JP4488140B2 - セリンプロテアーゼであるコリン - Google Patents
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Description
本発明は、1998年6月5日に出願されたアメリカ特許明細書第09092029号の一部継続出願であり、ここで参照することによりその全文を組み込んだものとする。
【0002】
発明の背景
セリンプロテアーゼは、発生学および生理学の様々なプロセスに関与している(Stroud R. Sci. Am. 231:74〜88, 1974:Neurath H. Science 224:350〜357, 1984)。例えば、セリンプロテアーゼは細胞シグナル、細胞分化およびプロホルモンの生物学的活性体への変換に必須である。HongおよびHashimoto, Cell, 82:785〜794, 1995:Inagami, J. Biol. Chem. 264:3043〜3046, 1989参照。
【0003】
発明の概要
本発明は、新規遺伝子、例えばセリンプロテアーゼ、特に、1個以上の縮れ(frizzled)LDLR、スカベンジャー受容体のシステインーリッチな反復およびセリンプロテアーゼ触媒ドメインを有する、ヒトおよびマウスコリンのような、ほ乳類のセリンプロテアーゼの核酸、ポリペプチドおよびその断片に関する。本発明は、さらに、このような核酸およびポリペプチドを、治療薬、診断薬および検査薬に使用する方法にも関する。例えば、コリンの核酸およびポリペプチドは、その活性のモジュレーターを同定する方法に、またヒトの疾患に類似した動物モデルに、さらに病状の診断に使用することができる。
【0004】
発明の詳細な説明
膜貫通/シグナルペプチド、縮れドメイン、低密度リポタンパク質受容体反復(LDLR)、スカベンジャー受容体のシステインリッチな反復(SRCR)およびセリンプロテアーゼ触媒ドメインを有する新規の遺伝子であり、コリンをコードしている核酸およびポリヌクレオチド配列が同定された。図1参照。
【0005】
本発明において、コリンポリペプチドは、コリンに特異的な免疫原性を有するか、または天然起源のものから獲得できるアミノ酸配列を有しており、以下の活性またはドメインを1個以上有する:セリンプロテアーゼ触媒活性;セリンプロテアーゼ触媒活性ドメイン;セリンプロテアーゼ結合基質活性;プロ−心房性ナトリウム利尿因子(ANF)変換酵素触媒活性;縮れドメイン;LDLR受容体ドメイン;およびスカベンジャー受容体のシステイン−リッチな反復(SRCR)。
【0006】
有利には、ユニジーンデータベース(Unigene database [PubEST])由来の以下の核酸断片でコードされたポリペプチド断片を除外する:Hs.62794(AA126468[1786098]、AA126648[1686206]、AA625395[2537780]、AA046682[1524579]、AA249850[1881137]、およびAA046793[1524691])、およびHs.71798(AA147031[1716421])(括弧内の番号はPubESTデータベースに合致する)。場合により、以下の断片をも除外してよい:Hs.121626(AA771958)、Hs.1657(M69297)、およびHs.47712(AA203291)、g1231787;g1312726;g1337948;およびg942724。前記核酸のヌクレオチド配列を、公的に入手可能なデータベースを検索することによって割り出すことができる。しかし、例えば全長コリン、前記断片を2個以上有するポリペプチド、または前記断片の1個に加えコリンまたはその他を起源とするアミノ酸配列を有するポリペプチドの配列を含有するポリペプチド、またはこのような配列から成るポリペプチドは除外しない。
【0007】
“コリンに特異的な免疫原性”という語は、コリンポリペプチドがコリンに選択的な免疫応答を誘起することを意味している。このような応答は、細胞性または体液性であり得る。従って、配列番号2および4記載のヒトまたはマウスコリンのような、ほ乳類コリンペプチドから選択されたコリンアミノ酸配列による、抗体、T−細胞、マクロファージ、B−細胞、樹状細胞などの刺激作用が、特異的な免疫原性である。このような応答を一般的な方法で測定できる。コリンに特異的な抗体に関して、以下の議論も参照されたい。
【0008】
セリンプロテアーゼ触媒活性とは、例えば、コリンポリペプチドがポリペプチド切断活性を有することを意味し、有利には、例えばペプチド結合の切断活性、例えばコリンのセリン残基がペプチド結合の切断に関与する場合を意味する。Stroud, Sci. Am., 231:74〜88 1974:Kraut, Ann. Rev. Biochem., 46:331〜358 1977を参照のこと。配列番号2または4に記載される全コリンポリペプチド配列またはその一部は、セリンプロテアーゼ触媒活性を有する。配列番号2の801番目のアミノ酸の後ろでの切断(アルギニンとイソロイシンの間のペプチド結合を切断)は、このような触媒活性を増大または強化し、その結果、実質的に802〜1042番目のアミノ酸を含有する触媒断片または該アミノ酸から成る触媒断片が放出される。
【0009】
“セリンプロテアーゼ触媒活性ドメイン”とは、前記のようなセリンプロテアーゼ触媒活性能力を有するポリペプチド領域を意味するが、必ずしも完全体は必要でなく、場合によってはバックグラウンド中に活性が存在することもある。例えば、トリプシンファミリーのものは、多くの場合、ポリペプチドの特異的部位で切断されることで初めて完全な活性を示すプロ酵素として、最初に発現される。切断により、タンパク分解された断片が放出される。一般的に、“放出された断片”は、タンパク質の残り部分でジスルフィド結合によって好適な位置に保持される。ジスルフィド結合を形成できるシステインに関しては、配列番号2を参照されたい。セリンプロテアーゼ触媒ドメインとは、完全なコリン配列から放出される前のタンパク分解性の断片を意味する。
【0010】
“プロ−心房性ナトリウム利尿因子(ANF)変換酵素触媒活性”とは、例えばプロ−ANFがタンパク質分解により1個以上のより小さなペプチドに変換されるような触媒活性を意味する。Inagami. J. Biol. Chem., 264:3043〜3046 1989:RosenzweigおよびSeidman, Ann. Rev. Biochem., 60:229〜255 1991;Silkins等,Lancet, 349:1307〜1310 1997を参照のこと。ANF(ANPとも呼ばれる)は、例えば体液のホメオスタシス、血圧、血漿体積、ならびに心臓および腎臓の機能に関連する生理学的プロセスを制御する、心臓のホルモンである。変換活性のための別の基質には、ANFと同種の同族体またはタンパク質、例えばBNPおよびCNPが含まれる。Wilkins等, Lancet. 349:1307〜1310 1997;Levin等, New Eng. J. Med.,339:321〜328 1998を参照のこと。変換活性は、慣用の方法、例えば実施例に記載されるように、コリンまたはコリンの生物学的に活性な断片を処理する前後における、プロ−ANFの分子量の違いを検出してアッセイすることにより、測定できる。コリンが細胞表面に発現することから、インタクトな細胞、例えばプロ−ANFをプロセス基質として使用することができる。
【0011】
リガンドとして機能する基質が最初に酵素表面に結合して酵素の触媒反応を誘起するので、基質の結合は一般的に、酵素触媒作用の第一段階と見なされる。酵素表面は、酵素の活性部位と考えられる。基質の酵素表面への結合には、酵素による様々な相互作用、例えば酵素を構成する1個以上のアミノ酸および/または官能基の化学結合が含まれる。ここに記載されるセリンプロテアーゼ基質結合活性とは、例えば(H−D−Pro−Phe−Arg−pNA.2HCl)、S2444(pyroGlu−Gly−Arg−pNA.HCl)およびS2288(H−D−Ile−Pro−Arg−pNA.2HCl)のような各基質またはプロ−ANFが、特にコリンポリペプチドの表面に結合することを意味する。酵素への結合は、それが保持する基質との、自然発生的な1個以上の相互作用によって達成される;しかし、ポリペプチドは自然発生的な相互作用の数および量を下回る基質を保持する場合にも、基質結合活性を有することができる。場合によりセリンプロテアーゼ基質結合活性は、基質の触媒作用の獲得に、活性部位への競合的または非競合的な結合に、酵素への不可逆的な結合に、結果的な触媒活性の消失(例えば自己不活化性の基質である場合)等に有効である。
【0012】
セリンプロテアーゼ基質結合活性を慣用の方法で測定できる。例えば、競合結合アッセイを使用して、例えば有効条件下に、検出可能なマーカーを有する基質、ヒトコリンポリペプチドまたはその断片、および基質結合活性を試験する化合物を結合させることにより、ポリペプチドに結合する基質またはその誘導体を同定できる。アッセイは、結合体と遊離基質とを膜によって分離できる液相中で、あるいは所望の固相中で実施してよい。固相アッセイを、例えばチップ、小板等の上で、高−処理能法により実施してよい。基質結合および触媒活性は別個のものである。従って、コリンポリペプチドは基質結合活性を有するが、触媒活性は有さない。
【0013】
コリンポリペプチドはまた、Wnt結合活性を有する“縮れ−様システインリッチドメイン”(ここでは“縮れドメイン”の表現も使用する)も包括する。縮れドメインは、例えばZorn, Current Biology 7:R501〜R504, 1997に定義および記載される、リガンド結合活性または領域を有する。例えば、縮れたドメインは、Wntに相同なリガンドの受容体および細胞増殖や細胞シグナルに関する他の分泌型糖タンパク質の受容体として機能できる。これは膜結合しても溶解性でもよい。溶解性の形であれば、例えばコリンの遊離縮れドメインが遊離リガンドと結合することによって、細胞表面上にある同種受容体との相互作用が回避される場合に、拮抗薬としても機能する。
【0014】
LDLR反復には、図7記載のヒトLDLR共通配列が含まれ、場合によりリガンド結合活性を有する。
【0015】
コリンポリペプチドはまた、スカベンジャー受容体システインリッチドメイン(“SRCR”)を含む。Matsumoto等, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9133〜9137 1990参照のこと。
【0016】
ほ乳類コリンは、天然源から得られるアミノ酸配列および前記活性を有するほ乳類ポリペプチドである。これは全長(すなわち、配列番号2)であるか、全長よりも短くてもよく、前記の活性を1個以上有する。従って、天然に産出する正常体、突然変異体、多形体等の配列が含まれる。天然源には、例えば組織または有機体全体から獲得される生細胞、本来のおよび不死化した細胞系を含む培養細胞系、生検組織等が含まれる。
【0017】
本発明はまた、ヒトまたはマウスコリンのような全長ほ乳類コリンの断片に関する。断片は有利に“生物学的に活性”である。“生物学的に活性”とは、ポリペプチド断片が、生物系または生物系の成分中で活性であることを意味する。生物学的な活性には、前記の例えば触媒活性、基質結合活性および/または免疫原性が含まれる。断片は、化学合成、遺伝子操作、切断生成物等、所望の任意の方法により製造できる。以下を参照のこと。
【0018】
本発明はまた、配列番号2の1〜1042番目のアミノ酸から推定される配列を有するヒトコリンに関する。1042個のアミノ酸ポリペプチドは、分子量が約116キロダルトンであると予測された。これは以下のようなドメインを有する:ほぼ46〜66番目のアミノ酸にあたる疎水性領域;ほぼ134〜259番目および450〜573番目のアミノ酸にあたる縮れシステインリッチドメイン;ほぼ268〜415番目および579〜690番目のアミノ酸にあたる7個のLDLR受容体;ほぼ713〜801番目のアミノ酸にあたるマクロファージスカベンジャー受容体の形態に類似したシステインリッチな領域;およびほぼ802〜1042番目のアミノ酸にあたるセリンプロテアーゼ触媒ドメイン。ほぼ7〜1042番目のアミノ酸にあたる細胞外ドメイン中に、N−グリコシル化部位と思われる部位が19個存在する。
【0019】
本発明の、例えば配列番号2または配列番号4記載のアミノ酸配列を有するコリンポリペプチドを適当な方法で分析することにより、ポリペプチド中の別の構造および/または機能ドメインを同定できる。例えばコリンポリペプチドを、KyteおよびDoolittle, J. Mol. Bio., 157:105,1982:EMBL Protein Predict; RostおよびSander. Peoteins, 19:55〜72,1994に記載される方法で分析できる。
【0020】
ヒトコリンのほぼ46〜66番目のアミノ酸にあたる疎水性ドメインは、膜固定配列として機能できる。ヘプシン、アミノ末端近くに膜貫通ドメインを有するトリプシンファミリーのほ乳類セリンプロテアーゼも同様である(kurachi等, Method in Enzymology 244:100〜114, 1994);キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)のセリンプロテアーゼである、スタブルスタブロイド(stubble- stubbloid)も、膜貫通ドメインを有している(Appel等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4937〜4941 1993)。疎水性および前記膜貫通ドメインの直前にプラスに荷電したアミノ酸残基が存在することは、コリンが、細胞質中にアミノ末端を有するII型膜貫通タンパク質であってよいことを示している。
【0021】
コリンはまた、ほぼ134〜259および450〜573番目のアミノ酸にあたる少なくとも2個のシステイン−リッチな縮れドメインを有する。図2は、ヒトコリン縮れドメインと、FZ−1、lin−17およびFrizzledとの比較を示している。縮れドメインには、例えばリガンド結合部位が含まれる。Zorn, Current Biology, 7:R501〜R504, 1997;Leyns等, Cell. 88:747〜756, 1997を参照のこと。以下に示すように、本発明の対象は、コリン縮れドメインに結合し、場合によりコリンポリペプチドを発現する細胞またはリガンドの発現する細胞の活性を制御するリガンドを同定することである。
【0022】
コリンタンパク質配列の分析から、細胞外領域には、2個の縮れ−様システイン−リッチドメイン、7個のLDL受容体、1個のマクロファージスカベンジャー受容体−様ドメイン、および1個のトリプシン−様セリンプロテアーゼドメイン(2A)が存在することが判明した。2個の縮れ−様システイン−リッチドメインはそれぞれ、134〜259番目および450〜573番目のアミノ酸に位置する。これらの2個のドメインのアミノ酸配列は、ショウジョウバエの分化において、極性の決定に不可欠な7回膜貫通型受容体である、ショウジョウバエのFrizzledタンパク質の細胞外システイン−リッチドメインと酷似している(19)。縮れ−様システイン−リッチドメインはまた、他のタンパク質、例えばショウジョウバエのDfz2(20)、線虫のLin−17(21)およびヒトのFZ−1(22)中にも見出される。コリンの2個の縮れ−様システイン−リッチドメイン配列は、lin−17およびFZ−1と最も近似している。保存された10個全てのシステイン残基が、コリンの縮れ−様システイン−リッチドメインに存在する。
【0023】
268〜415番目および579〜690番目のアミノ酸の間には、LDL受容体クラスA反復と相同な、7個のシステイン−リッチ反復が存在する(23)。それぞれの反復は約36アミノ酸長さであり、6個のシステイン残基ならびにマイナスに帯電したアミノ酸を多く保存した部分を有する。LDL受容体において、これらのシステイン−リッチ反復は、カルシウムイオンと結合し、細胞外リガンドのエンドサイトーシスに非常に重要な役割を果たす。同様の形態は、LDL受容体−関連タンパク質(LRP1)(24)、メガリン(LRP2またはgp330としても公知)(25)、補体タンパク質(26)、エンテロキナーゼ(27)、およびショウジョウバエタンパク質のヨークレス(yolkless)およびヌーデル(nudel)(28、29)のような他の膜受容体の細胞外ドメインにも認められる。
【0024】
縮れ−様システイン−リッチドメインおよびLDL受容体−様反復に加え、コリンの713〜801番目のアミノ酸中に別のシステイン−リッチな領域が存在する。この領域はアミノ酸を88個有しており、マクロファージスカベンジャー受容体で見出されたシステイン−リッチな形態と相同である(30)。この形態はまた、ウニの精子スペラクト(spematozoa speract)受容体(31、32)および脊椎動物のセリンプロテアーゼであるエンテロキナーゼ(27)中にも存在する。
【0025】
コリンタンパク質のカルボキシル末端において、802〜1042番目のアミノ酸残基の間に、トリプシン−様セリンプロテアーゼドメインが存在する。このプロテアーゼドメインはトリプシンスーパーファミリーの有する触媒ドメインと高い相同性を示す。例えば、コリンとプレカリクレイン(33)、因子XI(34)およびヘプシン(35)とのアミノ酸配列の相同性は、それぞれ40%、40%、および38%である。セリンプロテアーゼ配列に必要な全ての特徴がコリンには良好に保存されている。触媒トライアドの活性部位残基は、His843,Asp892およびSer985に位置する。基質特異的なポケットを形成するアミノ酸残基は、Asp979、Gly1007およびGly1018に位置する。これらの残基は基質P1残基へ結合すると考えられ、このことはコリンが塩基性残基、例えばリシンまたはアルギニン、の後ろでその基質を切断することを示唆している。さらに、推定される活性化のための切断部位がArg801に見出されることから、コリンが不活性酵素原として合成され、その活性には別のトリプシン−様酵素を要することが示唆される。
【0026】
プロテアーゼドメインには、12個のシステイン残基が存在する。これらのシステイン残基の可能な対合を、別の公知のセリンプロテアーゼ、例えばトリプシンおよびキモトリプシンとの比較から予測してよい。トリプシンスーパーファミリーのいずれにも不可欠に存在するシステイン残基の最初の3個の対合は、Cys828−Cys844、Cys955−Cys970およびCys981−Cys1010に位置する。さらに2個のシステイン残基対が、Cys790−Cys912およびCys926−Cys991の位置に存在する。システイン残基のこれら2個の対合は、二本鎖セリンプロテアーゼのサブファミリー、例えばキモトリプシンおよびプレカリクレイン(33)中で通常見出されるものである。Cys790およびCys912の存在により、Argで切断されて活性化した後に、コリンの触媒ドメインが、ジスルフィド結合により分子の残り部分に結合したままであることが判明した。興味深いことに、1個の付加的なシステイン残基対、すなわちCys817およびCys830がコリンに存在する。2つの位置に存在するこれらのシステイン残基は、脊椎動物の他の任意のセリンプロテアーゼ中には見当たらない。データベースを検索すると、ゴカイ(Arenicola marina)由来のキモトリプシノーゲン−様セリンプロテアーゼが相当の位置に2個のシステイン残基を有することが判明した(36)。コリンプロテアーゼドメインのモデルは、牛のキモトリプシノーゲンAに基づいて設計されている。2個のシステイン残基のCα原子が、エネルギー最小化の間固定されているこのコリンモデルでは、回転異性体を調査しても、側鎖の硫黄原子間の距離は約2.5Åである。このモデルは、この2個のシステインが、プロテアーゼドメインの中心部で、2つのb−シートを連結させるジスルフィド結合を形成するであろうことを示している。
【0027】
ヒトコリン配列に加え、マウスのような別のほ乳類種からもコリンをクローン化し、同定した。マウスコリンの全長ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、配列番号3および4に示す。マウスコリンには1113個のアミノ酸が存在し、ヒトコリンと同じドメインを含有する。マウスとヒトのコリンでは、アミノ酸配列の89%が一致している。
【0028】
ほ乳類および非ほ乳類に由来するコリンの別のホモログを、様々な方法で獲得できる。例えば、ほ乳類コリンに選択的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを実施して、そのようなホモログを選択でき、このことは例えばSambrook等, Molecular Cloning, 1989, 11章に記載されている。このようなホモログは、様々なヌクレオチド量およびアミノ酸配列を有するが、コリンに類似している。非ほ乳類生物には、例えば脊椎動物、無脊椎動物、ゼブラダニオ(zebra fish)、鶏、ショウジョウバエ、線虫、ツメガエル、サッカロマイセス ポンベ(pombe)、サッカロマイセス セレビシエ、回虫、原核生物、植物、ナズナ(arabidopsis)、ウイルス等が含まれる。
【0029】
本発明はまた、コリン特異的なアミノ酸配列、例えば配列番号2および4に記載されるような、特にヒトまたはマウス配列中に見出されるが、非コリンペプチドに由来する別のアミノ酸配列中には見出されない、限定されたアミノ酸配列に関する。特異的なアミノ酸配列は、通常、例えばコンピュータープログラムのBLASTセットを使用して遺伝子/タンパク質データベースを検索することによって見出すことができる。コリンに特異的なアミノ酸配列は、特異的に免疫応答を確立する抗原ペプチドの産生に有効である。このような免疫化により得られた抗体は、診断または検査の目的で、ほ乳類コリンタンパク質の特異的なプローブとして使用できる。
【0030】
前記のように、本発明のポリペプチドは、コリンの完全なコード配列またはその断片を含有してよい。有益な断片には、例えば、縮れドメイン、1個以上のLDLRドメイン、SRCR反復、膜貫通ドメイン、セリン触媒ドメインまたは断片を有する断片あるいは実質的にこれらから成る断片が含まれる。ヒトコリンの有利な断片は、配列番号2のポリペプチド配列を含み、ただしこの断片は、Hs.62794(AA126468[1686098]、AA126648[1686206]、AA625395[2537780]、AA046682[1524579]、AA249850[1881137]、およびAA046793[1524691])、およびHs.71798(AA147031[1716421])でコードされたポリペプチドではない。前記参照のこと。
【0031】
コリンペプチドの断片を、特異的な生物学的活性を有するように選択でき、特異的な生物学的活性とは例えば、セリンプロテアーゼ活性、プロ−ANF変換酵素活性、基質結合活性、免疫原性等である。一般的に、このような断片を所望の活性に関して試験することにより、有効な断片を同定できる。これらの活性の測定については、以下に、および実施例に記載する。これらのペプチドを、EP496162の記載に従って、同定および製造することもできる。
【0032】
本発明のポリペプチドは、配列番号2または4記載のアミノ酸配列と100%またはそれを下回るアミノ酸の同一性を有する。以下の議論において、配列の同一性とは、配列番号1〜4に記載の配列に見出されるのと同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が、比較配列の相当の位置にも存在することである。配列番号2または配列番号4記載のアミノ酸配列に100%を下回る配列の同一性を有するポリペプチドは、天然に産出する配列に由来した様々な置換基を含んでいてよく、これには相同のおよび非相同のアミノ酸置換基が含まれる。相同のアミノ酸置換基の例については以下を参照のこと。同一および相同の残基の合計を、配列中の残基の総数で割り算してコリンペプチドに関して比較したものが、配列の類似率に等しい。配列の同一性および相同性を計算する目的は、比較配列を、所望の方法、アルゴリズム、FASTA、BLASTAのようなコンピュータープログラムに応じて整理し算定することである。配列番号2または配列番号4のアミノ酸配列と100%を下回るアミノ酸配列の同一性を有するポリペプチドは、約99%、98%、97%、95%、90%、70%等で含有される。アミノ酸配列の同一性の有利な値は約85%を上回り、例えば約86%である。
【0033】
ほ乳類のコリンポリペプチド、断片または置換されたポリペプチドはまた様々な修飾を含んでおり、ここで修飾とは、脂質の修飾、メチル化、リン酸化、グリコシル化、共有結合修飾(例えば、アミノ酸のR基の共有結合修飾)、アミノ酸置換、アミノ酸欠失またはアミノ酸添加である。ポリペプチドの修飾は、組み換え、合成、化学的方法等、様々な方法で達成できる。
【0034】
本発明のポリペプチド(例えば、ヒトコリンまたはマウスコリン、その断片、その突然変異体)は、様々な方法、例えばアッセイ中で、以下に記載されるような抗体の免疫原として、生物学的に活性な薬剤として(例えばコリンに関連した1つ以上の活性を有する)使用できる。
【0035】
コリン、その誘導体あるいはその断片をコードするポリペプチドを、1つ以上の構造ドメイン、機能ドメイン、検出可能ドメイン、抗原性ドメイン、および/または関連する所望のポリペプチドと、天然に存在しないすなわち天然非産出の配置で結合させることができ、例えばヒトまたはネズミのコリン遺伝子の場合、生物、例えば動物、有利にはヒト、マウスまたはその細胞系のようなほ乳類のゲノムから製造した遺伝子断片と結合させることもできる。このような特徴を有するポリペプチドは、キメラまたは融合ポリペプチドである。このようなキメラポリペプチドを、化学的、合成的、偽合成的、および/または組み換え法を含む様々な方法で製造できる。キメラポリペプチドをコードするキメラ核酸は、種々のドメインまたは所望のポリペプチドを連続的に含有するか(例えば活性を安定または強化する多数のN−末端ドメイン)または例えばイントロン、スプライス部位、エンハンサー等を有する中断された読み取り枠を含有してよい。キメラ核酸を、種々の方法で製造できる。アメリカ特許明細書第5439819号参照。ドメインまたは所望のポリペプチドは、触媒、シグナリング、増殖促進、細胞ターゲティング(例えばエンドソーム、リソソーム、小胞体、核に対するシグナル配列、標的配列)等の生物学的機能、疎水性、親水性、膜スパニング等の構造機能、受容体−リガンド機能および/または例えば酵素、蛍光ポリペプチド、緑色蛍光タンパク質との結合のような検出可能機能を有していてよい(Chalfie等, 1994, Science, 263:802;Cheng等, 1996, Nature Biotechnology, 14:606;Levy等, 1996, Nature Biotechnology, 14:610等)。さらに、ポリペプチド、またはその一部を、宿主への導入時の選択マーカーとして使用できる。例えば本発明のアミノ酸配列をコードする核酸を、読み取り枠中で所望のコード配列と融合させ、精製、選択または標識のためのタッグとして機能させてもよい。融合領域は、発現、単離、精製等を促進するための切断部位をコードしていてよい。
【0036】
本発明のポリペプチドは、例えばin vivo、in vitro、無細胞、組み換え、細胞融合等、本発明の発現系で製造できる。ポリペプチドの修飾には、グリコシル化、アミノ酸置換(例えば、異なるコドンの利用による)、分解、切断、エンドペプチダーゼまたはエキソペプチダーゼ活性のようなポリペプチドのプロセシング、脂質およびリンを含む化学成分の添加等の系が含まれる。
【0037】
本発明のポリペプチドを、海面活性剤抽出(例えばTriton-X-100 CHAPS、オクチルグリコシド)、硫酸アンモニウムまたはエタノールによる沈殿、酸による抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む通常の方法により、天然物、形質転換宿主細胞(培地または細胞)から再生できる。成熟タンパク質の立体構造を完全にするために、場合により、タンパク質の再生工程を利用できる。最後に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を精製過程で使用できる。コリンポリペプチドを他のセリンプロテアーゼに関する記載と同様にして単離してもよい(例えばWu等, J. Biol. Chem., 267:24408〜24412, 1992;Wu等, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:6775〜6779, 1991)。
【0038】
ほ乳類のコリン核酸またはその断片は、天然源から獲得できるヌクレオチド配列を有する核酸である。前記参照。それ故、天然産出物、正常体、突然変異体、多形対立遺伝子、縮重配列などが含まれる。天然源には、組織および全有機体から獲得した生細胞、本来のおよび不死化した細胞系を含む培養細胞系が含まれる。有利には、ユニジーンデータベース[PubEST]由来の以下の核酸断片を除外する:Hs.62794(AA126468[1686098]、AA126648[1686206]、AA625395[2537780]、AA046682[1524579]、AA249850[1881137]、およびAA046793[1524691])およびHs.71798(AA147031[1716421])(括弧内の番号はPubESTデータベースの番号である)。場合により、以下の断片を除外してもよい:Hs.121626(AA771958)、Hs.1657(M69297)、およびHs.47712(AA203291)、g1231787;g1312726;g1337948;およびg942724。前記の核酸のヌクレオチド配列を公的に入手可能なデータベースを検索して確認することができる。しかし、例えば全長コリン、または前記断片の2個以上を有する核酸の配列を含有する核酸またはこれらの配列から成る核酸は除外しない。クローニングベクター、例えばプラスミドまたはファージ中に存在する前記断片を除外するのも有利である。
【0039】
人コリンは約5kbmRNAとして発現される。これは心臓に最も多く存在する。脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、膀胱、子宮および胃には存在しないかまたは非常に低いレベルで発現している。それ故コリンを、例えば組織切片(コリン−特異的な抗体またはコリン−特異的な核酸プローブを使用する)や生検サンプル等に心組織が存在するかを調べるマーカーとして使用できる。コリンはまた、子宮癌、骨肉腫、子宮内膜癌系HEC−1−A、AN3CA、およびRL95−2、平滑筋肉腫SK−LM−1、および骨肉腫US−OSのような様々なヒト細胞系で検出される。更なる詳細を以下の実施例に記載する。
【0040】
4933塩基対を有するヒトコリン対立遺伝子の核酸配列を配列番号1に示す。DNAの大きさは、ノーザン分析によって検出されたコリンmRNA(−5kb)長さに等しい。翻訳開始部位を表すと考えられるATGコドンは、95番目に位置する。読み取り枠(ORF)は3126bpであり、開始コドンの前に94ヌクレオチドから成る5′非翻訳領域(UTR)を有する。3′末端には、3221番目に位置する停止コドンの後ろに1.7−kbの3′UTRが存在する。ポリ(A)テールの12ヌクレオチド前に、AATAAAのポリアデニル化シグナルが存在する。本発明の核酸配列は、アミノ酸1〜1042に由来する完全なコード配列、その縮重配列、およびその断片を有する。本発明の核酸はまた、前記および下記の任意のヌクレオチド配列に100%相補的なヌクレオチド配列、例えばアンチ−センスを包括する。
【0041】
本発明はまた、例えば配列番号3に示すようなコリンの全体または一部をコードしたマウスヌクレオチド配列に関する。ヒト対立遺伝子の場合に、本発明は、その縮重配列およびそのアンチセンス断片に関する。ノーザン分析では、心臓由来のサンプル中に約5kbの顕著な転写物を認める。ヒトのサンプルを用いたノーザン分析と対称的に、マウスの精巣および腎臓由来のサンプル中ではmRNAは低レベルで検出される。マウスコリンmRNAのin situハイブリダイゼーションもまた、胎児の心組織、心房、心室筋細胞、発達中の腎臓、および軟骨由来の構造中で検出される。
【0042】
詳細は実施例に記載する。
【0043】
本発明の核酸は、起源が様々であってよい。例えば組織、細胞または全有機体から単離されたDNAまたはRNA、例えばポリアデニル化されたmRNAから獲得できる。核酸を直接DNAまたはRNAあるいはcDNAライブラリーから獲得できる。核酸は特に、所望の遺伝子型、表現型等を有する発生段階の細胞(例えば胎児または成人の心臓の細胞あるいは組織)から獲得できる。
【0044】
コリンポリペプチドに関して前記したように、本発明のポリペプチドをコードしたヌクレオチド配列を有する核酸には、コード配列のみ;コード配列および付加的なコード配列(リーダー、分泌、標的、酵素、蛍光をコードする配列またはその他の診断用ペプチド);コード配列および非コード配列(例えば5′および3′末端のいずれかまたはコード配列中に分散して存在する非翻訳配列、例えばイントロン)が包括される。ポリペプチドを中断することなくコードするヌクレオチド配列を有する核酸とは、コリンをコードするアミノ酸配列を有し、コード配列を中断またはコード配列に介在する非−コードヌクレオチドを有さない核酸、例えばイントロンの欠失を意味する。このようなヌクレオチド配列も、連続しているように記載される。ほ乳類ヒトまたはマウスコリン等をコードするゲノムDNAは、通常の方法で獲得できる。
【0045】
本発明の核酸はまた、前記のように核酸へ操作可能に結合した、発現制御配列を含有する。“発現制御配列”という表現は、それが操作可能に結合した核酸によってコードされたポリペプチドの発現を調節する核酸配列を意味する。発現は、mRNAまたはポリペプチドのレベルで制御される。従って、発現制御配列は、mRNA−関連要素およびタンパク質−関連要素を有する。このような要素には、プロモーター、エンハンサー(ウイルスまたは細胞の)、リボゾーム結合配列、転写ターミネーター等が含まれる。発現制御配列がコード配列の発現を誘起または達成させるように位置する場合、発現制御配列はヌクレオチドコード配列へ操作可能に結合している。例えば、プロモーターがコード配列の5′側に操作可能に結合される場合、コード配列の発現はプロモーターによって誘導される。発現制御配列は、正常遺伝子に非相同であっても内在性であってもよい。
【0046】
本発明の核酸は、核酸ハイブリダイゼーションに基づいて選択できる。2つの一本鎖核酸試料が一緒にハイブリダイズする能力は、その核酸配列の相補性、例えばA−T、C−G等のようなヌクレオチド間の塩基対の尺度である。従って、本発明はまた、配列番号1および配列番号3に記載されるヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズする核酸に関する。後者の配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列は相補的な核酸鎖を有するか、またはポリメラーゼ(すなわち適当な核酸合成酵素)の存在下に鋳型として働く。本発明は、両方の核酸鎖、例えばセンス鎖およびアンチ−センス鎖を包括する。
【0047】
ハイブリダイゼーションの条件は、配列番号1および配列番号3のヌクレオチド配列に対するヌクレオチドの相補性が所望量である核酸が得られるように、選択される。このような配列へハイブリダイズできる核酸は、有利に、配列間で約85%の、さらに有利には90%、92%の、特に有利には95%,97%または100%の相補性を示す。本発明は特に、僅かにまたは非常にストリンジェントな条件で、配列番号1および配列番号3のヌクレオチド配列とハイブリダイズする核酸配列に関する。
【0048】
コリン配列にハイブリダイズする核酸を、種々の方法で選択できる。例えばブロット(すなわち核酸を含むマトリクス)を、公知の方法に従い、プレハイブリダイゼーション溶液(6X SSC、0.5%SDS、変性させた鮭の精子DNA100μg/ml、5X デンハーズ溶液(Denhardt′s solution)、および50%ホルムアミド)中で30ECで一晩インキュベートし、ハイブリダイゼーション溶液(6X SSC、0.5%SDS、変性させた鮭の精子DNA100μg/ml、50%ホルムアミド)中の放射線ラベルしたプローブ(コリン)と、42ECで一晩ハイブリダイズさせた。ブロットを非常にストリンジェントな条件で洗浄し、それにより、例えばミスマッチが5%以下となり(例えば0.1%SSCおよび0.1%SDS中で30分間65ECで2回洗浄する)、すなわち95%以上の配列の一致を示す。非常にストリンジェントな条件で洗浄することによりミスマッチは5%以下となるが、あまりストリンジェントでない洗浄条件(0.2%SSCおよび0.5%SDSで30分間37ECで2回洗浄する)では、ミスマッチは20%を越える。この例に限らず、別のストリンジェントでない条件では、最終洗浄を30mM NaClおよび0.5%SDSを含むバッファー中で42ECで実施する。この例に限らず、別の非常にストリンジェントな条件では、最終洗浄を30mM NaClおよび0.5%SDSを含む水性バッファー中で65ECで実施する。洗浄およびハイブリダイゼーションはSambrook等、Molecular Cloning, 1989,第9章に記載されるようにして実施できる。ハイブリダイゼーションは、Sambrook等の記載のように、プローブとその標的間で形成されるハイブリッドの融点(Tm)の算出に基づいていてよい。このようなストリンジェントな条件により、核酸間で例えば少なくとも約95%、有利には97%のヌクレオチド相補性を有する配列を選択することができ、ただし、このような核酸はHs.62794(AA126468[1686098]、AA126648[1686206]、AA625395[2537780]、AA046682[1524579]、AA249850[1881137]、およびAA046793[1524691])、およびHs.71798(AA147031[1716421])ではない。前記および下記参照のこと。例えば全長コリン、またはこれらの前記断片を2個以上有する核酸の配列を含有するかまたはこのような核酸の配列から成る核酸は除外しない。
【0049】
本発明の核酸またはポリペプチドが、配列番号1〜4のヌクレオチドまたはアミノ酸配列中に1個以上の相違点を有していてよい。ヌクレオチドおよび/またはアミノ酸配列の変換または修飾は、定方向突然変異またはランダム突然変異を含む可能な任意の方法で達成できる。
【0050】
本発明のヒトまたはマウスコリンをコードする核酸は、天然に産出するコリン遺伝子、例えば天然に産出される多形、正常体または突然変異体の対立遺伝子(ヌクレオチドまたはアミノ酸)、ヒト、サル、ブタ、マウス、ラットまたはウサギのようなほ乳類の自然集団の中で見出される変異中に見られるヌクレオチドを含んでいてよい。天然に産出するという表現は、核酸が天然源、例えば動物組織および細胞、体液、組織培養細胞、法医学的サンプルから得られること意味する。天然に産出する突然変異体には、ヌクレオチド配列の欠失(切形アミノ末端またはカルボキシ末端)、置換または付加が含まれる。これらの遺伝子を当業者に公知の方法である核酸ハイブリダイゼーションにより検出し単離する。本発明のヒトまたはマウスコリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は天然に産出する遺伝子、転写体、またはcDNA、例えば配列番号1または配列番号3中に見出されるコドンを有するか、あるいは同一のアミノ酸配列をコードする縮重コドンを有する。例えば、有利には、所望の宿主中で発現できるよう配列を最適化するために、配列中のコドンを変化させる。
【0051】
本発明はまた、コリンポリペプチドの突然変異タンパク質、すなわち天然源から得られるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド(ほ乳類コリンの断片は天然に産出するコリンに由来するアミノ酸配列と異ならない)にも関する。従って、コリンの突然変異タンパク質は、アミノ酸置換、挿入および欠失を含み、天然に産出しないアミノ酸から成る。Wu等, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:7775〜6779, 1991、特に塩基性アミノ酸がグルタミン酸に置換されるアミノ酸置換により突然変異が誘起されることを記載した部分を参照のこと。
【0052】
本発明のアミノ酸配列の突然変異タンパク質は、ジーンデータバンク、例えばGenbank, EMBLから相同性を検索することにより製造できる。配列の相同性の検索は、コンピュータープログラムのBLASTファミリーに記載されるアルゴリズム、Smith- Watermanアルゴリズム等を含む種々の方法によって達成される。
【0053】
ポリペプチド間で一致しかつ/または相同であるドメイン内のアミノ酸を同定および配置調節し、次いでその配置調節に基づいてアミノ酸を修飾することにより、突然変異タンパク質を配列に導入する。例えば、ヒトコリンとFrizzled、LDLRおよび他のタンパク質のセリンプロテアーゼドメインとの配列の比較を図2〜4に図解する。これらの位置表示により、一致するアミノ酸位置および残基が互いに異なるが相同であるアミノ酸位置が明確になる。相同なアミノ酸は側鎖の大きさおよび極性化の度合いに基づいて定義され、この際、小さく非極性:システイン、プロリン、アラニン、スレオニン、小さく極性:セリン、グリシン、アスパラギン酸、アスパラギン、大きく極性:グルタミン酸、グルタミン、リシン、アルギニン、中間的で極性:チロシン、ヒスチジン、トリプトファン、大きく非極性:フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリンである。
【0054】
また、相同な酸は以下のように分類できる:非荷電極性R群、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン;酸性アミノ酸(負に荷電)、アスパラギン酸およびグルタミン酸;塩基性アミノ酸(正に荷電)、リシン、アルギニン、ヒスチジン。相同なアミノ酸はまた、Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978)およびArgos, EMBO J. 8, 779〜785(1989)に記載されるものを含有する。
【0055】
本発明の突然変異タンパク質には、ヒトまたはマウスコリン配列中の残基が、相当のドメインに由来する相同な残基で置換されたアミノ酸配列を含む。
【0056】
従って、本発明は、配列番号2または4のコリンヌクレオチド配列に関し、ここで、ポリペプチドをコードする該核酸およびアミノ酸位置の1つ以上は置換または欠失されているか、置換および欠失されており、該核酸でコードされたポリペプチドはセリンプロテアーゼ触媒ドメイン活性またはコリンに特異的な免疫原活性を有する。このような核酸は相同のアミノ酸で置換された1つ以上の置換アミノ酸位置を有していてよい。
【0057】
さらに、図2〜4に記載される配列の位置表示は、生物学的活性を減少、低下または消滅させるようなアミノ酸置換に関する情報を提供する。例えば、位置表示により2つ以上のドメイン間で保存された同一アミノ酸が明確となった場合(例えば図4記載の保存H、D、またはS残基の置換)、アミノ酸の欠損または置換がその生物学的活性に影響を及ぼす。触媒トライアド中の突然変異、すなわちHis910、Asp959およびSer1052(マウスコリン)は、セリンプロテアーゼの触媒活性を完全に破壊する。
【0058】
コリンポリペプチド突然変異タンパク質、およびその相応のヌクレオチドコード配列は、配列番号2または配列番号4記載のアミノ酸配列を有するが、ただし、1つ以上の位置が相同アミノ酸によって置換されているもの、例えば1、5、10、15または20置換が存在するものを除く。本発明はまた、突然変異タンパク質ポリペプチドおよびそのようなペプチドをコードする突然変異タンパク質の核酸に関する。
【0059】
本発明の核酸は、例えばDNA、RNA、合成核酸、ペプチド核酸、修飾ヌクレオチド、またはその混合物を含む。DNAは二本鎖または一本鎖であってよい。例えばRNaseHのようなヌクレアーゼ耐性、in vivoでの安定性の向上等の所望の目的に応じて、核酸から成るヌクレオチドを、例えばエステル、スルファミン酸、スルファミド、ホスホロチオネート、ホスホルアミデート、ホスホネート、カルバメート等の公知の様々な結合により連結させることができる。アメリカ特許第5378825号参照。
【0060】
核酸に対して様々な修飾が可能であり、例えば検出可能なマーカー(アビジン、ビオチン、放射性要素)の付加、ハイブリダイゼーション、検出、または安定性を向上させる成分の付加が挙げられる。核酸はまた、所望の方法により固体支持体、例えばニトロセルロース、磁性または常磁性微小球(例えばアメリカ特許第5411863号;アメリカ特許第5543289に記載されるように、例えば強磁性、超磁性、常磁性、超常磁性の酸化鉄およびポリサッカライドが含まれる)、ナイロン、アガロース、ジアゾ化セルロース、ラテックス固体微小球、ポリアクリルアミドに固着させることができる。アメリカ特許第5470967;5476925;5478893参照。
【0061】
本発明の別の対象は、オリゴヌクレオチドおよび核酸プローブである。例えば試験サンプルにおいてほ乳類コリン核酸を検出、定量、単離する場合に、このようなオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブを使用できる。有利な実施態様では、例えばPCR、RACE、ディファレンシャルディスプレーにおいて、cDNAライブラリー、発現ライブラリー等との組合せにおいて、核酸をオリゴヌクレオチドプローブとして使用できる。好適なオリゴヌクレオチドを以下の実施例に記載する。検査、診断および法律的な種々の目的に応じた検出であることが望ましい。診断が目的の場合には、サンプル中のそのような核酸配列の存在および量を確認するのが有利であり、この際、サンプルは組織、細胞、体液等から得る。有利な方法において、本発明は、標的とオリゴヌクレオチドとの間でのハイブリダイゼーションが効果的に達成される条件下に、試験サンプル中の標的核酸とオリゴヌクレオチドとを接触させ、ハイブリダイゼーションを検出することから成る、核酸の検出方法に関する。本発明のオリゴヌクレオチドを、PCR(例えばSaiki等, 1988. Science, 241:53;アメリカ特許第4683202号;PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis等, eds., Academic Press, New York, 1990)またはディファレンシャルディスプレー(例えばLinag等, Nucl. Acid. Res., 21:3269〜3275,1993:アメリカ特許第5599672:WO97/18454参照)またはRACEのような合成的な核酸の増幅に使用してもよい。このような検出は他の遺伝子、例えば心組織または骨の分化や機能に関与する遺伝子のオリゴヌクレオチドとの組合せにより達成される。
【0062】
本発明の別の対象は、ヒトコリンまたはマウスコリンに特徴的なヌクレオチド配列である。コリンに特徴的な配列とは、有利にヒト、ラット、マウス等のほ乳類のコリン中に見出されるヌクレオチドの規定配列を意味し、例えば配列番号1または3中には存在するが、特に動物の別の核酸には殆どまたは滅多に見られない配列を意味する。センスおよびアンチセンスヌクレオチド配列の両方を含有する。本発明に特徴的な配列を、慣用の方法で決定できる。このような特徴的な配列から成る核酸を、例えば核酸混合物を含むサンプル中のヒトまたはマウスコリンの存在を確認するためのハイブリダイゼーションプローブとして、ノーザンブロットで使用できる。プローブと少なくとも95%の一致(すなわち相補性)を示す核酸を選択するために、ハイブリダイゼーションをストリンジェントな条件下に実施するが(前記参照)、よりストリンジェントでない条件を適用してもよい。特徴的なコリンヌクレオチド配列を、コリン、触媒、GFP等の別の部分、発現制御配列等をコードする配列を含む特許に記載されるような様々なヌクレオチド配列と、5′または3′末端のいずれかにおいて、読み取り枠中に融合させてもよい。
【0063】
ハイブリダイゼーションを、所望の選択性、例えばSambrook等, Molecular Cloning, 1989に応じて種々の条件下に実施する。例えば、ヒトまたはマウスコリンを特異的に検出するために、オリゴヌクレオチドが標的核酸とだけハイブリダイズする、すなわちオリゴヌクレオチドが標的核酸と100%の相補性を有するような条件下にオリゴヌクレオチドを標的核酸へハイブリダイズさせる。100%を下回り、少なくとも約99%、97%、95%、90%、70%、67%のヌクレオチド相補性を有する標的核酸を選択するのが有利である場合には、異なる条件を適用してもよい。
【0064】
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号1または配列番号3の任意の連続したヌクレオチド配列を有する。本発明のオリゴヌクレオチド(核酸)は、所望される任意の大きさ、例えば約10〜200ヌクレオチド、12〜100、有利には12〜50、12〜25、14〜16、少なくとも約15、少なくとも約20等であってよい。オリゴヌクレオチドは配列番号1または配列番号3と100%一致するか相補的であり、ミスマッチまたはヌクレオチド置換、例えば1、2、3、4または5置換を有していてよい。本発明によれば、オリゴヌクレオチドは所望のバッファー(例えばリン酸バッファー、トリスバッファー等)、検出組成物等を有するキットを含有してよい。オリゴヌクレオチドは、従来技術に公知なようにして、放射性または非放射性ラベルで標識してもよく、または標識しなくてもよい。
【0065】
アンチセンス核酸も、本発明の核酸、有利には配列番号1または3のコード配列のアンチセンスから製造できる。アンチセンス核酸を、阻害、発現の検出、in situハイブリダイゼーションのようなコリンの発現を制御または調節する様々な方法に使用してよい。これらのオリゴヌクレオチドを、アメリカ特許第5576208号に記載されるのと同様に使用してよい。コリンの発現を制御または調節するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを発現制御配列に操作可能に結合させてよい。
【0066】
本発明の核酸を所望の任意の方法により標識してよい。核酸を、一般的に使用されるトレーサーである、32P、35S、125I、3Hまたは14Cのような放射性トレーサーを用いて標識できる。放射性標識は、任意の方法、例えば放射性標識ヌクレオチド、ポリヌクレオチドキナーゼ(ホスファターゼによる脱リン酸化を実施するかまたは実施しない)またはライゲース(末端を標識するかに依存する)を使用して3′または5′末端で末端標識してよい。非放射性標識も実施でき、この際、本発明の核酸を、免疫特性残基(抗原、ハプテン)、ある試薬への特異的な親和性を有する残基(リガンド)、検出可能な酵素反応を完全にする特性を有する残基(酵素または補酵素、酵素基質または酵素反応に関する他の基質)、または蛍光あるいは所望の波長の光の放出または吸収といった固有の物理特性を有する残基と組み合わせて使用する。
【0067】
オリゴヌクレオチド、アンチセンス核酸等を含む本発明の核酸を、全ての器官、組織、細胞等におけるコリンの発現を検出するために、ノーザンブロット、PCR、RACE、in situハイブリダイゼーション等を含む様々な方法に使用してもよい。このような核酸は特に、例えばコリンの細胞特異的および/または遺伝子変化に起因する発現の阻害を検出するのに好適である。コリンのレベルを単独で、または他の遺伝子産物、特に心特異的な遺伝子産物と組み合わせて測定できる。
【0068】
所望の目的に応じて、本発明の核酸を種々の系、in vitroおよびin vivoで発現させることができる。例えば、核酸を発現ベクター中に挿入し、所望の宿主に導入し、核酸がコードするポリペプチドを効果的に発現できるような条件下に培養することができる。効果的な条件には、宿主細胞でポリペプチドを製造するのに好適な任意の培養条件、すなわち効果的な温度、pH、培地、宿主細胞を培養する培地への添加物(例えば核酸がdhfr遺伝子と隣接する場合、ブチレートまたはメトトレキサート等の発現を増幅または誘導できる添加物)、シクロヘキシミド、細胞密度、培養皿等が含まれる。未変性DNA、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、インジョクション、DEAE−デキストラン仲介形質移入、リポソームによる融合、細胞への取り込みを強化する薬物との会合、ウイルス性形質移入等を含む任意の効果的な方法により、核酸を細胞へ導入する。本発明の核酸が導入された細胞は形質転換された宿主細胞である。核酸は染色体外に存在していても宿主細胞の染色体へ組み込まれていてもよい。これは安定性または一過性である。発現ベクターをその宿主細胞との適合により選択する。宿主細胞は、ほ乳類細胞、例えばCOS−7、CV1、BHK、CHO、HeLa、LTK、NIH3T3、酵母、昆虫の細胞、例えばSf9(S. frugipeda)およびショウジョウバエ、バクテリア、例えばエシェリキア コリ、ストレプトコッカス、桿菌、酵母、真菌細胞、植物細胞、胎児の幹細胞、(例えばマウスまたはヒトのようなほ乳類)、骨細胞(例えば破骨細胞または軟骨細胞)、心細胞(例えば一次培養由来)、筋細胞、神経細胞等を含む。発現制御配列は、宿主適合性の選択と同様に、所望の目的、例えば多くのコピー数、高い生産数、誘導、増幅、発現の制御に応じて選択される。使用できるその他の配列には、SV40、CMV、RSVに由来するエンハンサー、誘導性プロモーター、細胞型特異的要素、または選択的または特異的な細胞発現を誘起する配列が含まれる。発現を誘導するために使用できるプロモーターには、例えば内因性プロモーター、MMTV、SV40;バクテリアを宿主とするtrp、lac、tac、またはT7プロモーター:酵母のα因子、アルコールオキシダーゼ、またはPGHプロモーターが含まれる。
【0069】
本発明の別の遺伝子を、例えばコリンの機能を調節する目的で、同一の宿主へ導入してよい。このような遺伝子は正常遺伝子であるか、または突然変異体、キメラ、多形体等のような変異体であってよい。
【0070】
本発明の核酸またはポリペプチドを、核酸またはタンパク質の電気泳動、クロマトグラフィー等のサイズマーカーとして使用できる。制限部位のために配列をスキャンし、サイズを算出し、相当の制限切断を実施することにより、特徴的な制限断片を決定する。配列番号1記載のコリンcDNAを、核酸の電気泳動時の4.8kbの分子量マーカとして使用できる。
【0071】
配列番号1記載のヒトコリンcDNAは、ヒト染色体の4p12〜13に位置付けられる。従って、系統図のマーカーとして使用できる。例えば、この染色体領域は全肺静脈還流異常(TAPVR)の分離系を示し、それ故、他の遺伝子マーカーと共に疾患の位置づけに使用できる。Bley等, Am. J. Hum. Genet., 56:408〜415, 1995参照。
【0072】
本発明の別の対象は、特に病的および発生的状態でコリン遺伝子または遺伝子産物を含む生物学的経路調節、およびコリンポリペプチドまたは核酸の検出による、そのような状態の診断に関する。例えばANFは、例えば体液のホメオスタシス、血圧、血管拡張、ナトリウム排泄増加、糸球体管におけるナトリウム吸収の阻害、糸球体濾過の向上、アルドステロン産生および分泌の阻害、有糸分裂誘発等を含む冠血管および腎臓系に関連する種々の生理学的プロセスに関する。コリンのpro−ANF変換活性の調節は、生体生理学に絶大な影響を及ぼしている。例えば、心室のANFレベルは、通常、心室の筋細胞よりも少ないが、冠血管系の疾患により著しく増加する。鬱血性の心疾患患者は、ANFの血漿レベルが高い。高濃度は心室機能不全の重度に相関する。同様に、ANF濃度の高さは、心不整脈および血流易感染(hemodynamic compromise)に関連する。Levin等, New Engl. J. Med., 339:321〜328:1998参照。例えば遺伝子発現を阻害したり、触媒活性に直接作用する酵素阻害剤を投与することによりコリンの活性を阻害して、異常に高いレベルを低下させることができる。
【0073】
コリンは軟骨由来および心臓由来の細胞中で多く発現するので、これらの組織に関する疾患、例えば家族性肥大型心筋症、大理石骨病、および大理石骨−偽膠腫症候群、骨粗鬆症、ページェット病、奇形性骨炎、および全肺静脈還流異常に関連する。前記のように、コリンオリゴヌクレオチドは、TAPVRと同様に、これらの疾患の家族性遺伝を調べるための系統図に使用でき、コリンがこのような疾患に関与している場合には(遺伝子的連鎖または病原)診断の目的(例えば胎児期)に使用できる。コリンはまた、心臓の発育、Wntタンパク質および別の増殖因子によるシグナリングを含む発育経路、細胞分化(例えば軟骨細胞の分化)および関連プロセスに関する。さらに、コリンは細胞−細胞シグナリング、分化(骨および/または心臓)およびその他の発育経路に関する。このような役割は、セリンプロテアーゼ触媒活性、縮れドメインおよび/またはLDRLドメインによって仲介される。コリンは増殖因子、例えばBMPまたはTGF−βのプロセシング(例えばプロ増殖因子の触媒的な切断による)に関する。
【0074】
この線を考慮すると、本発明の別の対象は、冠血管および腎臓疾患、例えば高血圧、うっ血性心疾患、または腎不全(コリンの関与する他の任意の経路に関連する疾患も同様)を、ほ乳類コリンの活性を調節する薬剤を有効量で、必要とするホストへ投与して治療することである。調節という表現は:上昇、作用、促進、安定、低下、減少、拮抗、遮断、阻害等を意味する。所望の調節効果の性質を慣用の方法で測定でき、例えばANFの量を増加または減少させることにより病理学的効果が得られるかを測定する。活性は、コリンの触媒活性を直接遮断する薬剤(例えば、ロイペプチンまたはジイソプロピルフルオロホスフェートのような酵素インヒビター)の投与または相当の遺伝子の転写または翻訳を遮断するアンチセンスのような試薬により阻害される。コリン活性は、例えばコリンペプチドを効果的に産生するコリン遺伝子の接種により増加する。コリン遺伝子はその他の遺伝子治療と同様の方法で接種できる。Magovern等, Hum. Gen. Ther., 8:215〜227:1997;Spring等, Mol. Cell., 2:549〜558:1998参照。
【0075】
本発明は、様々な環境、例えばin vitroおよびin vivoにおいて、コリン自体の活性を直接調節するかまたはコリンをコードする遺伝子の発現を調節することにより、コリンの活性を調節する方法に関する。酵素活性を、例えばWu等, J. Biol. Chem., 267:24408〜24412,1992;Wu等, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:6775〜6779,1991に記載されるような慣用の方法で測定する。変換活性を、実施例に記載されるようにして、あるいは例えばInagami, J. Biol. Chem., 264:3043〜3046,1989に記載されるようにして測定する。従って、本発明は試験化合物、コリンペプチド、その断片およびセリンプロテアーゼまたは変換酵素のための基質の存在下に、該ポリペプチドまたはその断片が該基質を効果的に切断できる条件で反応させ;該切断を検出し;試験化合物が該セリンプロテアーゼ活性を調節しているかどうかを、試験化合物の存在および不在における切断量を比較することで確認する;ことから成る、コリンペプチド、断片またはその突然変異タンパク質の、前記活性モジュレーターを同定する方法に関する。
【0076】
任意の基質でよく、任意の検出法、例えば色素原、蛍光、放射性、電気泳動等を使用できる。例えば、切断の生成は、標識した基質とゲル電気泳動とを組み合わせて使用することにより検出できる。有利な実施態様において、基質は色素原基質、すなわちセリンプロテアーゼと反応し、本来の酵素基質の有する選択性と同等の選択性を有するように設計されたペプチドである。色素原基質のペプチド部分に結合しているのは、酵素切断後に放出されて検出可能な色を生じる化学基である。色の変化は分光光度計により測定でき、これはセリンプロテアーゼ触媒ドメインのタンパク分解活性と比例する。これらの基質は慣用の方法で合成できる。基質の加水分解(例えば4−ニトロアニリン、pNAをクロモフォアとして含有する)を室温で405nmでの吸光を調べることにより測定する。セリンププロテアーゼのアミド分解活性を測定するのに使用できる基質は、S2302、(H−D−Pro−Phe−Arg−pNA.2HCl)、S2444(pyroGlu−Gly−Arg−pNA.HCl)、およびS2288(H−D−Ile−Pro−Arg−pNA.2HCl)をそれぞれ含有する。基質に結合できるその他のクロモフォアには、例えばANBA、ADMP、チオエステル誘導体等が含まれる。更なる情報を得るには、例えばクロモジェニクスカタログ(Chromogenix catalog)およびそのウェブサイトを参照するとよい。KmおよびKcatの値は、ミカエリス−メンテンの式によって算出できる。
【0077】
本発明はまた、試験化合物がコリンペプチドと特異的に結合できる効果的な条件で、コリンペプチドと試験化合物とを接触させ;該コリンポリペプチドへの結合を検出する;ことから成る、コリンポリペプチドと特異的に結合する化合物の同定法に関する。結合アッセイを慣用の方法で実施する。コリンポリペプチドは、完全なコード配列またはその断片、特に1つ以上のLDLRドメイン、縮れドメイン、SRCRまたはその組合せを有していてよい。このようなドメインのアミノ酸位置については前記を参照のこと。ドメインを例えばイムノグロブリンドメインと組み合わせて融合タンパク質として使用できる。アメリカ特許台5639597号参照のこと。
【0078】
コリン成分を反応混合物へ様々な形態、例えば実質的に精製された細胞成分として、可溶性の抽出物として、または溶解液として添加できる。この際、コリンポリペプチドを、天然源、組み換え源(すなわち、例えばプロスミド、ベクター、未変性DNA等上にのせて細胞系に導入し、細胞中で発現させることにより、“組み換え”ポリペプチドを遺伝子操作により製造する)から獲得してよく、または合成してもよい(例えば全長コリンをアミノ酸残基の801番目で切断して化学的にまたは酵素的に製造し、例えば802〜1042断片を使用する)。コリンポリペプチドをほ乳類細胞、昆虫の細胞系、またはバクテリア中で、例えば融合タンパク質または非融合タンパク質として発現できる。
【0079】
有利には、コリンコード配列(例えば、cDNA、遺伝子、遺伝子断片等)で形質転換された細胞系中でコリンを発現させる。後者の場合、コリンは細胞の異形成分として存在する:ここで異形とは、コリンが、人工的(例えば、移入、形質転換等)に細胞中に導入されたコード配列によってコードされていることを意味する。有利には、コリンを細胞(バクテリア、酵母、昆虫、ほ乳類等)中で高レベルに発現させる。ヒトコリンは有利なコード配列である。配列番号1および配列番号2参照。
【0080】
本発明の有利な実施態様において、コリンを細胞溶解液として提供し、例えばヒトコリンで形質転換した細胞を溶解し、得られた溶解液、すなわち粗溶解液を直接アッセイに使用する。組み換えヒトコリンを含有する粗溶解液を、場合により、ヒトコリンとして精製または濃縮してよい。例えば、膜分画を慣用の方法で単離できる。
【0081】
コリンはまた、その発現経路の早い段階で調節でき、例えばその転写、mRNAの安定性、翻訳、翻訳後修飾、プロセシング(内部切断部位での切断)等を調節できる。発現は、異なる薬剤、例えばアンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー(aptamer)、合成化合物または天然化合物を使用しても調節できる。
【0082】
この方法または別の方法で同定した化合物は、細胞、組織、全有機体、in situ、in vitro(試験管、固体支持体等)、in vivo、または所望の環境中でコリン活性を調節するのに好適である。一般的に、このようなin vitro活性を有する化合物はin vivoにおいて、コリンに関する生物学的経路を調節するのに有利であり、例えば、骨および心臓に関する疾患およびその発育障害を含む前記の生物学的活性および細胞活性、増殖因子、セリンプロテアーゼ活性を介するタンパク質の突然変異等に関連する病状の治療に有利である。
【0083】
疾患の治療のために、化合物または混合物を、製薬学的に認容性の担体および当業者に公知の他の賦形剤から成る薬剤組成物中に配合できる。Remington′s Pharmaceutical Sciences, Eighteenth Edition, Mack Publishing Company, 1990参照。このような組成物は付加的に有効量の別の化合物を含有する。
【0084】
本発明はまた、本発明のほ乳類コリン、例えばヒトまたはマウスコリンを発現する細胞を、該遺伝子を配列特異的に阻害するヒトまたはマウスコリン遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスRNAのような適量の薬剤と接触させる;ことから成る、ほ乳類コリンをコードする遺伝子の発現を調節、有利には阻害する方法に関する。コリン遺伝子の発現を阻害することによりANFの成熟が阻害され、その結果、前記のようなANFに関連する経路に影響が及ぶ。
【0085】
遺伝子の配列特異的阻害は、アンチセンス核酸、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはRNAを使用することにより、慣用の方法で達成できる。例えばホスホジエステルまたはホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、コリンRNAの特異領域、例えば翻訳開始部位へ設計され、次いでそのような遺伝子を発現する細胞に、その発現を制御するのに効果的な量で接種する。一般的に、アンチセンス核酸とは、与えられた遺伝子のセンス鎖またはコード鎖に相補的な核酸であり、結果として相補的であり、遺伝子のmRNA転写物と特異的にハイブリダイズする。
【0086】
安定性の強化のために、接種した核酸を修飾でき、例えば細胞酵素、酸化、還元、ヌクレアーゼ等に抵抗性にしたり、または細胞への取り込みを強化したりする。任意の好適な修飾が利用でき、例えばホスホロチオエート、メチルホスホネート、アクリジンインターカレート剤および/または疎水性テールと結合したホスホジエステルオリゴヌクレオチド、ソラレン誘導体、2′−リボース修飾、ペントース糖誘導体、窒素ベースの誘導体等が可能である。アメリカ特許第5576208号およびアメリカ特許第5744362号参照。本発明に好適なその他の誘導体、修飾等に関しては、前記を参照のこと。一般的に、本発明のアンチセンス核酸は、天然に産出するヌクレオチドのモノマー、天然には産出しないヌクレオチドのモノマーおよびその組合せを含有することができ、それによって細胞の取り込みおよび/または安定性が強化される。
【0087】
アンチセンスは、未変性核酸として投与してよく、細胞への取り込みを促進する他の薬剤と複合化またはカプセル化して細胞中へ注入してもよく、ウイルスまたはアデノウイルスのようなベクターを用いた好適な運搬方法を利用してもよい。
【0088】
本発明はまた、コリンを特異的に認識する抗体に関する。コリンに特異的な抗体とは、コリン内のまたはコリンが有する定義されたアミノ酸配列、例えば配列番号2および配列番号3のヒトおよびマウスの配列を認識する抗体を意味する。従って、特異的な抗体は、通常、アミノ酸配列と高親和性で結合し、すなわち例えばイムノグロブリンアッセイまたは他の慣用のイムノアッセイによって検出されかつ/または測定される他の異なるエピトープよりも、配列番号2に見出されるエピトープとより良好に結合する。従って、ヒトコリンのエピトープに特異的な抗体はサンプル中、例えばヒトコリン遺伝子産物を含有するサンプル中のエピトープの存在を検出し、エピトープの存在しないサンプルと区別するのに好適である。Santa Cruz Biotechnology, Inc., Research Product Catalogに記載されるように、このような抗体は好適であり、従って例えば100μg/mlで配合できる。
【0089】
ポリクローナル、モノクローナル、組み換え、キメラ、ヒト化抗体を所望の任意の方法で製造できる。screening recombinant immunoglobulin libraries(Orlandi等, Proc. Natl. Acad. Sci., 86:3833〜3837, 1989;Huse等, Science, 256:1275〜1281, 1989);in vivo stimulation of lymphocyte populations;WinterおよびMilstein, Nature, 349:293〜299, 1991参照。例えばモノクローナル抗体を製造するために、図2または図3のポリペプチドを、アジュバントの存在または不在下に、免疫応答を効果的に誘導できる量で、マウス、ヤギ、またはウサギに皮下投与または/および腹腔内投与する。抗体は、一本鎖またはFabフラグメントであってよい。抗体はIgG、サブタイプ、IgG2a、IgG1等であってよい。抗体および免疫応答を、未変性DNAの投与により誘起できる。アメリカ特許第5703055号;第5589466号;第5580859号参照。
【0090】
抗体の誘導に使用されるコリンまたはその断片が生物学的活性を有する必要はないが、免疫原活性は有する必要がある。コリン−特異的抗体を誘導するのに使用されるペプチドは、少なくとも5個のアミノ酸、有利には少なくとも10個のアミノ酸から成るアミノ配列を有する。コリンアミノ酸の短鎖(short stretch)、例えば5個のアミノ酸は、キーホールリンペットヘモシアニンのような別のタンパク質あるいは別の好適な担体および抗体産生に使用されるキメラ分子の短鎖と融合できる。
【0091】
前記のように、いくつかの異なる方法を、コリンに特異的な抗体の製造に利用できる。例えば、1つの方法において、精製コリン由来の変性コリン(例えば逆相HPLCによる分離で精製する)を、75mgまでの量で獲得する。この変性タンパク質は標準的なプロトコールを使用してマウスまたはウサギを免疫化するのに使用できる:マウスの免疫化には約100μgが適当であり、これに対し、ウサギの免疫化には1mgまでを使用してよい。マウスのハイブリドーマを同定するために、変性タンパク質を放射性ヨウ素化標識し、抗体を産生する潜在的なマウスのB−細胞ハイブリドーマをスクリーニングするために使用する。この方法には僅かな量のタンパク質しか必要でなく、従って、数千クローンの標識とスクリーニングには20mgで十分である。
【0092】
その他の方法において、cDNA由来のコリンアミノ酸配列を、免疫原性の高い領域を決定するために分析する。これらの領域を有するポリペプチドを合成し、抗体産生のための好適な免疫化プロトコール中で使用する。好適なエピトープを選択するための分析についてはAusubel FM等が記載している(1989, Current Protocols in Molecular Biology, vol2. John Wiley & Sons)。免疫化に最適なアミノ酸配列は、通常、C−末端、N−末端およびタンパク質が本来の立体配座をとる場合に、外的環境に曝露されるポリペプチドの介在疎水性領域に存在する。一般的に、長さが約15残基の選択されたペプチドは、アプライド バイオシステム ペプチド シンセサイザー モデル431A(Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 431A)を使用し、fmoc−chemistryを用いて、M−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシサクシンイミドエステル(MBS:Ausubel FM等, supra参照)で反応することにより、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH、Sigma)と結合させる。場合により、ペプチドのN−末端へシステインを導入することにより、KLHと結合させる。ウサギは、フロインド完全アジュバントと結合したペプチドKLHにより免疫化する。得られた抗血清をアンチペプチド活性について試験するが、この際、ペプチドをプラスチックに結合させ、1%BSAでブロッキングし、抗血清と反応させ、洗浄し、さらに標識し(放射線または蛍光)かつ親和性により精製した特異的なヤギ抗−ウサギIgGと反応させる。
【0093】
例えば約46〜66;134〜259;450〜573;268〜415;579〜690;713〜801;802〜1402番目のアミノ酸から成る所望の領域または亜領域に対する抗体を製造することもできる。
【0094】
ハイブリドーマも、標準的な技術を用いて製造およびスクリーニングすることができる。目的のハイブリドーマを、標識したコリンを用いてスクリーニングすることにより検出し、所望の特異性を有するモノクローナル抗体を製造できるこれらの融合体を同定する。典型的なプロトコールにおいて、プレートのウェル(FAST, Becton- Dickinson, Palo Alto, Calif)を、親和性により精製した特異的ウサギ−抗−マウス(または好適な抗Ig)抗体10mg/mlで被覆する。被覆したウェルを1%BSAでブロックし、洗浄し、ハイブリドーマの上清を添加する。インキュベーションした後、ウェルを標識コリン1mg/mlに曝露する。抗体産生クローンは、前記背景によって検出可能となった標識コリンと定量的に結合する。このようなクローンを増加させ、限界希釈(1細胞/3ウェル)して2回のクローニングを実施する。クローン化したハイブリドーマを正常なマウスへ接種して腹水を製造し、タンパクA上のアフィニティークロマトグラフィーによりマウス腹水からモノクローナル抗体を精製する。少なくとも108M、有利には109〜1010またはそれ以上の親和性を有するモノクローナル抗体が、一般的に、通常の方法(例えばHarlowおよびLane(1988)Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor LaboratoryまたはGoding (1986)Monoclonal Antibodies: Principles and Practice第2版、編集Academic Press N. Y.)により製造される。
【0095】
特異的なコリン抗体は、コリンの量または分布の変化から特徴づけられる前病的症状および慢性または急性疾患の診断に好適である。コリンの診断試験には、抗体を使用してヒト(またはマウス等を使用する場合はマウス等)の体液、組織(例えば心臓および軟骨組織)、そのような組織の抽出物中のコリンを検出できるように標識する方法をも含む。
【0096】
本発明のポリペプチドおよび抗体を修飾してまたは修飾せずに使用してよい。しばしば、ポリペプチドおよび抗体を、検出可能なシグナルを提供する基質へ共役的または非共役的に結合させることによって標識する。様々な標識および抱合技術が公知であり、化学文献および特許明細書の両方に広く記載されている。好適な標識には、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光剤、化学ルミネセンス剤、磁粒およびその類似物が含まれる。このような標識の使用について記載した明細書には、アメリカ特許明細書第3817837号;第3850752号;3939350号;3996345号;4277437号;4275149号;および4366241号がある。また、組み換えイムノグロブリンを、ここで参考文献として引用しているアメリカ特許明細書第4816567号のようにして製造することもできる。
【0097】
コリンに特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用して可溶性または膜結合性コリンを測定する様々なプロトコールが、従来技術において公知である。例えば、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)および蛍光活性化セルソーティング(FACS)が挙げられる。EC上の障害のない2個のエピトープと反応するモノクローナル抗体を使用した2部位−モノクローナル抗体を基礎とするイムノアッセイ(two-site monoclonal- based immunoassay)が有利であるが、競合的結合アッセイも利用してよい。このようなアッセイは別のところにも記載されている(Maddox, Del等(1983)J Exp Med 158:1211)。
【0098】
コリンと結合する抗体および他のリガンドは、例えば動物、組織、細胞等中のコリンポリペプチドレベルの定量、コリンポリペプチドの細胞局在および/または分布の同定、コリンポリペプチドまたはその一部から成るポリペプチドの精製、コリンポリペプチドの機能調節のために、ウェスタンブロット、ELISA、免疫沈降、RIA等に、治療用、診断用および市販の研究用ツールとして様々な方法で使用できる。本発明はそのようなアッセイ、組成物およびそれらを実施するためのキット等に関する。記載のおよびその他の方法を利用する際、本発明の抗体を使用して、組織、細胞、体液、血液、尿、髄液を含む様々な試料中のコリンポリペプチドまたはその断片を検出する。本発明の方法は、a)従来技術において結合に有効であると考えられている条件下に、配列番号2または配列番号3のペプチドに結合するリガンドと接触させ、b)リガンドとペプチド間の特異的な結合を検出することから成る。特異的な結合とは、リガンドが特定のアミノ酸配列、例えば配列番号2または配列番号3のアミノ酸配列内またはそれを含有するあるいはその誘導体である配列と結合することを意味する。
【0099】
未変性コリンまたは組み換えコリンを、コリン特異的抗体を使用したイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製できる。一般的に、イムノアフィニティーカラムは、抗コリン抗体を活性化したクロマトグラフィーのレジンと共有結合させることによって製造される。
【0100】
硫酸アンモニウムで沈降させるかまたは固定化タンパク質A(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N. J.)上で精製することによって、免疫血清からポリクローナルイムノグロブリンを製造する。同様に、硫酸アンモニウム沈降または固定化タンパク質A上での精製により、マウス腹水からモノクローナル抗体を製造する。部分的に精製したIgはクロマトグラフィーのレジン、例えばCnBr活性化セファロース(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N. J.)と共有結合する。製造者の説明書に従って、抗体をレジンと結合させ、レジンをブロックし、誘導体化レジンを洗浄する。
【0101】
コリン含有細胞に由来する分画を製造することにより、コリンの精製時にイムノアフィニティーカラムを使用する。該製造物は、全細胞または界面活性剤を添加する識別遠心法によって得られた細胞画分の可溶化により、あるいは従来技術に公知の別の方法によって得られる。また、シグナル配列を有する可溶性コリンを、細胞が増殖している培地中に適当量分泌させてよい。
【0102】
可溶性コリン含有製造物をイムノアフィニティーカラムに通し、カラムを例えば界面活性剤の存在する強イオン性バッファーのような条件下に洗浄し、コリンの優先的な吸着を誘起する。次いで、抗体/コリン結合を崩壊させるような条件(pH2〜3のバッファーまたは高濃度の変性剤、例えば尿素またはチオシアネートイオン)下にカラムを溶出し、コリンを回収する。
【0103】
さらに、本発明のコリンポリペプチド結合するリガンドまたはその誘導体は、例えば合成ペプチドライブラリーまたはアプタマー(例えばPetrung等,アメリカ特許明細書第5143854号;Geysen等, 1987, J. Immunol. Methods, 102:259〜274;Scott等, 1990, Science, 249:386;Blackwell等, 1990, Science, 250:1104;Tuerk等, 1990, Science, 249:505)を使用して製造することもできる。
【0104】
抗体またはその誘導体もコリンまたはその断片の発現を阻害するのに使用できる。コリンポリペプチドのレベルを単独で、またはその他の遺伝子産物と組み合わせて測定できる。特に、コリンポリペプチドの量(例えばその発現レベル)を同一または異種サンプル中のアクチンのような他のポルペプチド量と比較(例えば比として)することもできる。一般的に、コリンに特異的な試薬を所望の方法における診断および/または法医学的研究に使用できる(例えばアメリカ特許第5397712号;第5434050号;第5429947号)。
【0105】
本発明はまた、例えばアメリカ特許第5434050号に記載されるような所望の方法で製造されたコリンポリペプチドにも関する。標識されたポリペプチドを、例えば結合アッセイに使用でき、これにより、コリンと結合または接着する基質を同定するか、細胞、in vitro、in vivoまたはin situ系等中のコリンの移動を追跡する。
【0106】
本発明の核酸、ポリペプチド、抗体、コリン、リガンド等を単離することができる。“単離”とは、物質が元来の環境では見出すことのできない形をしていることを意味し、例えば更なる濃縮、更なる精製、成分からの分離等である。単離された核酸には、例えば生物中に見出される染色体DNAから分離されたコリン配列を有する核酸が含まれる。核酸はベクターの一部であるか、または染色体へ挿入でき(特異的なジーンターゲティングまたは正常な位置とは異なる位置へのランダム組込による)、その場合も元来の環境では見出すことのできない形で単離できる:本発明の核酸またはポリペプチドを実質的に精製できる。実質的な精製とは、核酸またはポリペプチドを分離して基本的に他の核酸またはポリペプチド不含にすることを意味し、すなわち核酸またはポリペプチドは主成分でありかつ活性成分である。
【0107】
本発明はまた、コリンを含有する、またはコリンをノックアウトしたトランスジェニック動物、例えばヒトを除くほ乳類、例えばマウスに関する。トランスジェニック動物は、例えば組み換え遺伝子のI細胞胚前核への前核インジョクション、人工酵母染色体の胚幹細胞への組込、ジーンターゲティング法、胚幹細胞法のような公知の方法によって製造できる。アメリカ特許第4736866号;第4873191号;第4873316号;第5082779号;第5304489号;第5174986号;第5175384号:第5175385号;第5221778号;Gordon等, Proc. Natl. Acad. Sci., 77:7380〜7384(1980);Palmiter等, Cell, 41:343〜345(1985);Palmiter等, Ann. Rev. Genet., 20:465〜499(1986);Askew等, Mol. cell. Bio., 13:4115〜4124, 1993;Games等, Nature, 373:523〜527, 1995;ValanciusおよびSmithies, Mol. Cell. Bio., 11:1402〜1408, 1991;Stacey等, Mol. Cell. Bio., 14:1009〜1016,1994;Hasty等, Nature, 350:243〜246, 1995;Rubinstein等, Nucl. Acid Res., 21:2613〜2617, 1993を参照。本発明の核酸をヒトでないほ乳類、例えばマウス(Hogan等, 1986, in Manipulating the Mouse Embryo:A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)、ブタ(Hammer等, Nature, 315:343〜345, 1985)、ヒツジ(Hammer等, Nature, 315:343〜345, 1985)、牛、ラットまたは霊長類に導入できる。Church, 1987, Trends in Biotech, 5:13〜19;Clark等, 1987, Trends in Biotech, 5:20〜24:およびDepamphillis等,1988, Bio Techniques, 6:662〜680も参照のこと。さらに、慣用のトランスジェニックラットおよびマウスは市販されている。これらのトランスジェニック動物は、コリンのヘビ用の飼料としての機能、起源株を検出するマーカーとしての機能等を試験する際の有用な動物である。このようなトランスジェニック動物はさらに別の導入遺伝子を含有していてよいし、またはそれをノックアウトされていてよい(例えば他のセリンプロテアーゼ、ナトリウム排泄増加性ペプチド等)。
【0108】
コリン遺伝子のコピーを多く有するか、強力なプロモーターで制御されたコリン遺伝子を有するか、またはコリンをノックアウトしたトランスジェニック動物は、高血圧、腎疾患および心疾患のモデルとして有利に使用できる。Steinhelper等, Hypertension, 16:301〜307,1990;John等, Am. J. Physiol., 271:R109〜R114,1996参照。
【0109】
従って、本発明はトランスジェニック動物、例えば齧歯類、マウスまたはラットに関し、これらは、細胞の染色体中の未変性のコリン遺伝子座に組み込まれた組み換えコリン遺伝子を有する細胞を含有し、組み換えコリンポリペプチドをコードするヌクレオチドコード配列を有する該組み換えコリン遺伝子は少なくともひとつのアミノ酸から成り、そのアミノ酸の同一性および/または位置は、未変性のコリン遺伝子中で自然に見られるものとは異なっている。このような組み換え遺伝子を、例えば未変性遺伝子座におけるヒトコリンおよび宿主コリン遺伝子間の相同的な組み換えによって製造できる。
【0110】
本発明は、染色体コリン遺伝子座において機能的に破壊された組み換えコリン遺伝子を少なくとも1つ有する細胞を含む、トランスジェニック動物、例えばマウスまたはラットに関し、この際、該破壊により、コリン遺伝子でコードされたコリンポリペプチドの機能発現が抑制される。機能の不活性化または破壊は、例えば、単細胞、選択された細胞、またはあらゆるほ乳類の細胞の内因性セリンプロテアーゼ遺伝子でコードされたポリペプチドの少なくとも一部の発現が部分的にまたは完全に抑制されていることを意味する。このような抑制は、プロ−ANF変換酵素活性の減少も同時に引き起こし、これにより生理化学的に活性なANFが低下する。“ノックアウト”とは、遺伝子の機能的不活性化と同義である。
【0111】
1つの実施態様において、所望のヌクレオチド配列のコリン遺伝子への移入を促進するジーンターゲティング法が利用される。ジーンターゲティング法は有利には、二重相互組み換えおよび標的核酸へのヌクレオチド配列の挿入を助成するポジティブな選択マーカーを使用する。標的核酸は有利に遺伝子、より有利には特定の染色体遺伝子座に位置する遺伝子である。所望のヌクレオチド配列を、遺伝子が機能的に抑制される、すなわち発現が部分的にまたは完全に抑制される方法で、遺伝子に挿入する。
【0112】
染色体遺伝子座でのコリン遺伝子の修飾を、任意の好適な方法、例えば相同組み換えによって実施してよい。後者をコリン遺伝子の抑制、コリン遺伝子への遺伝子突然変異の導入、DNAの挿入または欠失等のために使用する。相同組み換えに効果的な配列の選択および使用について、例えばDengおよびCapecchi, Mol. Cell. Bio.,12:3365〜3371, 1992:Bollag等, Annu. Rev. Genet., 23:199〜225, 1989;WaldmanおよびLiskay, Mol. Cell. Bio., 8:5350〜5357,1988:Rubinstein等,Nucl. acid. Res.,21:2613〜2617, 1993; WO94/23049:WO95/14377に記載されている。
【0113】
コリン遺伝子は、例えば遺伝子の5′領域を欠失させることにより、機能を完全に抑制できる。また、コリンの特異的領域を修飾してもよい。例えば、ヒトコリン遺伝子の約802〜1042番目のアミノ酸の触媒ドメイン、またはマウス遺伝子の相当の位置を、組み換えにより遺伝子的に変化させて、無活性、強活性、弱活性を含む活性の修飾されたコリンを製造してよい。
【0114】
一般的に、本発明の核酸、ポリペプチド、抗体等を、アメリカ特許第5501969号、第5506133号、第5441870号;WO90/00607;WO91/15582号に記載されるようにして製造および使用する。
【0115】
核酸、ポリペプチド、抗体等の別の側面に関して、分子生物学、タンパク質科学または免疫学に関する標準的な教科書を参考文献に挙げることができる。Davis等(1986), Basic Methods in Molecular Biology, Elsevir Sciences Publishing, Inc., New York;Hames等(1985),Nucleic Acid Hybridization, IL Press, Molecular Cloning, Sambrook等;Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel等による編集, John Wiley & Sons, Inc.;Current Protocols in Human Genetics, Nicholas C. Dracopoli等による編集, John Wiley & Sons, Inc.; Current Protocols in Protein Science:Jhon E. Coligan等による編集.,John Wiley & Sons, Inc.;Current Protocols in Immunology;Jhon E. Coligan等による編集.,John Wiley & Sons, Inc.参照。
【0116】
実施例
ヒトコリンcDNAクローンの単離:
新規セリンプロテアーゼcDNAをIncyteESTデータベースに基づいて分析したところ、部分的なEST配列が一致した。クローン(307474)をIncyte社に注文した。クローンからの2.1kbのEcoRI−XhoI断片をヒトの心臓cDNAライブラリー(Clontech)をスクリーニングするために使用した。in vivoにおいて、ポジティブなファージクローンの1つから、3.8kbの挿入部位を有するファージミド14b2を得た。ファージミド14b2に由来するオリゴプライマーを使用し、マラソンレディー(marathon- ready)なヒト心臓cDNA(Clontehch)を鋳型として用い、さらにクローン5=末端cDNA配列を回収する。PCR産物をpCRIIベクター(Invitrogen)へクローン化し、配列を決定する。全長(すなわち開始コドンと終止コドンとを有する)ヒトコリンcDNA配列を、GCGDNA配列分析パッケージを使用し、5′−RACEとファージミドに由来する配列を組み合わせることで獲得する。
【0117】
5′RACEに使用するオリゴプライマー
【0118】
【外1】
【0119】
ノーザン分析:
Incyte社のクローン307474の2.1kb−EcoRI−XhoI断片を、ランダムプライマーラベリングキット(Boehringer)を使用し、32P−dCTPで標識した。ヒト多組織ノーザンブロットI、ヒト多組織ノーザンブロットII、ヒト筋肉ノーザンブロットフィルター(Clontech)を、標識したヒトコリンcDNAプローブとハイブリダイズさせた。ノーザンハイブリダイゼーションを42ECで40%ホルムアルデヒド、5Xデンハルツ溶液(Denhardts solution)、6×SSC、鮭の精子DNA100μg/ml、0.1%SDSを用いて一晩実施した。フィルターを、0.2×SSC、0.1%SDSを用いて60ECで洗浄し、フジイメージングプレート(Fuji imaging plates)へ曝露した。
【0120】
マウスコリンcDNAのクローニング
マウスコリンcDNAクローンを、PCRを基礎とする方法で単離した。マウスの心臓のcDNAライブラリーをClontechより購入し、PCR増幅のテンプレートとして使用した(1.5分−55ECでのアニーリング、1.5分−72ECでの伸長、1分−94ECでの変性を30サイクル)。PCRプライマーの配列は、ヒトコリンcDNA配列を基礎とする。マウスcDNAの増幅に使用したプライマーには以下が含まれる:
【0121】
【外2】
【0122】
PCR反応由来のDNA断片をpCRIIベクター中にクローン化した。独立PCR反応由来のプラスミドクローンを次ぎのシークエンスに使用した。マウスおよびヒトコリンcDNAは、配列の85%が一致している。
【0123】
in situハイブリダイゼーション
RT−PCR−mRNAサンプルを、市販のRNA製造キット(RNA preparation kit (Oligotex Direct mRNA Mini Kits, QIAGEN))を使用して、 Hec−1−A、U2−OS、SK−LMS−1およびAN3−CA細胞から単離した。最初に鎖状cDNAを、SuperScriptII RNase逆転写酵素(Life Technologies)を使用して合成した。ヒトコリン特異的オリゴヌクレオチドプライマー(センスプライマー:
【0124】
【外3】
【0125】
アンチセンスプライマー:
【0126】
【外4】
【0127】
)を使用して、コリンcDNAのヌクレオチド2475〜3105間の630bpの断片を増幅した。ヒトグリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)遺伝子に由来するオリゴヌクレオチドプライマーTFR1:
【0128】
【外5】
【0129】
およびTFR2:
【0130】
【外6】
【0131】
を、内部定量の制御に使用した。PCR反応をサーマルサイクラー(Perkin- Elmer, model 480)で実施した。PCR産物を1%アガロースゲル上で分離し、エチジウムブロマイド染色により視覚化した。
【0132】
in situハイブリダイゼーション−−成体マウスの心臓および胚組織部分をキシレン中で脱パラフィン処理し、再度水和物とし、4%パラホルムアルデヒド中に固定した。組織をプロテイナーゼK(20mg/ml)で分解し、トリエタノールアミン/無水酢酸で処理し、脱水した。コード領域に由来する800bpのマウスコリンcDNA断片を、プラスミドpM11およびpM41を得るために、2方向でpCRII(Invitrogen)中にクローン化した。プラスミドを、HindIII切断により直線化した。センスおよびアンチセンスプローブを、T7RNAポリメラーゼ(T7/SP6転写キット、Boehirnger Mannharim)を使用して製造し、[33P]UTP(Amersham)で標識した。ハイブリダイゼーションを(14)に記載されるようにして実施した。スライドを脱水し、Kodak社製NTB−2エマルジョンに浸し、遮光性の箱の中に4℃で4週間放置した。現像をKodak社製D−19現像装置中で実施した。スライドをヘモトキシンとエオシンとで染色し、ツァイスの顕微鏡の光学レンズおよび暗視野レンズの両方を使用して分析した。
【0133】
蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)分析−−ヒトコリン遺伝子を含むP1ファージクローンを、ヒトコリンcDNAをプローブとして使用したフィルターハイブリダイゼーションにより単離した。ヒトコリンcDNA由来のプライマーを使用したDNAシークエンスにより、1つのクローンを確認した。このP1ファージに由来するDNA断片をジゴキシゲニン−dUTPで標識した。標識したプローブを切断したヒトDNAと結合させ、50%ホルムアルデヒド、10%硫酸デキストランおよび2×SSCを含む溶液中のPHA−刺激抹消血液リンパ球に由来する中期染色体とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションシグナルを、蛍光標識抗ジゴキシゲニン抗体により検出し、DAPI(4,6−ジアミノイジノ−2−フェニルインドール)で対比染色した。合計80個の中期細胞のうち74細胞は特異的に標識されたという結果が分析された。
【0134】
コリンのプロテアーゼドメインの相同モデル−−コリンプロテアーゼドメイン(アミノ酸802〜1042)のモデルを、ホモロジープログラム(Insight II, 1995, MSI, San Diego, CA)を使用し、18Åの解像度(15,16)で、牛キモトリプシノーゲンA構造を基礎として設計した。非同一側鎖置換に回転異性体を使用した(16)。ループ挿入のための座標をブルックハーベンのタンパク質データバンクから獲得した(17)。距離依存的な誘電率を有するAMBER力場(Discover 95.0)を使用したエネルギーの最小化によりモデルを精製した。最小化には、最急降下法および共役勾配法(conjugate gradient method)を利用する:まず、挿入と欠失が見られる場所に限ったループに関して、次いで側鎖に関して、最小化の最後にはCa原子を固定した状態にする。テンプレート構造の酵素トライアドに相当するコリン残基(His843、Asp892およびSer985)も固定されたままである。
【0135】
コリンの生物学的活性
いくつかの異なる細胞系を慣用の方法で製造し、コリンの生物学的活性をアッセイした。293細胞は、pro−ANFおよびコリン発現プラスミドを同時に形質移入されている。pro−ANF発現プラスミドおよびヘプシンまたはプロトロンビン発現プラスミドを同時に293細胞に形質移入し、2個の別の細胞系を構築した。ANFに対する抗体を使用したウェスタンブロットで立証されたように、コリンを発現した細胞のみがpro−ANFをANFに変換した。
【0136】
別の実験も実施し、この際、pro−ANFを含有する調整培地を組み換えコリンポリペプチドを発現する細胞と接触させた。この場合も、pro−ANFはANFへと変換された。ヘプシンまたはプロトロンビンを発現するコントロールの細胞は、pro−ANFに対する効果を有さない。
【0137】
当業者が前記を参照して本発明を最大限に利用できることは容易に推測できる。前記の有利でありかつ特異的な実施態様は、従って、詳細な記載でしかなく、他の記載を限定するものではない。
【0138】
あらゆる出願、特許、公開文書、登録番号を有する核酸等、記載および図に引用した全記載は、記載したことにより、参考文献として全てを組み込んだものとし、これにはユニジーンPubESTおよびGenbBankデータベース由来の核酸断片を含む: Hs.62794(AA126468[1686098]、AA126648[1686206]、AA625395[2537780]、AA046682[1524579]、AA249850[1881137]、およびHs.71798(AA147031[1716421]);Hs.121626(AA771958)、Hs.1657(M69297)、およびHs.47712(AA203291)、g1231787;g1312726;g1337948;およびg942724。
【0139】
前記により、当業者はこの発明の本質的な特徴を容易に確認でき、その精神および目的を離れることなく、用途および条件に適するように本発明を様々に変化修飾することができる。
配列表
【0140】
【外7】
【0141】
【外8】
【0142】
【外9】
【0143】
【外10】
【0144】
【外11】
【0145】
【外12】
【0146】
【外13】
【0147】
【外14】
【0148】
【外15】
【0149】
【外16】
【0150】
【外17】
【0151】
【外18】
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、ヒトコリンポリペプチドに関する機能ドメインの配置を示す図である。
【図2】 図2は、ヒトコリンポリペプチド由来の縮れドメイン(コリンCrd1およびコリンCrd2)とFrizzled、Fz−1およびlin−17のアミノ酸配置を示す図である。
【図3】 図3は、ヒトコリンポリペプチドで確認されるLDLR反復のアミノ酸配列の配置とヒトLDLRの共通配列を示す図である。
【図4】 図4は、ヒトコリンセリンプロテアーゼドメイン(コリン)と別の3つのタンパク質に存在するセリンプロテアーゼのアミノ酸配列の配置を示す図である。KALはカリクレイン、ENTKはエンテロキナーゼ、TRP1はトリプシンである。
Claims (8)
- 配列番号2記載のアミノ酸1〜1042から成る、単離されたヒトコリンポリペプチドの全長。
- 配列番号1のDNA配列によってコードされる、請求項1記載の単離されたヒトコリンポリペプチドの全長。
- クローニングベクター中に存在する、配列番号2のアミノ酸1〜1042から成るヒトコリンポリペプチドの全長をコードするヌクレオチド配列から成る、単離された核酸。
- 配列番号1のヌクレオチド配列を有する、請求項3記載の単離された核酸。
- 請求項3記載の、配列番号2に記載の塩基配列から成る核酸を含むベクター。
- 配列番号1に記載の塩基配列から成る核酸を含有する形質転換された宿主細胞を、配列番号2に記載のアミノ酸配列から成るポリペプチドが効果的に発現される条件下に培養し、該ポリペプチドを含有する該宿主細胞の膜分画を単離する:
ことから成る、形質転換された宿主細胞中で配列番号1に記載の塩基配列から成る核酸でコードされた配列番号2の全長ヒトコリンを発現させる方法。 - 試験化合物の存在下に、配列番号2のアミノ酸1〜1042の配列を有するヒトコリンポリペプチドの全長とセリンプロテアーゼのための色素原基質とを、該ポリペプチドが該基質を効果的に切断できる条件で反応させ、その結果、検出可能な色が出現することによって該切断を検出し、試験化合物の存在および不在時の切断量を比較することで、試験化合物がセリンプロテアーゼ活性を調節するかどうかを確認する:
ことから成る、ヒトコリンポリペプチド活性のセリンプロテアーゼ触媒活性のモジュレーターを同定する方法。 - 該ヒトコリンポリペプチドの全長が、配列番号1に記載の核酸配列にコードされるアミノ酸配列を有する、請求項7記載の方法。
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