JPH0987299A

JPH0987299A - Ｍｍｐ−２活性化因子に特異的なモノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH0987299A
Application number: JP8200985A
Authority: JP
Inventors: Akira Shinagawa; 朗品川; Motoharu Seiki; 元治清木; Hiroshi Sato; 博佐藤
Original assignee: Fuji Yakuhin Kogyo KK
Current assignee: Fuji Yakuhin Kogyo KK
Priority date: 1995-07-14
Filing date: 1996-07-12
Publication date: 1997-03-31

Abstract

(57)【要約】【課題】癌細胞の有無、癌の悪性度の診断等の癌の診
断治療に関わる研究に有用な診断手段に、さらにその他
の医学的生理学的用途に有用な、新規なタンパク質に対
する抗体、特にはモノクローナル抗体を提供する。【解決手段】ヒト癌細胞表層で特異的に発現している
潜在型ＭＭＰ−２の活性化能を有し且つＭＭＰの一種で
あるＭＴ−ＭＭＰ−１以外の潜在型ＭＭＰ−２活性化因
子であるＭＴ−ＭＭＰ−３に特異的に結合するモノクロ
ーナル抗体、そのＭＴ−ＭＭＰ−３をコードする塩基配
列を含有するＤＮＡ、該ＤＮＡで形質転換せしめた宿主
細胞、該宿主細胞を用いる該マトリックスメタロプロテ
アーゼの製造方法、さらにはそれらタンパク質及び抗体
の用途。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は癌細胞の有無、癌の
悪性度の診断等の癌の診断治療に関わる研究に有用な診
断手段として、あるいはその他の医学的生理学的用途に
有用な、新規なタンパク質及びそれをコードする遺伝子
に関するものである。特に本発明は、潜在型ＭＭＰ−２
の活性化能を有するＭＭＰの一種であるＭＴ−ＭＭＰ−
１以外の潜在型ＭＭＰ−２活性化因子である新規な膜結
合型タンパク質及びそれをコードする遺伝子に関する。
さらに詳しくは、本発明はヒト癌細胞表層で特異的に発
現している新規マトリックスメタロプロテアーゼ〔本発
明で明らかにされた新規マトリックスメタロプロテアー
ゼをＭＴ−ＭＭＰ−３（Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ＴｙｐｅＭ
ａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−
３）と命名する〕、それをコードする塩基配列を含有す
るＤＮＡ、該ＤＮＡで形質転換せしめた宿主細胞、該宿
主細胞を用いる該マトリックスメタロプロテアーゼの製
造方法、該マトリックスメタロプロテアーゼタンパク質
に特異的に結合するモノクローナル抗体、さらにはそれ
らタンパク質及び抗体の用途に関するものである。

【０００２】

【従来技術】原発巣組織内に存在する癌細胞が浸潤、転
移するためには、その周囲に存在する細胞外マトリック
スが、癌細胞の移動の障害になる。したがって、癌細胞
が組織を浸潤し転移するには、原発巣からの遊離、周辺
の細胞外マトリックスの破壊が必要となる。癌細胞の転
移は、その後基底膜の破壊、血管への侵入、侵出、二次
臓器への生着、増殖等の段階を経て成立する。癌細胞の
転移の障壁となっている細胞外マトリックスは、ＩＶ型
コラーゲン、プロテオグリカン、エラスチン、フィブロ
ネクチン、ラミニン、ヘパラン硫酸等の複雑な成分から
構成されているが、この細胞外マトリックスの分解に
は、基質特異性を異にするマトリックスメタロプロテア
ーゼ（以下ＭＭＰと略記する）と総称される一群の酵素
が関与している。

【０００３】これまでにＭＭＰとして間質型コラゲナー
ゼ（ＭＭＰ−１）、７２ｋＤａゼラチナーゼ（ＩＶ型
コラゲナーゼあるいはゼラチナーゼＡともいう：ＭＭＰ
−２）、９２ｋＤａゼラチナーゼ（ＩＶ型コラゲナー
ゼあるいはゼラチナーゼＢともいう：ＭＭＰ−９）、ス
トロムライシン−１（ＭＭＰ−３）、マトリライシン
（ＭＭＰ−７）、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ−８）、
ストロムライシン−２（ＭＭＰ−１０）、ストロムライ
シン−３（ＭＭＰ−１１）等が報告されている（Ｃｒｉ
ｔ．Ｒｅｖ．Ｏｒａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，４：１９
７〜２５０，１９９３）。これらのＭＭＰはファミリー
を形成し、遺伝子の一次構造は既に報告されている。こ
れらのＭＭＰのｃＤＮＡデータから推定されるアミノ酸
配列には相同性が認められており、基本的に分泌産生時
に除かれるＮ末端のシグナルペプチドに続き、プロペプ
チドドメイン、Ｚｎ⁺結合触媒ドメイン、５〜５０アミ
ノ酸よりなるプロリンに富んだヒンジドメイン、Ｃ−末
端のヘモペキシン凝血酵素様ドメインから構成されてい
る。ＭＭＰ−７においてはヘモペキシン凝血酵素様ドメ
インはない。ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９では、この他にゼ
ラチン結合ドメインを含んでいる。

【０００４】これらのＭＭＰのうち、基底膜の主要構造
体であるＩＶ型コラーゲンを主たる基質とするＩＶ型コ
ラゲナーゼ（ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９）は、高転移性の
癌細胞における高い発現が数多く報告され、癌細胞の基
底膜浸潤への関与が提唱されてきた（Ｃｅｌｌ．，６
４：３２７〜３３６，１９９１）。ＭＭＰの活性発現調
節は、少なくとも転写レベル、酵素活性を示さない潜在
型酵素から活性型酵素への活性化の段階、ＭＭＰの特異
的阻害剤であるティシュインヒビターオブメタロプ
ロテアーゼ（ＴＩＭＰ）による活性調節などといった段
階で行われていると考えられている（ＴｒｅｎｄｓＧ
ｅｎｅｔ．，６：１２１〜１２５，１９９０）。全ての
ＭＭＰは不活性な潜在型として分泌されるが、Ｉｎｖ
ｉｔｒｏの実験では、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−９の活性化
は、プラスミン、トリプシン、カテプシンＧ等のセリン
プロテアーゼによって生じることが示されており、さら
に、ＭＭＰ−９の活性化が活性型ＭＭＰ−３の作用によ
っても引き起こされることが報告されている（Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：３５８１〜３５８４，１９
９２）。しかしながら、ＭＭＰ−２が上述のプロテアー
ゼの切断部位を持たないため、ＭＭＰ−２の活性化は、
これらによっては起こらないと考えられている（Ｃｕｒ
ｒ．Ｏｐｉｎ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，５：８９１〜８
９７，１９９３）。

【０００５】一方、これらのＭＭＰは、必ずしも癌細胞
だけから産生されている訳ではなく、周辺の線維芽細胞
や炎症細胞からもそれぞれ異なるＭＭＰが産生されてい
ることも報告されている（ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，２４：２０９〜２１８，１９
９３．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，
５：８９１〜８９７，１９９３）。中でもＭＭＰ−２
は、組織構築の改変を伴うような様々な部位の線維芽細
胞で発現しているが、正常組織と癌組織のＭＭＰ−２を
比較するとその活性化が癌組織で特異的に生じているこ
とが肺癌の例等で報告されている（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，１１：１８３〜１８９，１９９
３）。ＭＭＰ−９では、活性型が検出される頻度は低
い。また、癌細胞の浸潤の先端（ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉ
ａ）で活性型ＭＭＰ−２が局在することがＩｎｖｉｔ
ｒｏの実験系で示され、癌細胞浸潤における重要性が示
唆されている（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５３：３１５
９〜３１６４，１９９３．ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，５３：３１５９〜３１６
４，１９９４）。

【０００６】この様な背景から、ＭＭＰ−２の活性化機
構が注目されてきたが、前述の様にＭＭＰ−１、ＭＭＰ
−９の活性化がトリプシンなどのセリンプロテアーゼで
誘導されるのに対し、ＭＭＰ−２の活性化機構は不明で
あり、特に活性化因子は同定されていなかった。ＭＭＰ
−２の産生細胞であるＨＴ１０８０細胞をコンカナバリ
ンＡや１２−ο−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒ
ｂｏｌ１３−ａｃｅｔａｔｅ（ＴＰＡ）で処理すると
活性型ＭＭＰ−２が培養上清に出現することが知られて
おり、これらの細胞では、ＭＭＰ−２の活性化因子が誘
導されていると考えられる（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅ
ｒＩｎｓｔ．８５：１７５８〜１７６４，１９９３．
Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．，１１：１
８３〜１８９．１９９３）。このＭＭＰ−２の活性化が
細胞膜画分により誘導されること、キレート剤やＴＩＭ
Ｐによって活性化が抑制されることから、活性化因子は
膜結合型のＭＭＰの１種であることが想定された（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１４０３３〜１４０３
９，１９９３）。

【０００７】本発明者らは、先に遺伝子工学的手法によ
り新規なＭＭＰ遺伝子のクローニングを行い、Ｃ末端に
典型的なトランスメンブレン・ドメインを持ち、ＭＭＰ
−２を活性化する新しいＭＭＰをコードする遺伝子をク
ローニングした（Ｎａｔｕｒｅ，３７０：６１〜６５，
１９９４）。実際、この遺伝子を培養細胞で発現させる
と、その遺伝子産物は分泌されることなく細胞膜上に局
在したことから、本発明者らはこういったＭＭＰをＭＴ
−ＭＭＰ（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｔｙｐｅＭＭＰ）と命
名した。これまで述べてきたようにＭＭＰとりわけＭＭ
Ｐ−２は、その活性型が癌細胞特異的に見出されること
から、抗癌、癌などに対する抗転移薬の標的として益々
認識されつつある。しかしながら、ＭＭＰ−２は正常組
織においても潜在型として比較的恒常的に存在すること
から、活性発現調節は活性化酵素への活性化の過程にあ
り、その鍵を握る活性化因子の探索、同定は癌の診断、
悪性度の判定マーカー及び癌などに対する抗転移薬剤の
標的として極めて重要であるとすることができる。

【０００８】また、アルツハイマー病の発症に関与する
βアミロイドタンパク質の切断におけるＭＭＰ−２の関
与が指摘されている。βアミロイドタンパク質はアミロ
イドタンパク質前駆体の一部であり、βアミロイドタン
パク質領域は、その１／４がアミロイドタンパク質前駆
体の膜貫通領域に含まれ、残りは細胞外に出ている。最
近、アミロイドタンパク質前駆体の複数の代謝が明らか
にされたが、その一つは、αセクレターゼと呼ばれるプ
ロテアーゼによりβアミロイドタンパク質領域内を切断
され、細胞外放出されるものである。最近、ＭＭＰ−２
にαセクレターゼ様のβアミロイドタンパク質分解活性
が見出され、ＭＭＰ−２がαセクレターゼあるいは細胞
外でのβアミロイドタンパク質分解酵素として機能して
いる可能性が指摘されている（Ｎａｔｕｒｅ，３６２：
８３９，１９９３）。βアミロイドタンパク質は、アル
ツハイマー病患者の脳で観察される老人斑の主成分であ
り、βアミロイドタンパク質の自己凝集と沈着により老
人斑のコアを形成する。アルツハイマー病の患者の脳で
はβアミロイドタンパク質分解酵素の機能低下が生じて
いる可能性もあることからＭＭＰ−２が注目されている
が、やはりその鍵を握るのはＭＭＰ−２の活性化の過程
である。先に本発明者らが同定したＭＴ−ＭＭＰ（新た
に、ここで「ＭＴ−ＭＭＰ−１」と名付けられた）はＭ
ＭＰ−２の活性化因子であると考えられるが、ＭＴ−Ｍ
ＭＰ−１のような未知のＭＭＰが存在することは、細胞
外マトリックスには多様な構成成分が存在することから
も充分に予想され、ＭＴ−ＭＭＰ−１以外のＭＭＰ−２
の活性化因子の存在も否定できない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、潜在型ＭＭ
Ｐ−２の活性化能を有するＭＭＰの一種であり且つＭＴ
−ＭＭＰ−１以外であって潜在型ＭＭＰ−２活性化能を
有する潜在型ＭＭＰ−２活性化因子である新規なタンパ
ク質及びそれをコードする遺伝子、該潜在型ＭＭＰ−２
活性化因子である新規なタンパク質の製造方法及び該タ
ンパク質及び該遺伝子の用途等を提供することを目的と
する。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、潜在型Ｍ
ＭＰ−２の活性化が癌細胞膜画分により誘導されるこ
と、キレート剤やＴＩＭＰによって活性化が抑制される
ことから活性化因子は膜結合型のＭＭＰの１種であると
想定されていることに着目し、先に潜在型ＭＭＰ−２活
性化能を有する新規なＭＭＰをコードする遺伝子を単離
したが、これ以外にもＭＭＰ−２の活性化因子として作
用するＭＭＰや生化学的に既知のＭＭＰと異なるＭＭＰ
が存在するのではないかと考え、遺伝子工学的手法を用
い種々研究した結果、新たな潜在型ＭＭＰ−２活性化能
を有するＭＭＰをコードする遺伝子を単離することに成
功し、本発明を完成させるに至った。

【００１１】現在まで、潜在型ＭＭＰ−２の活性化能を
有するＭＭＰとしてＭＴ−ＭＭＰ−１が知られていた
が、それ以外の潜在型ＭＭＰ−２活性化因子については
同定されていなかった。本発明者により新規な潜在型Ｍ
ＭＰ−２活性化因子たるＭＭＰの遺伝子がクローニング
され、遺伝子塩基配列およびアミノ酸配列の全てが明ら
かにされるに至った。本発明者らは、この新規なＭＭＰ
を当初ＭＴ−ＭＭＰ−２と命名した（平成７年（１９９
５年）７月１４日に日本国に出願された特願平７−２０
０３１９号並びに特願平７−２００３２０号）が、ゴー
ドンリサーチコンファレンスオンマトリックス
メタロプロテアーゼズ（アンドーバーエヌエイチ１９
９５年７月１６−２１日）〔Gordon Research Conferen
ce onMatrix Metalloproteinases (Andover, NH July 1
6-21, 1995)〕において、このものは新たに「ＭＴ−Ｍ
ＭＰ−３」と呼ぶべきものとされ、そこに於いて「ＭＴ
−ＭＭＰ−３」と呼称するとの合意がなされた（ザジ
ャーナルオブバイオロジカルケミストリー (The
Journal of Biological Chemistry), Vol. 270,pp.230
13-23020 (1995)）。したがって、本ＭＴ−ＭＭＰ−３
は、特願平７−２００３１９号並びに特願平７−２００
３２０号に記載のＭＴ−ＭＭＰ−２と同一のものを指し
ているのである。

【００１２】すなわち、本発明は新規なタンパク質、Ｍ
Ｔ−ＭＭＰ−３及びその類縁体に関わるものである。さ
らに本発明は新規なＭＴ−ＭＭＰ−３の全体又は一部を
コードするＤＮＡ配列、このようなＤＮＡ配列を有する
ベクター及びこのようなベクターで形質転換又はトラン
スフェクションされた宿主細胞にも関する。さらに組換
えＭＴ−ＭＭＰ−３の製造法及びその用途も包含してい
る。またＭＴ−ＭＭＰ−３に特異的に結合する抗体にも
関する。別の観点からは上記の産物を用いた測定試薬、
その試薬を用いた測定方法にも関する。特には、生体内
及び生体外でのＭＴ−ＭＭＰ−３を測定する手法も提供
される。本発明は、潜在型ＭＭＰ−２の活性化能を有す
るＭＭＰの一種であるがＭＴ−ＭＭＰ−１以外の潜在型
ＭＭＰ−２活性化因子である天然のＭＴ−ＭＭＰと実質
的に同等な活性を有するタンパク質またはその塩、その
タンパク質の特徴的な部分ペプチドまたはその塩、それ
らをコードする遺伝子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡなど、そ
の遺伝子を遺伝子組換え技術で操作することが可能なよ
うに含有しているベクターあるいはプラスミド、こうし
たベクターなどで形質転換された宿主細胞、その宿主細
胞を、培養して該タンパク質またはその塩を製造する方
法、こうして得られた該タンパク質またはその塩やその
タンパク質の特徴的な部分ペプチドまたはその塩を用い
て得られた抗体、特にはモノクローナル抗体、その抗体
を産生するハイブリドーマ細胞、該単離された遺伝子、
例えばＤＮＡ、ＲＮＡなどをプローブとして用いたり、
あるいは該抗体を用いた測定診断手段に関する。

【００１３】特には本発明は、潜在型ＭＭＰ−２の活性
化能を有するＭＭＰの一種であるがＭＴ−ＭＭＰ−１以
外の潜在型ＭＭＰ−２活性化因子である天然のＭＴ−Ｍ
ＭＰ−３と実質的に同等な活性を有するタンパク質また
はその塩、そのタンパク質の特徴的な部分ペプチドまた
はその塩、それらをコードする遺伝子、例えばＤＮＡ、
ＲＮＡなど、その遺伝子を遺伝子組換え技術で操作する
ことが可能なように含有しているベクターあるいはプラ
スミド、こうしたベクターなどで形質転換された宿主細
胞、その宿主細胞を、培養して該タンパク質またはその
塩を製造する方法、こうして得られた該タンパク質また
はその塩やそのタンパク質の特徴的な部分ペプチドまた
はその塩を用いて得られた抗体、特にはモノクローナル
抗体、その抗体を産生するハイブリドーマ細胞、該単離
された遺伝子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡなどをプローブと
して用いたり、あるいは該抗体を用いた測定診断手段に
関する。好ましくは、本発明では、配列表の配列番号：
２で表されるアミノ酸配列又はそれと実質的に同等のア
ミノ酸配列を有することを特徴とするＭＴ−ＭＭＰ−３
またはその塩が挙げられる。

【００１４】本発明に従えば、次のような態様、すなわ
ち（１）潜在型ＭＭＰ−２の活性化能を有するＭＭＰの
一種であり且つＭＴ−ＭＭＰ−１以外の潜在型ＭＭＰ−
２活性化因子である天然のＭＴ−ＭＭＰと実質的に同等
な活性を有することを特徴とするタンパク質またはその
塩、（２）該タンパク質がＭＴ−ＭＭＰ−３またはその
塩と、実質的に同等な活性を有するか、あるいは実質的
に同等の一次構造コンフォメーションを持つものである
ことを特徴とする上記第（１）項記載のタンパク質、
（３）Ｃ末端領域に、配列表の配列番号：２のＡｌａ
⁵⁶¹ 〜Ｐｈｅ⁵⁸⁴ で表されるアミノ酸配列又はそれと実
質的に同等のアミノ酸配列を有することを特徴とする上
記第（１）又は（２）項記載のタンパク質、（４）配列
表の配列番号：２で表されるアミノ酸配列又はそれと実
質的に同等のアミノ酸配列を有するＭＴ−ＭＭＰ−３ま
たはその塩であることを特徴とする上記第（１）〜
（３）項のいずれか一記載のタンパク質、（５）外因性
ＤＮＡ配列を原核生物において発現して得たものである
か、あるいは真核生物で発現させて得たものであること
を特徴とする上記第（１）〜（４）項のいずれか一記載
のタンパク質、（６）配列表の配列番号：２で表される
アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するこ
とを特徴とする上記第（１）〜（５）項のいずれか一記
載のタンパク質、（７）上記第（１）〜（６）項のいず
れか一記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、

【００１５】（８）上記第（１）〜（７）項のいずれか
一記載のタンパク質又はその部分ペプチドをコードする
塩基配列を有することを特徴とする核酸、（９）上記第
（２）〜（４）項のいずれか一記載のＭＴ−ＭＭＰ−３
をコードする塩基配列を有するＤＮＡ遺伝子であること
を特徴とする上記第（８）項記載の核酸、（１０）配列
表の配列番号：１で表される塩基配列のうちオープンリ
ーディングフレーム部分又はそれと実質的に同等な活性
を有する塩基配列を有することを特徴とする上記第
（８）又は（９）項記載の核酸、（１１）上記第（８）
〜（１０）項のいずれか一記載の核酸を含有することを
特徴とするベクター、（１２）上記第（８）〜（１０）
項のいずれか一記載の核酸又は上記第（１１）項記載の
ベクターを保有することを特徴とする形質転換体、及び
（１３）上記第（１２）項記載の形質転換体を増殖可能
な栄養培地中で培養し、組換えタンパク質としてＭＴ−
ＭＭＰ−３またはその塩を包含する上記第（１）〜
（６）項のいずれか一記載のタンパク質又はその部分ペ
プチドを生成せしめることを特徴とするＭＴ−ＭＭＰ−
３またはその塩を包含する上記第（１）〜（６）項のい
ずれか一記載のタンパク質又はその部分ペプチドの製造
方法が提供される。

【００１６】本発明は、（１４）潜在型ＭＭＰ−２の活
性化能を有するＭＭＰの一種であり且つＭＴ−ＭＭＰ−
１以外の潜在型ＭＭＰ−２活性化因子である天然のＭＴ
−ＭＭＰと実質的に同等な活性を有することを特徴とす
るタンパク質又はその塩あるいはその部分ペプチド又は
その塩に対する抗体、（１５）ＭＴ−ＭＭＰ−３または
その塩と、実質的に同等な活性を有するか、あるいは実
質的に同等の一次構造コンフォメーションを持つもので
あるタンパク質に対する抗体であることを特徴とする上
記第（１４）項記載の抗体、（１６）配列表の配列番
号：２で表されるアミノ酸配列又はそれと実質的に同等
のアミノ酸配列を有するＭＴ−ＭＭＰ−３又はその塩で
あるタンパク質に対する抗体であることを特徴とする上
記第（１４）又は（１５）項記載の抗体、（１７）外因
性ＤＮＡ配列を原核生物において発現して得たものであ
るか、あるいは真核生物で発現させて得たものであるタ
ンパク質に対する抗体であることを特徴とする上記第
（１４）〜（１６）項のいずれか一記載の抗体、（１
８）配列表の配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実
質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質に対する
抗体であることを特徴とする上記第（１４）〜（１７）
項のいずれか一記載の抗体、（１９）タンパク質の部分
ペプチド又はその塩に対する抗体であることを特徴とす
る上記第（１４）〜（１８）項のいずれか一記載の抗
体、（２０）抗血清であることを特徴とする上記第（１
４）〜（１９）項のいずれか一記載の抗体、（２１）モ
ノクローナル抗体であることを特徴とする上記第（１
４）〜（１９）項のいずれか一記載の抗体、（２２）Ｍ
Ｔ−ＭＭＰ−３又はその塩に対するモノクローナル抗体
であることを特徴とする上記第（１４）〜（１９）及び
（２１）項のいずれか一記載の抗体、

【００１７】（２３）潜在型ＭＭＰ−２の活性化能を有
するＭＭＰの一種であり且つＭＴ−ＭＭＰ−１以外の潜
在型ＭＭＰ−２活性化因子である天然のＭＴ−ＭＭＰと
実質的に同等な活性を有することを特徴とするタンパク
質又はその塩あるいはその部分ペプチド又はその塩を抗
原として用い、それに対する抗体を得ることを特徴とす
る潜在型ＭＭＰ−２の活性化能を有するＭＭＰの一種で
あり且つＭＴ−ＭＭＰ−１以外の潜在型ＭＭＰ−２活性
化因子である天然のＭＴ−ＭＭＰと実質的に同等な活性
を有するタンパク質又はその部分ペプチドに対する抗体
の製造方法、（２４）潜在型ＭＭＰ−２の活性化能を有
するＭＭＰの一種であり且つＭＴ−ＭＭＰ−１以外の潜
在型ＭＭＰ−２活性化因子である天然のＭＴ−ＭＭＰと
実質的に同等な活性を有することを特徴とするタンパク
質又はその塩あるいはその部分ペプチド又はその塩で免
疫した動物から得られた、潜在型ＭＭＰ−２の活性化能
を有するＭＭＰの一種であり且つＭＴ−ＭＭＰ−１以外
の潜在型ＭＭＰ−２活性化因子である天然のＭＴ−ＭＭ
Ｐと実質的に同等な活性を有することを特徴とするタン
パク質又はその部分ペプチドに対する抗体を産生する細
胞を、継代培養可能な細胞と融合せしめ、継代培養可能
でかつＭＴ−ＭＭＰ−３を包含するタンパク質に対する
抗体を産生するハイブリッド細胞を選別することを特徴
とする上記第（２１）又は（２２）項記載の抗体の産生
方法、（２５）潜在型ＭＭＰ−２の活性化能を有するＭ
ＭＰの一種であり且つＭＴ−ＭＭＰ−１以外の潜在型Ｍ
ＭＰ−２活性化因子である天然のＭＴ−ＭＭＰと実質的
に同等な活性を有することを特徴とするタンパク質又は
その塩あるいはその部分ペプチド又はその塩を試薬とし
て用いるか、あるいは上記第（１４）〜（２２）項のい
ずれか一記載の抗体を試薬として用いることを特徴とす
るＭＴ−ＭＭＰ−３の検出・測定方法、（２６）上記第
（２５）項のＭＴ−ＭＭＰ−３の検出・測定方法に用い
る標識化されたＭＴ−ＭＭＰ−３に対する抗体、（２
７）上記第（２５）項のＭＴ−ＭＭＰ−３の検出・測定
方法に用いる潜在型ＭＭＰ−２の活性化能を有するＭＭ
Ｐの一種であり且つＭＴ−ＭＭＰ−１以外の潜在型ＭＭ
Ｐ−２活性化因子である天然のＭＴ−ＭＭＰと実質的に
同等な活性を有するタンパク質又はその塩あるいはその
部分ペプチド又はその塩であることを特徴とする標識化
されたタンパク質あるいは部分ペプチド又はその塩、
（２８）ＭＴ−ＭＭＰ−３発現細胞あるいは組織の検出
・測定方法に用いる潜在型ＭＭＰ−２の活性化能を有す
るＭＭＰの一種であり且つＭＴ−ＭＭＰ−１以外の潜在
型ＭＭＰ−２活性化因子である天然のＭＴ−ＭＭＰと実
質的に同等な活性を有するタンパク質又はその部分ペプ
チドをコードすることを特徴とする標識化された核酸、
及び（２９）ハイブリダイゼーション・プローブである
ことを特徴とする上記第（２８）項記載の核酸を提供す
る。

【００１８】本発明に従えば、特に次のような態様、す
なわち（３０）配列表の配列番号：２で表されるアミノ
酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する
ことを特徴とするＭＴ−ＭＭＰ−３またはその塩、（３
１）上記第（３０）項記載のＭＴ−ＭＭＰ−３の部分ペ
プチドまたはその塩、（３２）上記第（３０）項記載の
ＭＴ−ＭＭＰ−３をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
遺伝子、（３３）配列表の配列番号：１で表される塩基
配列を有する上記第（３２）項記載のＤＮＡ遺伝子、
（３４）上記第（３２）項記載の遺伝子を含有するベク
ター、（３５）上記第（３２）項記載の遺伝子又は上記
第（３４）項記載のベクターを保有する形質転換体、及
び（３６）上記第（３５）項記載の形質転換体を増殖可
能な栄養培地中で培養し、組換えタンパク質としてＭＴ
−ＭＭＰ−３またはその塩を生成せしめることを特徴と
するＭＴ−ＭＭＰ−３またはその塩の製造方法、（３
７）上記第（３０）項記載のＭＴ−ＭＭＰ−３又はその
塩あるいはその部分ペプチド又はその塩を抗原として用
い、それに対する抗体を得ることを特徴とするＭＴ−Ｍ
ＭＰ−３に対する抗体の製造方法が提供される。

【００１９】特に本発明は、（３８）上記第（３１）項
記載のＭＴ−ＭＭＰ−３に対する抗体、（３９）抗血清
であることを特徴とする上記第（３８）項記載のＭＴ−
ＭＭＰ−３に対する抗体、（４０）モノクローナル抗体
であることを特徴とする上記第（３８）項記載のＭＴ−
ＭＭＰ−３に対する抗体、（４１）上記第（３０）項記
載のＭＴ−ＭＭＰ−３又はその塩あるいはその部分ペプ
チド又はその塩で免疫した動物から得られたＭＴ−ＭＭ
Ｐ−３に対する抗体を産生する細胞を、継代培養可能な
細胞と融合せしめ、継代培養可能でかつＭＴ−ＭＭＰ−
３に対する抗体を産生するハイブリッド細胞を選別する
ことを特徴とする上記第（４０）項記載のＭＴ−ＭＭＰ
−３に対するモノクローナル抗体の産生方法、（４２）
上記第（３０）項記載のＭＴ−ＭＭＰ−３又はその塩あ
るいはその部分ペプチド又はその塩を試薬として用いる
か、あるいは上記第（３８）項記載のＭＴ−ＭＭＰ−３
に対する抗体を試薬として用いることを特徴とするＭＴ
−ＭＭＰ−３の検出・測定方法、（４３）上記第（４
２）項記載のＭＴ−ＭＭＰ−３の検出・測定方法に用い
る標識化されたＭＴ−ＭＭＰ−３又はその塩あるいはそ
の部分ペプチド又はその塩、及び（４４）上記第（４
２）項記載のＭＴ−ＭＭＰ−３の検出・測定方法に用い
る標識化されたＭＴ−ＭＭＰ−３に対する抗体を提供す
る。

【００２０】

【発明の実施の形態】潜在型ＭＭＰ−２の活性化能を有
するＭＭＰの一種であるがＭＴ−ＭＭＰ−１以外の潜在
型ＭＭＰ−２活性化因子である天然のＭＴ−ＭＭＰ（例
えば、ＭＴ−ＭＭＰ−３）と実質的に同等な活性を有す
るタンパク質またはその塩、そのタンパク質の特徴的な
部分ペプチドまたはその塩、それらをコードする遺伝
子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡなど、その遺伝子を遺伝子組
換え技術で操作することが可能なように含有しているベ
クターあるいはプラスミド、こうしたベクターなどで形
質転換された宿主細胞、その宿主細胞を、培養して該タ
ンパク質またはその塩を製造する方法、こうして得られ
た該タンパク質またはその塩やそのタンパク質の特徴的
な部分ペプチドまたはその塩を用いて得られた抗体、特
にはモノクローナル抗体、その抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞、該単離された遺伝子、例えばＤＮＡ、ＲＮ
Ａなどをプローブとして用いたり、あるいは該抗体を用
いた測定診断手段が提供される。

【００２１】より具体的には、本発明は配列表の配列番
号：２で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とす
るＭＴ−ＭＭＰ−３またはその塩を提供する。本発明の
ＭＴ−ＭＭＰ−３としては、潜在型ＭＭＰ−２の活性化
能を有するＭＭＰの一種であり且つＭＴ−ＭＭＰ−１以
外であって潜在型ＭＭＰ−２活性化能を有することを特
徴とし潜在型ＭＭＰ−２活性化因子でかつ新規なアミノ
酸配列を有するものであればよい。より好ましくは本発
明のＭＴ−ＭＭＰ−３としては、配列表の配列番号：２
で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列
を有するものがすべて挙げられる。さらに本発明のＭＴ
−ＭＭＰ−３としては、プレ部分として配列中のアミノ
酸番号１位のＭｅｔから２１位のＰｈｅまでのアミノ酸
配列の一部または全部を有していてもよく、プロ部分と
してアミノ酸番号２２位のＰｈｅから１１９位のＡｒｇ
までのアミノ酸配列の一部または全部を有していてもよ
い。こうした配列を有するものはすべて包含されてよ
い。本発明のＭＴ−ＭＭＰ−３は、配列表の配列番号：
１で表される塩基配列の１１３から１１５位のＡＴＧか
ら１９２２から１９２４位のＧＴＧより構成される塩基
配列にコードされるもの（１９２５から１９２７位の終
止コドンＴＧＡは、ＴＡＡまたはＴＡＧでも有りうる）
であることができるし、また、該塩基配列と相同性を有
するが、ＭＴ−ＭＭＰ−１以外の配列を持ち且つ潜在型
ＭＭＰ−２の活性化能を有するといったそれと同効の塩
基配列を含有するＤＮＡ配列でコードされるものである
ことができる。該ＭＴ−ＭＭＰ−３の塩基配列は、修飾
（例えば、付加、除去、置換など）されることもでき、
そうした修飾されたものも包含されてよい。

【００２２】配列表の配列番号：１で表される塩基配列
またはそれと同効の塩基配列を含有する本発明のＤＮＡ
は、例えば以下に示す方法によって取得した。なお、遺
伝子組換え技術は、例えばT. Maniatis et al.,"Molecu
lar Cloning", 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laborato
ry, Cold Spring Harbor, N. T. (1989)；日本生化学会
編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、東京
化学同人（１９８６）；日本生化学会編、「新生化学実
験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えＤＮＡ技術）」、東京化
学同人（１９９２）；R. Wu ed., "Methods in Enzymol
ogy", Vol. 68,Academic Press, New York (1980)；R.
Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 &
101, Academic Press, New York (1983)；R. Wu et a
l. ed.,"Methods in Enzymology", Vol. 153, 154 & 15
5, Academic Press, New York (1987) などに記載の方
法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそ
れらと実質的に同様な方法や改変法により行うことがで
きる。

【００２３】種々のヒト組織（胎盤、口腔癌、肺癌等）
あるいは培養細胞（ヒト線維肉腫細胞ＨＴ１０８０、ヒ
ト単球性白血病細胞Ｕ９３７等）からｍＲＮＡを単離す
る。特に好適にヒト口腔癌細胞よりｍＲＮＡを単離でき
る。ｍＲＮＡの単離は、当該分野で公知の方法あるいは
それと実質的に同様な方法や改変法により行うことがで
きるが、T. Maniatis et al.,"Molecular Cloning", 2n
d Ed., Chapter 7, Cold Spring Harbor Laboratory, C
old Spring Harbor, N. T. (1989); L. Grossman et a
l. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 12, Part A &
B, Academic Press, New York (1968); S. L. Berger
et al. ed., "Methods in Enzymology",Vol. 152, p.33
& p.215, Academic Press, New York (1987);Biochemi
stry, 18, 5294-5299, 1979 などに記載の方法、例えば
グアニジン−塩化セシウム法、チオシアン酸グアニジン
法、フェノール法などの方法で行うことが出来る。必要
に応じ、得られた全ＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）−セルロー
スカラムなどを使用して精製してポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡ
を得ることが出来る。このｍＲＮＡ及び逆転写酵素を用
いてｃＤＮＡを作製する。ｍＲＮＡ及び逆転写酵素を用
いてのｃＤＮＡ合成は当該分野で公知の方法あるいはそ
れと実質的に同様な方法や改変法により行うことができ
るが、H. Land et al., "Nucleic Acids Res.", Vol.
9, 2251 (1981); U. Gubler et al., "Gene", Vol. 2
5, 263-269 (1983); S. L. Berger et al. ed., "Metho
ds in Enzymology", Vol. 152, p.307, AcademicPress,
New York (1987) などに記載の方法が挙げられる。

【００２４】こうして作製されたｃＤＮＡを基にｃＤＮ
Ａライブラリーを構築できる。またファージベクターを
使用する以外で、大腸菌などの宿主細胞の形質転換をす
るには、例えばカルシウム法、ルビジウム／カルシウム
法など当該分野で知られた方法あるいはそれと実質的に
同様な方法で行うことができる（D. Hanahan, J. Mol.
Biol., Vol. 166, p.557 (1983) など）。さらに市販の
種々ヒト組織由来ｃＤＮＡライブラリー（例えば、ＣＬ
ＯＮＴＥＣＨなどより入手可能）を直接使用することも
できる。作製されたｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲ増幅反応を
行う。典型的な場合、既知のＭＭＰファミリーのアミノ
酸配列から選択した、高度に保存されているアミノ酸配
列を基に、デジェネレイテッド・プライマーを作製す
る。プライマーの作製は、当該分野で知られた方法で行
うことができ、例えばＤＮＡ自動合成装置を用い、フォ
スフォジエステル法、フォスフォトリエステル法、フォ
スフォアミダイト法などにより合成できる。このプライ
マーと上記作製したｃＤＮＡとを用い、ＰＣＲを行う。
ＰＣＲ反応は、当該分野で公知の方法あるいはそれと実
質的に同様な方法や改変法により行うことができるが、
例えば R. Saiki, etal., Science, Vol. 230, pp. 135
0 (1985); R. Saiki, et al., Science, Vol.239, pp.
487 (1985)；ＰＣＲテクノロジー (PCR Technology) ，
ストックトンプレス (Stockton Press) などに記載され
た方法に従って行うことができる。

【００２５】得られたＰＣＲ産物をクローニングし、得
られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定し、新規なＭＭＰ遺
伝子配列を有するＤＮＡ断片を取得する。塩基配列の決
定は、ダイデオキシ法、例えばＭ１３ダイデオキシ法な
ど、Maxam-Gilbert 法などを用いて行うことができる
が、市販のシークエンシングキット、例えば Taqダイプ
ライマーサイクルシークエンシングキットなどを用いた
り、自動塩基配列決定装置、例えば蛍光ＤＮＡシーケン
サー装置などを用いて行うことが出来る。特にはこのＤ
ＮＡ断片をプローブに種々のヒト組織（胎盤、口腔癌、
肺癌等）あるいは培養細胞（ヒト線維肉腫細胞ＨＴ１０
８０、ヒト単球性白血病細胞Ｕ９３７等）から構築され
たｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、塩基配列
の決定から目的とするＤＮＡを単離することができる。
好ましくは胎盤ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
し、塩基配列の決定をして目的とするＤＮＡを単離す
る。なお、プローブなどを放射性同位体などによって標
識するには、市販の標識キット、例えばランダムプライ
ムドＤＮＡラベリングキット (Boehringer Mannhaim)な
どを使用して行うことが出来る。

【００２６】以下にさらに詳細に記述する。本発明者ら
は、既知のＭＭＰファミリーの触媒ドメイン中から選択
した高度に保存されているアミノ酸配列ＧＥＡＤＩＬＶ
及びＧＤＡＨＦＤＤＤＥを基に、次の配列を有する５’
プライマー、５Ｐ−４配列番号：３ＳＧＮＶＶＮＧＣＷＧＡＹＡＴＭＲＴＳＡＴ（配列中、Ｓ＝Ｃ又はＧ、Ｎ＝Ａ又はＣ又はＧ又はＴ、
Ｖ＝Ａ又はＣ又はＧ、Ｗ＝Ａ又はＴ、Ｙ＝Ｃ又はＴ、Ｍ
＝Ａ又はＣ、Ｒ＝Ａ又はＧのそれぞれのミックスド・ベ
ースを示す）及び次の配列を有する３’プライマー、３Ｐ−２配列番号：４ＹＴＣＲＴＳＮＴＣＲＴＣＲＡＡＲＴＧＲＲＨＲＴＣＹ
ＣＣ（配列中、Ｙ＝Ｃ又はＴ、Ｒ＝Ａ又はＧ、Ｓ＝Ｃ又は
Ｇ、Ｎ＝Ａ又はＣ又はＧ又はＴ、Ｈ＝Ａ又はＣ又はＴの
それぞれのミックスドベースを示す）を設計、合成し
た。なお、上記の配列のうち、Ｓ、Ｎ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、
Ｍ、Ｒ及びＨはそこに複数の塩基を導入すること、そし
てその結果マルチプルなヌクレオチド配列を生ずること
を示している。プライマーはＭＭＰファミリーに特徴的
な領域のアミノ酸配列に基づいてデザインし、合成し、
使用することが出来る。

【００２７】これらのプライマーとヒト口腔癌細胞から
調製したｃＤＮＡライブラリーを用い、ＰＣＲ反応を行
った。プライマーのデザインから予想されるサイズ（９
０から１２０ｂ. ｐ. ）を持つところの得られたＰＣＲ
産物をサブクローニングし、塩基配列を決定した結果、
ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−９と同一な配列を持つＰＣＲ産物
以外に、既知のＭＭＰと相同性を有するが、配列が新規
な９３ｂ. ｐ. のＤＮＡ断片を得た。同様にこれらプラ
イマーと各種のヒト細胞由来のｃＤＮＡライブラリーを
用いて、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−９と同一な配列を持つＰ
ＣＲ産物以外に、既知のＭＭＰと相同性を有するが、配
列が新規なＰＣＲ産物を検索することもできる。この９
３ｂ. ｐ. ＤＮＡ断片をプローブとして、ヒト胎盤ｃＤ
ＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、２. １ｋｂ
のＤＮＡ断片が得られた。この断片の塩基配列の決定か
ら配列表の配列番号：１で表される塩基配列が得られ
た。配列表の配列番号：１で表される塩基配列と同一の
配列は、ＧＥＮＥＢＡＮＫ／ＥＭＢＬＤＮＡＤａｔ
ａＢａｓｅ中には存在せず、この塩基配列を有するＤ
ＮＡは全く新規なものであることが認められた。

【００２８】配列表の配列番号：１で表される塩基配列
を有する上記のクローンの塩基配列は、３' 非翻訳配列
と共に推定６０４個のアミノ酸残基をコードするオープ
ンリーディングフレームを有していた。開始コドンのす
ぐ下流から推定されるシグナル配列が続き、Ｃ末端のア
ミノ酸番号５６１から５８４に２４個の疎水性アミノ酸
の連続した膜結合型タンパク質に特徴的な疎水性領域の
存在が認められた。こうして得られた新規ＭＭＰを「Ｍ
Ｔ−ＭＭＰ−３」と命名した（本発明者等は当初ＭＴ−
ＭＭＰ−２と呼称した（平成７年７月１４日日本国出願
の特願平７−２００３１９号並びに特願平７−２００３
２０号）が、ゴードンリサーチコンファレンスオ
ンマトリックスメタロプロテアーゼズ（アンドーバ
ーエヌエイチ１９９５年７月１６−２１日）〔Gord
on Research Conference on Matrix Metalloproteinase
s (Andover, NH July 16-21, 1995)〕の会合での合意に
基づいて新たにＭＴ−ＭＭＰ−３と呼ぶことになっ
た）。

【００２９】ＭＴ−ＭＭＰ−３遺伝子産物の確認を、Ｍ
Ｔ−ＭＭＰ−３遺伝子をトランスフェクションしたＣＯ
Ｓ−１細胞などの適した動物細胞などを用いて行った。
この外来遺伝子を哺乳動物などの動物細胞に導入する方
法としては当該分野で知られた方法あるいはそれと実質
的に同様な方法で行うことができ、例えばリン酸カルシ
ウム法（例えば、F. L. Graham et al., "Virology", V
ol. 52, pp.456 (1973) など）、ＤＥＡＥ−デキストラ
ン法（例えば、D. Warden et al., "J. Gen. Virol.",
Vol. 3, pp.371 (1968) など）、エレクトロポレーショ
ン法（例えば、E. Neumann et al., "EMBO J", Vol. 1,
pp.841 (1982)など）、マイクロインジェクション法、
リボソーム法、ウイルス感染法、ファージ粒子法などが
挙げられる。こうしてＭＴ−ＭＭＰ−３遺伝子をトラン
スフェクションされた動物細胞の産生する遺伝子産物を
抗ＭＴ−ＭＭＰ−３モノクローナル抗体を用いた免疫沈
降実験で解析した結果、細胞溶解物から６４ｋＤａのタ
ンパク質が免疫沈降されたのに対し、培養上清からは相
当するタンパク質は検出されなかった。すなわち、ＭＴ
−ＭＭＰ−３遺伝子産物は分泌されることなく、細胞表
層上で発現していることが示唆された。図１〜図５に示
すように既知のＭＭＰファミリーのアミノ酸配列との相
同性を調査した結果、ＭＴ−ＭＭＰ−３は既知のＭＭＰ
ファミリーと高い相同性を示した。ＭＭＰファミリーで
保存されている前駆体と成熟体のプロセッシング部位近
傍の配列、および活性部位の配列はＭＴ−ＭＭＰ−３中
で最も良好に保存されていた。また、ＭＭＰの１次構造
上の特徴であるプロペプチドドメイン、Ｚｎ⁺結合触媒
ドメイン、プロリンに富んだヒンジドメイン、Ｃ−末端
のヘモペキシン凝血酵素様ドメインは良好に保存されて
いた。

【００３０】さらにＭＴ−ＭＭＰ−３では、ＭＴ−ＭＭ
Ｐ−１（先に本発明者らが単離同定したＭＴ−ＭＭＰは
その区別をなすため「ＭＴ−ＭＭＰ−１」と命名し直し
た）と同じくＣ末端領域に疎水性アミノ酸の連続した配
列が存在することから、膜結合型のＭＭＰであることが
示唆された。このような疎水性アミノ酸の連続した配列
は、他のＭＭＰファミリーには存在しない。実際、遺伝
子工学的にこの疎水性アミノ酸の連続配列を分泌タンパ
ク質と融合させた融合タンパク質を作成し培養細胞で発
現させたところ、融合タンパク質の分泌は抑えられ細胞
膜上で発現したことから、この疎水性アミノ酸の連続配
列がトランスメンブレン・ドメインとして機能している
ことが示された。したがって、ＭＴ−ＭＭＰ−３遺伝子
は、新規なＭＭＰタンパク質をコードしていることは明
白であり、ＭＴ−ＭＭＰ−３遺伝子を用いて作製した組
換え体プラスミドは全て新規な組換え体であり、そのプ
ラスミドで形質転換あるいはトランスフェクトされ得ら
れた形質転換体あるいはトランスフェクタントも新規な
ものである。

【００３１】ＭＴ−ＭＭＰ−３遺伝子を組込むプラスミ
ドとしては遺伝子工学的に常用される宿主細胞（例え
ば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞宿主、酵母、ＣＨＯ細
胞等の真核細胞宿主、Ｓｆ２１等の昆虫細胞宿主）中で
該ＤＮＡが発現できるプラスミドであればどのようなプ
ラスミドでもよい。こうした配列内には、例えば選択し
た宿主細胞で発現するのに好適なコドンが導入されてい
ることができるし、制限酵素部位が設けられていること
もできるし、目的とする遺伝子の発現を容易にするため
の制御配列、促進配列など、目的とする遺伝子を結合す
るのに役立つリンカー、アダプターなど、さらには抗生
物質耐性などを制御したり、代謝を制御したりし、選別
などに有用な配列等を含んでいることができる。好まし
くは、適当なプロモーター、例えば大腸菌を宿主とする
プラスミドでは、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ
ー、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファ
ン・ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポプロテイ
ン（ｌｐｐ）プロモーター、λファージＰＬプロモータ
ー等を、動物細胞を宿主とするプラスミドでは、ＳＶ４
０レートプロモーター、ＭＭＴＶＬＴＲプロモータ
ー、ＲＳＶＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモータ
ー、ＳＲαプロモーター等を、酵母を宿主とするプラス
ミドでは、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０プロモーター等を使用
し得る。

【００３２】大腸菌を宿主とするプラスミドとしては、
例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ
１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＳＰ６４、ｐＳＰ６５、ｐＴ
Ｚ−１８Ｒ／−１８Ｕ、ｐＴＺ−１９Ｒ／−１９Ｕ、ｐ
ＧＥＭ−３、ｐＧＥＭ−４、ｐＧＥＭ−３Ｚ、ｐＧＥＭ
−４Ｚ、ｐＧＥＭ−５Ｚｆ（−）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔＫＳ^TM (Stratagene) などが挙げられる。大腸菌
での発現に適したプラスミドベクターとしては、ｐＡ
Ｓ、ｐＫＫ２２３ (Pharmacia)、ｐＭＣ１４０３、ｐＭ
Ｃ９３１、ｐＫＣ３０なども挙げられる。動物細胞を宿
主とするプラスミドとしては、ＳＶ４０ベクター、ポリ
オーマ・ウイルスベクター、ワクシニア・ウイルスベク
ター、レトロウイルスベクターなどが挙げられ、例えば
ｐｃＤ、ｐｃＤ−ＳＲα、ＣＤＭ８、ｐＣＥＶ４、ｐＭ
Ｅ１８Ｓ、ｐＢＣ１２ＢＩ、ｐＳＧ５ (Stratagene) な
どが挙げられる。酵母を宿主とするプラスミドとして
は、ＹＩｐ型ベクター、ＹＥｐ型ベクター、ＹＲｐ型ベ
クター、ＹＣｐ型ベクターなどが挙げられ、例えばｐＧ
ＰＤ−２などが挙げられる。宿主細胞としては、宿主細
胞が大腸菌の場合、例えば大腸菌Ｋ１２株に由来するも
のが挙げられ、例えばＮＭ５３３ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、
Ｃ６００、ＤＨ１、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９などが挙げ
られる。宿主細胞が動物細胞の場合、例えばアフリカミ
ドリザル線維芽細胞由来のＣＯＳ７細胞、ＣＯＳ−１細
胞、ＣＶ−１細胞、マウス線維芽細胞由来のＣＯＰ細
胞、ＭＯＰ細胞、ＷＯＰ細胞、チャイニーズ・ハムスタ
ー細胞由来のＣＨＯ細胞、ＣＨＯＤＨＦＲ^-細胞、ヒ
トＨｅＬａ細胞、マウス細胞由来Ｃ１２７細胞、マウス
細胞由来ＮＩＨ３Ｔ３細胞などが挙げられる。昆虫細
胞としては、カイコ核多角体病ウイルス (Bombyx mori
nuclear polyhedrosis virus)をベクターとし、カイコ
幼虫あるいはカイコ培養細胞、例えばＢＭ−Ｎ細胞など
を用いることが挙げられる。

【００３３】本発明の遺伝子工学的手法においては、当
該分野で知られたあるいは汎用されている制限酵素、逆
転写酵素、ＤＮＡ断片をクローン化するのに適した構造
に修飾したりあるいは変換するための酵素であるＤＮＡ
修飾・分解酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、末端ヌクレオチ
ジルトランスフェラーゼ、ＤＮＡリガーゼなどを用いる
ことが出来る。制限酵素としては、例えば、R. J. Robe
rts, Nucleic Acids Res, Vol. 13, r165 (1985); S. L
inn et al. ed. Nucleases, p. 109, Cold Spring Harb
or Lab., Cold Spring Harbor, New York, 1982 などに
記載のものが挙げられる。逆転写酵素としては、例えば
マウスモロネイ白血病ウイルス (mouseMoloney leukemi
a virus; MMLV) 由来の逆転写酵素 (reverse transcrip
tase)、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス (avian myeloblas
tosis virus; AMV)由来の逆転写酵素などが挙げられ、
特にはRNase H 欠損体などは好ましく用いることが出来
る。ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼ、その誘導体であるクレノウ・フラグメン
ト、大腸菌ファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌
ファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱菌ＤＮＡポリ
メラーゼなどが挙げられる。末端ヌクレオチジルトラン
スフェラーゼとしては、例えばR. Wu et al.ed., "Meth
ods in Enzymology", Vol. 100, p. 96, Academic Pres
s, New York(1983) に記載の３’−ＯＨ末端にデオキシ
ヌクレオチド（ｄＮＭＰ）を付加するＴｄＴａｓｅなど
が挙げられる。ＤＮＡ修飾・分解酵素としては、エキソ
ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼなどが挙げられ、例
えばヘビ毒ホスホジエステラーゼ、脾臓ホスホジエステ
ラーゼ、大腸菌ＤＮＡエキソヌクレアーゼＩ、大腸菌Ｄ
ＮＡエキソヌクレアーゼＩＩＩ、大腸菌ＤＮＡエキソヌ
クレアーゼＶＩＩ、λエキソヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅ
Ｉ、ヌクレアーゼＳ１、ミクロコッカス (Micrococcu
s) ヌクレアーゼなどが挙げられる。ＤＮＡリガーゼと
しては、例えば大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼなどが挙げられる。ＤＮＡ遺伝子をクローニング
してＤＮＡライブラリーを構築するのに適したベクター
としては、プラスミド、λファージ、コスミド、Ｐ１フ
ァージ、Ｆ因子、ＹＡＣなどが挙げられ、好ましくはλ
ファージ由来のベクターが挙げられ、例えばＣｈａｒｏ
ｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、λｇｔ１０、λｇｔ
１１、λＤＡＳＨＩＩ、λＦＩＸＩＩ、λＥＭＢＬ３、
λＺＡＰＩＩ^TM (Stratagene) などが挙げられる。

【００３４】さらに、本発明に係わるＭＴ−ＭＭＰ−３
の遺伝子塩基配列を基に遺伝子工学的に常用される方法
を用いることにより、ＭＴ−ＭＭＰ−３のアミノ酸配列
中に適宜、１個ないし複数個以上のアミノ酸の置換、欠
失、挿入、転移あるいは付加したごとき変異を導入した
相当するタンパク質を製造することができる。こうした
変異・変換・修飾法としては、日本生化学会編、「続生
化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、ｐ１０５（広瀬
進）、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、
「新生化学実験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えＤＮＡ技
術）」、ｐ２３３（広瀬進）、東京化学同人（１９９
２）；R. Wu, L. Grossman, ed., "Methods inEnzymolo
gy", Vol. 154, p. 350 & p. 367, Academic Press, Ne
w York (1987)；R. Wu, L. Grossman, ed., "Methods i
n Enzymology", Vol. 100, p. 457 & p. 468, Academic
Press, New York (1983)；J. A. Wells et al., "Gen
e", Vol. 34, p. 315 (1985) ；T. Grundstroem et a
l., "Nucleic Acids Res", Vol. 13, p. 3305 (1985)
；J. Taylor et al., "Nucleic Acids Res.", Vol. 1
3, p.8765 (1985)；R. Wu ed., "Methods in Enzymolog
y", Vol. 155, p. 568, Academic Press, New York（19
87) ；A. R. Oliphant et al., "Gene", Vol. 44, p.17
7 (1986) などに記載の方法が挙げられる。例えば合成
オリゴヌクレオチドなどを利用する位置指定変異導入法
（部位特異的変異導入法）、 Kunkel 法、 dNTP[αS]法
（Eckstein) 法、亜硫酸や亜硝酸などを用いる領域指定
変異導入法等の方法が挙げられる。さらに得られた本発
明のタンパク質は、化学的な手法でその含有されるアミ
ノ酸残基を修飾することもできるし、ペプチダーゼ、例
えばペプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメライ
ン、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼなどの酵
素を用いて修飾したり、部分分解したりしてその誘導体
などにすることができる。また遺伝子組換え法で製造す
る時に融合タンパク質として発現させ、生体内あるいは
生体外で天然のＭＴ−ＭＭＰ−３と実質的に同等の生物
学的活性を有しているものに変換・加工してもよい。遺
伝子工学的に常用される融合産生法を用いることができ
るが、こうした融合タンパク質はその融合部を利用して
アフィニティクロマトグラフィーなどで精製することも
可能である。タンパク質の構造の修飾・改変などは、例
えば日本生化学会編、「新生化学実験講座１、タンパク
質ＶＩＩ、タンパク質工学」、東京化学同人（１９９
３）を参考にし、そこに記載の方法あるいはそこで引用
された文献記載の方法、さらにはそれらと実質的に同様
な方法で行うことができる。また下記するようにその生
物学的活性のうちには、免疫的に活性、例えば抗原性を
有するということも含まれてよい。

【００３５】かくして本発明は、１個以上のアミノ酸残
基が同一性の点で天然のものと異なるもの、１個以上の
アミノ酸残基の位置が天然のものと異なるものであって
もよい。本発明は、ＭＴ−ＭＭＰ−３に特有なアミノ酸
残基が１個以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜
６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましく
は１〜２０個、特には１〜１０個など）欠けている欠失
類縁体、特有のアミノ酸残基の１個以上（例えば、１〜
８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜
４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０
個など）が他の残基で置換されている置換類縁体、１個
以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さ
らに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０
個、特には１〜１０個など）のアミノ酸残基が付加され
ている付加類縁体も包含する。ＭＭＰの共通の特徴であ
るドメイン構造やＣ末端のトランスメンブレンドメイン
構造が維持されていれば、上記のごとき変異体は、全て
本発明に包含される。また本発明のＭＴ−ＭＭＰ−３は
天然のＭＴ−ＭＭＰ−３と実質的に同等の一次構造コン
フォメーションあるいはその一部を有しているものも含
まれてよいと考えられ、さらに天然のＭＴ−ＭＭＰ−３
と実質的に同等の生物学的活性を有しているものも含ま
れてよいと考えられる。さらに天然に生ずる変異体の一
つであることもできる。こうした本発明のＭＴ−ＭＭＰ
−３は、下記で説明するように分離・精製処理されるこ
とができる。こうして得られた本発明の潜在型ＭＭＰ−
２の活性化能を有するＭＭＰの一種であり且つＭＴ−Ｍ
ＭＰ−１以外の潜在型ＭＭＰ−２活性化因子である天然
のＭＴ−ＭＭＰ（特には、ＭＴ−ＭＭＰ−３）と実質的
に同等な活性を有することを特徴とするタンパク質また
はその塩、あるいはその部分ペプチドは、それを用いて
酵素阻害剤の開発や探索などの研究、医薬品の開発研
究、ＭＴ−ＭＭＰ−３が関与すると考えられる生物的な
現象や反応の研究を行うことができるし、さらにはそれ
に対する抗体を作成するのに用いることができるし、特
定の分析あるいは測定対象物を調査研究するのに使用す
ることもできる。一方では、こうして本発明は上記した
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、そして天然の特
性の全部あるいは一部を有するＭＴ−ＭＭＰ−３のポリ
ペプチド、さらにその類縁体あるいは誘導体をコードす
るＤＮＡ配列も包含する。

【００３６】本発明のＤＮＡ配列は、これまで知られて
いなかった哺乳動物のタンパク質のアミノ酸配列に関す
る情報を提供しているから、こうした情報を利用するこ
とも本発明に包含される。こうした利用としては、例え
ばＭＴ−ＭＭＰ−３及び関連タンパク質をコードする哺
乳動物、特に好ましくはヒトの、ゲノムＤＮＡ及びｃＤ
ＮＡの単離及び検知のためのプローブの設計などが挙げ
られる。本発明のＤＮＡ配列は、例えばＭＴ−ＭＭＰ−
３及び関連タンパク質をコードする哺乳動物、特に好ま
しくはヒトの、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの単離及び検
知のためのプローブとして有用である。遺伝子の単離に
あたっては、ＰＣＲ法、さらには逆転写酵素（ＲＴ）を
用いたＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）を利用することが出来
る。ＭＴ−ＭＭＰ−３ｃＤＮＡ及びその関連ＤＮＡ
は、クローニングされ、配列決定されたＭＴ−ＭＭＰ−
３ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列に基づき
特徴的な配列領域を選び、ＤＮＡプライマーをデザイン
して化学合成し、得られたＤＮＡプライマーを用いて、
ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ、その他の方法を用いてＭＴ−
ＭＭＰ−３関連遺伝子の単離、検出などに利用すること
が出来る。ＭＴ−ＭＭＰ−３がＭＴ−ＭＭＰ−１の構造
的特徴を良好に保存していたことから、ＭＴ−ＭＭＰ−
３も潜在型ＭＭＰ−２の活性化因子として作用する可能
性が想定される。そこで、ＣＯＳ−１細胞などの哺乳動
物細胞に潜在型ＭＭＰ−２の発現プラスミド及びＭＴ−
ＭＭＰ−３の発現プラスミドをコトランスフェクション
し、回収された培養上清を用いてザイモグラフィーを行
った。その結果、本来、分子量６８ｋＤａに検出される
潜在型ＭＭＰ−２以外に、６２ｋＤａの活性型ＭＭＰ−
２及び６４ｋＤａの活性中間体が検出され、ＭＴ−ＭＭ
Ｐ−３の発現に依存した潜在型ＭＭＰ−２の活性化が観
察された。

【００３７】ＭＴ−ＭＭＰ−３ｍＲＮＡのヒト組織中
での発現を各種の組織由来Ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡに対
するノーザンブロット分析により検討した。その結果、
ヒト肺、脳、胎盤で高い発現が認められたが、心臓、腎
臓、肝臓、膵臓、筋肉組織では検出されなかった。本発
明者らの研究では、ＭＴ−ＭＭＰ−１ｍＲＮＡの発現
は肺、腎臓、胎盤で顕著に高いのに対し、脳では最も低
かった。これらのことは、ＭＴ−ＭＭＰ−３は、ＭＴ−
ＭＭＰ−１とは構造的にも潜在型ＭＭＰ−２の活性化能
という機能的にも非常に類似しているが、実際の組織中
での遺伝子発現は異なる制御を受けていることを示して
いる。本発明のｃＤＮＡをプローブとして用いれば、例
えばノーザン・ブロティング、サザン・ブロティング、
ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどによりヒト
組織中でのＭＴ−ＭＭＰ−３ｍＲＮＡの発現やＭＴ−
ＭＭＰ−３遺伝子自体などを検出・測定でき、ひいては
癌細胞の有無、癌の悪性度の診断等の癌の診断治療、ま
たアルツハイマー病の診断等の研究に応用できる。以上
述べた、本発明者らの研究成果によりＭＴ−ＭＭＰ−３
の遺伝子及び組換えＤＮＡ分子を宿主に移入し、ＭＴ−
ＭＭＰ−３を発現させ、目的とするＭＴ−ＭＭＰを得る
方法が提供される。こうして本発明によれば、ＭＴ−Ｍ
ＭＰ−３の遺伝子を実質的に発現する組換え体あるいは
トランスフェクタント及びその製造法、さらにはその用
途も提供される。別の面では、本発明は潜在型ＭＭＰ−
２の活性化能を有するＭＭＰの一種であり且つＭＴ−Ｍ
ＭＰ−１以外の潜在型ＭＭＰ−２活性化因子である天然
のＭＴ−ＭＭＰと実質的に同等な活性を有することを特
徴とするタンパク質またはその塩、より好ましくはＭＴ
−ＭＭＰ−３またはその塩と、実質的に同等な活性を有
するか、あるいは実質的に同等の一次構造コンフォメー
ションを持つ該タンパク質の少なくとも一部あるいは全
部を有するポリペプチドを、大腸菌などの原核生物ある
いは哺乳動物細胞などの真核生物で発現させることを可
能にするＤＮＡやＲＮＡなどの核酸に関するとすること
ができる。またこうした核酸、特にはＤＮＡは、（ａ）
配列表の配列番号：２で表されるアミノ酸配列をコード
できる配列あるいはそれと相補的な配列、（ｂ）該
（ａ）のＤＮＡ配列またはその断片とハイブリダイズす
ることのできる配列、及び（ｃ）該（ａ）又は（ｂ）の
配列にハイブリダイズすることのできる縮重コードを持
った配列であることができる。こうした核酸で形質転換
され、本発明の該ポリペプチドを発現できる大腸菌など
の原核生物あるいは哺乳動物細胞などの真核生物も本発
明の特徴をなす。

【００３８】さらに、本発明では、本発明に係わるＭＴ
−ＭＭＰ−３と特異的に結合するモノクローナル抗体な
どの抗体が提供される。本発明に係わるモノクローナル
抗体などの抗体により、癌の診断はもとより癌の浸潤、
転移に係わる研究に有用な研究手段、さらにはアルツハ
イマー病の発症機作や診断方法に係わる研究に有用な研
究手段が提供される。本発明に係わるモノクローナル抗
体などの抗体は、本発明により得られるヒトＭＴ−ＭＭ
Ｐ−３を免疫原として公知の方法で動物を免疫したり、
当該分野で知られたあるいは汎用されている方法、例え
ばミルシュタインらの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４
９５〜４９７，１９７５）により製造することができ
る。この方法において、免疫原としては天然型ＭＴ−Ｍ
ＭＰ−３、リコンビナントヒトＭＴ−ＭＭＰ−３及び連
続した少なくとも８個のアミノ酸からなるＭＴ−ＭＭＰ
−３の一部のアミノ酸配列を有する合成ペプチド等の何
れでも使用することができる。さらに該モノクローナル
抗体は、常用される方法によって適宜標識することがで
きる。標識としては、酵素、補欠分子類、色素物質、蛍
光物質、化学ルミネッセンス化合物、発光物質、放射性
物質等を使用することができる。以下抗体の作製につき
詳しく説明する。

【００３９】本発明のモノクローナル抗体は、ミエロー
マ細胞を用いての細胞融合技術を利用して得られたモノ
クローナル抗体であってよいことはいうまでもない。本
発明のモノクローナル抗体は、例えば次のような工程で
作製できる。１．免疫原性抗原の調製２．免疫原性抗原による動物の免疫３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクロー
ン化６．モノクローナル抗体の製造

【００４０】１．免疫原性抗原の調製抗原としては、例えば天然由来のＭＴ−ＭＭＰ−３、本
発明の方法に従い調製したリコンビナントＭＴ−ＭＭＰ
−３を用いることができる。ＭＴ−ＭＭＰ−３は、さら
に免疫原性コンジュゲートなどにしてもよいが、そのま
ま適当なアジュバントと混合して動物を免疫するのに使
用できる。こうした抗原は、各種原料、例えば培養細
胞、培養組織など、形質転換体細胞などの抗原産生材料
から従来公知の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法な
どの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、例え
ばジエチルアミノエチル基あるいはカルボキシメチル基
などを持つ担体などを用いたイオン交換クロマトグラフ
ィー法、例えばブチル基、オクチル基、フェニル基など
疎水性基を持つ担体などを用いた疎水性クロマトグラフ
ィー法、色素ゲルクロマトグラフィー法、電気泳動法、
透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラフィー
法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精製して
得ることができる。好ましくは、ポリアクリルアミド電
気泳動、モノクローナル抗体などの抗原を特異的に認識
する抗体などを固定化したアフィニティー・クロマトグ
ラフィーなどで処理し精製分離処理できる。例えば、ゼ
ラチン−アガロース・アフィニティー・クロマトグラフ
ィー、ヘパリン−アガロース・クロマトグラフィーなど
が挙げられる。さらにＭＴ−ＭＭＰ−３は、それを断片
化したもの、あるいはクローニングされ、配列決定され
たｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列に基づき特
徴的な配列領域を選び、ポリペプチドをデザインして化
学合成し、得られた合成ポリペプチド断片であってもよ
く、その断片を適当な縮合剤を介して種々の担体タンパ
ク質類と結合させてハプテン−タンパク質の如き免疫原
性コンジュゲートとし、これを用いて特定の配列のみを
認識できるモノクローナル抗体をデザインするのに用い
ることもできる。デザインされるポリペプチドには予め
システイン残基などを付加し、免疫原性コンジュゲート
の調製を容易にできるようにしておくことができる。担
体タンパク質類と結合させるにあたっては、担体タンパ
ク質類はまず活性化されることができる。こうした活性
化にあたり活性化結合基を導入することが挙げられる。
活性化結合基としては、（１）活性化エステルあるいは
活性化カルボキシル基、例えばニトロフェニルエステル
基、ペンタフルオロフェニルエステル基、１−ベンゾト
リアゾールエステル基、Ｎ−スクシンイミドエステル基
など、（２）活性化ジチオ基、例えば２−ピリジルジチ
オ基などが挙げられる。担体タンパク質類としては、キ
ーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ），牛血
清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン、グロブリ
ン、ポリリジンなどのポリペプタイド、細菌菌体成分、
例えばＢＣＧなどが挙げられる。

【００４１】２．免疫原性抗原による動物の免疫動物を免疫するには、例えば村松繁、他編、実験生物学
講座１４、免疫生物学、丸善株式会社、昭和６０年、日
本生化学会編、続生化学実験講座５、免疫生化学研究
法、東京化学同人、１９８６年、日本生化学会編、新生
化学実験講座１２、分子免疫学 III、抗原・抗体・補
体、東京化学同人、１９９２年などに記載の方法に準じ
て行うことができる。抗原と共に用いられるアジュバン
トとしては、例えばフロイント完全アジュバント、リビ
（Ｒｉｂｉ）アジュバント、百日咳ワクチン、ＢＣＧ、
リピッドＡ、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカ
などが挙げられる。免疫は、例えばＢＡＬＢ／ｃなどの
マウスをはじめとする動物を使用して行われる。抗原の
投与量は、例えばマウスに対して約１〜４００μｇ／動
物で、一般には宿主動物の腹腔内や皮下に注射し、以後
１〜４週間おきに、好ましくは１〜２週間ごとに腹腔
内、皮下、静脈内あるいは筋肉内に追加免疫を２〜１０
回程度反復して行う。免疫用のマウスとしてはＢＡＬＢ
／ｃ系マウスの他、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスと他系マウス
とのＦ１マウスなどを用いることもできる。必要に応
じ、抗体価測定系を調製し、抗体価を測定して動物免疫
の程度を確認できる。一方では、本発明に従えばリコン
ビナントＭＴ−ＭＭＰ−３を用い、ＭＴ−ＭＭＰ−３に
対するポリクローナル抗体及びその製造にも関する。こ
うした場合、使用される動物としては、哺乳動物や鳥類
などが利用できるが、例えばウシ、ウマ、ヤギ、ヒツ
ジ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、サ
ル、イヌ、ネコ、ニワトリなどが挙げられる。抗体は抗
血清であってもよく、より精製されたものであってもよ
く、例えばその単離精製は下記モノクローナル抗体と同
様にして行うことができる。

【００４２】３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製細胞融合に使用される無限増殖可能株（腫瘍細胞株）と
しては免疫グロブリンを産生しない細胞株から選ぶこと
ができ、例えばＰ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１（ＮＳ−
１，Eur. J. Immunology, 6, 511〜519, 1976)、ＳＰ２
／０−Ａｇ１４（ＳＰ２，Nature, 276, 269〜270, 197
8 ) 、マウスミエローマＭＯＰＣ−２１セルライン由来
のＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１，Current to
pics in Microbiol. and Immunol., 81, 1〜7, 1978
）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３，Nature, 256, 49
5〜497, 1975 ) 、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−６５３ (６
５３，J.Immunol., 123, 1548〜1550, 1979) などを用
いることができる。８−アザグアニン耐性のマウスミエ
ローマ細胞株はダルベッコＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ培
地）、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの細胞培地に、例え
ばペニシリン、アミカシンなどの抗生物質、牛胎児血清
（ＦＣＳ）などを加え、さらに８−アザグアニン（例え
ば５〜４５μｇ／ｍｌ）を加えた培地で継代されるが、
細胞融合の２〜５日前に正常培地で継代して所要数の細
胞株を用意することができる。また使用細胞株は、凍結
保存株を約３７℃で完全に解凍したのちＲＰＭＩ−１６
４０培地などの正常培地で３回以上洗浄後、正常培地で
培養して所要数の細胞株を用意したものであってもよ
い。

【００４３】４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細
胞融合上記２．の工程に従い免疫された動物、例えばマウスは
最終免疫後、２〜５日後にその脾臓が摘出され、それか
ら脾細胞懸濁液を得る。脾細胞の他、生体各所のリンパ
節細胞を得て、それを細胞融合に使用することもでき
る。こうして得られた脾細胞懸濁液と上記３．の工程に
従い得られたミエローマ細胞株を、例えば最小必須培地
（ＭＥＭ培地）、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培
地などの細胞培地中に置き、細胞融合剤、例えばポリエ
チレングリコールを添加する。細胞融合剤としては、こ
の他各種当該分野で知られたものを用いることができ、
この様なものとしては不活性化したセンダイウイルス
（ＨＶＪ：Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇｖｉｒ
ｕｓｏｆＪａｐａｎ）なども挙げられる。好ましく
は、例えば３０〜６０％のポリエチレングリコールを
０．５〜２ｍｌ加えることができ、分子量が１，０００
〜８，０００のポリエチレングリコールを用いることが
でき、さらに分子量が１，０００〜４，０００のポリエ
チレングリコールがより好ましく使用できる。融合培地
中でのポリエチレングリコールの濃度は、例えば３０〜
６０％となるようにすることが好ましい。必要に応じ、
例えばジメチルスルホキシドなどを少量加え、融合を促
進することもできる。融合に使用する脾細胞（リンパ
球）：ミエローマ細胞株の割合は、例えば１：１〜２
０：１とすることが挙げられるが、より好ましくは４：
１〜７：１とすることができる。融合反応を１〜１０分
間行い、次にＲＰＭＩ−１６４０培地などの細胞培地を
加える。融合反応処理は複数回行うこともできる。融合
反応処理後、遠心などにより細胞を分離した後選択用培
地に移す。

【００４４】５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及
びモノクローン化選択用培地としては、例えばヒポキサンチン、アミノプ
テリン及びチミジンを含む、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地などの培地、所謂ＨＡＴ培地が挙
げられる。選択培地交換の方法は、一般的には培養プレ
ートに分注した容量と等容量を翌日加え、その後１〜３
日ごとにＨＡＴ培地で半量ずつ交換するというようにす
ることができるが、適宜これに変更を加えて行うことも
できる。また融合後８〜１６日目には、アミノプテリン
を除いた、所謂ＨＴ培地で１〜４日ごとに培地交換をす
ることができる。フィーダーとして、例えばマウス胸腺
細胞を使用することもでき、それが好ましい場合があ
る。ハイブリドーマの増殖のさかんな培養ウェルの培養
上清を、例えば放射免疫分析（ＲＩＡ）、酵素免疫分析
（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫分析（ＦＩＡ）などの測定
系、あるいは蛍光惹起細胞分離装置（ＦＡＣＳ）など
で、ＭＴ−ＭＭＰ−３あるいはその断片ペプチドを抗原
として用いたり、あるいは標識抗マウス抗体を用いて目
的抗体を測定するなどして、スクリーニングしたりす
る。目的抗体を産生しているハイブリドーマをクローニ
ングする。クローニングは、寒天培地中でコロニーをピ
ック・アップするか、あるいは限界希釈法によりなされ
うる。限界希釈法でより好ましく行うことができる。ク
ローニングは複数回行うことが好ましい。

【００４５】６．モノクローナル抗体の製造得られたハイブリドーマ株は、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、
ＲＰＭＩ−１６４０培地などの適当な増殖用培地中で培
養し、その培地上清から所望のモノクローナル抗体を得
ることが出来る。大量の抗体を得るためには、ハイブリ
ドーマを腹水化することが挙げられる。この場合ミエロ
ーマ細胞由来の動物と同系の組織適合性動物の腹腔内に
各ハイブリドーマを移植し、増殖させるか、例えばヌー
ド・マウスなどに各ハイブリドーマを移植し、増殖さ
せ、該動物の腹水中に産生されたモノクローナル抗体を
回収して得ることが出来る。動物はハイブリドーマの移
植に先立ち、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラ
メチルペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内投与してお
くことができ、その処理後、ハイブリドーマを増殖さ
せ、腹水を採取することもできる。腹水液はそのまま、
あるいは従来公知の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿
法などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、
イオン交換クロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、
限外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラフィー法、高
速液体クロマトグラフィー法などにより精製してモノク
ローナル抗体として用いることができる。好ましくは、
モノクローナル抗体を含有する腹水は、硫安分画した
後、ＤＥＡＥ−セファロースの如き、陰イオン交換ゲル
及びプロテインＡカラムの如きアフィニティーカラムな
どで処理し精製分離処理できる。特に好ましくは抗原又
は抗原断片（例えば合成ペプチド、組換え抗原タンパク
質あるいはペプチド、抗体が特異的に認識する部位な
ど）を固定化したアフィニティー・クロマトグラフィ
ー、プロテインＡを固定化したアフィニティー・クロマ
トグラフィーなどが挙げられる。

【００４６】またこうして大量に得られた抗体の配列を
決定したり、ハイブリドーマ株から得られた抗体をコー
ドする核酸配列を利用して、遺伝子組換え技術により抗
体を作製することも可能である。さらにこれら抗体をト
リプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理し
て、場合により還元して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ
（ａｂ’）₂ といった抗体フラグメントにして使用して
もよい。標識物を付与する抗体としては、ＩｇＧ画分、
更にはペプシン消化後還元して得られる特異的結合部Ｆ
ａｂ’を用いることができる。これらの場合の標識物の
例としては、下記するように酵素（ペルオキシダーゼ、
アルカリホスファターゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼなど）、化学物質、蛍光物質あるいは放射性同位元
素などがある。本発明での検知・測定は、イムノ染色、
例えば組織あるいは細胞染色、イムノアッセイ、例えば
競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで
行うことができ、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡな
どを用いることができ、Ｂ−Ｆ分離を行ってもあるいは
行わないでその測定を行うことができる。好ましくは放
射免疫測定法や酵素免疫測定法であり、さらにサンドイ
ッチ型アッセイが挙げられる。例えばサンドイッチ型ア
ッセイでは、ＭＴ−ＭＭＰ−３に対する抗体の一方を検
出可能に標識化する。同じ抗原を認識できる他の抗体を
固相に固定化する。検体と標識化抗体及び固相化抗体を
必要に応じ順次反応させるためインキュベーション処理
し、ここで非結合抗体を分離後、標識物を測定する。測
定された標識の量は抗原、すなわちＭＴ−ＭＭＰ−３の
量と比例する。このアッセイでは、不溶化抗体や、標識
化抗体の添加の順序に応じて同時サンドイッチ型アッセ
イ、フォワード（forward)サンドイッチ型アッセイある
いは逆サンドイッチ型アッセイなどと呼ばれる。例えば
洗浄、撹拌、震盪、ろ過あるいは抗原の予備抽出等は、
特定の状況のもとでそれら測定工程の中で適宜採用され
る。特定の試薬、緩衝液等の濃度、温度あるいはインキ
ュベーション処理時間などのその他の測定条件は、検体
中の抗原の濃度、検体試料の性質等の要素に従い変える
ことができる。当業者は通常の実験法を用いながら各測
定に対して有効な最適の条件を適宜選定して測定を行う
ことが出来る。

【００４７】抗原あるいは抗体を固相化できる多くの担
体が知られており、本発明ではそれらから適宜選んで用
いることができる。担体としては、抗原抗体反応などに
使用されるものが種々知られており、本発明においても
勿論これらの公知のものの中から選んで使用できる。特
に好適に使用されるものとしては、例えばガラス、例え
ば活性化ガラス、多孔質ガラス、シリカゲル、シリカ−
アルミナ、アルミナ、磁化鉄、磁化合金などの無機材
料、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、
ポリフッ化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリ
レート、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合
体、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ス
チレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタ
クリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタ
クリレート共重合体など、架橋化アルブミン、コラーゲ
ン、ゼラチン、デキストラン、アガロース、架橋アガロ
ース、セルロース、微結晶セルロース、カルボキシメチ
ルセルロース、セルロースアセテートなどの天然または
変成セルロース、架橋デキストラン、ナイロンなどのポ
リアミド、ポリウレタン、ポリエポキシ樹脂などの有機
高分子物質、さらにそれらを乳化重合して得られたも
の、細胞、赤血球などで、必要に応じ、シランカップリ
ング剤などで官能性基を導入してあるものが挙げられ
る。さらに、ろ紙、ビーズ、試験容器の内壁、例えば試
験管、タイタープレート、タイターウェル、ガラスセ
ル、合成樹脂製セルなどの合成材料からなるセル、ガラ
ス棒、合成材料からなる棒、末端を太くしたりあるいは
細くしたりした棒、末端に丸い突起をつけたりあるいは
偏平な突起をつけた棒、薄板状にした棒などの固体物質
（物体）の表面などが挙げられる。

【００４８】これら担体へは、抗体を結合させることが
でき、好ましくは本発明で得られるＭＴ−ＭＭＰ−３に
対し特異的に結合するモノクローナル抗体を結合させる
ことができる。担体とこれら抗原抗体反応に関与するも
のとの結合は、吸着などの物理的な手法、あるいは縮合
剤などを用いたり、活性化されたものなどを用いたりす
る化学的な方法、さらには相互の化学的な結合反応を利
用した手法などにより行うことが出来る。標識として
は、酵素、酵素基質、酵素インヒビター、補欠分子類、
補酵素、酵素前駆体、アポ酵素、蛍光物質、色素物質、
化学ルミネッセンス化合物、発光物質、発色物質、磁気
物質、金属粒子、例えば金コロイドなど、放射性物質な
どを挙げることができる。酵素としては、脱水素酵素、
還元酵素、酸化酵素などの酸化還元酵素、例えばアミノ
基、カルボキシル基、メチル基、アシル基、リン酸基な
どを転移するのを触媒する転移酵素、例えばエステル結
合、グリコシド結合、エーテル結合、ペプチド結合など
を加水分解する加水分解酵素、リアーゼ、イソメラー
ゼ、リガーゼなどを挙げることができる。酵素は複数の
酵素を複合的に用いて検知に利用することもできる。例
えば酵素的サイクリングを利用することもできる。

【００４９】代表的な放射性物質の標識用同位体元素と
しては、〔³²Ｐ〕、〔¹²⁵ Ｉ〕、〔¹³¹Ｉ〕、〔
³Ｈ〕、〔 ¹⁴ Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などが挙げられる。代表
的な酵素標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼな
どのペルオキシダーゼ、大腸菌β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼなどのガラクトシダーゼ、マレエート・デヒドロゲナ
ーゼ、グルコース−６−フォスフェート・デヒドロゲナ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、ア
セチルコリンエステラーゼ、カタラーゼ、ウシ小腸アル
カリホスファターゼ、大腸菌アルカリホスファターゼな
どのアルカリ・フォスファターゼなどが挙げられる。ア
ルカリホスファターゼを用いた場合、４−メチルウンベ
リフェリルフォスフェートなどのウンベリフェロン誘導
体、ニトロフェニルホスフェートなどのリン酸化フェノ
ール誘導体、ＮＡＤＰを利用した酵素的サイクリング
系、ルシフェリン誘導体、ジオキセタン誘導体などの基
質を使用したりして、生ずる蛍光、発光などにより測定
できる。ルシフェリン、ルシフェラーゼ系を利用したり
することもできる。カタラーゼを用いた場合、過酸化水
素と反応して酸素を生成するので、その酸素を電極など
で検知することもできる。電極としてはガラス電極、難
溶性塩膜を用いるイオン電極、液膜型電極、高分子膜電
極などであることもできる。酵素標識は、ビオチン標識
体と酵素標識アビジン（ストレプトアビジン）に置き換
えることも可能である。標識は、複数の異なった種類の
標識を使用することもできる。こうした場合、複数の測
定を連続的に、あるいは非連続的に、そして同時にある
いは別々に行うことを可能にすることもできる。

【００５０】本発明においては、信号の形成に４−ヒド
ロキシフェニル酢酸、１，２−フェニレンジアミン、テ
トラメチルベンジジンなどと西洋ワサビ・ペルオキシダ
ーゼ、ウンベリフェリルガラクトシド、ニトロフェニル
ガラクトシドなどとβ−D −ガラクトシダーゼ、グルコ
ース−６−リン酸・デヒドロゲナーゼなどの酵素試薬の
組合わせも利用でき、ヒドロキノン、ヒドロキシベンゾ
キノン、ヒドロキシアントラキノンなどのキノール化合
物、リポ酸、グルタチオンなどのチオール化合物、フェ
ノール誘導体、フェロセン誘導体などを酵素などの働き
で形成しうるものが使用できる。蛍光物質あるいは化学
ルミネッセンス化合物としては、フルオレセインイソチ
オシアネート、例えばローダミンＢイソチオシアネー
ト、テトラメチルローダミンイソチオシアネートなどの
ローダミン誘導体、ダンシルクロリド、ダンシルフルオ
リド、フルオレスカミン、フィコビリプロテイン、アク
リジニウム塩、ルミフェリン、ルシフェラーゼ、エクォ
リンなどのルミノール、イミダゾール、シュウ酸エステ
ル、希土類キレート化合物、クマリン誘導体などが挙げ
られる。標識するには、チオール基とマレイミド基の反
応、ピリジルジスルフィド基とチオール基の反応、アミ
ノ基とアルデヒド基の反応などを利用して行うことがで
き、公知の方法あるいは当該分野の当業者が容易になし
うる方法、さらにはそれらを修飾した方法の中から適宜
選択して適用できる。また上記免疫原性複合体作製に使
用されることのできる縮合剤、担体との結合に使用され
ることのできる縮合剤などを用いることができる。

【００５１】縮合剤としては、例えばグルタルアルデヒ
ド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレン
ジイソチオシアネート、Ｎ，Ｎ’−ポリメチレンビスヨ
ードアセトアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスマレイミ
ド、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネー
ト、ビスジアゾベンジジン、１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシンイミ
ジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｓ
ＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミ
ドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓ
ＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マ
レイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレー
ト、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）ア
ミノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル４−（１−
マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−（ε−マレイミ
ドカプロイルオキシ）コハク酸イミド（ＥＭＣＳ），イ
ミノチオラン、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水
物、メチル−３−（４’−ジチオピリジル）プロピオン
イミデート、メチル−４−メルカプトブチリルイミデー
ト、メチル−３−メルカプトプロピオンイミデート、Ｎ
−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルメルカプトアセテー
トなどが挙げられる。

【００５２】本発明の測定法によれば、測定すべき物質
を酵素などで標識したモノクローナル抗体などの標識抗
体試薬と、担体に結合された抗体とを順次反応させるこ
とができるし、同時に反応させることもできる。試薬を
加える順序は選ばれた担体系の型により異なる。感作さ
れたプラスチックなどのビーズを用いた場合には、酵素
などで標識したモノクローナル抗体などの標識抗体試薬
を測定すべき物質を含む検体試料と共に最初適当な試験
管中に一緒に入れ、その後該感作されたプラスチックな
どのビーズを加えることにより測定を行うことができ
る。本発明の定量法においては、免疫学的測定法が用い
られるが、その際の固相担体としては、抗体などタンパ
ク質を良く吸着するポリスチレン製、ポリカーボネイト
製、ポリプロピレン製あるいはポリビニル製のボール、
マイクロプレート、スティック、微粒子あるいは試験管
などの種々の材料および形態を任意に選択し、使用する
ことができる。測定にあたっては至適ｐＨ、例えばｐＨ
約４〜９に保つように適当な緩衝液系中で行うことがで
きる。特に適切な緩衝剤としては、例えばアセテート緩
衝剤、クエン酸塩緩衝剤、フォスフェート緩衝剤、トリ
ス緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ボレート緩衝
剤、グリシン緩衝剤、炭酸塩緩衝剤、トリス−塩酸緩衝
剤などが挙げられる。緩衝剤は互いに任意の割合で混合
して用いることができる。抗体抗原反応は約０℃〜６０
℃の間の温度で行うことが好ましい。

【００５３】酵素などで標識されたモノクローナル抗体
などの抗体試薬及び担体に結合せしめられた抗体試薬、
さらには測定すべき物質のインキュベーション処理は、
平衡に達するまで行うことができるが、抗体抗原反応の
平衡が達成されるよりもずっと早い時点で固相と液相と
を分離して限定されたインキュベーション処理の後に反
応を止めることができ、液相又は固相のいずれかにおけ
る酵素などの標識の存在の程度を測ることができる。測
定操作は、自動化された測定装置を用いて行うことが可
能であり、ルミネセンス・ディテクター、ホト・ディテ
クターなどを使用して基質が酵素の作用で変換されて生
ずる表示シグナルを検知して測定することもできる。抗
体抗原反応においては、それぞれ用いられる試薬、測定
すべき物質、さらには酵素などの標識を安定化したり、
抗体抗原反応自体を安定化するように適切な手段を講ず
ることができる。さらに、非特異的な反応を除去し、阻
害的に働く影響を減らしたり、あるいは測定反応を活性
化したりするため、タンパク質、安定化剤、界面活性化
剤、キレート化剤などをインキュベーション溶液中に加
えることもできる。キレート化剤としては、エチレンジ
アミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）がより好ましい。当該分野
で普通に採用されていたりあるいは当業者に知られた非
特異的結合反応を防ぐためのブロッキング処理を施して
もよく、例えば、哺乳動物などの正常血清タンパク質、
アルブミン、スキムミルク、乳発酵物質、コラーゲン、
ゼラチンなどで処理することができる。非特異的結合反
応を防ぐ目的である限り、それらの方法は特に限定され
ず用いることが出来る。本発明の測定方法で測定される
試料としては、あらゆる形態の溶液やコロイド溶液、非
流体試料などが使用しうるが、好ましくは生物由来の試
料、例えば血液、血清、血漿、関節液、脳脊髄液、唾
液、羊水、尿、その他の体液、細胞培養液、組織培養
液、組織ホモジュネート、生検試料、組織、細胞などが
挙げられる。なお、本発明のＤＮＡも上記抗体と同様に
処理することが出来、それ自体公知の方法又はそれと実
質的に同様な方法で標識されたり、測定に用いることが
できることは理解されるべきである。

【００５４】本発明の前述した種々の態様を利用するこ
とにより、癌細胞の有無、癌の悪性度の診断等の癌の診
断治療に関わる研究に有用な診断手段として、あるいは
その他の医学的生理学的用途に適用される種々の技術手
段を提供することができる。以下に実施例を掲げ、本発
明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定
されず、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能
であることは理解されるべきである。なお、明細書及び
図面において、塩基及びアミノ酸等を略号で表示する場
合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biochemical
Nomenclatureによるか、あるいは当該分野において慣用
的に使用される用語の意味に基づくものであり、アミノ
酸に光学異性体が存在する場合は、特に断らないかぎり
Ｌ−体を示す。後述の実施例１（ｅ）で得られた大腸菌
ＮＭ５３３ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／Ｍ
ＭＰ−Ｘ２）は、平成７年７月５日（原寄託日）から通
商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢ
Ｈ）に寄託されており（微工研菌寄第Ｐ−１５０３３
号）、平成８年７月１日に原寄託よりブダペスト条約に
基づく寄託への移管請求がなされ、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−５５７３としてＮＩＢＨに保管されている。後述
の実施例３（ｆ）〜（ｈ）で得られたマウス由来単クロ
ーン性抗ヒト膜結合型マトリックスメタロプロテアーゼ
−３（ＭＴ−ＭＭＰ−３）抗体産生ハイブリドーマ（１
１７−４Ｅ１）は、平成７年７月５日（原寄託日）から
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢ
Ｈ）に寄託されており（微工研菌寄第Ｐ−１５０３１
号）、平成８年７月１日に原寄託よりブダペスト条約に
基づく寄託への移管請求がなされ、寄託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−５５７２としてＮＩＢＨに保管されている。

【００５５】

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明を具体的に説明
するが、本発明は実施例に限定されること無く様々な態
様が含まれることは理解されるべきである。実施例１新規なメタロプロテアーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ−
３）ｃＤＮＡの単離新規なＭＭＰｃＤＮＡの単離は基本的に以下の方法にし
たがって行った。１）ＭＭＰファミリーで保存されている配列からデジェ
ネレイテッドプライマーを合成し、ヒト組織由来ｃＤＮ
Ａのスクリーニングを行い、ＰＣＲ産物を得る。２）得られた部分的クローンをプローブとして、ｃＤＮ
ＡライブラリーよりｃＤＮＡ全長をスクリーニングす
る。（ａ）ｃＤＮＡライブラリーの構築ｃＤＮＡライブラリー作製に用いるＲＮＡソースとして
は、種々ヒト組織（胎盤、口腔癌、肺癌等）あるいは培
養細胞（ヒト線維肉腫細胞ＨＴ１０８０、ヒト単球性白
血病細胞Ｕ９３７等）から抽出した全ＲＮＡを使用する
ことができる。本実施例では、口腔癌組織由来ＲＮＡを
出発材料として行った結果を示した。組織からの全ＲＮ
Ａの抽出は、グアニジン−塩化セシウム法（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，１８：５２９４〜５２９９，１９７
９）にしたがって行い、得られた全ＲＮＡよりポリ
（Ａ）⁺ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラム
を使用して精製した。

【００５６】ｃＤＮＡの合成はガブラー＆ホフマンの方
法（Ｇｅｎｅ，２５：２６３〜２６９，１９８３）にし
たがって行った。精製したポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡをテン
プレート、ランダムヘキサマーあるいはオリゴｄＴをプ
ライマーとし、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて１ｓｔｓｔｒａｎｄｃ
ＤＮＡを合成した。これをＲＮａｓｅＨで処理し、続
いて大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて、２ｎｄｓ
ｔｒａｎｄｃＤＮＡを合成し２本鎖ｃＤＮＡを作製し
た。ｃＤＮＡの第１鎖の合成は、５μｌのポリＡ⁺ｍＲ
ＮＡ画分サンプル、２μｌのランダム・ヘキサマー（８
０μＭ）及び反応用緩衝液４．５μｌの混合物を７０℃
で１０分間インキュベーション処理した後、氷で冷却
し、これに５×反応用緩衝液４μｌ、０．１Ｍのジチオ
スレイトール（ＤＤＴ）２μｌ、１０ｍＭｄＮＴＰｓ
１μｌ及びＲＮａｓｅインヒビター１μｌを加え、良く
混合し、０．５μｌ（約１００ユニット）の SuperScri
pt reverse transcriptase (GIBCO BRL)を加え、３７℃
で１時間インキュベーション処理した後、７０℃で１０
分間処理した。ｃＤＮＡの第２鎖の合成は、同様にして
処理して実行できる。ｃＤＮＡライブラリーの構築は、
例えばλｇｔ１１を使用して行うことができる。合成し
た２本鎖ｃＤＮＡをＴ₄ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し
た後、ＥｃｏＲＩメチラーゼによりｃＤＮＡ中に存在す
るＥｃｏＲＩサイトをメチル化する。さらにＥｃｏＲＩ
リンカーｄ（ｐＧＧＡＡＴＴＣＣ）をＴ₄ ＤＮＡリガー
ゼで連結し、ＥｃｏＲＩ消化することにより両末端にＥ
ｃｏＲＩサイトを有するｃＤＮＡを構築した。このｃＤ
ＮＡをλｇｔ１１のＥｃｏＲＩサイトへクローニングし
た。次にこのｃＤＮＡをインビトロパッケージングキッ
トによりパッケージングし、ｃＤＮＡライブラリーを構
築する。ｃＤＮＡライブラリーとしては市販の種々ヒト
組織由来ｃＤＮＡライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を
直接使用することもできる。

【００５７】（ｂ）新規なＭＭＰｃＤＮＡ断片の増幅得られたｃＤＮＡをテンペレートとし、ＭＭＰファミリ
ーで保存されているアミノ酸配列を基に合成したデジェ
ネレイテッドプライマー及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
を用いてポリメラーゼ・チェイン・リアクション法（Ｐ
ＣＲ）を行った。新規なＭＭＰｃＤＮＡ断片のＰＣＲ
増幅は、例えば R. Saiki, et al., Science, Vol. 23
0, pp. 1350 (1985); R. Saiki, et al., Science, Vo
l. 239, pp. 487 (1985)；ＰＣＲテクノロジー (PCR Te
chnology) ，ストックトンプレス (Stockton Press) な
どに記載された方法に従って行われた。１μｌの上記工
程の反応生成物を鋳型として用い、５μｌの１０×ＰＣ
Ｒ緩衝液、１μｌの２５ｍＭｄＮＴＰｓ、１μｌの増
幅用プライマー及び１ユニットの Taq polymerase の混
合物を無菌蒸留水で５０μｌとした。この反応用混合物
を９３℃で１分間、５５℃で１分間そして７２℃で１分
間を１サイクルとして、３０サイクルのＰＣＲ増幅にか
けた。

【００５８】デジェネレイテッドプライマーは、以下の
ように設計、合成した。既知のＭＭＰファミリーの触媒
ドメイン中から高度に保存されているアミノ酸配列とし
て、ＧＥＡＤＩＭＩ（ＭＭＰ−１のＧｌｙ¹⁵⁵ 〜Ｉｌｅ
¹⁶¹ 、ＭＭＰ−２のＧｌｙ¹⁶⁵ 〜Ｉｌｅ¹⁷¹ 、ＭＭＰ−
３のＧｌｙ¹⁵⁵ 〜Ｉｌｅ¹⁶¹ 、ＭＭＰ−７のＧｌｙ¹⁵⁰
〜Ｉｌｅ¹⁵⁶ 、ＭＭＰ−８のＧｌｙ¹⁵⁴ 〜Ｉｌｅ¹⁶⁰ 、
ＭＭＰ−９のＡｒｇ¹⁶ ² 〜Ｉｌｅ¹⁶⁸ 、ＭＭＰ−１０の
Ｇｌｙ¹⁵⁴ 〜Ｉｌｅ¹⁶⁰ 、ＭＭＰ−１１のＧｌｙ¹⁵¹ 〜
Ｉｌｅ¹⁵⁷ 及びＭＭＰ−１２のＧｌｙ¹⁵⁵ 〜Ｖａｌ¹⁶¹
にそれぞれ相当する。アミノ酸番号は図１〜図５記載の
番号にしたがった）及びＧＤＡＨＦＤＤＤＥ（ＭＭＰ−
１のＧｌｙ¹⁹² 〜Ｇｌｕ²⁰¹ 、ＭＭＰ−２のＧｌｙ²⁰³
〜Ｇｌｕ²¹¹ 、ＭＭＰ−３のＡｓｎ¹⁹² 〜Ｇｌｕ²⁰¹ 、
ＭＭＰ−７のＧｌｙ¹⁸⁷ 〜Ｇｌｕ¹⁹⁶ 、ＭＭＰ−８のＧ
ｌｙ¹⁹¹ 〜Ｇｌｕ²⁰⁰ 、ＭＭＰ−９のＧｌｎ¹⁹⁹ 〜Ｇｌ
ｕ²⁰⁸ 、ＭＭＰ−１０のＴｙｒ¹⁹¹ 〜Ｇｌｕ²⁰⁰ 、ＭＭ
Ｐ−１１のＧｌｕ¹⁸⁸ 〜Ｇｌｕ¹⁹⁷ 、ＭＭＰ−１２のＧ
ｌｙ¹⁹² 〜Ｇｌｕ²⁰¹ にそれぞれ相当する。アミノ酸番
号は図１〜図５に記載の番号にしたがった）を選択した
（プライマー部分に相当するアミノ酸配列のアミノ酸表
記は一般的な１文字表記にしたがった）。このアミノ酸
配列を基に、デジェネレイト・オリゴヌクレオチド・プ
ライマーである、次の配列を有する５’プライマー
（５’プライマー５Ｐ−４）

【００５９】〔配列番号：３〕５’−（Ｃ又はＧ）Ｇ（Ａ又はＣ又はＧ又はＴ）（Ａ又
はＣ又はＧ）（Ａ又はＣ又はＧ）（Ａ又はＣ又はＧ又は
Ｔ）ＧＣ（Ａ又はＴ）ＧＡ（Ｃ又はＴ）ＡＴ（Ａ又は
Ｃ）（Ａ又はＧ）Ｔ（Ｃ又はＧ）ＡＴ−３’

【００６０】及び次の配列を有する３’プライマー
（３’プライマー３Ｐ−２）

【００６１】〔配列番号：４〕５’−（Ｃ又はＴ）ＴＣ（Ａ又はＧ）Ｔ（Ｃ又はＧ）
（Ａ又はＣ又はＧ又はＴ）ＴＣ（Ａ又はＧ）ＴＣ（Ａ又
はＧ）ＡＡ（Ａ又はＧ）ＴＧ（Ａ又はＧ）（Ａ又はＧ）
（Ａ又はＣ又はＴ）（Ａ又はＧ）ＴＣ（Ｃ又はＴ）ＣＣ

【００６２】をＤＮＡシンセサイザＭｏｄｅｌ３９２
（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、
β−シアノエチルフォスフォアミダイト法により合成し
た。上記配列中、括弧内に示された塩基はその複数の塩
基を導入すること、そしてその結果マルチプルなヌクレ
オチド配列を生ずることを示している。括弧内複数の塩
基は合成時に混合塩基を用いて導入した。この時、プラ
イマー５Ｐ−４には５’側にＢａｍＨＩサイト、プライ
マー３Ｐ−２には３’側にＥｃｏＲＩサイトを導入し
た。得られたプライマー５Ｐ−４およびプライマー３Ｐ
−２は１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６. ８で
平衡化したニックカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い
精製し、２６０ｎｍの吸光度を測定して２０μＭに調製
したものを用いた。

【００６３】得られたＰＣＲ産物を１０％アガロースゲ
ル電気泳動で分離し、設定したプライマーから予想され
るサイズ（９０〜１２０ｂｐ）のＰＣＲ産物、７種類を
抽出、精製した。精製した各ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ及
びＥｃｏＲＩで処理し、適当なプラスミド、例えばｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ^TMやｐＵＣ１８などのＢａｍＨＩ、
ＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングした。例えば、１
０μｌのＰＣＲ産物を１０％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で分離して確認し、約１２０−１３０ｂｐのＰＣ
Ｒ産物を、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ^TMベクタ
ーにサブクローニングした。１μｌのＰＣＲ産物、１μ
ｌの１０×ライゲーション緩衝液、２μｌの再懸濁化ベ
クター液及び１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼからなる反応
用混合物を１２℃で一晩インキュベーション処理した。
得られたベクターを適当なコンペテント細胞（例えば、
大腸菌ＨＢ１０１やＸＬ１−Ｂｌｕｅのコンペテント細
胞が使用できる）にTA Cloning Kit（Invitrogen）のプ
ロトコールに従い導入し、サブクローニングした。その
ほかｐＵＣ１１９，ｐＣＲ^TMなどのベクターを用いるこ
ともできる。クローン化したＰＣＲ産物の塩基配列を蛍
光ＤＮＡシーケンサＭｏｄｅｌ３７３Ａ（Ａｐｐｌｉｅ
ｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｔａｑダイプライマーサ
イクルシークエンシングキット（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し決定した。

【００６４】決定したこれら７種のＰＣＲ産物の塩基配
列を既知ＭＭＰの塩基配列と比較した結果、２つは既に
報告されているＭＭＰ−２の塩基配列（Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２６１：６６００〜６６０５，１９８６）
の一部と、１つはＭＭＰ−９の塩基配列（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１７２１３〜１７２２１，１
９８９）の一部と一致した。残りの４種のＰＣＲ産物の
内、２つはＭＭＰとは無関係な塩基配列であったが、後
の２つは９３ｂｐで同一の配列を有しており、ＭＭＰ遺
伝子と相同性を示し推定されるアミノ酸配列も保存され
ていた。このＰＣＲ産物を便宜的にＭＭＰ−Ｘ２フラグ
メントと命名した。

【００６５】（ｃ）ｃＤＮＡライブラリーからの新規Ｍ
Ｔ−ＭＭＰ−３遺伝子のスクリーニングと塩基配列の決
定前項（ｂ）で得られたＭＭＰ−Ｘ２フラグメント（ｃＤ
ＮＡ断片）２５ｎｇを、例えばランダムプライムドＤＮ
Ａラベリングキット（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈ
ａｉｍ）を使用して〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰ (Amersham)
を用いて標識し、２〜５．０ＣＰＭ／μｇの比活性を
持つプローブを得た。これを種々のヒト組織または細胞
由来ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための
プローブとして用いた。（ａ）項で記載したλｇｔ１１
中に構築したヒト口腔癌組織ｃＤＮＡライブラリーを宿
主菌大腸菌Ｙ１０９０に４×１０⁴ プラーク形成単位／
１５ｃｍ² プレートの濃度で感染させ、プラークを形成
させた。まず、大腸菌Ｙ１０９０株を０. ０２％マルト
ースを含むＬ培地で１晩培養後、集菌し、１０ｍＭＭ
ｇＳＯ₄に懸濁した。この細胞懸濁液とファージ液を混
合し３７℃１５分間保温し、ファージを宿主菌に吸着さ
せた。これに軟寒天を加え、予め作製しておいた１５ｃ
ｍ² のＬプレート上に広げた。プレートを４２℃で１晩
保温し、プラークを形成させた後、ナイロンフィルター
（例えば、ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）−Ｎ、Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ）あるいはニトロセルロースフィルター（例え
ばＨＡＴＦ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をプレート上に置
き、約３０秒間放置した。膜を穏やかに剥がしアルカリ
変性液（０. ５ＭＮａＯＨ及び１．５ＭＮａＣｌ）
に１分間浸した後、中和液（１. ５ＭＮａＣｌ含有
０. ５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８）に１５分
間浸した。このフィルターを２×ＳＳＰＥ（０. ３６Ｍ
ＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＨ₂ ＰＯ₄ 及び２ｍＭＥ
ＤＴＡ）で洗浄した後、風乾した。上述のプラークのフ
ィルターへの転写を繰り返し、少なくとも２枚のフィル
ターを調製する。但し、２枚目以降のフィルターとプレ
ートの接触時間は２分間程度に延長した。

【００６６】このフィルターを８０℃で２時間ベーキン
グし、ＤＮＡを固定した。１つのプレートから調製した
少なくとも２枚のフィルターをそれぞれ４２℃、１時間
洗浄液（１ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ及び０. １
％Ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ
（ＳＤＳ）含有５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐ
Ｈ８. ０）で洗浄後、ハイブリダイゼーションバッグ中
にフィルターを入れ、プレハイブリダイゼーション溶液
［50％ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’
ｓ溶液（０. ２％ウシ血清アルブミン、０. ２％ｐｏ
ｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｏｌｉｄｏｎｅ）、５×ＳＳＰ
Ｅ、０. １％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ熱変性サケ精
子ＤＮＡ］に浸し、４２℃で６〜８時間プレハイブリダ
イゼーションを行った。次に１００℃、５分間加熱変性
させた（ｃ）項で記載した³²Ｐ標識プローブをプレハイ
ブリダイゼーション溶液に添加し、４２℃で１晩ハイブ
リダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション完
了後、フィルターを室温で多量の０. １％ＳＤＳ含有２
×ＳＳＣ溶液で洗浄した。次にフィルターを０．１％Ｓ
ＤＳ含有の０．２×ＳＳＣ溶液中に５５℃、３０分間置
いた。この操作を２回繰り返したこのフィルターを風乾
した後、Ｘ線フィルム（ＫｏｄａｋＸＲ）と重ね−８
０℃で１２時間オートラジオグラフィーを行った。Ｘ線
フィルムを現像し、１枚のプレートからできた２枚のフ
ィルムを重ね、重なるシグナルをマークする。マークし
たシグナルに相当するプラークをＳＭ溶液（１００ｍＭ
ＮａＣｌ及び１０ｍＭＭｇＳＯ₄ 含有５０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.５）に懸濁した。この
ファージ懸濁液を適度に希釈して、好ましくは１０〜１
００プラーク形成単位／１０ｃｍ² プレートの濃度に希
釈して大腸菌を培養してある１０ｃｍ² プレートにプレ
ーティングし、上記と同様のスクリーニングを行い、組
換え体ファージを得た。

【００６７】（ｄ）新規ＭＴ−ＭＭＰ−３遺伝子を持つ
組換え体λｇｔ１１ＤＮＡの調製クローン化したファージをそれぞれ前（ｃ）項の記載と
同様にプレーティングし４２℃、３時間保温し、続いて
３７℃、１晩保温した後ＳＭ溶液に数滴のクロロホルム
を加え室温で３０分間放置した。ＳＭ溶液と共に上層の
軟寒天を掻き取り、遠心分離した。遠心後の上清に終濃
度１０％になるようにポリエチレングリコール−６００
０（ＰＥＧ−６０００）を加え攪拌した後、４℃で１時
間放置した。これを遠心分離し上清を捨て、ファージ粒
子を回収した。このファージ粒子をＳＭ溶液に懸濁し、
グリセロールグラジエント超遠心分離法（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ，ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ，Ｅｄ．Ｔ．Ｍａｎｉａｓｔｉｓ，Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｖｏｕｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ，２ｎｄＥｄ．７８，１９８９）により精製し
た。得られたファージをＴＭ溶液に懸濁し、ＤＮａｓｅ
ＩおよびＲＮａｓｅＡで処理後、２０ｍＭＥＤＴ
Ａ、５０μｇ／ｍｌＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ及び
０. ５％ＳＤＳ混合液を加え６５℃、１時間保温し
た。これをフェノール抽出、ジエチルエーテル抽出後、
エタノール沈殿によりDNA を沈殿させた。得られたＤＮ
Ａを７０％エタノールで洗浄後乾燥し、TE溶液（１０ｍ
ＭＥＤＴＡ含有１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、
ｐＨ８）に溶解した。

【００６８】（ｅ）挿入断片の塩基配列決定前項（ｄ）で調製したλｇｔ１１ＤＮＡをＥｃｏＲＩ
で分解し、挿入断片を分離精製後、ベクターｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ^TM（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＩ
部位にサブクローニングする。この組換え体ｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔで大腸菌ＮＭ５３３ＸＬ１−Ｂｌｕｅを
形質転換した。形質転換細胞をＦ’選択後、ヘルパーフ
ァージＶＣＳＭ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を感染さ
せ終夜培養する。培養液を遠心分離し菌体を除き、これ
にＰＥＧ／ＮａＣｌを加えファージを沈殿させる。沈殿
をＴＥ溶液に懸濁後、１本鎖ＤＮＡをフェノール抽出、
エタノール沈殿により回収した。この１本鎖ＤＮＡの塩
基配列を蛍光ＤＮＡシーケンサＭｏｄｅｌ３７３Ａ（Ａ
ｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｔａｑダイプ
ライマーサイクルシークエンシングキット（Ａｐｐｌｉ
ｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し決定した。決定
した塩基配列の全長は２１０７ｂｐであり、その配列は
配列表の配列番号：１に記載した。ＧＥＮＢＡＮＫ／Ｅ
ＭＢＬＤＮＡＤａｔａＢａｓｅを使用し、配列表
の配列番号：１に記載した塩基配列を検索したが、同一
の配列は存在しなかった。この約２. １ｋｂのＤＮＡ配
列中には、推定６０４アミノ酸をコードするオープンリ
ーディングフレームの存在が認められ、その推定される
アミノ酸配列を配列表の配列番号：２に記載した。この
推定されるタンパク質を、「ＭＴ−ＭＭＰ−３」と名付
けた。得られたＤＮＡ断片をプラスミドＰＥＸ，ｐＭＥ
Ｍｎｅｏ、ｐＫＧなどのベクターに組込み、大腸菌、Ｃ
ＨＯ細胞などで発現させることができる。上記ＭＴ−Ｍ
ＭＰ−３をコードする塩基配列を挿入したベクター（ｐ
ＳＧ５^TM（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を保有する大腸菌
ＮＭ５３３ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／Ｍ
ＭＰ−Ｘ２）は、工業技術院生命工学工業技術研究所に
受託番号ＦＥＲＭＢＰ−５５７３として寄託保存され
ている（平成７年７月５日（原寄託日）に寄託された微
工研菌寄第Ｐ−１５０３３号（原寄託）よりブダペスト
条約に基づく寄託への移管請求が平成８年７月１日にさ
れた）。

【００６９】（ｆ）ＭＴ−ＭＭＰ−３のアミノ酸配列解
析配列表配列番号：１に記載のＭＴ−ＭＭＰ−３の塩基配
列から推定される配列表配列番号：２に記載したアミノ
酸配列を既知のＭＭＰｓのアミノ酸配列と比較したアラ
イメントを図１〜図５に示した。配列表配列番号：２に
示したアミノ酸配列は、ＭＭＰファミリーと高い相同性
を示し、ＭＭＰファミリーに特徴的なドメイン構造、す
なわち、分泌産生時に除去されるシグナルペプチド、プ
ロペプチドドメイン、触媒ドメイン、ヒンジドメイン、
ヘモペキシン凝血酵素様ドメインが良好に保存されてい
た。特に、ＭＭＰファミリーで非常に高度に保存されて
いるプロ体と活性型の切断部位近傍の配列ＰＲＣＧＶＰ
ＤはＭＴ−ＭＭＰ−３でも完全に保存されており、また
活性ドメインの配列も高い保存性を示した。Ｚｎ²⁺の結
合部位を含む活性ドメインのアミノ酸配列をＭＴ−ＭＭ
Ｐ−３と他の既知のＭＭＰと比較したところ、ＭＴ−Ｍ
ＭＰ−１に対する相同性は６６％と最も高く、また他の
ＭＭＰに対する相同性もＭＭＰ−１２に対して５１％、
ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９に対して５０％、ＭＭＰ−１
に対して４９％、ＭＭＰ−３に対して４８％、ＭＭＰ−
８に対して４７％、ＭＭＰ−１１に対して４６％、ＭＭ
Ｐ−７に対して４４％の相同性を示した。

【００７０】さらにＭＴ−ＭＭＰ−３のアミノ酸配列上
で他のＭＭＰと比較して特徴的な点は、３ヶ所の挿入配
列が存在する点である。すなわち、プロペプチドドメイ
ンと触媒ドメインの間に存在するＧＳＳＫＦＨＩＲＲＫ
Ｒの配列からなる１１アミノ酸残基の挿入配列−１（Ｉ
Ｓ−１；配列表の配列番号：２のＧｌｙ¹⁰⁹ 〜Ａｒｇ
¹¹⁹ ）、触媒ドメイン中のＰＹＳＥＬＥＮＧの配列から
なる８アミノ酸残基の挿入配列−２（ＩＳ−２；配列表
の配列番号：２のＰｒｏ¹⁷¹ 〜Ｇｌｙ¹⁷⁸ ）及びトラン
スメンブレンドメイン様の２４個の疎水性アミノ酸の連
続配列ＡＩＡＩＶＩＰＣＩＬＡＬＣＬＬＶＬＶＹＴＶＦ
ＱＦを含む７５アミノ酸残基の挿入配列−３（ＩＳ−
３；配列表の配列番号：２のＡｓｐ⁵³⁰ 〜Ｖａｌ⁶⁰⁴ ）
が存在する。このような３ヶ所の挿入配列は、ＭＭＰフ
ァミリー中ではＭＴ−ＭＭＰ−１においてのみ存在し、
他のＭＭＰには認められなかった。ＭＴ−ＭＭＰ−３に
おける３ヶ所の挿入配列について位置及び構成するアミ
ノ酸残基の数は、ＭＴ−ＭＭＰ−１におけるそれとほと
んど同じであったが、アミノ酸の組成は、ＭＴ−ＭＭＰ
−１のそれとは明らかに異なっており、ＩＳ−３のＭＴ
−ＭＭＰ−１との相同性は３７％であった。なお、全配
列の相同性は４３％であった。最初の挿入配列ＩＳ−１
は例外的にＭＭＰ−１１にも存在しているが、ＩＳ−１
中で保存されている配列ＲＸＫＲは、ズブチリシン様プ
ロテアーゼの切断部位の配列であり、アミノ酸配列ＲＸ
ＫＲはズブチリシン様プロテアーゼによる多くの真核生
物分泌タンパク質の切断部位であることが知られている
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１２１２７〜１
２１３０，１９９１）。ＩＳ−３中の疎水性アミノ酸の
連続配列はトランスメンブレンドメインと考えられ、Ｍ
Ｔ−ＭＭＰ−１の際立って特徴的な点であり（Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．：２７０，８０１〜８０５，１９９
５）、ＭＴ−ＭＭＰ−３のＩＳ−３中に存在する疎水性
アミノ酸の連続配列もトランスメンブレンドメインと考
えられた（実施例５参照）。本発明により単離されたＭ
Ｔ−ＭＭＰ−３ｃＤＮＡによってコードされるタンパク
質のアミノ酸配列は、他のＭＭＰファミリーと相同性が
高く、先に本発明者らが見出したＭＴ−ＭＭＰ−１とも
類似しているが、詳細な点では明らかに異なり、また分
子量も異なっていた。本発明のタンパク質は約６９ｋＤ
ａの分子量を有している。これらの配列上の特徴は、Ｍ
Ｔ−ＭＭＰ−１及びＭＴ−ＭＭＰ−３は、ＭＭＰファミ
リー中のサブファミリーを構成していることを示唆して
いる。

【００７１】実施例２ＭＴ−ＭＭＰ−３ｍＲＮＡの
発現（ａ）ヒト組織中での発現ヒト心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓各
組織由来のｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡをブロットしてある
メンブレンＨｕｍａｎＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕ
ｅＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ）を用い、³²Ｐ標識した実施例１（ｅ）項に記載した
２．１ｋｂのｃＤＮＡをプローブとしてノーザンブロッ
ティングを行った。プローブの標識は実施例１（ｃ）項
の記載と同様に行った。３×ＳＳＣ（０. ４５ＭＮａ
Ｃｌ，０．０４５Ｍｔｒｉｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａ
ｔｅ２Ｈ₂ Ｏ、ｐＨ７. ０）で湿らせたＭｕｌｔｉｐ
ｌｅＴｉｓｓｕｅＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔｓのフ
ィルターをプレハイブリダイゼーション溶液（０. ７５
ＭＮａＣｌ、２. ５ｍＭＥＤＴＡ、０. ５×Ｄｅｎ
ｈａｒｄｔ’ｓ溶液、５０％ｆｏｒｍａｍｉｄｅ及び
１％ＳＤＳ含有２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、
ｐＨ７. ５）１０ｍｌ中で穏やかに攪拌しながら４２℃
で２〜３時間プレハイブリダイズした。次にハイブリダ
イゼーション溶液（プレハイブリダイゼーション溶液に
１０％ｓｏｄｉｕｍｄｅｘｔｒａｎ、２０μｇ／ｍ
ｌ変性サケ精子ＤＮＡを加えた溶液）１０ｍｌに熱変性
したプローブを加えプレハイブリダイゼーション溶液と
交換し、４３℃で一晩ハイブリダイゼーションを行っ
た。ハイブリダイゼーション完了後、０. １％ＳＤＳ
含有２×ＳＳＣ溶液で洗浄した。

【００７２】次にブロットを０. １％ＳＤＳ含有１×
ＳＳＣ溶液中に５５℃、３０分間置いた。このブロット
をバイオイメージアナライザーＢＡＳ１０００（富士写
真フィルム株式会社）でトレースし各組織におけるｍＲ
ＮＡの発現強度を評価した。このとき、同じブロットを
³²Ｐ標識したＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰ
ＤＨ）遺伝子（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いてプロービン
グし、ｍＲＮＡの内部標準とした。その結果を図６Ａに
示した。ＭＴ−ＭＭＰ−３ｍＲＮＡのサイズは、何れの
組織でも１２ｋｂであり、調べた組織中、肺、脳、胎盤
で高い発現を認めたが、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、骨格
筋では検出されなかった。一方、同様にＨｕｍａｎＭｕ
ｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌ
ｏｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用い、³²Ｐ標識したＭＴ
−ＭＭＰ−１ｃＤＮＡをプローブとしてノーザンブロッ
ティングを行ったところ、４．５ｋｂに検出されたＭＴ
−ＭＭＰ−１ｍＲＮＡは、肺、腎臓、胎盤で顕著に発現
していたのに対し脳では最も低い発現であった。因み
に、ＭＴ−ＭＭＰ−１とＭＴ−ＭＭＰ−３のクロスハイ
ブリダイゼーションは生じなかった。

【００７３】（ｂ）培養癌細胞中での発現種々ヒト培養癌細胞中でのＭＴ−ＭＭＰ−３ｍＲＮＡの
発現を検討した。ヒト癌細胞として、喉頭癌由来細胞Ｈ
ｅｐ２、膀胱癌由来細胞Ｔ２４、肺癌由来細胞ＰＣ−
３、胃癌由来細胞ＫＫＬＳ、ＮＫＰＳ及びＭＫＮ−２
８、骨肉腫由来細胞ＳＫ−ＥＳ−１及びＵ−２０Ｓ、扁
平細胞癌由来細胞ＯＳＣ−１９及び悪性黒色腫細胞Ａ３
７５、線維芽細胞として胎児肺由来線維芽細胞ＨＥＬを
使用した。各細胞から抽出したＲＮＡ、１検体につき１
０μｇを５０％ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、１７．５％ｆｏｒ
ｍａｌｉｎ含有２％ＭＯＰＳ、ｐＨ７．５に溶解し、６
５℃で１０分間反応させた。これを１％アガロースで２
％ＭＯＰＳ中で電気泳動を行った。泳動後のゲルを、ナ
イロンメンブレン（例えば、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ，Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ）に転写した。転写後のメンブレンを波長２
５４ｎｍの紫外線を１２００マイクロジュール照射し、
固定した。このブロットを前項（ａ）と同じく³²Ｐ標識
したｃＤＮＡと１６時間ハイブリダイゼーションを行
い、バイオイメージアナライザーＢＡＳ１０００（富士
写真フィルム株式会社）でトレースし、シグナルの検
出、強度を評価した。ＭＴ−ＭＭＰ−３ｍＲＮＡは、Ｔ
２４細胞及びＨｅｐ２細胞で他の細胞より高い発現が検
出されたが、これらの細胞におけるＭＴ−ＭＭＰ−１ｍ
ＲＮＡの発現レベルは低レベルであった。一方、ＭＴ−
ＭＭＰ−１ｍＲＮＡの顕著な発現を認めたＯＳＣ−１９
細胞及びＨＥＬ細胞では逆にＭＴ−ＭＭＰ−３ｍＲＮＡ
の発現は他の細胞に比べ低レベルであった（図６Ｂ）。
ＭＴ−ＭＭＰ−１及びＭＴ−ＭＭＰ−３は、そのアミノ
酸配列の比較から極めて類似したドメイン構造を有し、
またプロＭＭＰ−２の活性化という同じ作用を有してい
るにも拘らず（実施例６参照）、その発現は、組織ある
いは細胞レベルでは全く異なるパターンを示した。この
ことは、ＭＴ−ＭＭＰ−１とＭＴ−ＭＭＰ−３が類似し
た構造及び作用を有するにも拘らず、異なる発現制御を
受けていることを示している。

【００７４】実施例３モノクローナル抗体の調製（ａ）抗原ポリペプチドの調製配列表の配列番号：２に記載したＭＴ−ＭＭＰ−３のア
ミノ酸配列中より他のＭＭＰファミリーとの相同性が低
い、ＭＴ−ＭＭＰ−３に特徴的な配列として、次の４個
の配列を選択し、合成した。

【００７５】〔配列番号：５〕ＱＴＲＧＳＳＫＦＨＩＲＲＫＲ（配列表配列番号：２のＧｌｎ¹⁰⁶ 〜Ａｒｇ¹¹⁹ の配
列；「ポリペプチドＡ」と略記する）〔配列番号：６〕ＥＥＶＰＹＳＥＬＥＮＧＫＲＤ（配列表配列番号：２のＧｌｕ¹⁶⁸ 〜Ａｓｐ¹⁸¹ の配
列；「ポリペプチドＢ」と略記する）〔配列番号：７〕ＰＴＳＰＲＭＳＶＶＲＳＡＥＴＭＱＳＡ（配列表配列番号：２のＰｒｏ⁵⁵〜Ａｌａ⁷²の配列；
「ポリペプチドＣ」と略記する）〔配列番号：８〕ＴＬＧＮＰＮＨＤＧＮＤＬＦＬ（配列表配列番号：２のＴｈｒ²²⁹ 〜Ｌｅｕ²⁴² の配
列；「ポリペプチドＤ」と略記する）

【００７６】これらのポリペプチドをペプチド合成機
（ペプチドシンセサイザー９６００、ＭｉｌｌｉＧｅｎ
／Ｂｉｏｓｅｒｃｈ）を使用して、Ｆｍｏｃ−ｂｏｐ法
で合成した。ポリペプチドのＮ末端にはシステインを導
入した。合成したペプチドはμＢｏｎｄａｓｐｈｅｒ
ｅ，Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を用いた高速液体ク
ロマトグラフィーにより精製した。

【００７７】（ｂ）各ポリペプチドとＢＳＡの複合体の
調製システイン残基を介してウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
と結合させ抗原コンジュゲートとした。２０ｍｇＢＳＡ
を２ｍｌの０. １Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７. ５）に溶解
したものと１８. １３ｍｇＮ−（６−ｍａｌｅｉｍｉ
ｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅを
２００μl のジメチルホルムアミドに溶解したものと混
合し、３０℃、３０分間反応させた。ついで、上記の混
合液を０. １Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７. ０）で平衡化し
たＰＤ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でゲルろ過した。
マレイミドが結合したＢＳＡを分取し、１. ５ｍｌ以下
に濃縮した。マレイミドが結合したＢＳＡに対し５０倍
モル量の前記（ａ）で合成した各ポリペプチドを１ｍｌ
の０. １Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７. ０）に溶解したもの
とそれぞれ混合し、４℃、２０時間インキュベートし、
ＢＳＡ−ポリペプチド複合体を調製した。

【００７８】（ｃ）抗体産生細胞の調製前記（ｂ）で調製した４種類のポリペプチドＡ、Ｂ、Ｃ
及びＤとＢＳＡとの複合体それぞれ２００μｇを完全フ
ロインドアジュバントと共に８週令Ｂａｌｂ／ｃ雌マウ
スに腹腔内投与し、初回免疫した。１８日後に０. １Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７. ５）に溶解した各複合体２００
μｇをそれぞれの初回免疫したマウスに腹腔内投与し、
追加免疫した。さらに３２日後に追加免疫時と同様に各
複合体１００μｇを静脈内投与し、最終免疫とした。そ
の３日後に脾臓を摘出し、脾細胞懸濁液を調製した。

【００７９】（ｄ）細胞融合（１）以下の材料および方法を用いた。ＲＰＭＩ−１６４０培地：ＲＰＭＩ−１６４０（Ｆｌｏ
ｗＬａｂ．）に重炭酸ナトリウム（２４ｍＭ）、ピル
ビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリンＧカリウム
（５０Ｕ／ｍｌ）、硫酸アミカシン（１００μｇ／ｍ
ｌ）を加え、ドライアイスでｐＨを７．２にし、０．２
μｍ東洋メンブレンフィルターで除菌ろ過した。ＮＳ−１培地：上記ＲＰＭＩ−１６４０培地に除菌ろ過
したＦＣＳ（Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）を１５
％（ｖ／ｖ）の濃度になるように加えた。ＰＥＧ４０００溶液：ＲＰＭＩ−１６４０培地にポリエ
チレングリコール４０００（ＰＥＧ４０００，Ｍｅｒ
ｋ＆Ｃｏ．）を５０％（ｗ／ｗ）になるように加
え、無血清溶液を調製した。８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞ＳＰ２（ＳＰ２／
０−Ａｇ１４）との融合は、ＳｅｌｅｃｔｅｄＭｅｔ
ｈｏｄｉｎＣｅｌｌｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙｐｐ３５１〜３７２（ｅｄ. Ｂ. Ｂ. Ｍｉｓｈｅｌ
ｌａｎｄＳ. Ｎ. Ｓｈｉｉｇｉ）、Ｗ. Ｈ. Ｆｒｅ
ｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ（１９８０）に記
載のＯｉらの方法を若干改変して行った。

【００８０】（２）以下では、ポリペプチドＡ−ＢＳＡ
複合体で免疫したマウス由来の有核脾細胞とミエローマ
細胞ＳＰ２との融合に関して詳述する。前記（ｃ）で調
製した有核脾細胞（生細胞率１００％）それぞれとミエ
ローマ細胞（生細胞率１００％）とを５：１の比率で以
下の手順で融合した。ポリペプチドＡ脾細胞懸濁液とミ
エローマ細胞をそれぞれＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し
た。次に同じ培地に懸濁し、融合させるために有核脾細
胞１. １×１０⁹ 個とミエローマ細胞２. １×１０⁸ 個
を混合した。次に遠心分離により細胞を沈殿させ、上清
を完全に吸引除去した。沈殿した細胞に３７℃に加温し
たＰＥＧ４０００溶液〔５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレン
グリコール４０００含有ＲＰＭＩ１６４０培地〕７. １
ｍｌを１分間で滴下し、１分間攪拌し、細胞を再懸濁、
分散させた。次に３７℃に加温したＲＰＭＩ１６４０培
地１４. ２ｍｌを２分間で滴下した後、同培地４９. ７
ｍｌを２〜３分間で常に攪拌しながら滴下し、細胞を分
散させた。これを遠心分離し、上清を完全に吸引除去し
た。次にこの沈殿した細胞に３７℃に加温したＮＳ−１
培地〔除菌ろ過した１５％（ｗ／ｖ）仔牛胎児血清（Ｊ
ＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）含有ＲＰＭＩ１６４０
培地〕７１ｍｌを速やかに加え、大きい細胞塊を注意深
くピペッティングで分散した。さらに同培地１４２ｍｌ
を加えて希釈し、ポリスチレン製９６穴マイクロウェル
にウェル当り６. ０×１０⁵ 個／０. １ｍｌの細胞を加
えた。細胞を加えた上記マイクロウェルを７％炭酸ガス
／９３％空気中で温度３７℃、湿度１００％で培養し
た。ポリペプチドＢ−ＢＳＡ複合体で免疫したマウス由
来脾細胞の場合では、脾細胞６. ２×１０⁸ 個とミエロ
ーマ細胞１. ２４×１０⁸ 個を混合し、上記で使用した
ＰＥＧ４０００溶液、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＮＳ−１
培地をそれぞれ４.１ｍｌ、３６. ９ｍｌ、１２３ｍｌ
用いた。ポリペプチドＣ−ＢＳＡ複合体で免疫したマウ
ス由来の脾細胞の場合、脾細胞３. ６×１０⁸ 個とミエ
ローマ細胞７. ５×１０⁷ 個を混合し、ＰＥＧ４０００
溶液、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＮＳ−１培地をそれぞ
れ２. ５ｍｌ、２２. ５ｍｌ、７５ｍｌ使用した。ポリ
ペプチドＤ−ＢＳＡ複合体で免疫したマウス由来の脾細
胞の場合、脾細胞６. ０×１０⁸ 個とミエローマ細胞
１. ２×１０⁸ 個を混合し、ＰＥＧ４０００溶液、ＲＰ
ＭＩ１６４０培地、ＮＳ−１培地をそれぞれ４. ０ｍ
ｌ、３６. ０ｍｌ、１２０ｍｌ使用した。

【００８１】（ｅ）選択培地によるハイブリドーマの選
択的増殖（１）使用する培地は以下の通りである。ＨＡＴ培地：前記（ｄ）（１）で述べたＮＳ−１培地に
更にヒポキサンチン（１００μＭ）、アミノプテリン
（０．４μＭ）およびチミジン（１６μＭ）を加えた。ＨＴ培地：アミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ
培地と同一組成のものである。（２）前記（ｄ）の培養開始後翌日（１日目）、細胞に
パスツールピペットでＨＡＴ培地２滴（約０. １ｍｌ）
を加えた。２、３、５、８日目に培地の半分（約０. １
ｍｌ）を新しいＨＡＴ培地で置き換え、１１日目に培地
の半分を新しいＨＴ培地で置き換えた。１４日目にハイ
ブリドーマの生育が肉眼にて認められた全ウエルについ
て固相−抗体結合テスト法（ＥＬＩＳＡ）により陽性ウ
エルを調べた。すなわち、ポリスチレン性９６穴プレー
トを抗原としたポリペプチドＡ、Ｂ、ＣおよびＤそれぞ
れでコートし、次に洗浄用ＰＢＳ（０. ０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０含有）を用いて洗浄して未吸着のペプチドを除い
た。さらに各ウエルの未コート部分を１％ＢＳＡでブロ
ックした。この各ウエルにハイブリドーマの生育が確認
されたウエルの上清０. １ｍｌを添加し、室温で約１時
間静置した。２次抗体として西洋わさびペルオキシダー
ゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｃａｐ
ｐｅｌＬａｂ．）を加え、さらに室温で約１時間静置
した。次に基質である過酸化水素とο- フェニレンジア
ミンを加え、発色の程度をマイクロプレート用吸光度測
定機（ＭＲＰ−Ａ４、東ソー）を用いて４９２ｎｍの吸
光度で測定した。

【００８２】（ｆ）ハイブリドーマのクローニング上記（ｅ）で得られた各抗原ペプチドに対する陽性ウエ
ル中のハイブリドーマを、限界希釈法を用いてモノクロ
ーン化した。すなわち、ＮＳ−１培地１ｍｌ当りフィ
ーダーとして１０⁷ 個のマウス胸腺細胞を含むクローニ
ング培地を調製し、９６穴マイクロウエルにハイブリド
ーマをウエル当り５個、１個、０. ５個になるように希
釈し、それぞれ３６穴、３６穴、２４穴に加えた。５日
目、１２日目に全ウエルに約０. １ｍｌのＮＳ−１培地
を追加した。クローニング開始後約２週間で、肉眼的に
十分なハイブリドーマの生育を認め、コロニー形成陰性
ウエルが５０％以上である群について（ｅ）に記載した
ＥＬＩＳＡを行った。調べた全ウエルが陽性でない場
合、抗体陽性ウエル中のコロニー数が１個のウエルを４
〜６個選択し、再クローニングを行った。最終的に表１
〜表４にまとめて示したように各ポリペプチドＡ、ポリ
ペプチドＢ、ポリペプチドＣまたはポリペプチドＤに対
するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマがそ
れぞれ７個、１６個、１１個、４個得られた。

【００８３】（ｇ）ハイブリドーマの培養とモノクロー
ナル抗体の精製得られた各ハイブリドーマ細胞をＮＳ−１培地で培養
し、その上清から濃度１０〜１００μｇ／ｍｌのモノク
ローナル抗体を得ることができた。また、得られたハイ
ブリドーマ１０⁷ 個を予め１週間前にプリスタンを腹腔
内投与したマウス（ＢＡＬＢ／ｃ系、♀、６週齢）に同
じく腹腔内投与し、１〜２週間後、腹水中からも４〜７
ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を含む腹水を得ること
ができた。得られた腹水を４０％飽和硫酸アンモニウム
で塩析後、ＩｇＧクラスの抗体をプロテインＡアフィゲ
ル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に吸着させ、０. １Ｍクエン酸緩
衝液（ｐＨ５）で溶出することにより精製した。（ｈ）モノクローナル抗体のクラス、サブクラスの決定前述したＥＬＩＳＡに従い、各ポリペプチドＡ、ポリペ
プチドＢ、ポリペプチドＣまたはポリペプチドＤをコー
トしたマイクロタイトレーションプレートに、（ｆ）で
得られたモノクローンの上清を加えた。次にＰＢＳで洗
浄後、アイソタイプ特異的ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体
（ＺｙｍｅｄＬａｂ. ）を加えた。ＰＢＳにより洗浄
後、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇ
Ｇ（Ｈ＋Ｌ）を加え、基質として過酸化水素および２，
２’−アジノ−ジ（３−エチルベンゾチアゾリン酸）を
用いてクラス、サブクラスを決定した。最終的に表１〜
表４に示したようにＭＴ−ＭＭＰ−３に対するモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマを得た。

【００８４】

【表１】

【表２】

【００８５】

【表３】

【００８６】

【表４】なお、クローン番号 117-4E1は、工業技術院生命工学工
業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−５５７２とし
て寄託保存されている（平成７年７月５日（原寄託日）
に寄託された微工研菌寄第Ｐ−１５０３１号（原寄託）
よりブダペスト条約に基づく寄託への移管請求が平成８
年７月１日にされた）。

【００８７】（ｉ）抗ＭＴ−ＭＭＰ−３モノクローナル
抗体の特異性ヒト新生児線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）の培養上清中か
らそれぞれ精製した潜在型ＭＭＰ−１（Ｃｌｉｎ．Ｃｈ
ｉｍ．Ａｃｔａ，２１９：１〜１４，１９９３）、潜在
型ＭＭＰ−２（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２２
１：９１〜１０３，１９９３）及び潜在型ＭＭＰ−３
（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２１１：５９〜７
２，１９９２）、ヒト直腸癌細胞（ＣａＲ−１）の培養
上清から精製した潜在型ＭＭＰ−７（ＣａｎｃｅｒＲ
ｅｓ．，５０：７７５８〜７７６４，１９９０）、ヒト
好中球より精製した潜在型ＭＭＰ−８（Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，３７１：Ｓｕｐｐｌ
ｅｍｅｎｔ２９５〜３０４，１９９０）並びにヒト線維
芽細胞腫株（ＨＴ１０８０）の培養上清から精製した潜
在型ＭＭＰ−９（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：
２１７１２〜２１７１９，１９９２）をそれぞれ抗原と
して使用し、前述の（ｅ）に記載した固相−抗体結合テ
スト法（ＥＬＩＳＡ）によりヒトＭＴ−ＭＭＰ−３ペプ
チドと陽性反応を示す抗ＭＴ−ＭＭＰ−３モノクローナ
ル抗体（モノクローン番号１１７−４Ｅ１、１５７−６
Ｆ５及び１５８−８Ｅ６）の交差反応性を調べた。すな
わち、ポリスチレン製９６穴プレートを使用し、各ウェ
ルに精製した各ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、
ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８及びＭＭＰ−９をそれぞれ５０
ｎｇ／ｗｅｌｌで加えコートした。洗浄用ＰＢＳで洗浄
し未吸着の抗原を除去した後、各ウェルの未コート部分
を３％スキムミルク含有ＰＢＳでブロックした。この各
ウェルに各抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体それぞれ
を１μｇ／ｗｅｌｌで加え、室温で約１時間静置した。
プレートを洗浄後、２次抗体としてペルオキシダーゼ標
識ヤギ抗マウス免疫グロブリンを加えさらに室温で約１
時間反応させた。次に基質である過酸化水素とο−フェ
ニレンジアミンを加え、発色の程度をマイクロプレート
用吸光度測定機（ＭＲＰ−Ａ４、東ソー）を用いて４９
２ｎｍの吸光度で測定した。その結果、抗ＭＴ−ＭＭＰ
−３モノクローナル抗体は何れも、供試したＭＴ−ＭＭ
Ｐ−３以外の精製ＭＭＰｓと反応性を示さなかった。本
実施例３の方法を、合成ペプチド抗原の代わりにリコビ
ナントＭＴ−ＭＭＰ−３、例えば下記実施例４あるいは
５の方法で得られたリコビナントＭＴ−ＭＭＰ−３を抗
原として用いることにより繰り返し、同様にして抗ＭＴ
−ＭＭＰ−３モノクローナル抗体を作製する。

【００８８】実施例４遺伝子産物の発現と同定動物細胞を宿主としてＭＴ−ＭＭＰ−３を発現させるた
め、ｃＤＮＡを発現ベクターと連結した。本実施例で
は、発現用ベクターにはＳＶ４０のプロモーター、エン
ハンサー、ポリＡシグナル、ｓｍａｌｌＴａｎｔｉ
ｇｅｎ遺伝子の介在配列を含むｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ）を用いた。実施例１（ｅ）で構築したＭＴ−
ＭＭＰ−３遺伝子をクローン化した組換えｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ^TM（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からＥｃｏＲＩ
切断により２．１ｋｂの挿入断片を切り出し、真核細胞
用発現ベクターｐＳＧ５のＥｃｏＲＩサイトにクローニ
ングし、発現用プラスミドｐＳＧＭＴ２を作製した。ラ
イゲーション反応は、ライゲーションキットに添付のプ
ロトコールに従って行った。５％ウシ胎児血清及び２ｍ
Ｍｇｌｕｔａｍｉｎｅを含むダルベッコ改変イーグル
培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａ
ｇｌｅ’ｓｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）中で培養したア
フリカミドリザル腎由来細胞ＣＯＳ−１にｐＳＧＭＴ２
及びｐＳＧＴ１（ＴＩＭＰ−１ｃＤＮＡをｐＳＧ５にク
ローン化してあるもの）をリン酸カルシウム法によりコ
トランスフェクションした（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：
４５６，１９７３）。対照として、ｐＳＧ５単独でＣＯ
Ｓ−１をトランスフェクションした。すなわち、蒸留水
に２μｇの組換えｐＳＧ５あるいはｐＳＧ５単独に、６
０μｌの０．２５ＭＣａＣｌ₂ を加え、次に２×ＢＢ
Ｓ溶液（２. ８ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄ 及び２８０ｍＭ
ＮａＣｌ含有５０ｍＭＢＥＳ緩衝液、ｐＨ７. ９）６
２．５μｌをチューブの底に加えた。これを混合後、室
温で３０分程度放置し、沈殿形成を十分行った。沈殿を
ピペッティングにより分散し、ＣＯＳ−１細胞に滴下し
た後、ＣＯ₂ インキュベーター中で約２４時間インキュ
ベートした。次に培地を除き、細胞をＰＢＳで洗浄後、
３０μＣｉ／ｍｌの³⁵Ｓ−メチオニンを含む新鮮なメチ
オニン不含ＤＭＥＭを加えた。培養を５時間継続し、細
胞タンパク質を³⁵Ｓで標識した。

【００８９】遠心分離により細胞とコンディション培地
を分離し、細胞を溶解緩衝液（０.１５ＭＮａＣｌ、
０. １％Ｓｏｄｉｕｍｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、
０.１％ＳＤＳ、１ｍＭＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０、１％ＮＰ−４０、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭｐ
ｈｅｎｙｌｍｅｔａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒ
ｉｄｅ（ＰＭＳＦ）含有１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝液、ｐＨ７. ５）中で４℃、１時間インキュベートし
た。細胞溶解液を遠心分離し、上清を回収した。上清及
びコンディション培地を実施例３で得られた抗ＭＴ−Ｍ
ＭＰ−３ポリペプチド抗体ｃｌｏｎｅＮｏｓ．１１７
−４Ｅ１あるいは１１７−１３Ｂ６、また対照として抗
ＴＩＭＰ−１抗体ｃｌｏｎｅＮｏ．５０−１Ｈ７と４
℃、１６時間反応させた。ｃｌｏｎｅＮｏｓ．１１７
−４Ｅ１あるいは１１７−１３Ｂ６抗体は、抗ＭＴ−Ｍ
ＭＰ−３モノクローナル抗体の中でも非特異的反応性の
低いものとして選択した。これらの抗原−抗体複合体に
プロテインＡをカップリングさせたセファロース−４Ｂ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を加え、４℃で２時間攪拌しな
がらインキュベートし、免疫沈降を行った。次に、遠心
分離により免疫沈降させたモノクローナル抗体をカップ
リングしたセファロース−４Ｂを沈殿させ、細胞溶解液
で３回洗浄し、最後に０. ０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝液、ｐＨ６. ８で洗浄した。この洗浄したセファロー
ス−４ＢにＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動用サンプ
ル緩衝液（１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２％ＳＤＳ、
２％β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、０. １％
ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌｂｌｕｅ含有５０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６. ５）を加え、１００℃で
３分間加熱した後、１２％ＳＤＳポリアクリルアミド
電気泳動を行った。バイオイメージアナライザーＢＡＳ
１０００（富士写真フィルム株式会社）を用いて泳動後
のゲルのシグナルの検出を行い、その結果を図７に示し
た。

【００９０】使用した抗ＭＴ−ＭＭＰ−３ポリペプチド
抗体ｃｌｏｎｅＮｏｓ. １１７−４Ｅ１及び１１７−
１３Ｂ６はいずれも、ＭＴ−ＭＭＰ−３遺伝子をトラン
スフェクションした細胞のセルライゼート中の分子量６
４ｋＤａのタンパク質を免疫沈降した。対照としたＭＴ
−ＭＭＰ−３遺伝子を含まないベクターｐＳＧ５単独を
トランスフェクトした細胞では、何れの抗体でも分子量
６４ｋＤａタンパク質は免疫沈降されなかった。免疫沈
降で検出されたタンパク質の分子量６４ｋＤａは、配列
表配列番号：２に記載したアミノ酸配列から算出される
分子量とほぼ一致した。また、分子量３０、３３及び
５２ｋＤａに相当する３本のバンドがＭＴ−ＭＭＰ−３
遺伝子をトランスフェクションした細胞のセルライゼー
ト中から検出されたが、対照ではこれらのバンドは検出
されなかった。一方、セルライゼートから免疫沈降され
たこれらタンパク質は、コンディション培地中からは検
出されなかった。これに対し、ＴＩＭＰ−１は分泌タン
パク質であるが、実際、発現したＴＩＭＰ−１は、その
殆どがコンディション培地中に検出され、確かに細胞外
に分泌されていることが確認された。以上の結果は、Ｍ
Ｔ−ＭＭＰ−３は、そのアミノ酸配列からシグナルペプ
チドの存在が示唆されるにも拘らず、容易に分泌されな
いことを示している。この知見は、ＭＴ−ＭＭＰ−１が
細胞表層上で発現し培地中では検出できなかった先の本
発明者らの知見（Ｎａｔｕｒｅ，３７０；６１〜６５，
１９９４）と非常によく類似している。ＭＴ−ＭＭＰ−
３ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡから逆転写酵素により合成され
た完全長のｃＤＮＡであるので、このｃＤＮＡを適当な
発現ベクターに移すことで、大腸菌、枯草菌、酵母、動
物細胞等を宿主としてＭＴ−ＭＭＰ−３を大量生産でき
る。ｐＳＧＭＴ２をＣＯＳ−１に導入した本実施例で
は、ＭＴ−ＭＭＰ−３の産生は短期的（ｔｒａｎｇｉｅ
ｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）であるが、適当な選択マ
ーカー（ｎｅｏ遺伝子、ｄｅｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ
ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子等）を有する発現ベクターを
使用し、ＣＨＯ細胞等に導入することにより長期間生産
可能な細胞株を得ることもできる。

【００９１】実施例５ＭＴ−ＭＭＰ−３のＣ末端疎水
性アミノ酸連続配列の機能（ａ）ＭＴ−ＭＭＰ−３のＣ末端疎水性アミノ酸連続配
列とＴＩＭＰ−１とのキメラタンパク質（ＴＩＭＰ／Ｍ
Ｔ−３）及びＭＴ−ＭＭＰ−１のＣ末端疎水性アミノ酸
連続配列とＴＩＭＰ−１とのキメラタンパク質（ＴＩＭ
Ｐ／ＭＴ−１）の調製ＭＴ−ＭＭＰｓのＣ末端疎水性アミノ酸連続配列とＴＩ
ＭＰ−１とのキメラタンパク質の調製は、ＣａｏらのＭ
Ｔ−ＭＭＰ−１のトランスメンブレンドメインとＴＩＭ
Ｐ−１とのキメラタンパク質の調製法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，１３；８０１〜８０５，１９９５）に準じ
て行った。ＭＴ−ＭＭＰ−３のＣ末端疎水性アミノ酸連
続配列を含むアミノ酸配列（Ａｌａ⁵⁵⁶ 〜Ｖａｌ⁶⁰⁴ ）
をコードするｃＤＮＡ断片、あるいはＭＴ−ＭＭＰ−１
のＣ末端疎水性アミノ酸連続配列を含むアミノ酸配列
（Ｇｌｙ⁵³⁵ 〜Ｖａｌ⁵⁸² ）をコードするｃＤＮＡ断片
をＰＣＲにより増幅し、断片を回収した。ＰＣＲ増幅
は、実施例１（ｂ）と同様にして行った。得られたＤＮ
Ａ断片それぞれをＴＩＭＰ−１ｃＤＮＡの３’末端側に
連結し、ｐＳＧ５にサブクローニングすることによりＴ
ＩＭＰ−１／ＭＴ−３キメラタンパク質発現プラスミド
ｐＳＧＴ１Ｍ２及びＴＩＭＰ−１／ＭＴ−１キメラタン
パク質発現プラスミドｐＳＧＴ１Ｍ１を作製した。ライ
ゲーション反応は、ライゲーションキットに添付のプロ
トコールに従って行った。これらのプラスミドのＣＯＳ
−１へのトランスフェクションは実施例４に記載と同様
に行った。５％ウシ胎児血清及び２ｍＭｇｌｕｔａｍ
ｉｎｅを含むＤＭＥＭ中で培養したＣＯＳ−１にｐＳＧ
Ｔ１Ｍ２、ｐＳＧＴ１Ｍ１あるいはｐＳＧＴ１それぞれ
をリン酸カルシウム法によりトランスフェクションし
た。対照として、ｐＳＧ５単独でＣＯＳ−１をトランス
フェクションした。すなわち、２μｇのプラスミドＤＮ
Ａに、６０μｌの０．２５ＭＣａＣｌ₂ を加え、次に
２×ＢＢＳ溶液（２. ８ｍＭＮａ₂ ＨＰＯ₄ 及び２８
０ｍＭＮａＣｌ含有５０ｍＭＢＥＳ緩衝液、ｐＨ７.
９）６２．５μｌをチューブの底に加えた。これを混合
後、室温で３０分程度放置し、沈殿形成を十分行った。
沈殿をピペッティングにより分散し、ＣＯＳ−１細胞に
滴下した後、ＣＯ₂ インキュベーター中で約２４時間イ
ンキュベートした。次に培地を除き、細胞をＰＢＳで洗
浄後、³⁵Ｓ−メチオニンを含む新鮮なメチオニン不含Ｄ
ＭＥＭを加えた。培養を５時間継続し、細胞タンパク質
を³⁵Ｓで標識した。

【００９２】遠心分離により細胞とコンディション培地
を分離し、細胞は溶解緩衝液（０.１５ＭＮａＣｌ、
０. １％Ｓｏｄｉｕｍｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、
０. １％ＳＤＳ、１ｍＭＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０、１％ＮＰ−４０、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＰＭ
ＳＦ含有１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.
５）中で４℃、１時間インキュベートした。細胞溶解液
を遠心分離し、上清を回収した。上清及びコンディショ
ン培地を実施例３で得られた抗ＴＩＭＰ−１抗体ｃｌｏ
ｎｅＮｏ．５０−１Ｈ７と４℃で１６時間反応させ
た。得られた抗原−抗体複合体にプロテインＡをカップ
リングさせたセファロース−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）を加え、４℃で２時間攪拌しながらインキュベート
し、免疫沈降を行った。次に、遠心分離により免疫沈降
させたモノクローナル抗体をカップリングしたセファロ
ース−４Ｂを沈殿させ、細胞溶解液で３回洗浄し、最後
に０.０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６. ８で
洗浄した。この洗浄したセファロース−４ＢにＳＤＳポ
リアクリルアミド電気泳動用サンプル緩衝液（１０％ｇ
ｌｙｃｅｒｏｌ、２％ＳＤＳ、２％ β−ｍｅｒｃａ
ｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、０. １％ｂｒｏｍｏｐｈｅｎ
ｏｌｂｌｕｅ含有５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝
液、ｐＨ６. ５）を加え、１００℃で３分間加熱した
後、１２％ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行っ
た。バイオイメージアナライザーＢＡＳ１０００（富士
写真フィルム株式会社）を用いて泳動後のゲルのシグナ
ルの検出を行った。ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−１／ＭＴ
−１、ＴＩＭＰ−１／ＭＴ−３はセルライゼート中で、
それぞれ２８、３２、３２ｋＤａのタンパク質として検
出された。検出されたキメラタンパク質ＴＩＭＰ−１／
ＭＴ−１及びＴＩＭＰ−１／ＭＴ−３の分子量は、融合
遺伝子から推定される分子量と合致した。ＴＩＭＰ−１
は、セルライゼート中でも検出されたが、その大半はコ
ンディション培地中に検出された。一方、ＴＩＭＰ−１
／ＭＴ−１は、セルライゼート中からのみ検出され、コ
ンディション培地中からは検出されなかった（Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１３；８０１〜８０５，１９９
５）。これに対し、ＴＩＭＰ−１／ＭＴ−３はＴＩＭＰ
−１／ＭＴ−１と同様セルライゼートからのみ検出さ
れ、全く同じ局在を示した（図８）。これらの結果は、
ＭＴ−ＭＭＰ−３のＣ末端領域の疎水性アミノ酸連続配
列がＭＴ−ＭＭＰ−１のＣ末端領域の疎水性アミノ酸連
続配列と同様に融合タンパク質の細胞外への分泌を抑制
していることを示している。

【００９３】（ｂ）細胞表層でのキメラタンパク質の発
現ＭＴ−ＭＭＰ−３のＣ末端領域の疎水性アミノ酸連続配
列が実際にトランスメンブレンドメインとして機能して
いるかどうかを、ＴＩＭＰ−１／ＭＴ−３発現細胞の間
接蛍光免疫染色により検討した。ＣＯＳ−１にｐＳＧＴ
１あるいはｐＳＧＴ１Ｍ２を実施例４に記載の方法と同
様にリン酸カルシウム法によりトランスフェクションし
た。但し、本実施例では、アイソトープラベルした培地
は使用せず、細胞はスライドチャンバー上で培養した。
培養２４時間後、細胞を５μｇ／ｍｌの抗ＴＩＭＰ−１
抗体ｃｌｏｎｅＮｏ．５０−１Ｈ７、３％ＢＳＡ含有Ｐ
ＢＳ中で３７℃で４０分間反応させた。次に細胞を３％
ＢＳＡ含有ＰＢＳで３回洗浄し、風乾後、９５％ア
セトンで５分間固定した。続いて細胞を３％ＢＳＡ含
有ＰＢＳに浸し、１５００倍に希釈したｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｔｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）
標識ゴート抗（マウスＩｇＧ）ＩｇＧ（Ｃａｐｅｌ）と
３７℃で３０分間反応させた後、ふたたび３％ＢＳＡ
含有ＰＢＳで過剰な抗体を洗浄した。最後にｇｌｙｃｅ
ｒｉｎを重層し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、ｐ
ＳＧＴ１Ｍ２を発現している細胞（キメラタンパク質Ｔ
ＩＭＰ−１／ＭＴ−３を発現している細胞）では、細胞
表面に蛍光が観察され、キメラタンパク質のＴＩＭＰ−
１部分が細胞表層上で発現していることが確認された。
一方ｐＳＧＴ１を発現している細胞（キメラでないＴＩ
ＭＰ−１を発現している細胞）では蛍光は観察されず、
細胞表層でのＴＩＭＰ−１の発現は認められなかった
（図９）。この結果は、ＭＴ−ＭＭＰ−３のＣ末端の疎
水性アミノ酸連続配列がトランスメンブレンドメインと
して機能していることを示している。

【００９４】実施例６ＭＴ−ＭＭＰ−３の発現による
潜在型ＭＭＰ−２の活性化実施例４で作製したＭＴ−ＭＭＰ−３ｃＤＮＡをクロー
ン化したプラスミドｐＳＧ５Ｍ２あるいはＭＴ−ＭＭＰ
−１ｃＤＮＡをクローン化したプラスミドｐＳＧ５Ｍ１
あるいはベクターｐＳＧ５それぞれと、潜在型ＭＭＰ−
２をクローン化したプラスミドｐＳＧＧＡを、実施例４
に記載したリン酸カルシウム法によりＣＯＳ−１にコト
ランスフェクションした。ただし、³⁵Ｓ−メチオニン含
有新鮮培地の代わりに、通常の新鮮培地を使用した。ま
た、ヒト線維芽細胞腫株ＨＴ−１０８０に、ｐＳＧＴ１
あるいはｐＳＧＴ２あるいはｐＳＧ５それぞれと、ｐＳ
ＧＭ２を、同様にコトランスフェクションした。ＨＴ−
１０８０は、潜在型ＭＭＰ−２及び潜在型ＭＭＰ−９を
構成的に分泌しており（図１０中の６８ＫＤａ及び９
７. ４ｋＤａのバンドにそれぞれ相当）、また、ＭＴ−
ＭＭＰ−３ｃＤＮＡをトランスフェクションした細胞で
は、ＭＴ−ＭＭＰ−３が発現していることを免疫沈降実
験により確認した（実施例４参照）。得られたトランス
フェクタントを無血清ＤＭＥＭ中で２４時間培養し、回
収した培養上清をザイモグラフィーにかけた。培養上清
をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動用サンプル緩衝液
（非還元；１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２％ＳＤＳ、
０. １％ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌｂｌｕｅ含有５０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６. ５）と混和後
３７℃で２０分間インキュベートした後、０.１％ｇ
ｅｌａｔｉｎ含有１０％ポリアクリルアミドゲルを用
い、電流２０ｍＡ、４℃で電気泳動を行った。泳動終了
後、ゲルを２. ５％ＴｒｉｔｏｎＸ- １００溶液中で
１時間ゆっくり振盪しながら洗浄し、次にゼラチナーゼ
用緩衝液（１０ｍＭＣａＣｌ₂ 、０. １５ＭＮａＣ
ｌ、０. ０２％ＮａＮ₃ 含有５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、pH７. ６）中で３７℃で２４時間ゆっくり振盪さ
せながらインキュベートした。緩衝液を廃棄し、ゲルを
０. １％ｃｏｏｍａｓｓｉｅｂｒｉｌｌｉａｎｔｂ
ｌｕｅＲ２５０（５０％メタノール−１０％酢酸に溶
解）で１時間染色後、脱色液（５％メタノール−７. ５
％酢酸）に浸し脱色した。得られたザイモグラフィーの
結果を図１０に示した。

【００９５】ＭＴ−ＭＭＰ−３ｃＤＮＡをトランスフェ
クションしたＣＯＳ−１では、ＭＴ−ＭＭＰ−１ｃＤＮ
ＡをトランスフェクションしたＣＯＳ−１と同様に、新
たにそれぞれ活性中間体ＭＭＰ−２と活性型ＭＭＰ−２
に相当する６４ｋＤａと６２ｋＤａのバンドが出現し、
潜在型ＭＭＰ−２の活性化が確認された。一方、ベクタ
ーｐＳＧ５をトランスフェクションした細胞では、潜在
型ＭＭＰ−２の６８ｋＤａのバンドのみが検出され、活
性化に伴う分子量変化は観察されなかった（図１０
Ａ）。ＣＯＳ−１細胞では、潜在型ＭＭＰ−２発現プラ
スミド（ｐＳＧＧＡ）をコトランスフェクションし、発
現プラスミド由来の潜在型ＭＭＰ−２の活性化を観察し
たが、潜在型ＭＭＰ−２を構成的に発現するＨＴ１０８
０でも同様に、ＭＴ−ＭＭＰ−３の発現に伴う潜在型Ｍ
ＭＰ−２の活性化が観察された。このＨＴ１０８０で観
察された活性型ＭＭＰ−２は、細胞を１００μg/mlのコ
ンカナバリンＡで処理して誘導される活性型ＭＭＰ−２
分子と同じ分子量を示し、また抗ＭＭＰ−２モノクロー
ナル抗体と特異的に反応した。この活性化は、ベクター
単独をトランスフェクションしたコントロールでは観察
されなかった。一方、潜在型ＭＭＰ−９は、コントロー
ルの細胞と同様に分子量の変化は認めらず、活性化は認
められなかった。ＴＩＭＰ−１とＭＴ−ＭＭＰ−３、あ
るいはＴＩＭＰ−２とＭＴ−ＭＭＰ−３をコトランスフ
ェクションした細胞における潜在型ＭＭＰ−２の活性化
は、何れも抑制された。その抑制の程度はＴＩＭＰ−２
をコトランスフェクションした細胞の方が、ＴＩＭＰ−
１の場合よりも顕著であり、この傾向はＭＴ−ＭＭＰ−
１、ＭＴ−ＭＭＰ−３とも同様であった（図１０Ｂ）。

【００９６】本発明の態様のうちには、（Ａ）潜在型Ｍ
ＭＰ−２の活性化能を有するＭＭＰの一種であり且つＭ
Ｔ−ＭＭＰ−１以外の潜在型ＭＭＰ−２活性化因子であ
る天然のＭＴ−ＭＭＰと実質的に同等な活性を有するこ
とを特徴とするタンパク質またはその塩；（Ｂ）該タン
パク質がＭＴ−ＭＭＰ−３またはその塩と、実質的に同
等な活性を有するか、あるいは実質的に同等の一次構造
コンフォメーションを持つものであることを特徴とする
上記（Ａ）項記載のタンパク質；（Ｃ）Ｃ末端領域に、
配列表の配列番号：２のＡｌａ⁵⁶¹ 〜Ｐｈｅ⁵⁸⁴ で表さ
れるアミノ酸配列又はそれと実質的に同等のアミノ酸配
列を有することを特徴とする上記（Ａ）項又は（Ｂ）項
記載のタンパク質；（Ｄ）配列表の配列番号：２で表さ
れるアミノ酸配列又はそれと実質的に同等のアミノ酸配
列を有するＭＴ−ＭＭＰ−３またはその塩であることを
特徴とする上記（Ａ）〜（Ｃ）項のいずれか一記載のタ
ンパク質；（Ｅ）外因性ＤＮＡ配列を原核生物において
発現して得たものであるか、あるいは真核生物で発現さ
せて得たものであることを特徴とする上記（Ａ）〜
（Ｄ）項のいずれか一記載のタンパク質；（Ｆ）配列表
の配列番号：２で表されるアミノ酸配列又はそれと実質
的に同一のアミノ酸配列を有することを特徴とする上記
（Ａ）〜（Ｅ）項のいずれか一記載のタンパク質；
（Ｇ）上記（Ａ）〜（Ｆ）項のいずれか一記載のタンパ
ク質の部分ペプチドまたはその塩；（Ｈ）上記（Ａ）〜
（Ｆ）項のいずれか一記載のタンパク質又はその部分ペ
プチドをコードする塩基配列を有することを特徴とする
核酸；（Ｉ）上記（Ｂ）〜（Ｄ）項のいずれか一記載の
ＭＴ−ＭＭＰ−３をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
遺伝子であることを特徴とする上記（Ｈ）項記載の核
酸；（Ｊ）配列表の配列番号：１で表される塩基配列の
うちオープンリーディングフレーム部分又はそれと実質
的に同等な活性を有する塩基配列を有することを特徴と
する上記（Ｈ）又は（Ｉ）項記載の核酸；（Ｋ）上記
（Ｈ）〜（Ｊ）項のいずれか一記載の核酸を含有するこ
とを特徴とするベクター；（Ｌ）上記（Ｈ）〜（Ｊ）項
のいずれか一記載の核酸又は上記（Ｋ）項記載のベクタ
ーを保有することを特徴とする形質転換体；（Ｍ）上記
（Ｌ）項記載の形質転換体を増殖可能な栄養培地中で培
養し、組換えタンパク質としてＭＴ−ＭＭＰ−３または
その塩を包含する上記（Ａ）〜（Ｆ）項のいずれか一記
載のタンパク質又はその部分ペプチドを生成せしめるこ
とを特徴とするＭＴ−ＭＭＰ−３またはその塩を包含す
る上記（Ａ）〜（Ｆ）項のいずれか一記載のタンパク質
又はその部分ペプチドの製造方法にも関連する。こうし
たタンパク質又はその部分ペプチド、さらには核酸は標
識され測定・検査などに用いるものであることもでき
る。

【００９７】

【発明の効果】潜在型ＭＭＰ−２の活性化能を有するＭ
ＭＰの一種であり且つＭＴ−ＭＭＰ−１以外の潜在型Ｍ
ＭＰ−２活性化因子である天然のＭＴ−ＭＭＰと実質的
に同等な活性を有するタンパク質またはその塩を得るこ
とができ、さらにそのタンパク質をコードする核酸が得
られたことで、癌細胞の有無、癌の悪性度の診断等の癌
の診断治療に関わる研究に有用な診断手段が得られるこ
とになった。またその他の医学的生理学的用途に有用で
もある。本発明は特にヒト癌細胞表層で特異的に発現し
ている新規マトリックスメタロプロテアーゼ、それをコ
ードする塩基配列を含有するＤＮＡ、該ＤＮＡで形質転
換せしめた宿主細胞、該宿主細胞を用いる該マトリック
スメタロプロテアーゼの製造方法、該マトリックスメタ
ロプロテアーゼタンパク質に特異的に結合するモノクロ
ーナル抗体、さらにはそれらタンパク質及び抗体の用途
がそれぞれ提供され、癌の診断、悪性度の判定マーカー
及び癌などに対する抗転移薬剤の標的として、細胞表層
で特異的に発現しているマトリックスメタロプロテアー
ゼを研究することが可能となった。アルツハイマー病の
研究にも資することが可能となった。本発明により、有
効な検知診断手段が提供される。

【００９８】

【配列表】

【配列番号：１】配列の長さ：2107 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 起源生物名：ヒト配列 GGCTCCTTAC CCACCCGGAG ACTTTTTTTT GAAAGGAAAC TAGGGAGGGA GGGAGAGGGA 60 GAGAGGGAGA AAACGAAGGG GAGCTCGTCC ATCCATTGAA GCACAGTTCA CT ATG 115 Met 1 ATC TTA CTC ACA TTC AGC ACT GGA AGA CGG TTG GAT TTC GTG CAT CAT 163 Ile Leu Leu Thr Phe Ser Thr Gly Arg Arg Leu Asp Phe Val His His 5 10 15 TCG GGG GTG TTT TTC TTG CAA ACC TTG CTT TGG ATT TTA TGT GCT ACA 211 Ser Gly Val Phe Phe Leu Gln Thr Leu Leu Trp Ile Leu Cys Ala Thr 20 25 30 GTC TGC GGA ACG GAG CAG TAT TTC AAT GTG GAG GTT TGG TTA CAA AAG 259 Val Cys Gly Thr Glu Gln Tyr Phe Asn Val Glu Val Trp Leu Gln Lys 35 40 45 TAC GGC TAC CTT CCA CCG ACT AGC CCC AGA ATG TCA GTC GTG CGC TCT 307 Tyr Gly Tyr Leu Pro Pro Thr Ser Pro Arg Met Ser Val Val Arg Ser 50 55 60 65 GCA GAG ACC ATG CAG TCT GCC CTA GCT GCC ATG CAG CAG TTC TAT GGC 355 Ala Glu Thr Met Gln Ser Ala Leu Ala Ala Met Gln Gln Phe Tyr Gly 70 75 80 ATT AAC ATG ACA GGA AAA GTG GAC AGA AAC ACA ATT GAC TGG ATG AAG 403 Ile Asn Met Thr Gly Lys Val Asp Arg Asn Thr Ile Asp Trp Met Lys 85 90 95 AAG CCC CGA TGC GGT GTA CCT GAC CAG ACA AGA GGT AGC TCC AAA TTT 451 Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Gln Thr Arg Gly Ser Ser Lys Phe 100 105 110 CAT ATT CGT CGA AAG CGA TAT GCA TTG ACA GGA CAG AAA TGG CAG CAC 499 His Ile Arg Arg Lys Arg Tyr Ala Leu Thr Gly Gln Lys Trp Gln His 115 120 125 AAG CAC ATC ACT TAC AGT ATA AAG AAC GTA ACT CCA AAA GTA GGA GAC 547 Lys His Ile Thr Tyr Ser Ile Lys Asn Val Thr Pro Lys Val Gly Asp 130 135 140 145 CCT GAG ACT CGT AAA GCT ATT CGC CGT GCC TTT GAT GTG TGG CAG AAT 595 Pro Glu Thr Arg Lys Ala Ile Arg Arg Ala Phe Asp Val Trp Gln Asn 150 155 160 GTA ACT CCT CTG ACA TTT GAA GAA GTT CCC TAC AGT GAA TTA GAA AAT 643 Val Thr Pro Leu Thr Phe Glu Glu Val Pro Tyr Ser Glu Leu Glu Asn 165 170 175 GGC AAA CGT GAT GTG GAT ATA CCC ATT ATT TTT GCA TCT GGT TTC CAT 691 Gly Lys Arg Asp Val Asp Ile Pro Ile Ile Phe Ala Ser Gly Phe His 180 185 190 GGG GAC AGC TCT CCC TTT GAT GGA GAG GGA GGA TTT TTG GCA CAT GCC 739 Gly Asp Ser Ser Pro Phe Asp Gly Glu Gly Gly Phe Leu Ala His Ala 195 200 205 TAC TTC CCT GGA CCA GGA ATT GGA GGA GAT ACC CAT TTT GAC TCA GAT 787 Tyr Phe Pro Gly Pro Gly Ile Gly Gly Asp Thr His Phe Asp Ser Asp 210 215 220 225 GAG CCA TGG ACA CTA GGA AAT CCT AAT CAT GAT GGA AAT GAC TTA TTT 835 Glu Pro Trp Thr Leu Gly Asn Pro Asn His Asp Gly Asn Asp Leu Phe 230 235 240 CTT GTA GCA GTC CAT GAA CTG GGA CAT GCT CTG GGA TTG GAG CAT TCC 883 Leu Val Ala Val His Glu Leu Gly His Ala Leu Gly Leu Glu His Ser 245 250 255 AAT GAC CCC ACT GCC ATC ATG GCT CCA TTT TAC CAG TAC ATG GAA CAG 931 Asn Asp Pro Thr Ala Ile Met Ala Pro Phe Tyr Gln Tyr Met Glu Gln 260 265 270 ACA CTT CAA CTA CCT AAT GAT GAT TAC AGG CAT CAG AGA TAT ATG TCA 979 Thr Leu Gln Leu Pro Asn Asp Asp Tyr Arg His Gln Arg Tyr Met Ser 275 280 285 CCT GAC AAG ATT CCT CCA CCT ACA AGA CCT CTA CCG ACA GTG CCC CCA 1027 Pro Asp Lys Ile Pro Pro Pro Thr Arg Pro Leu Pro Thr Val Pro Pro 290 295 300 305 CAC CGC TCT ATT CCT CCG GCT GAC CCA AGG AAA AAT GAC AGG CCA AAA 1075 His Arg Ser Ile Pro Pro Ala Asp Pro Arg Lys Asn Asp Arg Pro Lys 310 315 320 Pro Pro Arg Pro Pro Thr Gly Arg Pro Ser Tyr Pro Gly Ala Lys Pro 325 330 335 AAC ATC TGT GAT GGG AAC TTT AAC ACT CTA GCT ATT CTT CGT CGT GAG 1171 Asn Ile Cys Asp Gly Asn Phe Asn Thr Leu Ala Ile Leu Arg Arg Glu 340 345 350 ATG TTT GTT TTC AAG GAC CAG TGG TTT TGG CGA GTG AGA AAC AAC AGG 1219 Met Phe Val Phe Lys Asp Gln Trp Phe Trp Arg Val Arg Asn Asn Arg 355 360 365 GTG ATG GAT GGA TAC CCA ATG CAA ATT ACT TAC TTC TGG CGG GGC TTG 1267 Val Met Asp Gly Tyr Pro Met Gln Ile Thr Tyr Phe Trp Arg Gly Leu 370 375 380 385 CCT CCT AGT ATC GAT GCA GTT TAT GAA AAT AGC GAC GGG AAT TTT GTG 1315 Pro Pro Ser Ile Asp Ala Val Tyr Glu Asn Ser Asp Gly Asn Phe Val 390 395 400 TTC TTT AAA GGT AAC AAA TAT TGG GTG TTC AAG GAT ACA ACT CTT CAA 1363 Phe Phe Lys Gly Asn Lys Tyr Trp Val Phe Lys Asp Thr Thr Leu Gln 405 410 415 CCT GGT TAC CCT CAT GAC TTG ATA ACC CTT GGA AGT GGA ATT CCC CCT 1411 Pro Gly Tyr Pro His Asp Leu Ile Thr Leu Gly Ser Gly Ile Pro Pro 420 425 430 CAT GGT ATT GAT TCA GCC ATT TGG TGG GAG GAC GTC GGG AAA ACC TAT 1459 His Gly Ile Asp Ser Ala Ile Trp Trp Glu Asp Val Gly Lys Thr Tyr 435 440 445 TTC TTC AAG GGA GAC AGA TAT TGG AGA TAT AGT GAA GAA ATG AAA ACA 1507 Phe Phe Lys Gly Asp Arg Tyr Trp Arg Tyr Ser Glu Glu Met Lys Thr 450 455 460 465 ATG GAC CCT GGC TAT CCC AAG CCA ATC ACA GTC TGG AAA GGG ATC CCT 1555 Met Asp Pro Gly Tyr Pro Lys Pro Ile Thr Val Trp Lys Gly Ile Pro GAA TCT CCT CAG GGA GCA TTT GTA CAC AAA GAA AAT GGC TTT ACG TAT 1603 Glu Ser Pro Gln Gly Ala Phe Val His Lys Glu Asn Gly Phe Thr Tyr 485 490 495 TTC TAC AAG GAA GGA GTA TTG GAA ATT CAA ACA ACC AGA TAC TCA AGG 1651 Phe Tyr Lys Glu Gly Val Leu Glu Ile Gln Thr Thr Arg Tyr Ser Arg 500 505 510 CTA GAA CCT GGA CAT CCA AGA TCC ATC CTC AAG GAT TTA TCG GGC TGT 1699 Leu Glu Pro Gly His Pro Arg Ser Ile Leu Lys Asp Leu Ser Gly Cys 515 520 525 GAT GGA CCA ACA GAC AGA GTT AAA GAA GGA CAC AGC CCA CCA GAT GAT 1747 Asp Gly Pro Thr Asp Arg Val Lys Glu Gly His Ser Pro Pro Asp Asp 530 535 540 545 GTA GAC ATT GTC ATC AAA CTG GAC AAC ACA GCC AGC ACT GTG AAA GCC 1795 Val Asp Ile Val Ile Lys Leu Asp Asn Thr Ala Ser Thr Val Lys Ala 550 555 560 ATA GCT ATT GTC ATT CCC TGC ATC TTG GCC TTA TGC CTC CTT GTA TTG 1843 Ile Ala Ile Val Ile Pro Cys Ile Leu Ala Leu Cys Leu Leu Val Leu 565 570 575 GTT TAC ACT GTG TTC CAG TTC AAG AGG AAA GGA ACA CCC CGC CAC ATA 1891 Val Tyr Thr Val Phe Gln Phe Lys Arg Lys Gly Thr Pro Arg His Ile 580 585 590 CTG TAC TGT AAA CGC TCT ATG CAA GAG TGG GTG TGATGTAGGG TTTTTTCTTC 1944 Leu Tyr Cys Lys Arg Ser Met Gln Glu Trp Val 595 600 604 TTTCTTTCTT TTGCAGGAGT TTGTGGTAAC TTGAGATTCA AGACAAGAGC TGTTATGCTG 2004 TTTCCTAGCT AGGAGCAGGC TTGTGGCAGC CTGATTCGGG GCTGACCTTT CAAACCAGAG 2064 GGTTGCTTGG TCCTGCACAT GAGTGGAAAT ACACTCATGG GGA 2107

【００９９】

【配列番号：２】配列の長さ：604 配列の型：アミノ酸配列の種類：タンパク質起源生物名：ヒト配列 Met Ile Leu Leu Thr Phe Ser Thr Gly Arg Arg Leu Asp Phe Val His 1 5 10 15 His Ser Gly Val Phe Phe Leu Gln Thr Leu Leu Trp Ile Leu Cys Ala 20 25 30 Thr Val Cys Gly Thr Glu Gln Tyr Phe Asn Val Glu Val Trp Leu Gln 35 40 45 Lys Tyr Gly Tyr Leu Pro Pro Thr Ser Pro Arg Met Ser Val Val Arg 50 55 60 Ser Ala Glu Thr Met Gln Ser Ala Leu Ala Ala Met Gln Gln Phe Tyr 65 70 75 80 Gly Ile Asn Met Thr Gly Lys Val Asp Arg Asn Thr Ile Asp Trp Met 85 90 95 Lys Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Gln Thr Arg Gly Ser Ser Lys 100 105 110 Phe His Ile Arg Arg Lys Arg Tyr Ala Leu Thr Gly Gln Lys Trp Gln 115 120 125 His Lys His Ile Thr Tyr Ser Ile Lys Asn Val Thr Pro Lys Val Gly 130 135 140 Asp Pro Glu Thr Arg Lys Ala Ile Arg Arg Ala Phe Asp Val Trp Gln 145 150 155 160 Asn Val Thr Pro Leu Thr Phe Glu Glu Val Pro Tyr Ser Glu Leu Glu 165 170 175 Asn Gly Lys Arg Asp Val Asp Ile Pro Ile Ile Phe Ala Ser Gly Phe 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Pro Phe Asp Gly Glu Gly Gly Phe Leu Ala His 195 200 205 Ala Tyr Phe Pro Gly Pro Gly Ile Gly Gly Asp Thr His Phe Asp Ser 210 215 220 Asp Glu Pro Trp Thr Leu Gly Asn Pro Asn His Asp Gly Asn Asp Leu 225 230 235 240 Phe Leu Val Ala Val His Glu Leu Gly His Ala Leu Gly Leu Glu His 245 250 255 Ser Asn Asp Pro Thr Ala Ile Met Ala Pro Phe Tyr Gln Tyr Met Glu 260 265 270 Gln Thr Leu Gln Leu Pro Asn Asp Asp Tyr Arg His Gln Arg Tyr Met 275 280 285 Ser Pro Asp Lys Ile Pro Pro Pro Thr Arg Pro Leu Pro Thr Val Pro 290 295 300 Pro His Arg Ser Ile Pro Pro Ala Asp Pro Arg Lys Asn Asp Arg Pro 305 310 315 320 Lys Pro Pro Arg Pro Pro Thr Gly Arg Pro Ser Tyr Pro Gly Ala Lys 325 330 335 Pro Asn Ile Cys Asp Gly Asn Phe Asn Thr Leu Ala Ile Leu Arg Arg 340 345 350 Glu Met Phe Val Phe Lys Asp Gln Trp Phe Trp Arg Val Arg Asn Asn 355 360 365 Arg Val Met Asp Gly Tyr Pro Met Gln Ile Thr Tyr Phe Trp Arg Gly 370 375 380 Leu Pro Pro Ser Ile Asp Ala Val Tyr Glu Asn Ser Asp Gly Asn Phe 375 390 395 400 Val Phe Phe Lys Gly Asn Lys Tyr Trp Val Phe Lys Asp Thr Thr Leu 405 410 415 Gln Pro Gly Tyr Pro His Asp Leu Ile Thr Leu Gly Ser Gly Ile Pro 420 425 430 Pro His Gly Ile Asp Ser Ala Ile Trp Trp Glu Asp Val Gly Lys Thr 435 440 445 Tyr Phe Phe Lys Gly Asp Arg Tyr Trp Arg Tyr Ser Glu Glu Met Lys 450 455 460 Thr Met Asp Pro Gly Tyr Pro Lys Pro Ile Thr Val Trp Lys Gly Ile 455 470 475 480 Pro Glu Ser Pro Gln Gly Ala Phe Val His Lys Glu Asn Gly Phe Thr 485 490 495 Tyr Phe Tyr Lys Glu Gly Val Leu Glu Ile Gln Thr Thr Arg Tyr Ser 500 505 510 Arg Leu Glu Pro Gly His Pro Arg Ser Ile Leu Lys Asp Leu Ser Gly 515 520 525 Cys Asp Gly Pro Thr Asp Arg Val Lys Glu Gly His Ser Pro Pro Asp 530 535 540 Asp Val Asp Ile Val Ile Lys Leu Asp Asn Thr Ala Ser Thr Val Lys 545 550 555 560 Ala Ile Ala Ile Val Ile Pro Cys Ile Leu Ala Leu Cys Leu Leu Val 565 570 575 Leu Val Tyr Thr Val Phe Gln Phe Lys Arg Lys Gly Thr Pro Arg His 580 585 590 Ile Leu Tyr Cys Lys Arg Ser Met Gln Glu Trp Val 595 600 604

【０１００】

【配列番号：３】配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 SGNVVNGCWG AYATMRTSAT 20

【０１０１】

【配列番号：４】配列の長さ：27 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 YTCRTSNTCR TCRAARTGRR HRTCYCC 27

【０１０２】

【配列番号：５】配列の長さ：14 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gln Thr Arg Gly Ser Ser Lys Phe His Ile Arg Arg Lys Arg 1 5 10 14

【０１０３】

【配列番号：６】配列の長さ：14 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Glu Glu Val Pro Tyr Ser Glu Leu Glu Asn Gly Lys Arg Asp 1 5 10 14

【０１０４】

【配列番号：７】配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Pro Thr Ser Pro Arg Met Ser Val Val Arg Ser Ala Glu Thr Met Gln 1 5 10 15 Ser Ala 18

【０１０５】

【配列番号：８】配列の長さ：14 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Thr Leu Gly Asn Pro Asn His Asp Gly Asn Asp Leu Phe Leu 1 5 10 14

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＭＴ−ＭＭＰ−３のアミノ酸配列と既
知のＭＭＰファミリー（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭ
Ｐ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１０、ＭＭ
Ｐ−１１及びＭＴ−ＭＭＰ−１）のアミノ酸配列との相
同性を比較し、ドメイン構造を示した図である。アミノ
酸の表記は一般的な一文字表記に従い、プレ型のＮ末端
をアミノ酸１位として番号を付した。

【図２】本発明のＭＴ−ＭＭＰ−３と既知のＭＭＰファ
ミリーのアミノ酸配列との相同性を比較した結果を図１
に続けてアライメントとして示す。

【図３】本発明のＭＴ−ＭＭＰ−３と既知のＭＭＰファ
ミリーのアミノ酸配列との相同性を比較した結果を図２
に続けてアライメントとして示す。

【図４】本発明のＭＴ−ＭＭＰ−３と既知のＭＭＰファ
ミリーのアミノ酸配列との相同性を比較した結果を図３
に続けてアライメントとして示す。

【図５】本発明のＭＴ−ＭＭＰ−３と既知のＭＭＰファ
ミリーのアミノ酸配列との相同性を比較した結果を図４
に続けてアライメントとして示す。

【図６】ノーザンブロット分析の結果の電気泳動写真を
示す。Ａ：ノーザンブロット分析による各種ヒト組織中でのＭ
Ｔ−ＭＭＰ−３ｍＲＮＡの発現を調べた結果を示したも
のである。Ｂ：ノーザンブロット分析による各種ヒト培養癌細胞中
でのＭＴ−ＭＭＰ−３ｍＲＮＡの発現を調べた結果を示
したものである。

【図７】ＭＴ−ＭＭＰ−３ｃＤＮＡをＣＯＳ−１細胞中
で発現させ、ＭＴ−ＭＭＰ−３タンパク質を免疫沈殿法
によりセルライゼート及びコンディション培地中より検
出した結果の電気泳動写真を示したものである。ＭＴ−
ＭＭＰ−３タンパク質（６４ｋＤａ）、ＴＩＭＰ−１タ
ンパク質（２８ｋＤａ）の位置をそれぞれ▲、△で示し
た。

【図８】ＭＴ−ＭＭＰ−３のＣ末端の疎水性アミノ酸の
連続配列がトランスメンブレンドメインとして機能して
いることを、ＴＩＭＰ−１／疎水性アミノ酸の連続配列
の融合タンパク質を作製して検討した結果の電気泳動写
真を示す。Ａ：遺伝子工学的に作製した融合タンパク質をＣＯＳ−
１細胞中で発現させ、セルライゼートとコンディション
培地中より検出した結果を電気泳動写真で示したもので
ある。

【図９】ＭＴ−ＭＭＰ−３のＣ末端の疎水性アミノ酸の
連続配列がトランスメンブレンドメインとして機能して
いることを、ＴＩＭＰ−１／疎水性アミノ酸の連続配列
の融合タンパク質を作製して検討した結果を生物の形態
を示す写真として示す。Ｂ：ＣＯＳ−１細胞中で発現させたＴＩＭＰ−１／疎水
性アミノ酸の連続配列の融合タンパク質を免疫蛍光染色
により検出した結果を生物の形態を示す写真で示したも
のである。

【図１０】ＭＴ−ＭＭＰ−３の発現による潜在型ＭＭＰ
−２の活性化の様子をザイモグラフィーの結果の電気泳
動写真で示す。Ａ：ＭＴ−ＭＭＰ−３ｃＤＮＡ及び潜在型ＭＭＰ−２ｃ
ＤＮＡをコトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞中
での潜在型ＭＭＰ−２の活性化を示した電気泳動写真で
ある。Ｂ：ＭＴ−ＭＭＰ−３ｃＤＮＡをトランスフェクション
したＨＴ１０８０細胞中での潜在型ＭＭＰ−２の活性
化及びこの潜在型ＭＭＰ−２の活性化に及ぼすＴＩＭＰ
−１、ＴＩＭＰ−２の影響を示した電気泳動写真であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/577 ＢＣ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 39/395 ＴＧ０１Ｎ 33/574 48/00 ＡＡＭ 33/577 Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ // Ａ６１Ｋ 38/46 5/00 Ｂ 39/395 9162−4Ｂ 15/00 Ｃ 48/00 ＡＡＭ 9162−4ＢＺＮＡＡＣ１２Ｎ 9/64 Ａ６１Ｋ 37/54 (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】潜在型ＭＭＰ−２の活性化能を有するＭ
ＭＰの一種であり且つＭＴ−ＭＭＰ−１以外の潜在型Ｍ
ＭＰ−２活性化因子である天然のＭＴ−ＭＭＰと実質的
に同等な活性を有することを特徴とするタンパク質又は
その塩あるいはその部分ペプチド又はその塩に対する抗
体。
【請求項２】ＭＴ−ＭＭＰ−３またはその塩と、実質
的に同等な活性を有するか、あるいは実質的に同等の一
次構造コンフォメーションを持つものであるタンパク質
に対する抗体であることを特徴とする請求項１記載の抗
体。
【請求項３】配列表の配列番号：２で表されるアミノ
酸配列又はそれと実質的に同等のアミノ酸配列を有する
ＭＴ−ＭＭＰ−３又はその塩であるタンパク質に対する
抗体であることを特徴とする請求項１又は２記載の抗
体。
【請求項４】外因性ＤＮＡ配列を原核生物において発
現して得たものであるか、あるいは真核生物で発現させ
て得たものであるタンパク質に対する抗体であることを
特徴とする請求項１〜３のいずれか一記載の抗体。
【請求項５】配列表の配列番号：２で表されるアミノ
酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク
質に対する抗体であることを特徴とする請求項１〜４の
いずれか一記載の抗体。
【請求項６】タンパク質の部分ペプチド又はその塩に
対する抗体であることを特徴とする請求項１〜５のいず
れか一記載の抗体。
【請求項７】抗血清であることを特徴とする請求項１
〜６のいずれか一記載の抗体。
【請求項８】モノクローナル抗体であることを特徴と
する請求項１〜６のいずれか一記載の抗体。
【請求項９】ＭＴ−ＭＭＰ−３又はその塩に対するモ
ノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１〜６
及び８のいずれか一記載の抗体。
【請求項１０】潜在型ＭＭＰ−２の活性化能を有する
ＭＭＰの一種であり且つＭＴ−ＭＭＰ−１以外の潜在型
ＭＭＰ−２活性化因子である天然のＭＴ−ＭＭＰと実質
的に同等な活性を有することを特徴とするタンパク質又
はその塩あるいはその部分ペプチド又はその塩を抗原と
して用い、それに対する抗体を得ることを特徴とする潜
在型ＭＭＰ−２の活性化能を有するＭＭＰの一種であり
且つＭＴ−ＭＭＰ−１以外の潜在型ＭＭＰ−２活性化因
子である天然のＭＴ−ＭＭＰと実質的に同等な活性を有
するタンパク質又はその部分ペプチドに対する抗体の製
造方法。
【請求項１１】潜在型ＭＭＰ−２の活性化能を有する
ＭＭＰの一種であり且つＭＴ−ＭＭＰ−１以外の潜在型
ＭＭＰ−２活性化因子である天然のＭＴ−ＭＭＰと実質
的に同等な活性を有することを特徴とするタンパク質又
はその塩あるいはその部分ペプチド又はその塩で免疫し
た動物から得られた、潜在型ＭＭＰ−２の活性化能を有
するＭＭＰの一種であり且つＭＴ−ＭＭＰ−１以外の潜
在型ＭＭＰ−２活性化因子である天然のＭＴ−ＭＭＰと
実質的に同等な活性を有することを特徴とするタンパク
質又はその部分ペプチドに対する抗体を産生する細胞
を、継代培養可能な細胞と融合せしめ、継代培養可能で
かつＭＴ−ＭＭＰ−３を包含するタンパク質に対する抗
体を産生するハイブリッド細胞を選別することを特徴と
する請求項８又は９記載の抗体の産生方法。
【請求項１２】潜在型ＭＭＰ−２の活性化能を有する
ＭＭＰの一種であり且つＭＴ−ＭＭＰ−１以外の潜在型
ＭＭＰ−２活性化因子である天然のＭＴ−ＭＭＰと実質
的に同等な活性を有することを特徴とするタンパク質又
はその塩あるいはその部分ペプチド又はその塩を試薬と
して用いるか、あるいは請求項１〜９のいずれか一記載
の抗体を試薬として用いることを特徴とするＭＴ−ＭＭ
Ｐ−３の検出・測定方法。
【請求項１３】請求項１２のＭＴ−ＭＭＰ−３の検出
・測定方法に用いる標識化されたＭＴ−ＭＭＰ−３に対
する抗体。
【請求項１４】請求項１２のＭＴ−ＭＭＰ−３の検出
・測定方法に用いる潜在型ＭＭＰ−２の活性化能を有す
るＭＭＰの一種であり且つＭＴ−ＭＭＰ−１以外の潜在
型ＭＭＰ−２活性化因子である天然のＭＴ−ＭＭＰと実
質的に同等な活性を有するタンパク質又はその塩あるい
はその部分ペプチド又はその塩であることを特徴とする
標識化されたタンパク質あるいは部分ペプチド又はその
塩。
【請求項１５】ＭＴ−ＭＭＰ−３発現細胞あるいは組
織の検出・測定方法に用いる潜在型ＭＭＰ−２の活性化
能を有するＭＭＰの一種であり且つＭＴ−ＭＭＰ−１以
外の潜在型ＭＭＰ−２活性化因子である天然のＭＴ−Ｍ
ＭＰと実質的に同等な活性を有するタンパク質又はその
部分ペプチドをコードすることを特徴とする標識化され
た核酸。
【請求項１６】ハイブリダイゼーション・プローブで
あることを特徴とする請求項１５記載の核酸。