月15日発行、株式会社廣川書店；同、医薬品の開発
12巻（製剤素材〔II〕）平成２年10月28日発行、株式会
社廣川書店などの記載を参考にしてそれらのうちから必
要に応じて適宜選択して適用することができる。
【０１１１】本発明の前述した種々の態様を利用するこ
とにより、癌細胞の有無、癌の悪性度の診断等の癌の診
断治療に関わる研究に有用な診断手段として、あるいは
その他の医学的生理学的用途に適用される種々の技術手
段を提供することができる。以下に実施例を掲げ、本発
明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定
されず、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能
であることは理解されるべきである。なお、明細書及び
図面において、塩基及びアミノ酸等を略号で表示する場
合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatu
reによるか、あるいは当該分野において慣用的に使用さ
れる用語の意味に基づくものであり、アミノ酸に光学異
性体が存在する場合は、特に断らないかぎりL-体を示
す。以下で用いる主な略語を示す。 bp: base pair(s);EST: expressed sequence tag; GST:
glutathione S-transferase;IPTG: isopropyl-1-thio-
β-D-galactopyranoside;PAGE: polyacrylamide gel e
lectrophoresis;PCR: polymerase chain reaction; SD
S: sodium dodecyl sulfate;
とにより、癌細胞の有無、癌の悪性度の診断等の癌の診
断治療に関わる研究に有用な診断手段として、あるいは
その他の医学的生理学的用途に適用される種々の技術手
段を提供することができる。以下に実施例を掲げ、本発
明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定
されず、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能
であることは理解されるべきである。なお、明細書及び
図面において、塩基及びアミノ酸等を略号で表示する場
合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatu
reによるか、あるいは当該分野において慣用的に使用さ
れる用語の意味に基づくものであり、アミノ酸に光学異
性体が存在する場合は、特に断らないかぎりL-体を示
す。以下で用いる主な略語を示す。 bp: base pair(s);EST: expressed sequence tag; GST:
glutathione S-transferase;IPTG: isopropyl-1-thio-
β-D-galactopyranoside;PAGE: polyacrylamide gel e
lectrophoresis;PCR: polymerase chain reaction; SD
S: sodium dodecyl sulfate;
【０１１２】
【実施例】以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれら実施例に限定されず、本明細書
の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解
されるべきである。全ての実施例は、他に詳細に記載す
るもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又
は実施することのできるものであり、これは当業者にと
り周知で慣用的なものである。なお、以下の実施例にお
いて、特に指摘が無い場合には、具体的な操作並びに処
理条件などは、DNA クローニングでは J. Sambrook, E.
F. Fritsch & T.Maniatis, "Molecular Cloning", 2nd
ed., Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Ha
rbor, N. Y. (1989) 及び D. M. Glover et al. ed.,
"DNACloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical
Approach Series), IRLPress, Oxford University Pre
ss (1995) ; 特にPCR 法では、H. A. Erliched., PCR T
echnology, Stockton Press, 1989 ; D. M. Glover et
al. ed.,"DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Pract
ical Approach Series), IRLPress, Oxford University
Press (1995) 及び M. A. Innis et al. ed.,"PCR P
rotocols", Academic Press, New York (1990)に記載の
方法に準じて行っているし、また市販の試薬あるいはキ
ットを用いている場合はそれらに添付の指示書(protoco
ls) や添付の薬品等を使用している。
するが、本発明はこれら実施例に限定されず、本明細書
の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解
されるべきである。全ての実施例は、他に詳細に記載す
るもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又
は実施することのできるものであり、これは当業者にと
り周知で慣用的なものである。なお、以下の実施例にお
いて、特に指摘が無い場合には、具体的な操作並びに処
理条件などは、DNA クローニングでは J. Sambrook, E.
F. Fritsch & T.Maniatis, "Molecular Cloning", 2nd
ed., Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Ha
rbor, N. Y. (1989) 及び D. M. Glover et al. ed.,
"DNACloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical
Approach Series), IRLPress, Oxford University Pre
ss (1995) ; 特にPCR 法では、H. A. Erliched., PCR T
echnology, Stockton Press, 1989 ; D. M. Glover et
al. ed.,"DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Pract
ical Approach Series), IRLPress, Oxford University
Press (1995) 及び M. A. Innis et al. ed.,"PCR P
rotocols", Academic Press, New York (1990)に記載の
方法に準じて行っているし、また市販の試薬あるいはキ
ットを用いている場合はそれらに添付の指示書(protoco
ls) や添付の薬品等を使用している。
【０１１３】実施例１：プローブの作成、cDNAライブラ
リーのスクリーニング、5'-RACE 反応、クロモゾームウ
ォーキング及びヒトMT5-MMP の解析 既報のMMPsと類似性を有する記載をhuman expressed se
quence tags (ESTs)のGenBankTMデータベースからコン
ピューター検索し、MMPsに特徴的なヘモペキシンドメイ
ンと有意の類似性を示す262 bpの大脳cDNA由来の配列(A
A324134)を同定した。このDNA 断片を取得するために、
AA324134に由来する２種の特異的プライマー 5'-TTCAACACAGTGGCCCTCTTC-3’（配列番号：３）及び 5'-CCCCCAGGCTGTGGGGGTA-3' （配列番号：４） を用い、ヒトcDNAパネル(Quick Screen, Clontech)のPC
R を実施した。プライマーは、DNA シンセサイザー（Ap
plied Biosystems Model 392A ）を用いて合成した。PC
R 反応はGeneAmp 2400 PCR system (Perkin-Elmer/Cetu
s)を用い、変性(94 ℃、15秒) 、アニーリング(57 ℃、
15秒) 、伸長(72 ℃、30秒) の40サイクルで行なった。
ヒト脳cDNAライブラリーから増幅された245 bpのPCR 産
物をT4ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、pUC18
のSmaIサイトにクローン化した。このクローン化したcD
NA断片の配列を確認した結果、AA324134と実質的に同一
(99％同一) であった。このcDNA断片をベクターより切
り出し、放射標識して、同じヒト脳cDNAライブラリーの
スクリーニングに使用した。cDNA断片の放射標識には、
Amersham International（Buckinghamshire, UK ）の[
α-32P]dCTP(3000 Ci/mL) とランダムプライミングキッ
トを使用した。1 ×106 個のプラークのスクリーニング
により、1.1 から1.6 と命名した6 個の陽性クローンを
同定した。これらの陽性クローンからDNA を単離し、そ
の塩基配列を決定した。陽性クローンのプラークよりフ
ァージを精製、挿入断片をEcoRI(Boehringer Mannheim,
Mannheim Germany)消化により切り出し、pUC18 にサブ
クローニングした。クローニングされたDNA 断片を切り
出し、それぞれファージベクターM13mp19 のポリリンカ
ー領域に挿入し、M13 ユニバーサルプライマーあるいは
cDNA特異的プライマー及びSequnase Version2.0キット
(U.S. Biochemicals, Cleveland, OH)によるダイデオキ
シチェーンターミネーター法によりその塩基配列を決定
した。全ての配列解析は両鎖について行ない、確認し
た。DNA 塩基配列及びタンパク質アミノ酸配列のコンピ
ューター解析は、Wisconsin 大学Genetic Computerグル
ープのGCG Software packageを用いて実施した。
リーのスクリーニング、5'-RACE 反応、クロモゾームウ
ォーキング及びヒトMT5-MMP の解析 既報のMMPsと類似性を有する記載をhuman expressed se
quence tags (ESTs)のGenBankTMデータベースからコン
ピューター検索し、MMPsに特徴的なヘモペキシンドメイ
ンと有意の類似性を示す262 bpの大脳cDNA由来の配列(A
A324134)を同定した。このDNA 断片を取得するために、
AA324134に由来する２種の特異的プライマー 5'-TTCAACACAGTGGCCCTCTTC-3’（配列番号：３）及び 5'-CCCCCAGGCTGTGGGGGTA-3' （配列番号：４） を用い、ヒトcDNAパネル(Quick Screen, Clontech)のPC
R を実施した。プライマーは、DNA シンセサイザー（Ap
plied Biosystems Model 392A ）を用いて合成した。PC
R 反応はGeneAmp 2400 PCR system (Perkin-Elmer/Cetu
s)を用い、変性(94 ℃、15秒) 、アニーリング(57 ℃、
15秒) 、伸長(72 ℃、30秒) の40サイクルで行なった。
ヒト脳cDNAライブラリーから増幅された245 bpのPCR 産
物をT4ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、pUC18
のSmaIサイトにクローン化した。このクローン化したcD
NA断片の配列を確認した結果、AA324134と実質的に同一
(99％同一) であった。このcDNA断片をベクターより切
り出し、放射標識して、同じヒト脳cDNAライブラリーの
スクリーニングに使用した。cDNA断片の放射標識には、
Amersham International（Buckinghamshire, UK ）の[
α-32P]dCTP(3000 Ci/mL) とランダムプライミングキッ
トを使用した。1 ×106 個のプラークのスクリーニング
により、1.1 から1.6 と命名した6 個の陽性クローンを
同定した。これらの陽性クローンからDNA を単離し、そ
の塩基配列を決定した。陽性クローンのプラークよりフ
ァージを精製、挿入断片をEcoRI(Boehringer Mannheim,
Mannheim Germany)消化により切り出し、pUC18 にサブ
クローニングした。クローニングされたDNA 断片を切り
出し、それぞれファージベクターM13mp19 のポリリンカ
ー領域に挿入し、M13 ユニバーサルプライマーあるいは
cDNA特異的プライマー及びSequnase Version2.0キット
(U.S. Biochemicals, Cleveland, OH)によるダイデオキ
シチェーンターミネーター法によりその塩基配列を決定
した。全ての配列解析は両鎖について行ない、確認し
た。DNA 塩基配列及びタンパク質アミノ酸配列のコンピ
ューター解析は、Wisconsin 大学Genetic Computerグル
ープのGCG Software packageを用いて実施した。
【０１１４】この塩基配列解析の結果、陽性クローンの
内の一つ（クローン1.3)は3.5 kbの挿入断片を有してお
り、この3.5 kb断片は残りの陽性クローンで決定された
2 kbの挿入配列全体を含んでいた。この最も長い挿入断
片を持つクローンの塩基配列と相当する既知MMPsの配列
の詳細な比較解析から、陽性クローン(1.3) の配列は5'
末端側が不完全であることが示唆された。そこで、この
部分cDNA配列から5'末端側の配列を伸長させるため、陽
性クローン(1.3) から推定される特異的オリゴヌクレオ
チドプライマーと、ヒト脳由来のRNA を鋳型として5'-R
ACE(Rapid Amplification of cDNA Ends) 実験を行なっ
た。5'- RACEにはMarathonTM cDNA Amplification キッ
ト(Clontech)を使用し、キットの用法に従った。RACEの
各サイクルで約60から100 bp 5' 側へ伸長した。5'- RA
CEで得られたDNA 断片をクローニング、配列を決定した
後、新しい特異的オリゴヌクレオチドを合成して、次の
5'-RACE で使用した。最終的に完全cDNAを Expand PCR
キット(Boehringer-Mannheim) を用いたPCR によって得
た。このPCR 反応は、 5'-ATGGCTATCTGCTTCCCTATGACC-3'（配列番号：５）及び 5'- GCACCCATTCCTGGACTGGCCGC-3'（配列番号：６） をプライマーとして、GeneAmp 2400 PCR system (Perki
n-Elmer/Cetus)を用い、変性(94 ℃、15秒) 、アニーリ
ング(64 ℃、15秒) 、伸長(68 ℃、２分) の35サイクル
で行なった。PCR 増幅産物は、ゲル精製後、クローン化
し、その塩基配列を決定した。最終的にMMP の翻訳情報
のほぼ全体を含むに十分な長さのDNA 断片を得た。しか
しながら、数回のヒトの異なる組織由来のRNA を用いた
5'-RACE 実験を行なっても、MMP の推定上のプロペプチ
ドをコードする領域よりも5'側へ配列を伸長させること
ができなかった。恐らくこの領域の極めて高いGC含量の
ためと考え、この問題を克服し、このMMP をコードする
塩基配列を完全にするためにゲノムからアプローチし
た。
内の一つ（クローン1.3)は3.5 kbの挿入断片を有してお
り、この3.5 kb断片は残りの陽性クローンで決定された
2 kbの挿入配列全体を含んでいた。この最も長い挿入断
片を持つクローンの塩基配列と相当する既知MMPsの配列
の詳細な比較解析から、陽性クローン(1.3) の配列は5'
末端側が不完全であることが示唆された。そこで、この
部分cDNA配列から5'末端側の配列を伸長させるため、陽
性クローン(1.3) から推定される特異的オリゴヌクレオ
チドプライマーと、ヒト脳由来のRNA を鋳型として5'-R
ACE(Rapid Amplification of cDNA Ends) 実験を行なっ
た。5'- RACEにはMarathonTM cDNA Amplification キッ
ト(Clontech)を使用し、キットの用法に従った。RACEの
各サイクルで約60から100 bp 5' 側へ伸長した。5'- RA
CEで得られたDNA 断片をクローニング、配列を決定した
後、新しい特異的オリゴヌクレオチドを合成して、次の
5'-RACE で使用した。最終的に完全cDNAを Expand PCR
キット(Boehringer-Mannheim) を用いたPCR によって得
た。このPCR 反応は、 5'-ATGGCTATCTGCTTCCCTATGACC-3'（配列番号：５）及び 5'- GCACCCATTCCTGGACTGGCCGC-3'（配列番号：６） をプライマーとして、GeneAmp 2400 PCR system (Perki
n-Elmer/Cetus)を用い、変性(94 ℃、15秒) 、アニーリ
ング(64 ℃、15秒) 、伸長(68 ℃、２分) の35サイクル
で行なった。PCR 増幅産物は、ゲル精製後、クローン化
し、その塩基配列を決定した。最終的にMMP の翻訳情報
のほぼ全体を含むに十分な長さのDNA 断片を得た。しか
しながら、数回のヒトの異なる組織由来のRNA を用いた
5'-RACE 実験を行なっても、MMP の推定上のプロペプチ
ドをコードする領域よりも5'側へ配列を伸長させること
ができなかった。恐らくこの領域の極めて高いGC含量の
ためと考え、この問題を克服し、このMMP をコードする
塩基配列を完全にするためにゲノムからアプローチし
た。
【０１１５】ゲノミッククローンを単離するため、二つ
のゲノムライブラリー、ヒトP1 artificial chromosome
(PAC, Human Genome Mapping Resource Center より恵
与)とヒトbacterial artificial chromosome (BAC, Dr.
P.J. Jong より恵与) を上述のcDNAクローンを用いて
スクリーニングした。フィルターハイブリダイゼーショ
ンの結果、５個のPAC 陽性クローンと13個のBAC 陽性ク
ローンを得た。個々のクローンから単離したDNA を該cD
NAクローンをプローブとしたサザンブロット解析に供
し、得られた陽性バンドからDNA 断片を抽出、その塩基
配列を決定した。その結果、大半のクローンが遺伝子の
5'末端近傍の配列を含んでいることが明らかとなった。
しかしながら、 BAC クローンから調製した一連の制限酵
素断片のみが5'-RACE 実験で得た5'-cDNA プローブ(5'-
RACE Probe) とハイブリダイズした。そこで、5'-RACE
Probe とハイブリダイズする１kbのBAC のEcoRI/PstIゲ
ノム断片をサブクローニングし、塩基配列を決定した。
この断片の塩基配列解析の結果、最初のメチオニンをコ
ードするin-frameのATG トリヌクレオチドばかりでなく
典型的なシグナル配列をコードする領域の存在が明らか
となった。こうして得られた配列のコンピューター解析
の結果、推定分子量 73.2 kDaの645 アミノ酸残基から
なるタンパク質（配列番号:1及び配列番号:9）をコード
するオープンリーディングフレームが明らかになった
（配列番号:2及び配列番号:9）。
のゲノムライブラリー、ヒトP1 artificial chromosome
(PAC, Human Genome Mapping Resource Center より恵
与)とヒトbacterial artificial chromosome (BAC, Dr.
P.J. Jong より恵与) を上述のcDNAクローンを用いて
スクリーニングした。フィルターハイブリダイゼーショ
ンの結果、５個のPAC 陽性クローンと13個のBAC 陽性ク
ローンを得た。個々のクローンから単離したDNA を該cD
NAクローンをプローブとしたサザンブロット解析に供
し、得られた陽性バンドからDNA 断片を抽出、その塩基
配列を決定した。その結果、大半のクローンが遺伝子の
5'末端近傍の配列を含んでいることが明らかとなった。
しかしながら、 BAC クローンから調製した一連の制限酵
素断片のみが5'-RACE 実験で得た5'-cDNA プローブ(5'-
RACE Probe) とハイブリダイズした。そこで、5'-RACE
Probe とハイブリダイズする１kbのBAC のEcoRI/PstIゲ
ノム断片をサブクローニングし、塩基配列を決定した。
この断片の塩基配列解析の結果、最初のメチオニンをコ
ードするin-frameのATG トリヌクレオチドばかりでなく
典型的なシグナル配列をコードする領域の存在が明らか
となった。こうして得られた配列のコンピューター解析
の結果、推定分子量 73.2 kDaの645 アミノ酸残基から
なるタンパク質（配列番号:1及び配列番号:9）をコード
するオープンリーディングフレームが明らかになった
（配列番号:2及び配列番号:9）。
【０１１６】この配列は、２ヶ所の潜在的なN グリコシ
レーション部位 (第174 位から第176 位のAsn-Tyr-Thr
及び第627 位から第629 位のAsn-Lys-Thr)を含んでい
た。同定したアミノ酸配列の更なる解析から他のヒトMM
P と顕著な類似性を示すことが判明し、最も高い同一性
のパーセンテージ(63%) は MT3-MMPであった。推定され
るアミノ酸配列（配列番号:1, 9 又は10）は、いくつか
のMMP に特徴的な性質を示す。すなわちこのアミノ酸配
列はシグナル配列、MMP の潜在性の維持に必須のCys 残
基を含むプロドメイン、亜鉛分子の結合に関わるHEXGHX
XGXXHS（X は任意のアミノ酸残基を示す）からなる共通
配列を含む約170 アミノ酸からなる触媒ドメイン及びヘ
モペキシン様の約200 アミノ酸からなる断片を含む。さ
らにこの新規なアミノ酸配列は膜結合型MMP に特徴的な
３ヶ所の挿入配列を有する。最初の挿入配列(IS-1:配列
表の配列番号：1 の第147 位から第155 位) はプロペプ
チドと触媒ドメインの間に位置し、その末端はRXKR（X
は任意のアミノ酸残基を示す配列表の配列番号：1 の第
152 位から第155 位）のフィウリン活性化の共通配列で
ある。二番目の挿入配列(IS-2:配列表の配列番号：1 の
第207 位から第214 位) は、MT4-MMP を除く全てのMT-M
MPの触媒ドメイン中に存在する。また、疎水性アミノ酸
残基に富むC 末端の配列を有し、その長さは、これまで
に解析されている他のMT-MMPの相当するドメインと同様
であった。このような構造的特徴から単離した脳由来の
cDNAは新規なヒトMT-MMPをコードしていると結論を下す
ことが出きる。この新規なMT-MMPを "ヒトMT5-MMP"と命
名した。
レーション部位 (第174 位から第176 位のAsn-Tyr-Thr
及び第627 位から第629 位のAsn-Lys-Thr)を含んでい
た。同定したアミノ酸配列の更なる解析から他のヒトMM
P と顕著な類似性を示すことが判明し、最も高い同一性
のパーセンテージ(63%) は MT3-MMPであった。推定され
るアミノ酸配列（配列番号:1, 9 又は10）は、いくつか
のMMP に特徴的な性質を示す。すなわちこのアミノ酸配
列はシグナル配列、MMP の潜在性の維持に必須のCys 残
基を含むプロドメイン、亜鉛分子の結合に関わるHEXGHX
XGXXHS（X は任意のアミノ酸残基を示す）からなる共通
配列を含む約170 アミノ酸からなる触媒ドメイン及びヘ
モペキシン様の約200 アミノ酸からなる断片を含む。さ
らにこの新規なアミノ酸配列は膜結合型MMP に特徴的な
３ヶ所の挿入配列を有する。最初の挿入配列(IS-1:配列
表の配列番号：1 の第147 位から第155 位) はプロペプ
チドと触媒ドメインの間に位置し、その末端はRXKR（X
は任意のアミノ酸残基を示す配列表の配列番号：1 の第
152 位から第155 位）のフィウリン活性化の共通配列で
ある。二番目の挿入配列(IS-2:配列表の配列番号：1 の
第207 位から第214 位) は、MT4-MMP を除く全てのMT-M
MPの触媒ドメイン中に存在する。また、疎水性アミノ酸
残基に富むC 末端の配列を有し、その長さは、これまで
に解析されている他のMT-MMPの相当するドメインと同様
であった。このような構造的特徴から単離した脳由来の
cDNAは新規なヒトMT-MMPをコードしていると結論を下す
ことが出きる。この新規なMT-MMPを "ヒトMT5-MMP"と命
名した。
【０１１７】実施例２：真核細胞発現ベクターの調製と
ヒトMT5-MMP の膜への局在 アミノ酸配列Gly89-Val645（配列表の配列番号:1）をコ
ードするヒトMT5-MMPcDNAをPCR で増幅し、pCEP-pU 分
泌ベクター(Dr.R.Timpleより分与) の平滑化したNheIサ
イトへクローン化した。次にヒトインフルエンザウイル
スのヘマグルチニン(HA)エピトープをコードする24 bp
のリンカーを挿入したヒトMT5-MMP cDNAの3'末へフレー
ム枠に合うように連結した。得られたプラスミドを"pCE
P PU/AC7MT5-MMP-HA"と命名した。pCEP PU/AC7 MT5-MMP
-HAから発現するヒトMT5-MMP タンパク質はCOOH末端にH
Aタグを有している。COS-7 細胞を１μｇのpCEP PU/AC7
MT5-MMP-HAプラスミドDNA でFugene 6 reagent (Boehri
nger-Mannheim)を用いてトランスフェクションした。ト
ランスフェクション48時間後、細胞を4%パラホルムアル
デヒドを含む冷PBS で10分間固定し、PBS で洗浄後、0.
2% Triton X-100を含むPBS 中で10分間インキュベート
した。トランスフェクトした細胞は、抗HAモノクローナ
ル抗体12CA5 (Boehringer-Mannheim) を用いて蛍光抗体
法により解析した。蛍光検出は、1:2500希釈の抗HAモノ
クローナル抗体12CA5 とスライドをインキュベートした
後、1:50希釈の抗マウスヤギ蛍光標識抗体でインキュベ
ートすることで行なった。抗体の希釈はブロッキング溶
液で行なった。PBS で洗浄後、スライドはvectashield
(Vector, Burlingame, CA)でマウントし、BioRad共焦点
レーザー顕微鏡で観察した。その結果、細胞周囲に明ら
かな蛍光パターンが観察された（図３）。この結果は、
ヒトMT5-MMP がプロゼラチナーゼA の活性化因子に要求
される性質である膜結合型MMP であるという強い証拠を
提供する。
ヒトMT5-MMP の膜への局在 アミノ酸配列Gly89-Val645（配列表の配列番号:1）をコ
ードするヒトMT5-MMPcDNAをPCR で増幅し、pCEP-pU 分
泌ベクター(Dr.R.Timpleより分与) の平滑化したNheIサ
イトへクローン化した。次にヒトインフルエンザウイル
スのヘマグルチニン(HA)エピトープをコードする24 bp
のリンカーを挿入したヒトMT5-MMP cDNAの3'末へフレー
ム枠に合うように連結した。得られたプラスミドを"pCE
P PU/AC7MT5-MMP-HA"と命名した。pCEP PU/AC7 MT5-MMP
-HAから発現するヒトMT5-MMP タンパク質はCOOH末端にH
Aタグを有している。COS-7 細胞を１μｇのpCEP PU/AC7
MT5-MMP-HAプラスミドDNA でFugene 6 reagent (Boehri
nger-Mannheim)を用いてトランスフェクションした。ト
ランスフェクション48時間後、細胞を4%パラホルムアル
デヒドを含む冷PBS で10分間固定し、PBS で洗浄後、0.
2% Triton X-100を含むPBS 中で10分間インキュベート
した。トランスフェクトした細胞は、抗HAモノクローナ
ル抗体12CA5 (Boehringer-Mannheim) を用いて蛍光抗体
法により解析した。蛍光検出は、1:2500希釈の抗HAモノ
クローナル抗体12CA5 とスライドをインキュベートした
後、1:50希釈の抗マウスヤギ蛍光標識抗体でインキュベ
ートすることで行なった。抗体の希釈はブロッキング溶
液で行なった。PBS で洗浄後、スライドはvectashield
(Vector, Burlingame, CA)でマウントし、BioRad共焦点
レーザー顕微鏡で観察した。その結果、細胞周囲に明ら
かな蛍光パターンが観察された（図３）。この結果は、
ヒトMT5-MMP がプロゼラチナーゼA の活性化因子に要求
される性質である膜結合型MMP であるという強い証拠を
提供する。
【０１１８】この組換えヒトMT5-MMP タンパク質の性質
をさらに解析するため、pCEP PU/AC7 MT5-MMP-HAでトラ
ンスフェクトしたCOS-7 細胞の細胞可溶化物をSDS-PAGE
と抗HAモノクローナル抗体によるウェスタンブロッティ
ングにより解析した。COS-7 トランスフェクタントをPB
S でリンスした後、プレートから掻き取った。膜画分は
Pendas (Pendas, A. M., Moran, P., Freije, J. P.,
and Garcia-Vazquez, E., Cytogenet. Cell Genet, 67,
31-36 (1994))らの方法にしたがって調製した。抽出物
はSDS-PAGE分画し、抗HAモノクローナル抗体によるウェ
スタンブロッティングはECL chemiluminiscentキット(A
mersham)を用いて検出した。その結果、期待された分子
量(62 kDa)のバンドが膜画分中に検出されたが、培養上
清中には観察されなかった（図４Ａ）。このことは組換
えヒトMT5-MMP タンパク質が膜に局在していることをさ
らに示唆する。pCEP PU/AC7 MT5-MMP-HAプラスミドから
cDNAをHindIII/XhoI切断により切り出し、pcDNA3 (Invi
trogen) にクローニングした。このプラスミド１μｇを
coupled reticulocyte TNT T7 キット(Promega) 用い、
35S メチオニン存在下でin vitroトランスクリプショ
ン、トランスレーションした。得られたタンパク質産物
をSDS-PAGE後、一晩オートラジオグラフィーを行なっ
た。ヒトMT5-MMP のin vitroトランスクリプション、ト
ランスレーションで得られたタンパク質のSDS-PAGE上の
移動度は、COS-7 トランスフェクタントの膜画分中に検
出されたタンパク質の電気泳動移動度と一致した（図４
Ｂ）。
をさらに解析するため、pCEP PU/AC7 MT5-MMP-HAでトラ
ンスフェクトしたCOS-7 細胞の細胞可溶化物をSDS-PAGE
と抗HAモノクローナル抗体によるウェスタンブロッティ
ングにより解析した。COS-7 トランスフェクタントをPB
S でリンスした後、プレートから掻き取った。膜画分は
Pendas (Pendas, A. M., Moran, P., Freije, J. P.,
and Garcia-Vazquez, E., Cytogenet. Cell Genet, 67,
31-36 (1994))らの方法にしたがって調製した。抽出物
はSDS-PAGE分画し、抗HAモノクローナル抗体によるウェ
スタンブロッティングはECL chemiluminiscentキット(A
mersham)を用いて検出した。その結果、期待された分子
量(62 kDa)のバンドが膜画分中に検出されたが、培養上
清中には観察されなかった（図４Ａ）。このことは組換
えヒトMT5-MMP タンパク質が膜に局在していることをさ
らに示唆する。pCEP PU/AC7 MT5-MMP-HAプラスミドから
cDNAをHindIII/XhoI切断により切り出し、pcDNA3 (Invi
trogen) にクローニングした。このプラスミド１μｇを
coupled reticulocyte TNT T7 キット(Promega) 用い、
35S メチオニン存在下でin vitroトランスクリプショ
ン、トランスレーションした。得られたタンパク質産物
をSDS-PAGE後、一晩オートラジオグラフィーを行なっ
た。ヒトMT5-MMP のin vitroトランスクリプション、ト
ランスレーションで得られたタンパク質のSDS-PAGE上の
移動度は、COS-7 トランスフェクタントの膜画分中に検
出されたタンパク質の電気泳動移動度と一致した（図４
Ｂ）。
【０１１９】実施例３：ヒトMT5-MMP 遺伝子の染色体マ
ッピング ヒトMT5-MMP と他のMMP 遺伝子ファミリー、特には他の
MT-MMPとの構造上、あるいは進化上の関連を明らかにす
るため、ヒトMT5-MMP の染色体座位を検討した。蛍光in
situ ハイブリダイゼーション(FISH)マッピングによる
ヒトMT5-MMP 遺伝子の染色体座位の決定はZucker等の方
法(Zucker, S., Wieman, J.M., Lysik,R.M., Wilkie,
D., Ramamurthy, N.S., Golub, L.M., and Lane, B., C
ancer Res., 47, 1608-1614 (1987)) に準じて行なっ
た。PAC 198F17からQIAGENカラムによりアルカリリシス
法でDNA を単離し、biotin-16-dUTPを用いてニックトラ
ンスレーションを行なった。ラベルプローブをフィトヘ
マグルチニンで刺激した培養リンパ球から調製した正常
男子の分裂中期染色体とハイブリダイズさせ、２種のア
ビジン−蛍光色素で検出した。染色体は、ジアミジン-2
- フェニルインドール二塩酸塩(DAPI)でバンド化してCC
D カメラ(Photometrics)を接続したZeiss axiophot蛍光
顕微鏡で観察した（図５）。ビオチン化したヒトMT5-MM
P クローンに相当する蛍光シグナルは20番染色体に位置
しており、他の染色体ではバックグラウンド以上のシグ
ナルは検出されなかった。20番染色体にハイブリダイゼ
ーションが認められる50の分裂中期染色体のDAPIバンド
化により、ヒトMT5-MMP 遺伝子の蛍光シグナルは、20番
染色体の長腕の動原体性領域、さらにはq11.2 に位置す
ることが明らかとなった。多くの遺伝子が既にこの領域
にマップされており、α1-シントロフィン、グルタチオ
ンシンセターゼあるいは軟骨由来形態形成タンパク質-1
遺伝子などが相当する (Ahn, A.H., Freener, C.A., Gu
ssoni, E., Yoshida, M., Ozawa, E., and Kunkel, L.
M., J. Biol. Chem., 271, 2724-2730 (1996)、Webb,
G.C., Vaska, V.L., Gali,R.R., Ford, J.H., and Boar
d, P.G., Genomics, 30, 617-619 (1995)、Lin, K., Th
omas, J.T., McBride, O.W., and Luyten, F.P., Genom
ics, 34, 150-151(1996)) 。ゼラチナーゼB(MMP-9)遺伝
子もまた20番染色体長腕に位置している（Linn, R., Du
Pont, B.R., Knight, C.B., Plaetke, R., and Leach,
R.J., Cytogenet. Cell Genet., 72, 159-161 (199
6)）。しかしながらこの染色体座位は、これまで報告さ
れている他の全てのMT-MMPの染色体座位、14q11 (MT1-M
MP/MMP14) 、16q13 (MT2-MMP/MMP15) 、8q21 (MT3-MMP/
MMP16)、12q24 (MT4-MMP/MMP17)(Mignon, C., Okada,
A., Mattei, M.G., and Basset, P., Genomics, 28, 36
0-361 (1995)、Mattei, M.G., Roeckel, N., Olsen, B.
R., and Apte, S.S., Genomics, 40, 168-169 (1997)、
Sato, H., Tanaka, M., Takino, T., Inoue, M., and S
eiki, M., Genomics, 39, 412-413 (1997)、Puente, X.
S., Pendas, A.M.,Llano, E., and Lopez-Otin, C., Ge
nomics, 54, 578-579 (1998))とは全く異なっていた。
ッピング ヒトMT5-MMP と他のMMP 遺伝子ファミリー、特には他の
MT-MMPとの構造上、あるいは進化上の関連を明らかにす
るため、ヒトMT5-MMP の染色体座位を検討した。蛍光in
situ ハイブリダイゼーション(FISH)マッピングによる
ヒトMT5-MMP 遺伝子の染色体座位の決定はZucker等の方
法(Zucker, S., Wieman, J.M., Lysik,R.M., Wilkie,
D., Ramamurthy, N.S., Golub, L.M., and Lane, B., C
ancer Res., 47, 1608-1614 (1987)) に準じて行なっ
た。PAC 198F17からQIAGENカラムによりアルカリリシス
法でDNA を単離し、biotin-16-dUTPを用いてニックトラ
ンスレーションを行なった。ラベルプローブをフィトヘ
マグルチニンで刺激した培養リンパ球から調製した正常
男子の分裂中期染色体とハイブリダイズさせ、２種のア
ビジン−蛍光色素で検出した。染色体は、ジアミジン-2
- フェニルインドール二塩酸塩(DAPI)でバンド化してCC
D カメラ(Photometrics)を接続したZeiss axiophot蛍光
顕微鏡で観察した（図５）。ビオチン化したヒトMT5-MM
P クローンに相当する蛍光シグナルは20番染色体に位置
しており、他の染色体ではバックグラウンド以上のシグ
ナルは検出されなかった。20番染色体にハイブリダイゼ
ーションが認められる50の分裂中期染色体のDAPIバンド
化により、ヒトMT5-MMP 遺伝子の蛍光シグナルは、20番
染色体の長腕の動原体性領域、さらにはq11.2 に位置す
ることが明らかとなった。多くの遺伝子が既にこの領域
にマップされており、α1-シントロフィン、グルタチオ
ンシンセターゼあるいは軟骨由来形態形成タンパク質-1
遺伝子などが相当する (Ahn, A.H., Freener, C.A., Gu
ssoni, E., Yoshida, M., Ozawa, E., and Kunkel, L.
M., J. Biol. Chem., 271, 2724-2730 (1996)、Webb,
G.C., Vaska, V.L., Gali,R.R., Ford, J.H., and Boar
d, P.G., Genomics, 30, 617-619 (1995)、Lin, K., Th
omas, J.T., McBride, O.W., and Luyten, F.P., Genom
ics, 34, 150-151(1996)) 。ゼラチナーゼB(MMP-9)遺伝
子もまた20番染色体長腕に位置している（Linn, R., Du
Pont, B.R., Knight, C.B., Plaetke, R., and Leach,
R.J., Cytogenet. Cell Genet., 72, 159-161 (199
6)）。しかしながらこの染色体座位は、これまで報告さ
れている他の全てのMT-MMPの染色体座位、14q11 (MT1-M
MP/MMP14) 、16q13 (MT2-MMP/MMP15) 、8q21 (MT3-MMP/
MMP16)、12q24 (MT4-MMP/MMP17)(Mignon, C., Okada,
A., Mattei, M.G., and Basset, P., Genomics, 28, 36
0-361 (1995)、Mattei, M.G., Roeckel, N., Olsen, B.
R., and Apte, S.S., Genomics, 40, 168-169 (1997)、
Sato, H., Tanaka, M., Takino, T., Inoue, M., and S
eiki, M., Genomics, 39, 412-413 (1997)、Puente, X.
S., Pendas, A.M.,Llano, E., and Lopez-Otin, C., Ge
nomics, 54, 578-579 (1998))とは全く異なっていた。
【０１２０】実施例４：組換えヒトMT5-MMP の大腸菌に
おける発現とプロゼラチナーゼA プロセッシング活性 ヒトMT5-MMP は多くのMT-MMPに独特な構造的特徴を有す
ることから、プロゼラチナーゼA の活性化能を有するか
どうかさらに検討した。この疑問を解明する最初の段階
として、クローン化したcDNAを大腸菌で発現させた。プ
ロドメインの一部と触媒ドメインをコードする917 bpの
ヒトMT5-MMP 断片を 5'- AGTCCTATGGCTATCTGCTTCCC-3 ’（配列番号：７）及
び 5'- CCGGAAGAGGGCCACTGTGTTG-3' （配列番号：８） をプライマーとしたPCR により増幅した。PCR 反応は、
Expand Long High Fidelity PCR キットとGeneAmp 9700
PCR system (Perkin-Elmer/Cetus)を用い、変性(95
℃、15秒) 、アニーリング(54 ℃、15秒) 、伸長(68
℃、１分) の30サイクルで行なった。PCR 産物は、発現
ベクターpGEX 3XのSmaIサイトにクローニングした。こ
の発現ベクターを"pGEX-3X MT5" と命名した。pGEX-3X
MT5 で大腸菌BL21(DE3)pLysSコンピテント細胞を形質転
換し、クロラムフェニコールとアンピシリンを含むプレ
ート上で生育させた。33μg/mLのクロラムフェニコール
と50μg/mLのアンピシリンを含む2 mLの2YT 培地に、得
られた単一コロニーを植菌した。この培養液500 μl を
33μg/mLのクロラムフェニコールと50μg/mLのアンピシ
リンを含む200mL の2YT 培地に植え継いだ。培養液のOD
600 が0.6 に達した後、イソプロピル-1- チオ- β-D-
ガラクトピラノシド(IPTG)（最終濃度0.5 mM）を添加し
発現を誘導し、30℃で 3〜20時間培養を継続した。細胞
を遠心で集菌、洗浄後、0.05容のPBS (phosphate buffe
red saline) に懸濁した。細胞は、フレンチプレスで破
砕し、４℃で20,000×g 、20分間遠心した。発現を誘導
したバクテリア由来の抽出タンパク質をSDS-PAGEで解析
した。組換えプラスミドで形質転換したバクテリアは約
62 kDaの融合タンパク質を含んでいた（図６Ａ：レーン
２) が、コントロールの抽出物中には、このタンパク質
は存在していなかった（図６Ａ：レーン１) 。ヒトMT5-
MMP を含む融合タンパク質(GST-MT5-MMP) は、グルタチ
オン-Sepharose 4B (Pharmacia) で処理し、グルタチオ
ン溶出バッファー（10 mM reduced glutathione を含む
50mM Tris-HCl, pH 8.0）で溶出し精製した。この溶出
液に存在するタンパク質をSDS-PAGEで解析したところ、
予想されるサイズの単一バンドが検出された（図６Ａ：
レーン３）。GST-MT5-MMP は、プロ体酵素の潜在性を維
持するシステインスイッチのあるプロドメインを持つに
もかかわらず、自己分解活性を有する。同様な結果は、
GST-MT5-MMP と同じ構造ドメインを有するGST-MT1-MMP
でも観察されている(Kinoshita,T., Sato, H., Takino,
T., Itoh, M., Akizawa, T., and Seiki, M., Cancer
Res., 56, 2535-2538 (1996))。
おける発現とプロゼラチナーゼA プロセッシング活性 ヒトMT5-MMP は多くのMT-MMPに独特な構造的特徴を有す
ることから、プロゼラチナーゼA の活性化能を有するか
どうかさらに検討した。この疑問を解明する最初の段階
として、クローン化したcDNAを大腸菌で発現させた。プ
ロドメインの一部と触媒ドメインをコードする917 bpの
ヒトMT5-MMP 断片を 5'- AGTCCTATGGCTATCTGCTTCCC-3 ’（配列番号：７）及
び 5'- CCGGAAGAGGGCCACTGTGTTG-3' （配列番号：８） をプライマーとしたPCR により増幅した。PCR 反応は、
Expand Long High Fidelity PCR キットとGeneAmp 9700
PCR system (Perkin-Elmer/Cetus)を用い、変性(95
℃、15秒) 、アニーリング(54 ℃、15秒) 、伸長(68
℃、１分) の30サイクルで行なった。PCR 産物は、発現
ベクターpGEX 3XのSmaIサイトにクローニングした。こ
の発現ベクターを"pGEX-3X MT5" と命名した。pGEX-3X
MT5 で大腸菌BL21(DE3)pLysSコンピテント細胞を形質転
換し、クロラムフェニコールとアンピシリンを含むプレ
ート上で生育させた。33μg/mLのクロラムフェニコール
と50μg/mLのアンピシリンを含む2 mLの2YT 培地に、得
られた単一コロニーを植菌した。この培養液500 μl を
33μg/mLのクロラムフェニコールと50μg/mLのアンピシ
リンを含む200mL の2YT 培地に植え継いだ。培養液のOD
600 が0.6 に達した後、イソプロピル-1- チオ- β-D-
ガラクトピラノシド(IPTG)（最終濃度0.5 mM）を添加し
発現を誘導し、30℃で 3〜20時間培養を継続した。細胞
を遠心で集菌、洗浄後、0.05容のPBS (phosphate buffe
red saline) に懸濁した。細胞は、フレンチプレスで破
砕し、４℃で20,000×g 、20分間遠心した。発現を誘導
したバクテリア由来の抽出タンパク質をSDS-PAGEで解析
した。組換えプラスミドで形質転換したバクテリアは約
62 kDaの融合タンパク質を含んでいた（図６Ａ：レーン
２) が、コントロールの抽出物中には、このタンパク質
は存在していなかった（図６Ａ：レーン１) 。ヒトMT5-
MMP を含む融合タンパク質(GST-MT5-MMP) は、グルタチ
オン-Sepharose 4B (Pharmacia) で処理し、グルタチオ
ン溶出バッファー（10 mM reduced glutathione を含む
50mM Tris-HCl, pH 8.0）で溶出し精製した。この溶出
液に存在するタンパク質をSDS-PAGEで解析したところ、
予想されるサイズの単一バンドが検出された（図６Ａ：
レーン３）。GST-MT5-MMP は、プロ体酵素の潜在性を維
持するシステインスイッチのあるプロドメインを持つに
もかかわらず、自己分解活性を有する。同様な結果は、
GST-MT5-MMP と同じ構造ドメインを有するGST-MT1-MMP
でも観察されている(Kinoshita,T., Sato, H., Takino,
T., Itoh, M., Akizawa, T., and Seiki, M., Cancer
Res., 56, 2535-2538 (1996))。
【０１２１】そこで、このヒトMT5-MMP 融合タンパク質
を用いてヒト線維肉腫細胞HT1080の培養上清中のプロゼ
ラチナーゼA(MMP-2/72 kDa) とプロゼラチナーゼB(MMP-
9/92kDa) 活性化能の有無を検討した。グルタチオン-Se
pharose 4B ビーズに吸着させたGST-MT5-MMP 融合タン
パク質を50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl及び10
mM CaCl2 を添加したHT1080の培養上清と３時間インキ
ュベーションした。プロゼラチナーゼの活性化はゼラチ
ンザイモグラフィーにより検出した。組換えヒトMT5-MM
P は、顕著なプロゼラチナーゼA に対するタンパク質分
解活性を示し、活性型ゼラチナーゼA に相当する 62 kD
a のバンドを与えた（図６Ｂ：レーン２）。一方、これ
までの他のMT-MMPに関する研究と同様、ヒトMT5-MMP は
プロゼラチナーゼB に対しては全く活性化能を示さなか
った（図６Ｂ）。このヒトMT5-MMP のプロゼラチナーゼ
A に対するタンパク質分解活性が広くMMP 活性阻害剤と
して用いられているEDTAで阻害されるかどうか検討し
た。ゼラチンザイモグラフィーで62 kDaのバンドができ
なくなったことから明らかなように、EDTAによりヒトMT
5-MMP のタンパク質分解活性は完全に消失した（図Ｂ：
レーン３）。以上を総合すると、これらの機能解析から
クローン化したcDNAがプロゼラチナーゼA の活性化能を
持つMT-MMPの一つをコードしていることを示す。
を用いてヒト線維肉腫細胞HT1080の培養上清中のプロゼ
ラチナーゼA(MMP-2/72 kDa) とプロゼラチナーゼB(MMP-
9/92kDa) 活性化能の有無を検討した。グルタチオン-Se
pharose 4B ビーズに吸着させたGST-MT5-MMP 融合タン
パク質を50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl及び10
mM CaCl2 を添加したHT1080の培養上清と３時間インキ
ュベーションした。プロゼラチナーゼの活性化はゼラチ
ンザイモグラフィーにより検出した。組換えヒトMT5-MM
P は、顕著なプロゼラチナーゼA に対するタンパク質分
解活性を示し、活性型ゼラチナーゼA に相当する 62 kD
a のバンドを与えた（図６Ｂ：レーン２）。一方、これ
までの他のMT-MMPに関する研究と同様、ヒトMT5-MMP は
プロゼラチナーゼB に対しては全く活性化能を示さなか
った（図６Ｂ）。このヒトMT5-MMP のプロゼラチナーゼ
A に対するタンパク質分解活性が広くMMP 活性阻害剤と
して用いられているEDTAで阻害されるかどうか検討し
た。ゼラチンザイモグラフィーで62 kDaのバンドができ
なくなったことから明らかなように、EDTAによりヒトMT
5-MMP のタンパク質分解活性は完全に消失した（図Ｂ：
レーン３）。以上を総合すると、これらの機能解析から
クローン化したcDNAがプロゼラチナーゼA の活性化能を
持つMT-MMPの一つをコードしていることを示す。
【０１２２】実施例５：ヒト組織におけるMT5-MMP の発
現分布 ヒト組織におけるMT5-MMP の発現を様々なヒト組織から
調製した poly(A)+ RNA を含むノーザンブロットを脳cD
NAライブラリーより単離したヒトMT5-MMP cDNAとのハイ
ブリダイゼーションで解析した。様々なヒト組織（白血
球、大腸、小腸、卵巣、精巣, 前立腺、胸腺、脾臓、膵
臓、腎臓、骨格筋、肝臓、肺、胎盤、脳及び心臓）から
調製した２μg の poly(A)+ RNA を含むナイロンフィル
ターを42℃で３時間、50% ホルムアミド、5 x SSPE (1
x SSC= 150mM NaCl, 10 mM NaH2PO4, 1mM EDTA, pH 7.
4) 、10 x Denhardt's 溶液、2% SDS及び100 μg/mL変
性ニシン精子DNA 中でプレハイブリダイズした。次にAm
ersham International (Buckinghamshire, UK)の[ α-
32P]dCTP(3000 Ci/mL) とランダムプライミングキット
で標識したヒトMT5-MMP の全長cDNAと同一条件で20時間
ハイブリダイズさせた。フィルターを0.1 x SSC, 0.1 %
SDSで50℃、２時間洗浄した後、オートラジオグラフィ
ーを行なった。RNA の完全性と容量の均一性はアクチン
プローブとのハイブリダイゼーションで評価した。主に
脳、腎臓、膵臓及び肺で約４kbの転写物が検出された。
同じサイズの転写物は胎盤や心臓等の他の組織でも弱い
ながら検出された。他のMT-MMPではそれらの顕著な発現
が検出されなかった膵臓や腎臓でヒトMT5-MMP が優性な
発現を示したことは、この新規なMT-MMPが、生理条件下
で起こっているこれら組織の何らかのリモデリングの過
程に関与している可能性を示唆する。また、ヒトMT5-MM
P の発現が脳で高いことからアルツハイマー病における
ゼラチナーゼ Aの関与と併せ、脳疾患領域での機能が予
想される。
現分布 ヒト組織におけるMT5-MMP の発現を様々なヒト組織から
調製した poly(A)+ RNA を含むノーザンブロットを脳cD
NAライブラリーより単離したヒトMT5-MMP cDNAとのハイ
ブリダイゼーションで解析した。様々なヒト組織（白血
球、大腸、小腸、卵巣、精巣, 前立腺、胸腺、脾臓、膵
臓、腎臓、骨格筋、肝臓、肺、胎盤、脳及び心臓）から
調製した２μg の poly(A)+ RNA を含むナイロンフィル
ターを42℃で３時間、50% ホルムアミド、5 x SSPE (1
x SSC= 150mM NaCl, 10 mM NaH2PO4, 1mM EDTA, pH 7.
4) 、10 x Denhardt's 溶液、2% SDS及び100 μg/mL変
性ニシン精子DNA 中でプレハイブリダイズした。次にAm
ersham International (Buckinghamshire, UK)の[ α-
32P]dCTP(3000 Ci/mL) とランダムプライミングキット
で標識したヒトMT5-MMP の全長cDNAと同一条件で20時間
ハイブリダイズさせた。フィルターを0.1 x SSC, 0.1 %
SDSで50℃、２時間洗浄した後、オートラジオグラフィ
ーを行なった。RNA の完全性と容量の均一性はアクチン
プローブとのハイブリダイゼーションで評価した。主に
脳、腎臓、膵臓及び肺で約４kbの転写物が検出された。
同じサイズの転写物は胎盤や心臓等の他の組織でも弱い
ながら検出された。他のMT-MMPではそれらの顕著な発現
が検出されなかった膵臓や腎臓でヒトMT5-MMP が優性な
発現を示したことは、この新規なMT-MMPが、生理条件下
で起こっているこれら組織の何らかのリモデリングの過
程に関与している可能性を示唆する。また、ヒトMT5-MM
P の発現が脳で高いことからアルツハイマー病における
ゼラチナーゼ Aの関与と併せ、脳疾患領域での機能が予
想される。
【０１２３】実施例６：モノクローナル抗体の作成 免疫に用いる抗原は、実施例４で得られた精製した融合
組換えヒトMT5-MMP を使用することができる。あるい
は、この融合組換えヒトMT5-MMP をファクターXaで処理
し、グルタチオン-S- トランスフェラーゼ(GST) 部分を
除去した組換えタンパク質を使用することもできる。さ
らに、実施例２のヒトMT5-MMP cDNAを動物細胞発現ベク
ターに連結し、これを CHO細胞あるいは COS細胞で発現
させて得られた組換えヒトMT5-MMP を使用することも可
能である。またさらに、免疫に用いる抗原は、ヒトMT5-
MMP cDNAからC-末端側の疎水性膜貫通領域と細胞内領域
を切断した遺伝子を組み込んだ大腸菌、酵母、昆虫細胞
あるいは動物細胞で発現した組換えタンパク質を使用す
ることができる。C-末端側の疎水性膜貫通領域と細胞内
領域を欠いた組換えタンパク質は、可溶性が改善し、免
疫用抗原として特に好ましい。また、配列番号:1に記載
したヒトMT5-MMP のアミノ酸配列中より他のヒトMT-MMP
ファミリー、特にはヒトMT3-MMP と相同性が低く、ヒト
MT5-MMP に特徴的な配列を選択し、合成することができ
る。これらの抗原タンパク質は、イオン交換、ゲル濾
過、抗体アフィニティークロマトグラフィーまたはそれ
以外の各種クロマトグラフィーによって精製できる。精
製した免疫用抗原を一般的な方法で免疫し、抗体産生細
胞を誘導、細胞融合によりハイブリドーマとして抗体産
生細胞を得ることができる。さらに精製した免疫用抗原
に対する反応性に基づいてクローニング、モノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマとして株化できる。ただし、
GST 融合組換えヒトMT5-MMP を免疫源として得られたハ
イブリドーマの場合には、GST に対する抗体産生株を含
んでいるので、GST に反応する抗体産生ハイブリドーマ
を除去しなければならない。また、ヒトMT5-MMP 特異的
モノクローナル抗体を得るための免疫源としては、ヒト
MT5-MMP に特徴的なアミノ酸配列を持つハプテン化合成
ペプチドが使用できる。たとえば第155 位までのシグナ
ルペプチド及びプロペプチド領域、第156-327 位の活性
部位、第328-379 位のヒンジ領域、第380-569 位のヘモ
ペキシン領域、第570-645 位の膜貫通領域と細胞内領域
を含む領域から、他のMMPsには見られない特異的で、疎
水性の低い可溶性ペプチド配列を選択し使用することが
できる。
組換えヒトMT5-MMP を使用することができる。あるい
は、この融合組換えヒトMT5-MMP をファクターXaで処理
し、グルタチオン-S- トランスフェラーゼ(GST) 部分を
除去した組換えタンパク質を使用することもできる。さ
らに、実施例２のヒトMT5-MMP cDNAを動物細胞発現ベク
ターに連結し、これを CHO細胞あるいは COS細胞で発現
させて得られた組換えヒトMT5-MMP を使用することも可
能である。またさらに、免疫に用いる抗原は、ヒトMT5-
MMP cDNAからC-末端側の疎水性膜貫通領域と細胞内領域
を切断した遺伝子を組み込んだ大腸菌、酵母、昆虫細胞
あるいは動物細胞で発現した組換えタンパク質を使用す
ることができる。C-末端側の疎水性膜貫通領域と細胞内
領域を欠いた組換えタンパク質は、可溶性が改善し、免
疫用抗原として特に好ましい。また、配列番号:1に記載
したヒトMT5-MMP のアミノ酸配列中より他のヒトMT-MMP
ファミリー、特にはヒトMT3-MMP と相同性が低く、ヒト
MT5-MMP に特徴的な配列を選択し、合成することができ
る。これらの抗原タンパク質は、イオン交換、ゲル濾
過、抗体アフィニティークロマトグラフィーまたはそれ
以外の各種クロマトグラフィーによって精製できる。精
製した免疫用抗原を一般的な方法で免疫し、抗体産生細
胞を誘導、細胞融合によりハイブリドーマとして抗体産
生細胞を得ることができる。さらに精製した免疫用抗原
に対する反応性に基づいてクローニング、モノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマとして株化できる。ただし、
GST 融合組換えヒトMT5-MMP を免疫源として得られたハ
イブリドーマの場合には、GST に対する抗体産生株を含
んでいるので、GST に反応する抗体産生ハイブリドーマ
を除去しなければならない。また、ヒトMT5-MMP 特異的
モノクローナル抗体を得るための免疫源としては、ヒト
MT5-MMP に特徴的なアミノ酸配列を持つハプテン化合成
ペプチドが使用できる。たとえば第155 位までのシグナ
ルペプチド及びプロペプチド領域、第156-327 位の活性
部位、第328-379 位のヒンジ領域、第380-569 位のヘモ
ペキシン領域、第570-645 位の膜貫通領域と細胞内領域
を含む領域から、他のMMPsには見られない特異的で、疎
水性の低い可溶性ペプチド配列を選択し使用することが
できる。
【０１２４】（ａ）抗原ポリペプチドの調製 前述のようなポリペプチドは、ペプチド合成機（ペプチ
ドシンセサイザー9600、MilliGen/Biosearch）を使用し
て、Fmoc-bop法で合成する。ポリペプチドのN末端ある
いはC 末端にはシステインを導入する。合成したペプチ
ドはμBondasphere, C18カラム（Waters）を用いた高速
液体クロマトグラフィーにより精製する。 （ｂ）ポリペプチドとBSA の複合体の調製 システイン残基を介してウシ血清アルブミン(BSA) と結
合させ、抗原コンジュゲートとする。BSA を 0.1M リン
酸緩衝液 (pH7.5)に溶解したものとN-(6-maleimidecapr
oyloxy)-succinimide (EMCS)をジメチルホルムアミドに
溶解したものと混合し、30℃、30分間反応させ、つい
で、上記の混合液を 0.1M リン酸緩衝液 (pH7.0)で平衡
化した PD-10 (Pharmacia)でゲルろ過する。マレイミド
結合BSA を分取し、1.5mL 以下に濃縮する。前記(a) で
合成したそれぞれのポリペプチドを0.1M リン酸緩衝液
(pH7.0)に溶解し、マレイミド結合BSA に対し50倍モル
量となるようにそれぞれ混合し、４℃、20時間インキュ
ベートし、BSA-ポリペプチド複合体を調製する。
ドシンセサイザー9600、MilliGen/Biosearch）を使用し
て、Fmoc-bop法で合成する。ポリペプチドのN末端ある
いはC 末端にはシステインを導入する。合成したペプチ
ドはμBondasphere, C18カラム（Waters）を用いた高速
液体クロマトグラフィーにより精製する。 （ｂ）ポリペプチドとBSA の複合体の調製 システイン残基を介してウシ血清アルブミン(BSA) と結
合させ、抗原コンジュゲートとする。BSA を 0.1M リン
酸緩衝液 (pH7.5)に溶解したものとN-(6-maleimidecapr
oyloxy)-succinimide (EMCS)をジメチルホルムアミドに
溶解したものと混合し、30℃、30分間反応させ、つい
で、上記の混合液を 0.1M リン酸緩衝液 (pH7.0)で平衡
化した PD-10 (Pharmacia)でゲルろ過する。マレイミド
結合BSA を分取し、1.5mL 以下に濃縮する。前記(a) で
合成したそれぞれのポリペプチドを0.1M リン酸緩衝液
(pH7.0)に溶解し、マレイミド結合BSA に対し50倍モル
量となるようにそれぞれ混合し、４℃、20時間インキュ
ベートし、BSA-ポリペプチド複合体を調製する。
【０１２５】（ｃ）抗体産生細胞の調製 前記（ｂ）で調製したポリペプチドとBSA との複合体、
200 μg を完全フロインドアジュバントと共に８週令Ba
lb/c雌マウスに腹腔内投与し、初回免疫する。19日目と
34日目に 0.1M リン酸緩衝液 (pH7.5)に溶解した複合体
200μg を初回免疫したマウスに腹腔内投与し、追加免
疫する。さらに69日目に複合体 200μgを静脈内投与
し、最終免疫とする。その３日後に脾臓を摘出し、脾細
胞懸濁液を調製する。 （ｄ）細胞融合 （１）以下の材料および方法を用いる。RPMI-1640 培
地：RPMI-1640 (Flow Lab.) に重炭酸ナトリウム (24m
M) 、ピルビン酸ナトリウム (1mM)、ペニシリンG カリ
ウム (50U/mL) 、硫酸アミカシン (100 μg/mL) を加
え、ドライアイスでpHを7.2 にし、0.2 μm 東洋メンブ
レンフィルターで除菌ろ過する。NS-1培地：上記RPMI-1
640 培地に除菌ろ過したウシ胎児血清 (FCS, M.A. Biop
roducts)を15% (v/v) の濃度になるように加える。PEG-
4000溶液：RPMI-1640 培地にポリエチレングリコール-4
000 (PEG-4000, Merk & Co.)を50% (w/w) になるように
加えた無血清培地を調製する。8-アザグアニン耐性ミエ
ローマ細胞 SP2 (SP2/0-Ag14) との融合は、SelectedMe
thod in culture immunology, pp 351 〜372 (ed. B.
B. Mishell and S. N.Shiigi), W. H. Freeman and Com
pany (1980)に記載のOiらの方法を若干改変して行う。 （２）前記（ｃ）で調製した有核脾細胞（生細胞率 100
％）とミエローマ細胞（生細胞率 100％）とを５：１の
比率で以下の手順で融合した。それぞれのポリペプチド
免疫脾細胞懸濁液とミエローマ細胞をそれぞれ RPMI164
0 培地で洗浄する。次に同じ培地に懸濁し、融合させる
ために有核脾細胞とミエローマ細胞個を混合する。次に
遠心分離により細胞を沈殿させ、上清を完全に吸引除去
する。沈殿した細胞に37℃に加温したPEG-4000溶液を１
分間で滴下し、１分間撹拌し、細胞を再懸濁、分散させ
る。次に37℃に加温したRPMI1640培地を２分間で滴下し
た後、同培地を２〜３分間で常に撹拌しながら滴下し、
細胞を分散させる。これを遠心分離し、上清を完全に吸
引除去する。次にこの沈殿した細胞に37℃に加温したNS
-1培地を速やかに加え、大きい細胞塊を注意深くピペッ
ティングで分散する。さらに同培地64mLを加えて希釈
し、ポリスチレン製96穴マイクロウェルにウェル当り
6.0×105 個/0.1mLの細胞を加える。細胞を加えた上記
マイクロウェルを７％炭酸ガス/93 ％空気中で温度37
℃、湿度100 ％で培養する。
200 μg を完全フロインドアジュバントと共に８週令Ba
lb/c雌マウスに腹腔内投与し、初回免疫する。19日目と
34日目に 0.1M リン酸緩衝液 (pH7.5)に溶解した複合体
200μg を初回免疫したマウスに腹腔内投与し、追加免
疫する。さらに69日目に複合体 200μgを静脈内投与
し、最終免疫とする。その３日後に脾臓を摘出し、脾細
胞懸濁液を調製する。 （ｄ）細胞融合 （１）以下の材料および方法を用いる。RPMI-1640 培
地：RPMI-1640 (Flow Lab.) に重炭酸ナトリウム (24m
M) 、ピルビン酸ナトリウム (1mM)、ペニシリンG カリ
ウム (50U/mL) 、硫酸アミカシン (100 μg/mL) を加
え、ドライアイスでpHを7.2 にし、0.2 μm 東洋メンブ
レンフィルターで除菌ろ過する。NS-1培地：上記RPMI-1
640 培地に除菌ろ過したウシ胎児血清 (FCS, M.A. Biop
roducts)を15% (v/v) の濃度になるように加える。PEG-
4000溶液：RPMI-1640 培地にポリエチレングリコール-4
000 (PEG-4000, Merk & Co.)を50% (w/w) になるように
加えた無血清培地を調製する。8-アザグアニン耐性ミエ
ローマ細胞 SP2 (SP2/0-Ag14) との融合は、SelectedMe
thod in culture immunology, pp 351 〜372 (ed. B.
B. Mishell and S. N.Shiigi), W. H. Freeman and Com
pany (1980)に記載のOiらの方法を若干改変して行う。 （２）前記（ｃ）で調製した有核脾細胞（生細胞率 100
％）とミエローマ細胞（生細胞率 100％）とを５：１の
比率で以下の手順で融合した。それぞれのポリペプチド
免疫脾細胞懸濁液とミエローマ細胞をそれぞれ RPMI164
0 培地で洗浄する。次に同じ培地に懸濁し、融合させる
ために有核脾細胞とミエローマ細胞個を混合する。次に
遠心分離により細胞を沈殿させ、上清を完全に吸引除去
する。沈殿した細胞に37℃に加温したPEG-4000溶液を１
分間で滴下し、１分間撹拌し、細胞を再懸濁、分散させ
る。次に37℃に加温したRPMI1640培地を２分間で滴下し
た後、同培地を２〜３分間で常に撹拌しながら滴下し、
細胞を分散させる。これを遠心分離し、上清を完全に吸
引除去する。次にこの沈殿した細胞に37℃に加温したNS
-1培地を速やかに加え、大きい細胞塊を注意深くピペッ
ティングで分散する。さらに同培地64mLを加えて希釈
し、ポリスチレン製96穴マイクロウェルにウェル当り
6.0×105 個/0.1mLの細胞を加える。細胞を加えた上記
マイクロウェルを７％炭酸ガス/93 ％空気中で温度37
℃、湿度100 ％で培養する。
【０１２６】（ｅ）選択培地によるハイブリドーマの選
択的増殖 (1) 使用した培地は以下の通りである。 HAT 培地：前記(d) 項(1) で述べたNS-1培地に更にヒポ
キサンチン（100 μM)、アミノプテリン（0.4 μM)およ
びチミジン（16μM)を加える。HT培地：アミノプテリン
を除去した以外は上記HAT 培地と同一組成のものであ
る。 （２）前記 (d)項の培養開始後翌日（１日目）、細胞に
パスツールピペットでHAT 培地２滴（約 0.1mL）を加え
る。２、３、５、８日目に培地の半分（約 0.1mL）を新
しい HAT培地で置き換え、11日目に培地の半分を新しい
HT培地で置き換える。14日目にハイブリドーマの生育が
肉眼にて認められた全ウエルについて固相−抗体結合テ
スト法 (ELISA)により陽性ウエルを調べる。すなわち、
ポリスチレン製96穴プレートを抗原としたそれぞれのポ
リペプチドでコートし、次に洗浄用PBS (0.05％ Tween2
0含有) を用いて洗浄して未吸着のペプチドを除く。さ
らに各ウエルの未コート部分を１％ BSAでブロックす
る。この各ウエルにハイブリドーマの生育が確認された
ウエルの上清 0.1mLを添加し、室温で約１時間静置す
る。２次抗体として西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP)
標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン (Cappele Lab.) を加
え、さらに室温で約１時間静置する。次に基質である過
酸化水素と o‐フェニレンジアミンを加え、発色の程度
をマイクロプレート用吸光度測定機（MRP-A4、東ソー）
を用いて 492nmの吸光度で測定する。ポリスチレン製96
穴プレートに固相化する抗原としては、前述の精製した
各種組換えヒトMT5-MMP も使用できる。
択的増殖 (1) 使用した培地は以下の通りである。 HAT 培地：前記(d) 項(1) で述べたNS-1培地に更にヒポ
キサンチン（100 μM)、アミノプテリン（0.4 μM)およ
びチミジン（16μM)を加える。HT培地：アミノプテリン
を除去した以外は上記HAT 培地と同一組成のものであ
る。 （２）前記 (d)項の培養開始後翌日（１日目）、細胞に
パスツールピペットでHAT 培地２滴（約 0.1mL）を加え
る。２、３、５、８日目に培地の半分（約 0.1mL）を新
しい HAT培地で置き換え、11日目に培地の半分を新しい
HT培地で置き換える。14日目にハイブリドーマの生育が
肉眼にて認められた全ウエルについて固相−抗体結合テ
スト法 (ELISA)により陽性ウエルを調べる。すなわち、
ポリスチレン製96穴プレートを抗原としたそれぞれのポ
リペプチドでコートし、次に洗浄用PBS (0.05％ Tween2
0含有) を用いて洗浄して未吸着のペプチドを除く。さ
らに各ウエルの未コート部分を１％ BSAでブロックす
る。この各ウエルにハイブリドーマの生育が確認された
ウエルの上清 0.1mLを添加し、室温で約１時間静置す
る。２次抗体として西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP)
標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン (Cappele Lab.) を加
え、さらに室温で約１時間静置する。次に基質である過
酸化水素と o‐フェニレンジアミンを加え、発色の程度
をマイクロプレート用吸光度測定機（MRP-A4、東ソー）
を用いて 492nmの吸光度で測定する。ポリスチレン製96
穴プレートに固相化する抗原としては、前述の精製した
各種組換えヒトMT5-MMP も使用できる。
【０１２７】（ｆ）ハイブリドーマのクローニング 上記（ｅ）項で得られる抗原ペプチドに対する陽性ウエ
ル中のハイブリドーマを、限界希釈法を用いてモノクロ
ーン化する。すなわち、NS-1培地1mL 当りフィーダーと
して 107個のマウス胸腺細胞を含むクローニング培地を
調製し、96穴マイクロウエルにハイブリドーマをウエル
当り５個、１個、0.5 個になるように希釈し、それぞれ
36穴、36穴、24穴に加える。５日目、12日目に全ウエル
に約 0.1mLのNS-1培地を追加する。クローニング開始後
約２週間で、肉眼的に十分なハイブリドーマの生育を認
め、コロニー形成陰性ウエルが50％以上である群につい
て（ｅ）項に記載したELISA を行う。調べた全ウエルが
陽性でない場合、抗体陽性ウエル中のコロニー数が１個
のウエルを４〜６個選択し、再クローニングを行う。最
終的にそれぞれのポリペプチドに対するモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマが得られる。 （ｇ）ハイブリドーマの培養とモノクローナル抗体の精
製 得られるハイブリドーマ細胞をNS-1培地で培養し、その
上清から濃度10〜100μg/mLのモノクローナル抗体を得
ることができる。また、得られたハイブリドーマ 107個
を予め１週間前にプリスタンを腹腔内投与したマウス
（Balb/c系、雌、６週齢）に同じく腹腔内投与し、１〜
２週間後、腹水中からも 4〜7mg/mLのモノクローナル抗
体を含む腹水を得ることができる。得られた腹水を40％
飽和硫酸アンモニウムで塩析後、IgG クラスの抗体をプ
ロテインA アフィゲル (Bio-Rad)に吸着させ、0.1Mクエ
ン酸緩衝液 (pH5.0)で溶出することにより精製する。 （ｈ）モノクローナル抗体のクラス、サブクラスの決定 前述したELISA に従い、それぞれのポリペプチドをコー
トしたポリスチレン製96穴プレートに、（ｆ）項で得ら
れたハイブリドーマの上清を加える。次にPBSで洗浄
後、アイソタイプ特異的ウサギ抗マウスIgG 抗体 (Zyme
d Lab.) を加える。PBS により洗浄後、西洋わさびペル
オキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG (H＋L)を加え、基質
として過酸化水素および 2,2'-アジノ- ジ（3-エチルベ
ンゾチアゾリン酸）を用いてクラス、サブクラスを決定
する。
ル中のハイブリドーマを、限界希釈法を用いてモノクロ
ーン化する。すなわち、NS-1培地1mL 当りフィーダーと
して 107個のマウス胸腺細胞を含むクローニング培地を
調製し、96穴マイクロウエルにハイブリドーマをウエル
当り５個、１個、0.5 個になるように希釈し、それぞれ
36穴、36穴、24穴に加える。５日目、12日目に全ウエル
に約 0.1mLのNS-1培地を追加する。クローニング開始後
約２週間で、肉眼的に十分なハイブリドーマの生育を認
め、コロニー形成陰性ウエルが50％以上である群につい
て（ｅ）項に記載したELISA を行う。調べた全ウエルが
陽性でない場合、抗体陽性ウエル中のコロニー数が１個
のウエルを４〜６個選択し、再クローニングを行う。最
終的にそれぞれのポリペプチドに対するモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマが得られる。 （ｇ）ハイブリドーマの培養とモノクローナル抗体の精
製 得られるハイブリドーマ細胞をNS-1培地で培養し、その
上清から濃度10〜100μg/mLのモノクローナル抗体を得
ることができる。また、得られたハイブリドーマ 107個
を予め１週間前にプリスタンを腹腔内投与したマウス
（Balb/c系、雌、６週齢）に同じく腹腔内投与し、１〜
２週間後、腹水中からも 4〜7mg/mLのモノクローナル抗
体を含む腹水を得ることができる。得られた腹水を40％
飽和硫酸アンモニウムで塩析後、IgG クラスの抗体をプ
ロテインA アフィゲル (Bio-Rad)に吸着させ、0.1Mクエ
ン酸緩衝液 (pH5.0)で溶出することにより精製する。 （ｈ）モノクローナル抗体のクラス、サブクラスの決定 前述したELISA に従い、それぞれのポリペプチドをコー
トしたポリスチレン製96穴プレートに、（ｆ）項で得ら
れたハイブリドーマの上清を加える。次にPBSで洗浄
後、アイソタイプ特異的ウサギ抗マウスIgG 抗体 (Zyme
d Lab.) を加える。PBS により洗浄後、西洋わさびペル
オキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG (H＋L)を加え、基質
として過酸化水素および 2,2'-アジノ- ジ（3-エチルベ
ンゾチアゾリン酸）を用いてクラス、サブクラスを決定
する。
【０１２８】実施例７：サンドイッチEIA 実施例６で調製した抗ヒトMT5-MMP モノクローナル抗体
から適当な２種の組み合わせによってヒトMT5-MMP を特
異的に検出・測定するサンドイッチEIA 系が構成でき
る。EIA 系は１ステップ法、２ステップ法のいずれも可
能であり、標識抗体はFab'-HRPに限定されない。各反応
緩衝液の組成や反応条件は測定の目的に応じて短縮ある
いは延長など調整できる。 （ａ）標識抗体の調製 抗ヒトMT5-MMP モノクローナル抗体を0.1M NaCl を含む
0.1M 酢酸緩衝液 (pH4.2)に抗体量の 2%(W/W)のペプシ
ンを加え、37℃、24時間消化する。消化物に3MTris-HCl
(pH7.5)を添加し、反応を停止する。 0.1M リン酸緩衝
液 (pH7.0)で平衡化したウルトロゲルAcA54 カラムによ
るゲルろ過でF(ab')2 画分を分取する。このF(ab')2 画
分に最終濃度 0.01Mとなるようにシステアミン塩酸塩を
添加し、37℃、1.5 時間還元し、5mM EDTA含有 0.1M リ
ン酸緩衝液 (pH6.0)で平衡化したウルトロゲルAcA54 カ
ラムによるゲルろ過でFab'画分を分取する。上記の操作
とは別にHRP を 0.1M リン酸緩衝液 (pH7.0)に溶解、HR
P の25倍モル量のEMCSをDMF 溶液として加え、30℃、30
分間反応させる。これを 0.1M リン酸緩衝液 (pH6.0)で
平衡化した NICK-5 カラム (Pharmacia)でゲルろ過しマ
レイミド標識 HRP画分を分取する。Fab'画分とマレイミ
ド標識 HRPを等モルとなるように両画分を混合し４℃、
20時間反応させた後、Fab'の10倍モル量のN-エチルマレ
イミドで未反応のチオール基をブロックする。これを
0.1M リン酸緩衝液 (pH6.5)で平衡化したウルトロゲルA
cA54 カラムでゲルろ過し、Fab'-HRP標識抗体を分取す
る。これに0.1% BSAおよび0.001%クロルヘキシジンを添
加して４℃で保存する。
から適当な２種の組み合わせによってヒトMT5-MMP を特
異的に検出・測定するサンドイッチEIA 系が構成でき
る。EIA 系は１ステップ法、２ステップ法のいずれも可
能であり、標識抗体はFab'-HRPに限定されない。各反応
緩衝液の組成や反応条件は測定の目的に応じて短縮ある
いは延長など調整できる。 （ａ）標識抗体の調製 抗ヒトMT5-MMP モノクローナル抗体を0.1M NaCl を含む
0.1M 酢酸緩衝液 (pH4.2)に抗体量の 2%(W/W)のペプシ
ンを加え、37℃、24時間消化する。消化物に3MTris-HCl
(pH7.5)を添加し、反応を停止する。 0.1M リン酸緩衝
液 (pH7.0)で平衡化したウルトロゲルAcA54 カラムによ
るゲルろ過でF(ab')2 画分を分取する。このF(ab')2 画
分に最終濃度 0.01Mとなるようにシステアミン塩酸塩を
添加し、37℃、1.5 時間還元し、5mM EDTA含有 0.1M リ
ン酸緩衝液 (pH6.0)で平衡化したウルトロゲルAcA54 カ
ラムによるゲルろ過でFab'画分を分取する。上記の操作
とは別にHRP を 0.1M リン酸緩衝液 (pH7.0)に溶解、HR
P の25倍モル量のEMCSをDMF 溶液として加え、30℃、30
分間反応させる。これを 0.1M リン酸緩衝液 (pH6.0)で
平衡化した NICK-5 カラム (Pharmacia)でゲルろ過しマ
レイミド標識 HRP画分を分取する。Fab'画分とマレイミ
ド標識 HRPを等モルとなるように両画分を混合し４℃、
20時間反応させた後、Fab'の10倍モル量のN-エチルマレ
イミドで未反応のチオール基をブロックする。これを
0.1M リン酸緩衝液 (pH6.5)で平衡化したウルトロゲルA
cA54 カラムでゲルろ過し、Fab'-HRP標識抗体を分取す
る。これに0.1% BSAおよび0.001%クロルヘキシジンを添
加して４℃で保存する。
【０１２９】（ｂ）モノクローナル抗体結合担体の調製 抗ヒトMT5-MMP モノクローナル抗体を 0.1M リン酸緩衝
液 (pH7.5)に溶解し、50μg/mLの濃度に調製する。この
モノクローナル抗体溶液を96穴マイクロプレートにウエ
ルあたり100 μL ずつ加え、４℃、18時間静置する。モ
ノクローナル抗体溶液を除去し、生理食塩液で１回、0.
05% Tween20 、0.1M NaCl 、5mM CaCl2を含むTris-HCl
緩衝液 (pH8.0)で３回洗浄後、1% BSA、0.1M NaCl 、5m
M CaCl2を含むTris-HCl緩衝液 (pH8.0)を加えブロッキ
ングする。
液 (pH7.5)に溶解し、50μg/mLの濃度に調製する。この
モノクローナル抗体溶液を96穴マイクロプレートにウエ
ルあたり100 μL ずつ加え、４℃、18時間静置する。モ
ノクローナル抗体溶液を除去し、生理食塩液で１回、0.
05% Tween20 、0.1M NaCl 、5mM CaCl2を含むTris-HCl
緩衝液 (pH8.0)で３回洗浄後、1% BSA、0.1M NaCl 、5m
M CaCl2を含むTris-HCl緩衝液 (pH8.0)を加えブロッキ
ングする。
【０１３０】（ｃ）１ステップサンドイッチEIA 法 精製したヒトMT5-MMP 画分を標準抗原としてヒトMT5-MM
P 定量用標準曲線を作成する。1% BSA、0.05% Brij35、
0.05% Tween20 、0.1M NaCl 、5mM CaCl2 を含むTris-H
Cl緩衝液 (pH8.0)で段階希釈した標準ヒトMT5-MMP を60
μL ずつ分注、それぞれに1% BSA、0.05% Brij35、0.05
% Tween20 、0.1M NaCl 、5mM CaCl2 を含むTris-HCl緩
衝液 (pH8.0)で100ng/50μL に調製した標識抗体Fab'-H
RPを60μL ずつ添加し十分混和する。調製した抗体結合
マイクロプレートを0.05% Tween20 、0.1M NaCl 、5mM
CaCl2 を含むTris-HCl緩衝液 (pH8.0)で３回洗浄し、標
準抗原と標識抗体混合液を 100μL/ウエルずつ添加す
る。室温で１時間反応した後0.05% Tween20 、0.1M NaC
l 、5mM CaCl2 を含むTris-HCl緩衝液 (pH8.0)で３回洗
浄する。次に、0.02% 過酸化水素含有 0.1M クエン酸−
リン酸緩衝液 (pH4.9)に溶解した1.2mg/mL o- フェニレ
ンジアミンをウエルあたり 100μL 添加し、室温で20分
間反応後、2N硫酸を 100μL 添加し反応を停止する。こ
の反応混液のA4 92をマイクロプレートリーダーを用いて
測定し、標準曲線を求める。測定検体は、ヒト血清、血
漿、関節液、尿および唾液などのに由来する体液成分、
各種ヒト組織の抽出液、ヒト由来あるいは組換え体など
各種培養細胞の細胞抽出液、培養上清などから調製され
る。それぞれの測定検体は、標準ヒトMT5-MMP にかえて
上記１ステップサンドイッチEIA に供し、標準ヒトMT5-
MMP と同時に反応を進行させる。測定検体から得られた
A492の値を得られた標準曲線にあてはめ、測定検体に含
まれるヒトMT5-MMP の量を算出する。標準抗原として使
用するヒトMT5-MMP として、C-末端側の疎水性膜貫通領
域と細胞内領域を切除し可溶性を改善した組換えタンパ
ク質が、有用である。
P 定量用標準曲線を作成する。1% BSA、0.05% Brij35、
0.05% Tween20 、0.1M NaCl 、5mM CaCl2 を含むTris-H
Cl緩衝液 (pH8.0)で段階希釈した標準ヒトMT5-MMP を60
μL ずつ分注、それぞれに1% BSA、0.05% Brij35、0.05
% Tween20 、0.1M NaCl 、5mM CaCl2 を含むTris-HCl緩
衝液 (pH8.0)で100ng/50μL に調製した標識抗体Fab'-H
RPを60μL ずつ添加し十分混和する。調製した抗体結合
マイクロプレートを0.05% Tween20 、0.1M NaCl 、5mM
CaCl2 を含むTris-HCl緩衝液 (pH8.0)で３回洗浄し、標
準抗原と標識抗体混合液を 100μL/ウエルずつ添加す
る。室温で１時間反応した後0.05% Tween20 、0.1M NaC
l 、5mM CaCl2 を含むTris-HCl緩衝液 (pH8.0)で３回洗
浄する。次に、0.02% 過酸化水素含有 0.1M クエン酸−
リン酸緩衝液 (pH4.9)に溶解した1.2mg/mL o- フェニレ
ンジアミンをウエルあたり 100μL 添加し、室温で20分
間反応後、2N硫酸を 100μL 添加し反応を停止する。こ
の反応混液のA4 92をマイクロプレートリーダーを用いて
測定し、標準曲線を求める。測定検体は、ヒト血清、血
漿、関節液、尿および唾液などのに由来する体液成分、
各種ヒト組織の抽出液、ヒト由来あるいは組換え体など
各種培養細胞の細胞抽出液、培養上清などから調製され
る。それぞれの測定検体は、標準ヒトMT5-MMP にかえて
上記１ステップサンドイッチEIA に供し、標準ヒトMT5-
MMP と同時に反応を進行させる。測定検体から得られた
A492の値を得られた標準曲線にあてはめ、測定検体に含
まれるヒトMT5-MMP の量を算出する。標準抗原として使
用するヒトMT5-MMP として、C-末端側の疎水性膜貫通領
域と細胞内領域を切除し可溶性を改善した組換えタンパ
ク質が、有用である。
【０１３１】
【発明の効果】ヒトMT-MMP遺伝子配列に特徴的な配列を
有する、新規であって且つ膜結合型メタロプロテアーゼ
ファミリーに属するヒトMT5-MMP をコードする遺伝子の
全長をヒトcDNAライブラリーからクローニングし、その
塩基配列を解析したことにより、結合組織の改変など、
多くの正常な細胞のプロセス、さらにはアテローム性動
脈硬化症、アルツハイマー病、肺気腫、リウマチ性関節
炎、筋ジストロフィー、骨粗鬆症、神経変性疾患および
癌の浸潤・転移の様な多くの疾患についての研究におい
てその利用が可能となった。さらに大腸菌、その他の宿
主においてこの遺伝子の発現を行い、組換えタンパク質
によってこの酵素学的特性を明らかにできるし、その活
性を阻害する物質を研究することも可能になる。また、
ヒトMT5-MMP 遺伝子の染色体座位を決定し、ヒト組織に
おける発現を調査することができる。また本発明の遺伝
子プローブによりヒトMT5-MMP 遺伝子、その発現細胞な
どの検出手段並びにそのための試薬を提供できる。ヒト
MT5-MMP に特異的に反応する抗体、特にはモノクローナ
ル抗体を作成し免疫学的組織染色など、ヒトMT5-MMPの
検出手段並びにそのための試薬を提供できる。また、ヒ
トMT5-MMP を検出、測定する方法、例えば、EIA 系を提
供する。当該試薬は、癌の検出・診断をはじめとして、
上記した疾患の発症機序の解明、治療及び治療薬の開発
等に利用可能性を有する。本発明は、前述の説明及び実
施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかで
ある。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変
形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲
の範囲内のものである。
有する、新規であって且つ膜結合型メタロプロテアーゼ
ファミリーに属するヒトMT5-MMP をコードする遺伝子の
全長をヒトcDNAライブラリーからクローニングし、その
塩基配列を解析したことにより、結合組織の改変など、
多くの正常な細胞のプロセス、さらにはアテローム性動
脈硬化症、アルツハイマー病、肺気腫、リウマチ性関節
炎、筋ジストロフィー、骨粗鬆症、神経変性疾患および
癌の浸潤・転移の様な多くの疾患についての研究におい
てその利用が可能となった。さらに大腸菌、その他の宿
主においてこの遺伝子の発現を行い、組換えタンパク質
によってこの酵素学的特性を明らかにできるし、その活
性を阻害する物質を研究することも可能になる。また、
ヒトMT5-MMP 遺伝子の染色体座位を決定し、ヒト組織に
おける発現を調査することができる。また本発明の遺伝
子プローブによりヒトMT5-MMP 遺伝子、その発現細胞な
どの検出手段並びにそのための試薬を提供できる。ヒト
MT5-MMP に特異的に反応する抗体、特にはモノクローナ
ル抗体を作成し免疫学的組織染色など、ヒトMT5-MMPの
検出手段並びにそのための試薬を提供できる。また、ヒ
トMT5-MMP を検出、測定する方法、例えば、EIA 系を提
供する。当該試薬は、癌の検出・診断をはじめとして、
上記した疾患の発症機序の解明、治療及び治療薬の開発
等に利用可能性を有する。本発明は、前述の説明及び実
施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかで
ある。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変
形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲
の範囲内のものである。
【０１３２】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha <120> Novel Membrane-type Matrix Metalloproteinase <130> P-99NF285 <140> <141> <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 645 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Pro Arg Ser Arg Gly Gly Arg Ala Ala Pro Gly Pro Pro Pro Pro 1 5 10 15 Pro Pro Pro Pro Gly Gln Ala Pro Arg Trp Ser Arg Trp Arg Val Pro 20 25 30 Gly Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Ala Leu Cys Cys Leu Pro Gly 35 40 45 Ala Ala Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Asn Arg Ala Ala 50 55 60 Val Ala Val Ala Val Ala Arg Ala Asp Glu Ala Glu Ala Pro Phe Ala 65 70 75 80 Gly Gln Asn Trp Leu Lys Ser Tyr Gly Tyr Leu Leu Pro Tyr Asp Ser 85 90 95 Arg Ala Ser Ala Leu His Ser Ala Lys Ala Leu Gln Ser Ala Val Ser 100 105 110 Thr Met Gln Gln Phe Tyr Gly Ile Pro Val Thr Gly Val Leu Asp Gln 115 120 125 Thr Thr Ile Glu Trp Met Lys Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp His 130 135 140 Pro His Leu Ser Arg Arg Arg Arg Asn Lys Arg Tyr Ala Leu Thr Gly 145 150 155 160 Gln Lys Trp Arg Gln Lys His Ile Thr Tyr Ser Ile His Asn Tyr Thr 165 170 175 Pro Lys Val Gly Glu Leu Asp Thr Arg Lys Ala Ile Arg Gln Ala Phe 180 185 190 Asp Val Trp Gln Lys Val Thr Pro Leu Thr Phe Glu Glu Val Pro Tyr 195 200 205 His Glu Ile Lys Ser Asp Arg Lys Glu Ala Asp Ile Met Ile Phe Phe 210 215 220 Ala Ser Gly Phe His Gly Asp Ser Ser Pro Phe Asp Gly Glu Gly Gly 225 230 235 240 Phe Leu Ala His Ala Tyr Phe Pro Gly Pro Gly Ile Gly Gly Asp Thr 245 250 255 His Phe Asp Ser Asp Glu Pro Trp Thr Leu Gly Asn Ala Asn His Asp 260 265 270 Gly Asn Asp Leu Phe Leu Val Ala Val His Glu Leu Gly His Ala Leu 275 280 285 Gly Leu Glu His Ser Ser Asp Pro Ser Ala Ile Met Ala Pro Phe Tyr 290 295 300 Gln Tyr Met Glu Thr His Asn Phe Lys Leu Pro Gln Asp Asp Leu Gln 305 310 315 320 Gly Ile Gln Lys Ile Tyr Gly Pro Pro Ala Glu Pro Leu Glu Pro Thr 325 330 335 Arg Pro Leu Pro Thr Leu Pro Val Arg Arg Ile His Ser Pro Ser Glu 340 345 350 Arg Lys His Glu Arg Gln Pro Arg Pro Pro Arg Pro Pro Leu Gly Asp 355 360 365 Arg Pro Ser Thr Pro Gly Thr Lys Pro Asn Ile Cys Asp Gly Asn Phe 370 375 380 Asn Thr Val Ala Leu Phe Arg Gly Glu Met Phe Val Phe Lys Asp Arg 385 390 395 400 Trp Phe Trp Arg Leu Arg Asn Asn Arg Val Gln Glu Gly Tyr Pro Met 405 410 415 Gln Ile Glu Gln Phe Trp Lys Gly Leu Pro Ala Arg Ile Asp Ala Ala 420 425 430 Tyr Glu Arg Ala Asp Gly Arg Phe Val Phe Phe Lys Gly Asp Lys Tyr 435 440 445 Trp Val Phe Lys Glu Val Thr Val Glu Pro Gly Tyr Pro His Ser Leu 450 455 460 Gly Glu Leu Gly Ser Cys Leu Pro Arg Glu Gly Ile Asp Thr Ala Leu 465 470 475 480 Arg Trp Glu Pro Val Gly Lys Thr Tyr Phe Phe Lys Gly Glu Arg Tyr 485 490 495 Trp Arg Tyr Ser Glu Glu Arg Arg Ala Thr Asp Pro Gly Tyr Pro Lys 500 505 510 Pro Ile Thr Val Trp Lys Gly Ile Pro Gln Ala Pro Gln Gly Ala Phe 515 520 525 Ile Ser Lys Glu Gly Tyr Tyr Thr Tyr Phe Tyr Lys Gly Arg Asp Tyr 530 535 540 Trp Lys Phe Asp Asn Gln Lys Leu Ser Val Glu Pro Gly Tyr Pro Arg 545 550 555 560 Asn Ile Leu Arg Asp Trp Met Gly Cys Asn Gln Lys Glu Val Glu Arg 565 570 575 Arg Lys Glu Arg Arg Leu Pro Gln Asp Asp Val Asp Ile Met Val Thr 580 585 590 Ile Asn Asp Val Pro Gly Ser Val Asn Ala Val Ala Val Val Ile Pro 595 600 605 Cys Ile Leu Ser Leu Cys Ile Leu Val Leu Val Tyr Thr Ile Phe Gln 610 615 620 Phe Lys Asn Lys Thr Gly Pro Gln Pro Val Thr Tyr Tyr Lys Arg Pro 625 630 635 640 Val Gln Glu Trp Val 645 <210> 2 <211> 1938 <212> DNA <213> Human <400> 2 atgccgagga gccggggcgg ccgcgccgcg ccggggccgc cgccgccgcc gccgccgccg 60 ggccaggccc cgcgctggag ccgctggcgg gtccctgggc ggctgctgct gctgctgctg 120 cccgcgctct gctgcctccc gggcgccgcg cgggcggcgg cggcggcggc gggggcaggg 180 aaccgggcag cggtggcggt ggcggtggcg cgggcggacg aggcggaggc gcccttcgcc 240 gggcagaact ggttaaagtc ctatggctat ctgcttccct atgactcacg ggcatctgcg 300 ctgcactcag cgaaggcctt gcagtcggca gtctccacta tgcagcagtt ttacgggatc 360 ccggtcaccg gtgtgttgga tcagacaacg atcgagtgga tgaagaaacc ccgatgtggt 420 gtccctgatc acccccactt aagccgtagg cggagaaaca agcgctatgc cctgactgga 480 cagaagtgga ggcaaaaaca catcacctac agcattcaca actatacccc aaaagtgggt 540 gagctagaca cgcggaaagc tattcgccag gctttcgatg tgtggcagaa ggtgacccca 600 ctgacctttg aagaggtgcc ataccatgag atcaaaagtg accggaagga ggcagacatc 660 atgatctttt ttgcttctgg tttccatggc gacagctccc catttgatgg agaaggggga 720 ttcctggccc atgcctactt ccctggccca gggattggag gagacaccca ctttgactcc 780 gatgagccat ggacgctagg aaatgccaac catgacggga acgacctctt cctggtggct 840 gtgcatgagc tgggccacgc gctgggactg gagcactcca gcgaccccag cgccatcatg 900 gcgcccttct accagtacat ggagacgcac aacttcaagc tgccccagga cgatctccag 960 ggcatccaga agatctatgg acccccagcc gagcctctgg agcccacaag gccactccct 1020 acactccccg tccgcaggat ccactcacca tcggagagga aacacgagcg ccagcccagg 1080 ccccctcggc cgcccctcgg ggaccggcca tccacaccag gcaccaaacc caacatctgt 1140 gacggcaact tcaacacagt ggccctcttc cggggcgaga tgtttgtctt taaggatcgc 1200 tggttctggc gtctgcgcaa taaccgagtg caggagggct accccatgca gatcgagcag 1260 ttctggaagg gcctgcctgc ccgcatcgac gcagcctatg aaagggccga tgggagattt 1320 gtcttcttca aaggtgacaa gtattgggtg tttaaggagg tgacggtgga gcctgggtac 1380 ccccacagcc tgggggagct gggcagctgt ttgccccgtg aaggcattga cacagctctg 1440 cgctgggaac ctgtgggcaa gacctacttt ttcaaaggcg agcggtactg gcgctacagc 1500 gaggagcggc gggccacgga ccctggctac cctaagccca tcaccgtgtg gaagggcatt 1560 ccacaggctc cccaaggagc cttcatcagc aaggaaggat attacaccta tttctacaag 1620 ggccgggact actggaagtt tgacaaccag aaactgagcg tggagccagg ctacccgcgc 1680 aacatcctgc gtgactggat gggctgcaac cagaaggagg tggagcggcg gaaggagcgg 1740 cggctgcccc aggacgacgt ggacatcatg gtgaccatca acgatgtgcc gggctccgtg 1800 aacgccgtgg ccgtggtcat cccctgcatc ctgtccctct gcatcctggt gctggtctac 1860 accatcttcc agttcaagaa caagacaggc cctcagcctg tcacctacta taagcggcca 1920 gtccaggaat gggtgtga 1938 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 3 ttcaacacag tggccctctt c 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 4 cccccaggct gtgggggta 19 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 5 atggctatct gcttccctat gacc 24 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 6 gcacccattc ctggactggc cgc 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 7 agtcctatgg ctatctgctt ccc 23 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 8 ccggaagagg gccactgtgt tg 22 <210> 9 <211> 2118 <212> DNA <213> Human <220> <221> CDS <222> (1)..(1935) <400> 9 atg ccg agg agc cgg ggc ggc cgc gcc gcg ccg ggg ccg ccg ccg ccg 48 Met Pro Arg Ser Arg Gly Gly Arg Ala Ala Pro Gly Pro Pro Pro Pro 1 5 10 15 ccg ccg ccg ccg ggc cag gcc ccg cgc tgg agc cgc tgg cgg gtc cct 96 Pro Pro Pro Pro Gly Gln Ala Pro Arg Trp Ser Arg Trp Arg Val Pro 20 25 30 ggg cgg ctg ctg ctg ctg ctg ctg ccc gcg ctc tgc tgc ctc ccg ggc 144 Gly Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Ala Leu Cys Cys Leu Pro Gly 35 40 45 gcc gcg cgg gcg gcg gcg gcg gcg gcg ggg gca ggg aac cgg gca gcg 192 Ala Ala Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Asn Arg Ala Ala 50 55 60 gtg gcg gtg gcg gtg gcg cgg gcg gac gag gcg gag gcg ccc ttc gcc 240 Val Ala Val Ala Val Ala Arg Ala Asp Glu Ala Glu Ala Pro Phe Ala 65 70 75 80 ggg cag aac tgg tta aag tcc tat ggc tat ctg ctt ccc tat gac tca 288 Gly Gln Asn Trp Leu Lys Ser Tyr Gly Tyr Leu Leu Pro Tyr Asp Ser 85 90 95 cgg gca tct gcg ctg cac tca gcg aag gcc ttg cag tcg gca gtc tcc 336 Arg Ala Ser Ala Leu His Ser Ala Lys Ala Leu Gln Ser Ala Val Ser 100 105 110 act atg cag cag ttt tac ggg atc ccg gtc acc ggt gtg ttg gat cag 384 Thr Met Gln Gln Phe Tyr Gly Ile Pro Val Thr Gly Val Leu Asp Gln 115 120 125 aca acg atc gag tgg atg aag aaa ccc cga tgt ggt gtc cct gat cac 432 Thr Thr Ile Glu Trp Met Lys Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp His 130 135 140 ccc cac tta agc cgt agg cgg aga aac aag cgc tat gcc ctg act gga 480 Pro His Leu Ser Arg Arg Arg Arg Asn Lys Arg Tyr Ala Leu Thr Gly 145 150 155 160 cag aag tgg agg caa aaa cac atc acc tac agc att cac aac tat acc 528 Gln Lys Trp Arg Gln Lys His Ile Thr Tyr Ser Ile His Asn Tyr Thr 165 170 175 cca aaa gtg ggt gag cta gac acg cgg aaa gct att cgc cag gct ttc 576 Pro Lys Val Gly Glu Leu Asp Thr Arg Lys Ala Ile Arg Gln Ala Phe 180 185 190 gat gtg tgg cag aag gtg acc cca ctg acc ttt gaa gag gtg cca tac 624 Asp Val Trp Gln Lys Val Thr Pro Leu Thr Phe Glu Glu Val Pro Tyr 195 200 205 cat gag atc aaa agt gac cgg aag gag gca gac atc atg atc ttt ttt 672 His Glu Ile Lys Ser Asp Arg Lys Glu Ala Asp Ile Met Ile Phe Phe 210 215 220 gct tct ggt ttc cat ggc gac agc tcc cca ttt gat gga gaa ggg gga 720 Ala Ser Gly Phe His Gly Asp Ser Ser Pro Phe Asp Gly Glu Gly Gly 225 230 235 240 ttc ctg gcc cat gcc tac ttc cct ggc cca ggg att gga gga gac acc 768 Phe Leu Ala His Ala Tyr Phe Pro Gly Pro Gly Ile Gly Gly Asp Thr 245 250 255 cac ttt gac tcc gat gag cca tgg acg cta gga aat gcc aac cat gac 816 His Phe Asp Ser Asp Glu Pro Trp Thr Leu Gly Asn Ala Asn His Asp 260 265 270 ggg aac gac ctc ttc ctg gtg gct gtg cat gag ctg ggc cac gcg ctg 864 Gly Asn Asp Leu Phe Leu Val Ala Val His Glu Leu Gly His Ala Leu 275 280 285 gga ctg gag cac tcc agc gac ccc agc gcc atc atg gcg ccc ttc tac 912 Gly Leu Glu His Ser Ser Asp Pro Ser Ala Ile Met Ala Pro Phe Tyr 290 295 300 cag tac atg gag acg cac aac ttc aag ctg ccc cag gac gat ctc cag 960 Gln Tyr Met Glu Thr His Asn Phe Lys Leu Pro Gln Asp Asp Leu Gln 305 310 315 320 ggc atc cag aag atc tat gga ccc cca gcc gag cct ctg gag ccc aca 1008 Gly Ile Gln Lys Ile Tyr Gly Pro Pro Ala Glu Pro Leu Glu Pro Thr 325 330 335 agg cca ctc cct aca ctc ccc gtc cgc agg atc cac tca cca tcg gag 1056 Arg Pro Leu Pro Thr Leu Pro Val Arg Arg Ile His Ser Pro Ser Glu 340 345 350 agg aaa cac gag cgc cag ccc agg ccc cct cgg ccg ccc ctc ggg gac 1104 Arg Lys His Glu Arg Gln Pro Arg Pro Pro Arg Pro Pro Leu Gly Asp 355 360 365 cgg cca tcc aca cca ggc acc aaa ccc aac atc tgt gac ggc aac ttc 1152 Arg Pro Ser Thr Pro Gly Thr Lys Pro Asn Ile Cys Asp Gly Asn Phe 370 375 380 aac aca gtg gcc ctc ttc cgg ggc gag atg ttt gtc ttt aag gat cgc 1200 Asn Thr Val Ala Leu Phe Arg Gly Glu Met Phe Val Phe Lys Asp Arg 385 390 395 400 tgg ttc tgg cgt ctg cgc aat aac cga gtg cag gag ggc tac ccc atg 1248 Trp Phe Trp Arg Leu Arg Asn Asn Arg Val Gln Glu Gly Tyr Pro Met 405 410 415 cag atc gag cag ttc tgg aag ggc ctg cct gcc cgc atc gac gca gcc 1296 Gln Ile Glu Gln Phe Trp Lys Gly Leu Pro Ala Arg Ile Asp Ala Ala 420 425 430 tat gaa agg gcc gat ggg aga ttt gtc ttc ttc aaa ggt gac aag tat 1344 Tyr Glu Arg Ala Asp Gly Arg Phe Val Phe Phe Lys Gly Asp Lys Tyr 435 440 445 tgg gtg ttt aag gag gtg acg gtg gag cct ggg tac ccc cac agc ctg 1392 Trp Val Phe Lys Glu Val Thr Val Glu Pro Gly Tyr Pro His Ser Leu 450 455 460 ggg gag ctg ggc agc tgt ttg ccc cgt gaa ggc att gac aca gct ctg 1440 Gly Glu Leu Gly Ser Cys Leu Pro Arg Glu Gly Ile Asp Thr Ala Leu 465 470 475 480 cgc tgg gaa cct gtg ggc aag acc tac ttt ttc aaa ggc gag cgg tac 1488 Arg Trp Glu Pro Val Gly Lys Thr Tyr Phe Phe Lys Gly Glu Arg Tyr 485 490 495 tgg cgc tac agc gag gag cgg cgg gcc acg gac cct ggc tac cct aag 1536 Trp Arg Tyr Ser Glu Glu Arg Arg Ala Thr Asp Pro Gly Tyr Pro Lys 500 505 510 ccc atc acc gtg tgg aag ggc att cca cag gct ccc caa gga gcc ttc 1584 Pro Ile Thr Val Trp Lys Gly Ile Pro Gln Ala Pro Gln Gly Ala Phe 515 520 525 atc agc aag gaa gga tat tac acc tat ttc tac aag ggc cgg gac tac 1632 Ile Ser Lys Glu Gly Tyr Tyr Thr Tyr Phe Tyr Lys Gly Arg Asp Tyr 530 535 540 tgg aag ttt gac aac cag aaa ctg agc gtg gag cca ggc tac ccg cgc 1680 Trp Lys Phe Asp Asn Gln Lys Leu Ser Val Glu Pro Gly Tyr Pro Arg 545 550 555 560 aac atc ctg cgt gac tgg atg ggc tgc aac cag aag gag gtg gag cgg 1728 Asn Ile Leu Arg Asp Trp Met Gly Cys Asn Gln Lys Glu Val Glu Arg 565 570 575 cgg aag gag cgg cgg ctg ccc cag gac gac gtg gac atc atg gtg acc 1776 Arg Lys Glu Arg Arg Leu Pro Gln Asp Asp Val Asp Ile Met Val Thr 580 585 590 atc aac gat gtg ccg ggc tcc gtg aac gcc gtg gcc gtg gtc atc ccc 1824 Ile Asn Asp Val Pro Gly Ser Val Asn Ala Val Ala Val Val Ile Pro 595 600 605 tgc atc ctg tcc ctc tgc atc ctg gtg ctg gtc tac acc atc ttc cag 1872 Cys Ile Leu Ser Leu Cys Ile Leu Val Leu Val Tyr Thr Ile Phe Gln 610 615 620 ttc aag aac aag aca ggc cct cag cct gtc acc tac tat aag cgg cca 1920 Phe Lys Asn Lys Thr Gly Pro Gln Pro Val Thr Tyr Tyr Lys Arg Pro 625 630 635 640 gtc cag gaa tgg gtg tgagcagccc agagccctct ctatccactt ggtctggcca 1975 Val Gln Glu Trp Val 645 gccaggccct tcctcaccag ggtctgaggg gcagctctgg ccagtgctca ccagggccag 2035 cagggctagg ctggggtcgt acagctgaag tggtgggtgc attggcctag gctgagcgtg 2095 gggcagggaa ttatgggggc tgt 2118 <210> 10 <211> 645 <212> PRT <213> Human <400> 10 Met Pro Arg Ser Arg Gly Gly Arg Ala Ala Pro Gly Pro Pro Pro Pro 1 5 10 15 Pro Pro Pro Pro Gly Gln Ala Pro Arg Trp Ser Arg Trp Arg Val Pro 20 25 30 Gly Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Ala Leu Cys Cys Leu Pro Gly 35 40 45 Ala Ala Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Asn Arg Ala Ala 50 55 60 Val Ala Val Ala Val Ala Arg Ala Asp Glu Ala Glu Ala Pro Phe Ala 65 70 75 80 Gly Gln Asn Trp Leu Lys Ser Tyr Gly Tyr Leu Leu Pro Tyr Asp Ser 85 90 95 Arg Ala Ser Ala Leu His Ser Ala Lys Ala Leu Gln Ser Ala Val Ser 100 105 110 Thr Met Gln Gln Phe Tyr Gly Ile Pro Val Thr Gly Val Leu Asp Gln 115 120 125 Thr Thr Ile Glu Trp Met Lys Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp His 130 135 140 Pro His Leu Ser Arg Arg Arg Arg Asn Lys Arg Tyr Ala Leu Thr Gly 145 150 155 160 Gln Lys Trp Arg Gln Lys His Ile Thr Tyr Ser Ile His Asn Tyr Thr 165 170 175 Pro Lys Val Gly Glu Leu Asp Thr Arg Lys Ala Ile Arg Gln Ala Phe 180 185 190 Asp Val Trp Gln Lys Val Thr Pro Leu Thr Phe Glu Glu Val Pro Tyr 195 200 205 His Glu Ile Lys Ser Asp Arg Lys Glu Ala Asp Ile Met Ile Phe Phe 210 215 220 Ala Ser Gly Phe His Gly Asp Ser Ser Pro Phe Asp Gly Glu Gly Gly 225 230 235 240 Phe Leu Ala His Ala Tyr Phe Pro Gly Pro Gly Ile Gly Gly Asp Thr 245 250 255 His Phe Asp Ser Asp Glu Pro Trp Thr Leu Gly Asn Ala Asn His Asp 260 265 270 Gly Asn Asp Leu Phe Leu Val Ala Val His Glu Leu Gly His Ala Leu 275 280 285 Gly Leu Glu His Ser Ser Asp Pro Ser Ala Ile Met Ala Pro Phe Tyr 290 295 300 Gln Tyr Met Glu Thr His Asn Phe Lys Leu Pro Gln Asp Asp Leu Gln 305 310 315 320 Gly Ile Gln Lys Ile Tyr Gly Pro Pro Ala Glu Pro Leu Glu Pro Thr 325 330 335 Arg Pro Leu Pro Thr Leu Pro Val Arg Arg Ile His Ser Pro Ser Glu 340 345 350 Arg Lys His Glu Arg Gln Pro Arg Pro Pro Arg Pro Pro Leu Gly Asp 355 360 365 Arg Pro Ser Thr Pro Gly Thr Lys Pro Asn Ile Cys Asp Gly Asn Phe 370 375 380 Asn Thr Val Ala Leu Phe Arg Gly Glu Met Phe Val Phe Lys Asp Arg 385 390 395 400 Trp Phe Trp Arg Leu Arg Asn Asn Arg Val Gln Glu Gly Tyr Pro Met 405 410 415 Gln Ile Glu Gln Phe Trp Lys Gly Leu Pro Ala Arg Ile Asp Ala Ala 420 425 430 Tyr Glu Arg Ala Asp Gly Arg Phe Val Phe Phe Lys Gly Asp Lys Tyr 435 440 445 Trp Val Phe Lys Glu Val Thr Val Glu Pro Gly Tyr Pro His Ser Leu 450 455 460 Gly Glu Leu Gly Ser Cys Leu Pro Arg Glu Gly Ile Asp Thr Ala Leu 465 470 475 480 Arg Trp Glu Pro Val Gly Lys Thr Tyr Phe Phe Lys Gly Glu Arg Tyr 485 490 495 Trp Arg Tyr Ser Glu Glu Arg Arg Ala Thr Asp Pro Gly Tyr Pro Lys 500 505 510 Pro Ile Thr Val Trp Lys Gly Ile Pro Gln Ala Pro Gln Gly Ala Phe 515 520 525 Ile Ser Lys Glu Gly Tyr Tyr Thr Tyr Phe Tyr Lys Gly Arg Asp Tyr 530 535 540 Trp Lys Phe Asp Asn Gln Lys Leu Ser Val Glu Pro Gly Tyr Pro Arg 545 550 555 560 Asn Ile Leu Arg Asp Trp Met Gly Cys Asn Gln Lys Glu Val Glu Arg 565 570 575 Arg Lys Glu Arg Arg Leu Pro Gln Asp Asp Val Asp Ile Met Val Thr 580 585 590 Ile Asn Asp Val Pro Gly Ser Val Asn Ala Val Ala Val Val Ile Pro 595 600 605 Cys Ile Leu Ser Leu Cys Ile Leu Val Leu Val Tyr Thr Ile Phe Gln 610 615 620 Phe Lys Asn Lys Thr Gly Pro Gln Pro Val Thr Tyr Tyr Lys Arg Pro 625 630 635 640 Val Gln Glu Trp Val 645
【図１】 ヒトMT5-MMP のドメイン構成図を示す。ま
た、ヒトMT5-MMP に特徴的な挿入(IS-1 、IS-2、膜貫通
および細胞内部位) を示してある。
た、ヒトMT5-MMP に特徴的な挿入(IS-1 、IS-2、膜貫通
および細胞内部位) を示してある。
【図２】 ヒトMT5-MMP と他のMT-MMPs のアミノ酸配列
の比較。ヒトMT-MMPs のアミノ酸配列はSwissProt デー
タベースよりとり出し、GCG パッケージのPILEUPプログ
ラムで解析した。５つのヒトMT-MMPs すべてに保存され
たアミノ酸残基には下線が付してある。
の比較。ヒトMT-MMPs のアミノ酸配列はSwissProt デー
タベースよりとり出し、GCG パッケージのPILEUPプログ
ラムで解析した。５つのヒトMT-MMPs すべてに保存され
たアミノ酸残基には下線が付してある。
【図３】 ヒトMT5-MMP の膜局在性を示す。COS-7 細胞
に導入したMT5-MMP-HAを抗HAモノクローナル抗体で蛍光
検出した。蛍光は共焦点レーザー顕微鏡で観察、COS-7
細胞の表面に局在することを確認した。
に導入したMT5-MMP-HAを抗HAモノクローナル抗体で蛍光
検出した。蛍光は共焦点レーザー顕微鏡で観察、COS-7
細胞の表面に局在することを確認した。
【図４】 組換えヒトMT5-MMP の解析の結果を示す。 Ａ）MT5-MMP-HAを導入したCOS-7 細胞のウエスタンブロ
ッティング。細胞全抽出物（レーン１）および細胞膜画
分（レーン３）に64kDa ヒトMT5-MMP が検出されたが、
可溶性画分（レーン２）には認められない。 Ｂ）ヒトMT5-MMP cDNAをin vitroで転写、翻訳を行い、
SDS-PAGE後、直接オートラジオグラフィーを行った。
ッティング。細胞全抽出物（レーン１）および細胞膜画
分（レーン３）に64kDa ヒトMT5-MMP が検出されたが、
可溶性画分（レーン２）には認められない。 Ｂ）ヒトMT5-MMP cDNAをin vitroで転写、翻訳を行い、
SDS-PAGE後、直接オートラジオグラフィーを行った。
【図５】 ヒトMT5-MMP 遺伝子の染色体マッピングの結
果を示す。ヒトMT5-MMP PAC クローンは、分裂中期の細
胞とハイブリダイズした。蛍光ハイブリダイゼーション
シグナルは、20番染色体長腕動原体性領域のq11.2 で検
出された。中期染色体は、DAPIでカウンター染色した。
果を示す。ヒトMT5-MMP PAC クローンは、分裂中期の細
胞とハイブリダイズした。蛍光ハイブリダイゼーション
シグナルは、20番染色体長腕動原体性領域のq11.2 で検
出された。中期染色体は、DAPIでカウンター染色した。
【図６】 大腸菌で産生したGST-MT5-MMP のSDS-PAGEと
プロゼラチナーゼA の活性化の結果を示す。 Ａ）pGEX-3X-MT5 で形質転換した大腸菌の抽出物5 μL
をSDS-PAGEに供した。レーン１；誘導前、レーン２；IP
TG誘導後、レーン３；精製したGST-MT5-MMP を添加し
た。組換えタンパク質は矢印で示した。分子量マーカー
を左側に付記した。Ｂ）MT5-MMP によるプロゼラチナー
ゼA の活性化をゼラチンザイモグラフィーで示した。HT
1080細胞の培養上清（レーン１）、組換えGST-MT5-MMP
とHT1080細胞の培養上清を反応させたもの（レーン２）
およびEDTA存在下で反応させたもの（レーン３）を添加
した。
プロゼラチナーゼA の活性化の結果を示す。 Ａ）pGEX-3X-MT5 で形質転換した大腸菌の抽出物5 μL
をSDS-PAGEに供した。レーン１；誘導前、レーン２；IP
TG誘導後、レーン３；精製したGST-MT5-MMP を添加し
た。組換えタンパク質は矢印で示した。分子量マーカー
を左側に付記した。Ｂ）MT5-MMP によるプロゼラチナー
ゼA の活性化をゼラチンザイモグラフィーで示した。HT
1080細胞の培養上清（レーン１）、組換えGST-MT5-MMP
とHT1080細胞の培養上清を反応させたもの（レーン２）
およびEDTA存在下で反応させたもの（レーン３）を添加
した。
【図７】 ノーザンブロットによるヒト組織のMT5-MMP
発現の解析結果を示す。示した組織から抽出したおよそ
２μg のポリA 付加RNA は、ヒトMT5-MMP の全長cDNAと
ハイブリダイズした。RNA のサイズマーカーを付記し
た。フィルターは、サンプル間の RNA量の差を見積もる
ためにアクチンプローブとハイブリダイズした。
発現の解析結果を示す。示した組織から抽出したおよそ
２μg のポリA 付加RNA は、ヒトMT5-MMP の全長cDNAと
ハイブリダイズした。RNA のサイズマーカーを付記し
た。フィルターは、サンプル間の RNA量の差を見積もる
ためにアクチンプローブとハイブリダイズした。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 21/04 Ａ６１Ｋ 31/00 ６２１Ｄ ４Ｃ０８４ 25/00 ６２５ ４Ｃ０８５ 25/28 ６２６Ｎ ４Ｃ０８６ 35/00 ６３５ ４Ｈ０４５ 35/04 ６３５Ｂ 43/00 ６４３Ｄ Ａ６１Ｋ 31/711 31/70 ６２５ 38/46 39/395 Ｄ 39/395 Ｐ 45/00 45/00 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 9/50 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9/50 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/573 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/573 Ａ６１Ｋ 37/54 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 アルベルト・エム・ペンダス スペイン国 33004 オビエード セルバ ンテス 25 ７−Ｄ (72)発明者 ホセ・ピー・フレイヘ スペイン国 33008 オビエード バホ プラド ピシオン 12 (72)発明者 青木 隆則 富山県高岡市長慶寺530番地 富士薬品工 業株式会社内 (72)発明者 品川 朗 富山県高岡市長慶寺530番地 富士薬品工 業株式会社内 (72)発明者 岩田 和士 富山県高岡市長慶寺530番地 富士薬品工 業株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA12 BA14 BA43 CA04 DA02 DA06 EA04 GA05 GA11 HA14 HA15 4B050 CC03 DD07 FF09E LL03 4B063 QA01 QQ08 QQ44 QR56 QS25 QS34 QX07 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA14 4B065 AA26X AA90X AA92X AA93Y AB01 AB05 AC10 BA02 CA33 CA46 4C084 AA01 AA07 AA13 AA17 BA01 BA22 BA44 CA53 DA39 DC02 MA13 MA17 MA22 MA23 MA28 MA31 MA32 MA35 MA37 MA38 MA44 MA52 MA56 MA57 MA58 MA59 MA60 MA63 MA66 MA67 ZC192 ZC202 4C085 AA14 BB22 DD62 DD63 GG02 GG03 GG04 GG06 GG08 GG10 4C086 AA01 AA03 EA16 ZC19 ZC20 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA45 DA76 EA51 FA72
Claims (17)
- 【請求項１】 プロゼラチナーゼ A活性化能を有するヒ
ト膜結合型メタロプロテアーゼの一種であり且つMT1-MM
P, MT2-MMP, MT3-MMP, MT4-MMP以外のプロゼラチナーゼ
A活性化因子である天然のヒト膜結合型タンパク質若し
くは該ヒト膜結合型タンパク質のアミノ酸配列と少なく
とも64％の相同性を有し且つマトリックスメタロプロテ
アーゼ活性、プロゼラチナーゼ A活性化能あるいは同等
の抗原性を有するものであることを特徴とする新規ヒト
膜結合型タンパク質またはその塩。 - 【請求項２】 配列表の配列番号:1で表されるアミノ酸
配列のうち、第156番目〜第327 番目のアミノ酸配列を
有するもの、同第1 番目〜第327 番目のアミノ酸配列を
有するもの、同第156 番目〜第569 番目のアミノ酸配列
を有するもの、同第１番目〜第569 番目のアミノ酸配列
を有するもの、第156 番目〜第645 番目のアミノ酸配列
を有するもの、同第１番目〜第645 番目のアミノ酸配列
を有するもの、及びそれらのいずれか一つと実質的に同
等のアミノ酸配列を有するものからなる群から選ばれた
アミノ酸配列を少なくとも一つ含有するタンパク質であ
ることを特徴とするタンパク質またはその塩。 - 【請求項３】 請求項１または２記載のタンパク質の部
分ペプチドまたはその塩。 - 【請求項４】 請求項１または２記載のタンパク質又は
その部分ペプチドをコードする塩基配列を有することを
特徴とする核酸。 - 【請求項５】 配列表の配列番号:2又は9 で表される塩
基配列のうち、オープンリーディングフレーム部分また
はそれと実質的に同等な塩基配列を有することを特徴と
する請求項４記載の核酸。 - 【請求項６】 請求項４または５記載の核酸を含有する
ことを特徴とするベクター。 - 【請求項７】 請求項４または５記載の核酸あるいは請
求項６記載のベクターを含有することを特徴とする形質
転換体。 - 【請求項８】 宿主細胞が大腸菌、酵母、CHO 細胞およ
びCOS 細胞からなる群から選ばれたものであることを特
徴とする請求項７記載の形質転換体。 - 【請求項９】 請求項８記載の形質転換体によって発現
させて得たものであることを特徴とする請求項１または
２記載のタンパク質。 - 【請求項１０】 次のものに対する抗体： (i) 請求項１記載のタンパク質またはその塩、(ii)
請求項２記載のタンパク質またはその塩、あるいは(ii
i) 請求項３記載のその部分ペプチドまたはその塩。 - 【請求項１１】 請求項１または２記載のタンパク質ま
たはその塩と特異的に免疫反応する抗体を測定試薬とし
て用いることを特徴とする請求項１または２記載のタン
パク質またはその塩の免疫学的測定方法。 - 【請求項１２】 請求項１または２記載のタンパク質ま
たはその塩と特異的に免疫反応する抗体を含むことを特
徴とする請求項１または２記載のタンパク質またはその
塩の免疫学的測定試薬。 - 【請求項１３】 請求項１または２記載のタンパク質又
はその部分ペプチドをコードする塩基配列を有すること
を特徴とする、プロゼラチナーゼ A活性化能を有するヒ
ト膜結合型メタロプロテアーゼの一種であり且つMT1-MM
P, MT2-MMP,MT3-MMP, MT4-MMP以外のプロゼラチナーゼ
A活性化因子であるヒト膜結合型タンパク質遺伝子に対
するハイブリダイゼーションプローブ。 - 【請求項１４】 配列表の配列番号:2又は9 で表される
塩基配列の全部又はその一部を含むことを特徴とする、
プロゼラチナーゼ A活性化能を有するヒト膜結合型メタ
ロプロテアーゼの一種であり且つMT1-MMP, MT2-MMP, MT
3-MMP, MT4-MMP以外のプロゼラチナーゼ A活性化因子で
あるヒト膜結合型タンパク質遺伝子に対するハイブリダ
イゼーションプローブ。 - 【請求項１５】 請求項１〜３のいずれか一記載のタン
パク質、その一部のペプチドまたはそれらの塩；あるい
は請求項４または５記載の核酸；あるいは請求項１０記
載の抗体を含有していることを特徴とする医薬。 - 【請求項１６】 請求項１〜３のいずれか一記載のタン
パク質、その一部のペプチドまたはそれらの塩の生物学
的活性を促進または阻害する化合物またはその塩を含有
していることを特徴とする医薬。 - 【請求項１７】 請求項１〜３のいずれか一記載のタン
パク質、その一部のペプチドまたはそれらの塩の生物学
的活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方
法およびスクリーニングキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11082516A JP2000270874A (ja) | 1999-03-25 | 1999-03-25 | 新規な膜結合型メタロプロテアーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11082516A JP2000270874A (ja) | 1999-03-25 | 1999-03-25 | 新規な膜結合型メタロプロテアーゼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000270874A true JP2000270874A (ja) | 2000-10-03 |
Family
ID=13776708
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11082516A Pending JP2000270874A (ja) | 1999-03-25 | 1999-03-25 | 新規な膜結合型メタロプロテアーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000270874A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004089419A1 (ja) | 2003-04-04 | 2004-10-21 | The University Of Tokyo | 抗ｍｔ－ｍｍｐモノクローナル抗体含有脂質膜構造体 |
| US6906036B2 (en) | 2001-08-16 | 2005-06-14 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-aging and wound healing compounds |
| US7071164B2 (en) | 2001-08-16 | 2006-07-04 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-cancer and wound healing compounds |
| US7094754B2 (en) | 2001-08-16 | 2006-08-22 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-aging and wound healing compounds |
| US7148194B2 (en) | 2002-12-30 | 2006-12-12 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Method to increase fibronectin |
| US7186693B2 (en) | 2001-08-16 | 2007-03-06 | Kimberly - Clark Worldwide, Inc. | Metalloproteinase inhibitors for wound healing |
| US7189700B2 (en) | 2003-06-20 | 2007-03-13 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-chrondrosarcoma compounds |
-
1999
- 1999-03-25 JP JP11082516A patent/JP2000270874A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6906036B2 (en) | 2001-08-16 | 2005-06-14 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-aging and wound healing compounds |
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| US7094754B2 (en) | 2001-08-16 | 2006-08-22 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-aging and wound healing compounds |
| US7186693B2 (en) | 2001-08-16 | 2007-03-06 | Kimberly - Clark Worldwide, Inc. | Metalloproteinase inhibitors for wound healing |
| US7196162B2 (en) | 2001-08-16 | 2007-03-27 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-aging and wound healing compounds |
| US7148194B2 (en) | 2002-12-30 | 2006-12-12 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Method to increase fibronectin |
| WO2004089419A1 (ja) | 2003-04-04 | 2004-10-21 | The University Of Tokyo | 抗ｍｔ－ｍｍｐモノクローナル抗体含有脂質膜構造体 |
| US7189700B2 (en) | 2003-06-20 | 2007-03-13 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-chrondrosarcoma compounds |
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