JP2694604B2 - 新規なメタロプロテアーゼおよびそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は、癌細胞の存在の有無、癌の悪性
度の診断等に、あるいはその他の医学的、生理学的分野
の用途に有用な新規なメタロプロテアーゼに関する。

【０００２】さらに詳しく言えば、本発明はヒト癌細胞
で特異的に発現しているメタロプロテアーゼの１種なら
びにそれをコードする遺伝子ＤＮＡ配列、そのＤＮＡ配
列を含有する塩基配列を有するプラスミド、そのプラス
ミドを有する宿主細胞、該宿主細胞を用いる該タンパク
質の製造方法、前記ＤＮＡ配列とハイブリダイズするプ
ローブ、該プローブを用いる前記ＤＮＡ配列を有するＤ
ＮＡまたはＲＮＡの検出方法、前記のタンパク質に特異
的に結合するモノクローナル抗体に関するものである。

【０００３】

【背景技術】コラーゲン、プロテオグリカン、エラスチ
ン、フィブロネクチン、ラミニン等の複雑な成分から構
成される細胞外マトリックスの分解には、基質特異性を
異にするマトリックスメタロプロテアーゼと総称される
一群の酵素（以下ＭＭＰｓと略記する）が関与してい
る。

【０００４】これまでＭＭＰｓとしては、間質型コラゲ
ナーゼ（ＭＭＰ−１）、７２ｋＤａゼラチナーゼ（ＩＶ
型コラゲナーゼあるいはゼラチナーゼＡともいう：ＭＭ
Ｐ−２）９２ｋＤａゼラチナーゼ（ＩＶ型コラゲナーゼ
あるいはゼラチナーゼＢともいう：ＭＭＰ−９）、スト
ロムライシン−１（ＭＭＰ−３）、マトリライシン（Ｍ
ＭＰ−７）、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ−８）、スト
ロムライシン−２（ＭＭＰ−１０）、ストロムライシン
−３（ＭＭＰ−１１）等が報告されている。

【０００５】これらのＭＭＰｓはファミリーを形成し、
遺伝子の一次構造は既に報告されている。決定されてい
るＭＭＰｓファミリー間の一次構造においては、ＭＭＰ
−７を除き各ＭＭＰは基本的にＮ−末端プロペプチドド
メイン、Ｚｎ^＋結合触媒ドメイン、Ｃ−末端ヘモペキシ
ン凝血酵素様ドメインの３つから構成されている。ＭＭ
Ｐ−７においてはヘモペキシン凝血酵素様ドメインはな
い。ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９では、この他にゼラチン結
合ドメインを含んでいる。さらに、ＭＭＰ−９では、Ｚ
ｎ^＋結合触媒ドメインとＣ−末端ヘモペキシン凝血酵素
様ドメインの間にプロリンに富むＶ型コラーゲンα２鎖
と相同性の高いドメインが挿入されている。

【０００６】転移性の高い癌細胞では、ＩＶ型コラーゲ
ンを主たる基質とするＩＶ型コラゲナーゼ（ＭＭＰ−
２、ＭＭＰ−９）の顕著な発現が見られることが報告さ
れており（キャンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．）、第４６巻、１〜７頁（１９８６）；バイオケミ
カル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニ
ケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ
ｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、第１５４巻、８３２〜８３８頁
（１９８８）；キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ）、第７１
巻、１３６８〜１３８３頁（１９９３））、また、ＭＭ
Ｐ−９の活性化がＭＭＰ−３の作用によって引き起こさ
れることが報告されている（ザ ジャーナルオブ バイ
オロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）第２６７巻、３５８１〜３５８４頁（１９９
２））。マトリックスメタロプロテアーゼの発現の程度
は、癌の悪性度を診断する指標となる。

【０００７】

【発明の開示】本発明者らは新規なマトリックスメタロ
プロテアーゼ（以下本明細書においてはＭＴ−ＭＭＰと
記述する）を見出し、その構造分析を行った。本発明に
より、下記に記載されるとおり、新規なメタロプロテア
ーゼタンパク質、そのタンパク質をコードする塩基配列
を有するＤＮＡ、このＤＮＡ塩基配列を有するプラスミ
ド、このプラスミドを有する宿主細胞ならびに上記メタ
ロプロテアーゼタンパク質を特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体が提供される。

【０００８】１． Ｃ末端領域に膜結合型タンパク質に
特徴的な配列表配列番号１の５３３位から５６２位まで
の疎水性アミノ酸の連続配列を有することを特徴とする
天然型膜結合型マトリックスメタロプロテアーゼ。 ２． Ｃ末端領域に膜結合型タンパク質に特徴的な配列
表配列番号１の５３３位から５６２位までの疎水性アミ
ノ酸の連続配列を有し、かつ１６０位から１７３位、３
２０位から３３３位及び４９８位から５１２位のアミノ
酸配列を有することを特徴とする天然型膜結合型マトリ
ックスメタロプロテアーゼ。 ３． Ｃ末端領域に膜結合型タンパク質に特徴的な配列
表配列番号１の５３３位から５８２位までの疎水性アミ
ノ酸の連続配列を有し、かつ１位から１７３位、３２０
位から３３３位及び４９８位から５１２位のアミノ酸配
列を有することを特徴とする天然型膜結合型マトリック
スメタロプロテアーゼ。 ４． 上記１ないし３のいずれかに記載された膜結合型
マトリックスメタロプロテアーゼのアミノ酸配列に対応
する配列表配列番号２に記載された塩基配列を有するＤ
ＮＡ。 ５． 上記４に記載された塩基配列を有するＤＮＡ配列
を有し、上記１ないし３のいずれかに記載された膜結合
型マトリックスメタロプロテアーゼを発現するプラスミ
ド。 ６． 上記４に記載された塩基配列を有するＤＮＡ配列
を有し、上記１ないし３のいずれかに記載された膜結合
型マトリックスメタロプロテアーゼを発現するプラスミ
ドを有する宿主細胞。 ７． 上記１ないし３のいずれかに記載された膜結合型
マトリックスメタロプロテアーゼを特異的に認識するモ
ノクローナル抗体。

【０００９】以下に、本発明を詳細に説明する。本発明
者らは、公知のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭ
Ｐ）ファミリーのアミノ酸配列から選択した高度に保存
されている配列（配列表配列番号３および４）より、配
列表配列番号５および６に記載した配列を有するオリゴ
ヌクレオチドプライマーを設計、合成した。該オリゴヌ
クレオチドプライマーとヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー
を用い、ＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ産物の各Ｄ
ＮＡの塩基配列を決定し、公知のＭＭＰと相同でない配
列を有する３９０ｂ．ｐ．のＤＮＡ断片を得た。この３
９０ｂ．ｐ．ＤＮＡ断片をプローブとし、ヒト胎盤ｃＤ
ＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、得られた陽
性クローンのファージＤＮＡ中に組み込まれていたｃＤ
ＮＡの塩基配列を決定した。塩基配列は配列表配列番号
２に記載の塩基配列である。配列表配列番号２に記載の
塩基配列と同一の配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ／ＥＭＢＬ
ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ中には存在せず、この塩基
配列を有するＤＮＡは全く新規なものであることが認め
られた。

【００１０】配列表配列番号２に記載した上記のクロー
ンのｃＤＮＡの塩基配列は、３′非翻訳配列と共に推定
５８２アミノ酸残基のオープンリーディングフレームを
有していた。開始コドンは塩基番号１１２に位置し、停
止コドンは塩基番号１８５８に存在する。このオープン
リーディングフレームは、配列表配列番号１に記載した
５８２アミノ酸からなる配列をコードしており、開始コ
ドンのすぐ下流から推定されるシグナル配列が続き、Ｃ
末端のアミノ酸番号５３３から５６２に２０個以上の疎
水性アミノ酸の連続した膜結合型タンパク質に特徴的な
疎水性領域（配列表配列番号７）が存在することが認め
られた。

【００１１】図２に示すようにＭＴ−ＭＭＰのアミノ酸
配列と公知のＭＭＰファミリーのアミノ酸配列との相同
性を調査した結果、ＭＴ−ＭＭＰは公知のＭＭＰファミ
リーと高い相同性を示した。ＭＭＰファミリーで保存さ
れている前駆体と成熟体のプロセッシング部位近傍の配
列、および活性部位の配列はＭＴ−ＭＭＰ中で最も良好
に保存されていた。またＭＴ−ＭＭＰでは、他のＭＭＰ
ファミリーのアミノ酸配列上には認められない配列表配
列番号７に示した疎水性アミノ酸の連続した配列が存在
し、膜貫通型タンパク質の構造的特徴を有することか
ら、他のＭＭＰファミリーとは異なる膜結合型のＭＭＰ
であることが強く示唆された。

【００１２】ＭＴ−ＭＭＰのヒト組織中での発現を各種
の組織由来Ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡに対するノーザンブロ
ット分析により検討した結果、胎盤、肺、腎臓で高い発
現をしていることが認められた（図３参照）。また、ヒ
ト肺偏平上皮癌の正常部分および癌部分から抽出したＲ
ＮＡに対しノーザンブロット分析を行った結果、ＭＴ−
ＭＭＰは癌部位で特異的に発現していることが認められ
た（図４参照）。なお、本発明のＭＴ−ＭＭＰは、抗Ｍ
Ｔ−ＭＭＰモノクローナル抗体を用いた免疫沈降や免疫
染色実験により遺伝子産物が分泌されることなく細胞膜
上に発現されていることが示され、また、ＭＴ−ＭＭＰ
遣伝子をトランスフェクションした細胞では、ＭＴ−Ｍ
ＭＰの発現に依存したＭＭＰ−２の活性化が観察された
（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３７０巻、６１〜６
５頁（１９９４））。以上述べた本発明者らの研究成果
により、本発明により、配列表配列番号１に記載された
アミノ酸配列を有する新規なマトリックスメタロプロテ
アーゼタンパク質が提供される。

【００１３】また、本発明により配列表配列番号１に記
載されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードして
いる配列表配列番号２に記載された塩基配列を有するＤ
ＮＡ、該ＤＮＡを有し発現し得るプラスミド、このプラ
スミドを有する宿主細胞が提供される。上記の宿主細胞
としては、大腸菌、枯草菌などの原核細胞宿主、酵母、
ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞などの真核細胞、
Ｓｆ２１などの昆虫細胞等、通常遺伝子組換え技術で用
いられる全ての宿主細胞を用いることができる。上記の
プラスミドとしては、通常用いられる宿主細胞に応じた
発現ベクターを用いることができる。

【００１４】さらに本発明により、配列表配列番号２に
記載された塩基配列を有するＤＮＡから転写されるｍＲ
ＮＡが提供される。上記のＤＮＡあるいはＲＮＡとハイ
ブリダイズし、該ＤＮＡまたはＲＮＡを特異的に検出す
るプローブも提供されるが、該プローブは、通常使用さ
れる放射性同位元素、酵素などにより標識され、通常の
ブロッティング分析、Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼー
ションで該ＤＮＡあるいはＲＮＡと特異的にハイブリダ
イズし、検出できるものであれば配列表配列番号２に記
載した塩基配列の一部を有するものであればよく、どの
ような塩基配列でもよい。

【００１５】さらに、本発明は、本発明に係るＭＴ−Ｍ
ＭＰと特異的に結合するモノクローナル抗体を提供す
る。本発明に係るモノクローナル抗体は、ヒトＭＴ−Ｍ
ＭＰを免疫原として公知の方法、例えばミルシュタイン
らの方法（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２５６巻、
４９５〜４９７頁（１９７５））により製造することが
できる。この方法において、免疫原としては天然型ヒト
ＭＴ−ＭＭＰ、組換えヒトＭＴ−ＭＭＰおよびそれらの
一部のアミノ酸配列を有する合成ペプチド等の何れでも
よい。

【００１６】本発明により、本発明に係る新規なＭＴ−
ＭＭＰのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする
塩基配列を有するＤＮＡをクローン化し、そのＤＮＡお
よびそのＤＮＡにコードされているタンパク質を遺伝子
工学的方法により製造することができる。この新規なＭ
Ｔ−ＭＭＰのｃＤＮＡクローンを用いることにより、上
記の塩基配列を遺伝子工学的に常用される方法を用いて
他のベクターあるいは宿主へのクローン化を行うことが
できる。また、上記のｃＤＮＡの塩基配列に準拠して適
宜、プローブに適したＤＮＡを設計し、調製することが
できる。さらに、本発明に係わるＭＴ−ＭＭＰの遣伝子
塩基配列をもとに遺伝子工学的に常用される方法を用い
ることにより、ＭＴ−ＭＭＰのアミノ酸配列中に適宜、
１個ないしは複数個以上のアミノ酸の置換、欠失、挿
入、転移あるいは付加した如き変異を導入した相当する
タンパク質を製造することができる。メタロプロテアー
ゼの共通の特徴である前駆体と成熟体のプロッセシング
部位近傍の配列や活性部位の配列、ドメイン構造、ＭＴ
−ＭＭＰの特徴であるＣ末端近傍に存在する疎水性アミ
ノ酸の連続した疎水性領域が維持されていれば、上記の
如き誘導体は全て本発明に包含される。

【００１７】本発明の前述した種々の態様を利用するこ
とにより、癌細胞の存在の有無、癌の悪性度などの診断
用の診断剤あるいは診断方法の用途に、あるいはまた、
その他の医学的生理学的分野の用途に適用される種々の
技術手段を提供することができる。以下、実施例により
本発明を具体的に説明するが、本発明は、これら実施例
により限定されるものではない。

【００１８】

【実施例】

実施例１ 新規なメタロプロテアーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）ｃＤＮＡの
単離 （ａ）ｃＤＮＡライブラリーの構築 ヒト胎盤組織から全ＲＮＡをグアニジン−塩化セシウム
法（バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）、第１８巻、５２９４〜５２９９頁（１９７９））
により抽出し、ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−
セルロースカラムを使用して精製した。精製したポリ
（Ａ）^＋ＲＮＡをテンプレート、オリゴ（ｄＴ）をプラ
イマーとしてガブラー・ホフマン（Ｇｕｂｌｅｒ・Ｈｏ
ｆｆｍａｎ）法（ジーン（Ｇｅｎｅ）、第２５巻、２６
３〜２６９頁（１９８３））に従い、ｃＤＮＡを合成し
た。Ｔ_４ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡの末端を平
滑化した後、ＥｃｏＲ ＩメチラーゼによりｃＤＮＡ中
に存在するＥｃｏＲ Ｉサイトをメチル化した。さらに
ＥｃｏＲ Ｉリンカー〔ｄ（ｐＧ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ
−Ｃ−Ｃ）〕とｃＤＮＡをＴ_４ＤＮＡリガーゼを用い連
結させた後、ＥｃｏＲ Ｉ消化することにより両末端に
ＥｃｏＲ Ｉサイトを有するｃＤＮＡを構築した。この
ｃＤＮＡをλｇｔｌｌのＥｃｏＲ ＩサイトにＴ_４ＤＮ
Ａリガーゼを用い連結させた。次にこのｃＤＮＡを例え
ばインビトロパッケージングキット（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ）を使用し、インビトロパッケージングを行い、ｃＤ
ＮＡライブラリーを構築した。ｃＤＮＡライブラリーと
して市販の例えばヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（ＣＬ
ＯＮＴＥＣＨ）を使用することもできる。

【００１９】（ｂ）合成オリゴヌクレオチドプライマー
の作製 既知のＭＭＰｓファミリーのアミノ酸配列の中から、Ｍ
ＭＰｓファミリー中で高度に保存されているアミノ酸配
列として配列表配列番号３（Ｐ−１）および配列番号４
に記載した配列（Ｐ−２）を選択した。このオリゴペプ
チドＰ−１およびオリゴペプチドＰ−２のそれぞれに対
応するオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを設計し
た。すなわち、オリゴペプチド中に２つ以上のコドンで
コードされるアミノ酸が存在する場合その混合物とし配
列表配列番号５（プライマー１）および配列番号６（プ
ライマー２）に記載した配列のごとく設計した。このプ
ライマー１およびプライマー２をＤＮＡシンセサイザＭ
ｏｄｅｌ ３９２（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ）を使用し、β−シアノエチルフォスフォアミダイ
ト（β−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ Ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉ
ｄｉｔｅ）法により合成した。得られたプライマー１お
よびプライマー２は１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐ
Ｈ６．８で平衡化したニックカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）を用い精製した。

【００２０】（ｃ）ＰＣＲによる遺伝子増幅 ヒト胎盤由来のｃＤＮＡをテンプレート、前項（ｂ）に
記載したプライマー１およびプライマー２をプライマー
としてＰＣＲ反応（ＰＣＲテクノロジー（ＰＣＲ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ）６３〜６７頁、ストックトンプレス
（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ））を行った。その結
果、３９０ｂ．ｐ．のＰＣＲ産物を得た。得られたＰＣ
Ｒ産物を適当なプラスミド、例えばｐＵＣ １１９やｐ
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、このＰＣＲ産
物の塩基配列を、蛍光ＤＮＡシーケンサＭｏｄｅｌ ３
７３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｔ
ａｑダイプライマーサイクルシークエンシングキット
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し決
定した。塩基配列を決定した種々のＰＣＲ産物の中から
既知ＭＭＰの塩基配列と相同性のないＰＣＲ産物Ａを得
た。このＰＣＲ産物Ａを前述の（ａ）項に記載したヒト
胎盤組織ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするた
めのプローブとして用いた。プローブの^３２Ｐ標識は、
ランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈａｉｍ）を使用して行った。

【００２１】（ｄ）ｃＤＮＡライブラリーからの新規Ｍ
ＭＰ遺伝子のスクリーニングと塩基配列の決定 前述の（ａ）に記載したλｇｔｌｌ中に構築したヒト胎
盤ｃＤＮＡライブラリーを宿主菌大腸菌Ｙ１０９０に感
染させ、プラークを形成させた。すなわち、Ｙ１０９０
株を０．０２％マルトースを含むＬ培地で１晩培養後、
集菌し、１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４に懸濁した。この細胞懸
濁液とファージ液を混合し３７℃１５分間インキュベー
トし、ファージを宿主菌に吸着させた。これに軟寒天を
加え、Ｌプレート上に広げた（上記の操作を以後プレー
ティングと称す）。プレートを４２℃で１晩インキュベ
ートし、プラークを形成させた後、ナイロンフィルター
（例えば、ハイボンド−Ｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ））ある
いはニトロセルロースフィルター（例えばＨＡＴＦ（Ｍ
ｉｌｌｉｐｏｒｅ））をプレート上に置き、約３０秒間
放置した。膜を穏やかに剥がしアルカリ変性液（０．１
Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）に３０秒間浸した
後、中和液（１．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．５Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８）に５分間浸した。このフィ
ルターを２×ＳＳＰＥ（０．３６Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍ
Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４，２ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄した
後、風乾した。上述のプラークのフィルターへの転写を
繰り返し、少なくとも２枚のフィルターを調製した。但
し、２枚目以降のフィルターとプレートの接触時間は２
分間程度に延長した。このフィルターを８０℃で２時間
ベーキングし、ＤＮＡを固定した。１つのプレートから
調製した少なくとも２枚のフィルターをそれぞれ４２
℃、１時間洗浄液（１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ
および０．１％ＳＤＳ含有５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
緩衝液、ｐＨ８．０）で洗浄後、ハイブリダイゼーショ
ンバッグ中にフィルターを入れ、プレハイブリダイゼー
ション溶液（５０％ ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、５×Ｄｅｎ
ｈａｒｄｔ’ｓ溶液（０．２％ウシ血清アルブミン、
０．２％ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｏｌｉｄｏｎｅ）、
５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ熱変
性サケ精子ＤＮＡ）に浸し、４２℃で６〜８時間プレハ
イブリダイゼーションを行った。次に１００℃、５分間
加熱変性させた（ｃ）項で記載した^３２Ｐ標識プローブ
をプレハイブリダイゼーション溶液に添加し、４２℃で
１晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼ
ーション完了後、フィルターを室温で多量の０．１％Ｓ
ＤＳ含有２×ＳＳＣ溶液で洗浄した。次にフィルターを
０．１％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液中に６８℃、１５分
間置いた。このフィルターを風乾した後、Ｘ線フィルム
（Ｋｏｄａｋ ＸＲ）と重ね−７０℃で１週間オートラ
ジオグラフィーを行った。Ｘ線フィルムを現像し、１枚
のプレートからできた２枚のフィルムを重ね、重なるシ
グナルをマークした。マークしたシグナルに相当するプ
ラークをＳＭ溶液（１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍ
Ｍ ＭｇＳＯ_４含有５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝
液、ｐＨ７．５）に懸濁した。このファージ懸濁液を適
度に希釈してプレーティングし、上記と同様のスクリー
ニング行い、組換え体ファージを得た。

【００２２】（ｅ）組換え体λｇｔｌｌ ＤＮＡの調製 クローン化したファージをそれぞれプレーティングし４
２℃、３時間インキュベートし、続いて３７℃、１晩イ
ンキュベートした後ＳＭ溶液に数滴のクロロホルムを加
え室温で３０分間放置した。ＳＭ溶液と共に上層の軟寒
天を掻き取り、遠心分離した。遠心後の上清に終濃度１
０％になるようにポリエチレングリコールを加え撹拌し
た後、４℃で１時間放置した。これを遠心分離し上清を
捨て、ファージ粒子を回収した。このファージ粒子をＳ
Ｍ溶液に懸濁し、グリセロールグラジエント超遠心分離
法（モレキュラークローニング、ア ラボラトリーマニ
ュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）、Ｔ．マニアスチ
ス（Ｔ．Ｍａｎｉａｓｔｉｓ）他著、コールド スプリ
ング ハーバー ラボラトリー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ）発行、２．７８頁（１９８９））により精製
した。得られたファージをＴＭ溶液に懸濁し、ＤＮａｓ
ｅ ＩおよびＲＮａｓｅ Ａで処理後、２０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、５０μｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋおよ
び０．５％ＳＤＳの混合液を加え６５℃、１時間インキ
ュベートした。これをフェノール抽出、ジエチルエーテ
ル抽出後、エタノール沈殿によりＤＮＡを沈殿させた。
得られたＤＮＡを７０％エタノールで洗浄後乾燥し、Ｔ
Ｅ溶液（１０ｍＭ ＥＤＴＡ含有１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８）に溶解した。

【００２３】（ｆ）挿入断片の塩基配列決定 前項（ｅ）で調製したλｇｔ１１ ＤＮＡをＥｃｏＲ
Ｉで分解し、挿入断片を分離精製後、ベクターｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲ
Ｉ部位にクローニングした。この組換え体ｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔで大腸菌ＮＭ５２２ ＸＬＩ−Ｂｌｕｅを形
質転換した。形質転換細胞をＦ′選択後、ヘルパーファ
ージＶＣＳＭ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を感染させ
終夜培養した。培養液を遠心分離し菌体を除き、これに
ＰＥＧ／ＮａＣｌを加えファージを沈殿させた。沈殿を
ＴＥ溶液に懸濁後、１本鎖ＤＮＡをフェノール抽出、エ
タノール沈殿により回収した。この１本鎖ＤＮＡの塩基
配列を蛍光ＤＮＡシーケンサＭｏｄｅｌ ３７３Ａ（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｔａｑダイプ
ライマーサイクルシークエンシングキット（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し決定した。決定
した塩基配列の全長は３４０３塩基対であり、その配列
は配列表配列番号２に記載した。ＧＥＮＢＡＮＫ／ＥＭ
ＢＬ ＤＮＡＤａｔａ Ｂａｓｅを使用し、配列表配列
番号２に記載した塩基配列を検索したが、同一の配列は
存在しなかった。

【００２４】（ｇ）遺伝子産物の解析 配列表配列番号２に記載した遺伝子塩基配列から予想さ
れる配列表配列番号１に記載したアミノ酸配列の親水、
疎水性値をカイト・ドーリトル（Ｋｙｔｅ・Ｄｏｏｌｉ
ｔｔｌｅ）法（ジャーナル オブ モレキュラーバイオ
ロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、 第１５７巻、１
０５〜１３２頁（１９８２））により算出し、図１に示
す親水性、疎水性分布図を決定した。配列表配列番号１
のアミノ酸５３３位から５６２位のＣ末端領域に膜結合
型タンパク質に特徴的な２０個以上の疎水性アミノ酸が
連続する配列からなる疎水性領域が存在し、その配列を
配列表配列番号７に示した。このような疎水性のアミノ
酸が連続している配列は、既知のＭＭＰｓには見られな
い配列である。配列表配列番号１に記載したアミノ酸配
列を公知のＭＭＰｓのアミノ酸配列とその相同性を比較
した結果、配列表配列番号１に示したアミノ酸配列は、
ＭＭＰｓファミリーと相同性を示した。特に、ＭＭＰｓ
ファミリーで非常に高度に保存されている前駆体と活性
型の切断部位および活性部位はＭＴ−ＭＭＰでもそれぞ
れ高い保存性を示した（配列表配列番号１、アミノ酸８
８位〜９７位およびアミノ酸番号１１２位〜２２２
位）。

【００２５】実施例２ 遺伝子発現 （ａ）組織での発現 ヒト心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、
各組織由来のポリ（Ａ）^＋ＲＮＡをブロットしてあるメ
ンブレン ヒューマン マルチプル ティッシュ ノー
ザン ブロッツ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）に対し、^３２Ｐ標
識した実施例１（ｃ）項に記載したＰＣＲ産物Ａをプロ
ーブとして用いてハイブリダイゼーションを行った。３
×ＳＳＣ（０．４５Ｍ ＮａＣｌ、０．０４５Ｍ ｔｒ
ｉｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ−２Ｈ_２Ｏ、ｐＨ７．
０）で湿らせたヒューマン マルチプル ティッシュ
ノーザン ブロッツのフィルターをプレハイブリダイゼ
ーション溶液（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、０．５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、５０％Ｆ
ｏｒｍａｍｉｄｅおよび１％ＳＤＳ含有２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５）中で穏やかに撹拌し
ながら２〜３時間プレハイブリダイズした。次にハイブ
リダイゼーション溶液（プレハイブリダイゼーション溶
液に１０％Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｅｘｔｒａｎ、５０μｇ／
ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを加えた溶液）に熱変性したプ
ローブを加えプレハイブリダイゼーション溶液と交換
し、４３℃で１晩ハイブリダイゼーションを行った。ハ
イブリダイゼーション完了後、０．１％ＳＤＳ含有２×
ＳＳＣ溶液で洗浄した。次にフィルターを０．１％ＳＤ
Ｓ含有１×ＳＳＣ溶液中に６８℃、１５分間置いた。こ
のフィルターを風乾した後、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ
ＸＲ）と重ね−７０℃で１週間オートラジオグラフィ
ーを行った。ＭＴ−ＭＭＰ遺伝子の転写産物のサイズ
は、何れの組織でも４．８ｋｂ．であった。現像したＸ
線フィルムをデンシトメーターでトレースしシグナルの
強度を測定した結果、ＭＴ−ＭＭＰ遺伝子は、調べた組
織中、肺、胎盤、腎臓で高い発現を認めた。

【００２６】（ｂ）癌組織での発現 ヒト肺偏平上皮癌２例それぞれから正常組織と癌組織を
採取し、全ＲＮＡをグアニジン−塩化セシウム法により
抽出した。１０μｇの該ＲＮＡそれぞれを１％アガロー
ス電気泳動後、ナイロンメンブレンにトランスファー
し、実施例１（ｃ）項に記載した^３２Ｐ標識したプロー
ブを使用してハイブリダイゼーションを行った。ハイブ
リダイゼーションおよびオートラジオグラフィーのトレ
ースは前項（ａ）と同様に行った。いずれのヒト肺偏平
上皮癌においても癌組織（図４ Ｔ参照）での発現が正
常組織（図４ Ｎ参照）に比べ有意に高値を示した。

【００２７】実施例３ モノクローナル抗体の調製 （ａ）抗原ポリペプチドの調製 配列表配列番号１に記載したＭＴ−ＭＭＰのアミノ酸配
列中より他のＭＭＰファミリーとの相同性が低い特異的
な配列として配列表配列番号８（配列表配列番号１アミ
ノ酸番号１６０位〜１７３位の配列）、同９（配列表配
列番号１アミノ酸番号３２０位〜３３３位の配列）およ
び同１０（配列表配列番号１アミノ酸番号４９８位〜５
１２位の配列）に記載した配列（以下それぞれポリペプ
チドＡ、ポリペプチドＢおよびポリペプチドＣと略記す
る）を選択した。これらのポリペプチドをペプチド合成
機（ペプチドシンセサイザー９６００、ＭｉｌｌｉＧｅ
ｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）を用いＦｍｏｃ−ＢＯＰ法に
より合成し、Ｎ末端にシステインを導入した。合成した
各ペプチドは高速液体クロマトグラフィーにより精製し
た。

【００２８】（ｂ）各ポリペプチドとキーホールリンベ
ットヘモシアニンの複合体の調製 ２ｍｇキーホールリンベットヘモシアニン（ＫＬＨ）を
１ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し
たものと１．８５ｍｇＮ−（ε−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃ
ａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅを２００
μｌのジメチルホルムアミドに溶解したものと混合し、
３０℃、３０分間反応させた。ついで、上記の混合液を
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＰＤ
−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でゲルろ過した。マレイ
ミドが結合したＫＬＨを分取し、１．５ｍｌ以下に濃縮
した。マレイミドが結合したＫＬＨに対し５０倍モル量
の前記（ａ）で合成した各ポリペプチドを１ｍｌの０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解したものとをそ
れぞれ混合し、４℃、２０時間インキュベートし、ＫＬ
Ｈ−ポリペプチド複合体を調製した。

【００２９】（ｃ）抗体産生細胞の調製 前項（ｂ）で調製した３種類のポリペプチドＡ、ポリペ
プチドＢおよびポリペプチドＣとＫＬＨとの複合体それ
ぞれ２５０μｇを完全フロインドアジュバントと共に８
週令Ｂａｌｂ／ｃ雌マウスに腹腔内投与し、初回免疫し
た。１８日後に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に
溶解した各複合体２００μｇをそれぞれの初回免疫した
マウスに腹腔内投与し、追加免疫した。さらに３２日後
に追加免疫時と同様に各複合体１００μｇを静脈内投与
し、最終免疫とした。その３日後に牌臓を摘出し、脾細
胞懸濁液を調製した。

【００３０】（ｄ）細胞融合 ８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞ＳＰ２（ＳＰ２／
Ｏ−Ａｇ１４）との融合は、オイ（Ｏｉ）らの方法（セ
レクテッド メソッド イン セルラー イムノロジー
（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅｌｌｕ
ｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、Ｂ．Ｂ．ミッシェル
とＳ．Ｍ．シーギ編（ｅｄ．Ｂ．Ｂ．Ｍｉｓｈｅｌｌ
ａｎｄ Ｓ．Ｍ．Ｓｈｉｉｇｉ）、Ｗ．Ｈ．フリーマン
アンドカンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ
Ｃｏｍｐａｎｙ）発行、３５１〜３７２頁（１９８
０））を若干改変して行った。以下では、ポリペプチド
Ａ−ＫＬＨ複合体で免疫したマウス由来の有核脾細胞と
ミエローマ細胞ＳＰ２との融合に関して詳述する。

【００３１】前項（ｃ）で調製した有核脾細胞（生細胞
率１００％）それぞれとミエローマ細胞（生細胞率１０
０％）とを５：１の比率で以下の手順で融合した。ポリ
ペプチドＡ脾細胞懸濁液とミエローマ細胞をそれぞれＲ
ＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。次に同じ培地に懸濁
し、融合させるために有核脾細胞３×１０^８個とミエロ
マ細胞６×１０^７個を混合した。次に遠心分離により細
胞を沈殿させ、上清を完全に吸引除去した。沈殿した細
胞に３７℃に加温したＰＥＧ４０００溶液（５０％（ｗ
／ｖ）ポリエチレングリコール４０００含有ＲＰＭＩ１
６４０培地）２．０ｍｌを１分間で滴下し、１分間撹拌
し、細胞を再懸濁、分散させた。次に３７℃に加温した
ＲＰＭＩ１６４０培地２．０ｍｌを１分間で滴下した。
この操作をさらに１回繰り返した後、同培地１４ｍｌを
２〜３分間で常に撹拌しながら滴下し、細胞を分散させ
た。これを遠心分離し、上清を完全に吸引除去した。次
にこの沈殿した細胞に３７℃に加温したＮＳ−１培地
（除菌ろ過した１５％（ｗ／ｖ）仔牛胎児血清（ＪＲＨ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）含有ＲＰＭＩ１６４０培
地）３０ｍｌを速やかに加え、大きい細胞塊を注意深く
ピペッティングで分散した。さらに同培地３０ｍｌを加
えて希釈し、ポリスチレン製９６穴マイクロウェルにウ
ェル当り６．０×１０^５個／０．１ｍｌの細胞を加え
た。細胞を加えた上記マイクロウェルを７％炭酸ガス／
９３％空気中で温度３７℃、湿度１００％で培養した。

【００３２】ポリペプチドＢ−ＫＬＨ複合体で免疫した
マウス由来脾細胞の場合では、脾細胞６．４×１０^８個
とミエローマ細胞１．２８×１０^８個を混合し、上記で
使用したＰＥＧ４０００溶液、ＲＰＭＩ１６４０培地、
ＮＳ−１培地をそれぞれ４．３ｍｌ、３８．７ｍｌ、１
２９ｍｌ用いた。ポリペプチドＣ−ＫＬＨ複合体で免疫
したマウス由来の脾細胞の場合、脾細胞６．８×１０^８
個とミエローマ細胞１．３６×１０^８個を混合し、ＰＥ
Ｇ４０００溶液、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＮＳ−１培地
をそれぞれ４．５ｍｌ、４０．５ｍｌ、１３５ｍｌ使用
した。

【００３３】（ｅ）選択培地によるハイブリドーマの選
択的増殖 前項（ｄ）の培養開始後翌日（１日目）、細胞にパスツ
ールピペットでＨＡＴ培地（ＮＳ−１培地にヒポキサン
チン（１００μＭ）、アミノプテリン（０．４μＭ）お
よびチミジン（１６μＭ）を加えた培地）２滴（約０．
１ｍｌ）を加えた。２、３、５、８日目に培地の半分
（約０．１ｍｌ）を新しいＨＡＴ培地で置き換え、１１
日目に培地の半分を新しいＨＴ培地（アミノプテリン不
含ＨＡＴ培地）で置き換えた。１４日目にハイブリドー
マの生育が肉眼にて認められた全ウェルについて固相−
抗体結合テスト法（ＥＬＩＳＡ）により陽性ウェルを調
べた。すなわち、ポリスチレン性９６穴プレートを抗原
としたポリペプチドＡ、ＢおよびＣそれぞれでコート
し、次に洗浄用ＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含
有）を用いて洗浄して未吸着のペプチドを除いた。さら
に各ウェルの未コート部分を１％ＢＳＡでブロックし
た。この各ウェルにハイブリドーマの生育が確認された
ウェルの上清０．１ｍｌを添加し、室温で約１時間静置
した。２次抗体として西洋わさびペルオキシダーゼ標識
ヤギ抗マウス免疫グロブリンを加え、さらに室温で約１
時間静置した。次に基質である過酸化水素とｏ−フェニ
レンジアミンを加え、発色の程度をマイクロプレート用
吸光度測定機（ＭＲＰ−Ａ４、東ソー）を用いて４９２
ｎｍの吸光度で測定した。

【００３４】（ｆ）ハイブリドーマのクローニング 前項（ｅ）で得られた各抗原ペプチドに対する陽性ウェ
ル中のハイブリドーマを、限界希釈法を用いてモノクロ
ーン化した。すなわち、９６穴マイクロウェルにハイブ
リドーマをウェル当り５個、１個、０．５個になるよう
に希釈し、それぞれ３６穴、３６穴、２４穴に加えた。
５日目、１２日目に全ウェルに約０．１ｍｌのＮＳ−１
培地を追加した。クローニング開始後約２週間で、肉眼
的に十分なハイブリドーマの生育を認め、コロニー形成
陰性ウェルが５０％以上である群について（ｅ）に記載
したＥＬＩＳＡを行った。調べた全ウェルが陽性でない
場合、抗体陽性ウェル中のコロニー数が１個のウェルを
４〜６個選択し、再クローニングを行った。最終的に表
１および表２にまとめて示したように各ポリペプチド
Ａ、ポリペプチドＢまたはポリペプチドＣに対するモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマがそれぞれ１
２個、２０個、９個得られた。

【００３５】（ｇ）ハイブリドーマの培養とモノクロー
ナル抗体の精製 得られた各ハイブリドーマ細胞をＮＳ−１培地で培養
し、その上清から濃度１０〜１００μｇ／ｍｌのモノク
ローナル抗体を得ることができた。また、得られたハイ
ブリドーマを１０^７個を予め１週間前にプリスタンを腹
腔内投与したマウス（ＢＡＬＢ／ｃ系、雌、６週齢）に
同じく腹腔内投与し、１〜２週間後、腹水中からも４〜
７ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を含む腹水を得るこ
とができた。得られた腹水を４０％飽和硫酸アンモニウ
ムで塩析後、ＩｇＧクラスの抗体をプロテインＡアフィ
ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に吸着させ、０．１Ｍクエン酸
緩衝液（ｐＨ５）で溶出することにより精製した。

【００３６】（ｈ）モノクローナル抗体のクラス、サブ
クラスの決定 前述したＥＬＩＳＡに従い、各ポリペプチドＡ、ポリペ
プチドＢまたはポリペプチドＣをコートしたマイクロタ
イトレーションプレートに、（ｆ）で得られたモノクロ
ーンの上清を加えた。次にＰＢＳで洗浄後、アイソタイ
プ特異的ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａ
ｂ．）を加えた。ＰＢＳにより洗浄後、西洋わさびペル
オキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を加
え、基質として過酸化水素および２，２′−アジノージ
（３−エチルベンゾチアゾリン酸）を用いてクラス、サ
ブクラスを決定した。

【００３７】（ｉ）抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体
の特異性 ヒト新生児線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）の培養上清中か
らそれぞれ精製した潜在型ＭＭＰ−１（クリニカ キミ
カ アクタ（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ）、第２１
９巻、１〜１４頁（１９９３））、潜在型ＭＭＰ−２
（クリニカ キミカ アクタ（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａ
ｃｔａ）、第２２１巻、９１〜１０３頁（１９９３））
および潜在型ＭＭＰ−３（クリニカ キミカ アクタ
（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ）、第２１１巻、５９
〜７２頁（１９９２））、ヒト直腸癌細胞（Ｃａｒ−
１）の培養上清から精製した潜在型ＭＭＰ−７（キャン
サー リサーチ （ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）、第５０
巻、７７５８〜７７６４頁、（１９９０））、ヒト好中
球より精製した潜在型ＭＭＰ−８（バイオロジカル ケ
ミストリー ホップ セイラー（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ）、第３７１巻、サプルメン
ト、２９５〜３０４頁、（１９９０））並びにヒト線維
芽細胞腫株（ＨＴ１０８０）の培養上清から精製した潜
在型ＭＭＰ−９（ザジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）、第２６７
巻、２１７１２〜２１７１９頁、（１９９２））をそれ
ぞれ抗原として使用し、前述の（ｅ）に記載したＥＬＩ
ＳＡによりヒトＭＴ−ＭＭＰペプチドと陽性反応を示す
５種類の抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体（モノクロ
ーン番号１１３−５Ｂ７、１１３−１５Ｅ７、１１４−
１Ｆ１、１１４−２Ｆ２および１１８−３Ｂ１）の交差
反応性を調べた。

【００３８】すなわち、ポリスチレン製９６穴プレート
を使用し、各ウエルに精製した各ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−
２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８およびＭＭＰ
−９をそれぞれ５０ｎｇ／Ｗｅｌｌで加えコートした。
洗浄用ＰＢＳで洗浄し未吸着の抗原を除去した後、各ウ
エルの未コート部分を３％スキムミルク含有ＰＢＳでブ
ロックした。この各ウエルに各抗ＭＴ−ＭＭＰモノクロ
ーナル抗体それぞれを１μｇ／Ｗｅｌｌで加え、室温で
約１時間静置した。プレートを洗浄後、２次抗体として
ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンを加
えさらに室温で約１時間反応させた。次に基質である過
酸化水素とｏ−フェニレンジアミンを加え、発色の程度
をマイクロプレート用吸光度測定機（ＭＲＰ−Ａ４、東
ソー）を用いて４９２ｎｍの吸光度で測定した。その結
果、表３に示したように、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナ
ル抗体は何れも、供試したＭＴ−ＭＭＰ以外の精製ＭＭ
Ｐｓと反応性を示さなかった。

【００３９】

【表１】

【００４０】

【表２】

【００４１】

【表３】

【００４２】実施例４ 遺伝子産物の発現と同定 実施例１（ｆ）で構築したＭＴ−ＭＭＰ遺伝子をクロー
ン化した組換えｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔからＥｏｏＲ
Ｉ 切断により挿入断片を切出し、真核細胞用発現ベク
ターｐＳＧ５（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲ Ｉ
サイトにクローニングした。該組換えｐＳＧ５をヒト線
維芽細胞腫株ＨＴ１０８０にリン酸カルシウム法により
トランスフェクションした。すなわち、蒸留水に２０μ
ｇの組換えｐＳＧ５、６２μｌの２Ｍ ＣａＣｌ_２を加
え、次に２×ＨＢＳＰ溶液（１．５ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ
_４、１０ｍＭ ＫＣｌ、２８０ｍＭ ＮａＣｌおよび１
２ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ含有５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝
液、ｐＨ７．１）をチューブの底に加え全量が１ｍｌに
なるようにした。これを混合後、室温で３０分程度放置
し、沈殿形成を十分行った。沈殿をピペッティングによ
り分散し、ＨＴ１０８０細胞に滴下した後、ＣＯ_２イン
キュベーター中で約４時間インキュベートした。次に培
地を除き、１５％グリセリン溶液を加え１〜３時間処理
した後、グリセリンを吸引除去、ＰＢＳで洗浄後、^３５
Ｓ−メチオニンを含む新鮮な培地を加えた。培養を継続
し、細胞タンパク質を^３５Ｓで標識した。因みに、ＨＴ
１０８０細胞におけるＭＴ−ＭＭＰ遺伝子の発現はノー
ザンブロット分析では検出できない。

【００４３】細胞を溶解緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００、１％ ｂｏｖｉｎｅ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉ
ｎ、１ｍＭ ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ、０．２Ｕ
ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、１ｍＭ ＰＭＳ
Ｆおよび０．１４ＭＮａＣｌ含有０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８）中で４℃、１時間インキュベ
ートした。細胞溶解液を遠心分離し、上清を回収した。
上清に実施例３で得られたモノクローナル抗体をカップ
リングさせたセファロース−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）を加え、４℃で２時間撹拌しながらインキュベート
し、免疫沈降を行った。免疫沈降には実施例３で得られ
たポリペプチドＡに対する１２個のモノクローナル抗体
のうち非特異的反応性の低いモノクローン番号 １１４
−１Ｆ２および１１４−２Ｆ２（受託番号ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４７４３）の２種類をそれぞれ使用した。次に、遠
心分離により免疫沈降させたモノクローナル抗体をカッ
プリングしたセファロース−４Ｂを沈殿させ、洗浄液
（１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％ｂｏｖｉｎｅ ｈ
ｅｍｏｇｌｏｂｉｎおよび０．１４Ｍ ＮａＣｌ含有
０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８）で３回洗浄
し、最後に０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ
６．８で洗浄した。この洗浄したモノクローナル抗体を
カップリングしたセファロース−４ＢにＳＤＳポリアク
リルアミド電気泳動用サンプル緩衝液を加え、１００℃
で５分間加熱した後、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳
動を行った。泳動後のゲルをＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ
ＸＲ）と重ね−７０℃で１週間オートラジオグラフィ
ーを行った後、現像したＸ線フィルムをデンシトメータ
ーでトレースしシグナルの強度を測定した。使用した抗
ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体モノクローン番号１１
４−１Ｆ２および１１４−２Ｆ２はいずれも、６３ｋＤ
ａのタンパク質を免疫沈降した。対照としたＭＴ−ＭＭ
Ｐ遺伝子を含まないベクターｐＳＧ５のみをトランスフ
ェクションした細胞では、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナ
ル抗体モノクローン番号１１４−１Ｆ２および１１４−
２Ｆ２で６３ｋＤａタンパク質は免疫沈降されなかっ
た。免疫沈降で検出されたタンパク質の分子量６３ｋＤ
ａは、配列表配列番号１に記載したアミノ酸配列から算
出される分子量６５．７８ｋＤａとほぼ一致した。さら
に、配列表配列番号１に記載したアミノ酸配列のアミノ
酸１３位から１０１位までを欠失した変異体ＭＴ−ＭＭ
Ｐ発現プラスミドを作成し、前述と同様ＨＴ１０８０細
胞にトランスフェクションし、免疫沈降を行った。変異
体ＭＴ−ＭＭＰ遺伝子を導入したＨＴ１０８０細胞で
は、６３ｋＤａタンパク質は検出されず、５５ｋＤａタ
ンパク質を検出した。この分子量は、導入した欠失から
予想される分子量と一致した。

【００４４】

【実験例】（ａ）ＭＴ−ＭＭＰの発現による潜在型ＭＭ
Ｐ−２の活性化 実施例４で構築したＭＴ−ＭＭＰ遺伝子をクローン化し
た組換えｐＳＧ５あるいはコントロールとしてベクター
ｐＳＧ５単独を同じく実施例４に記載したリン酸カルシ
ウム法によりＨＴ１０８０細胞、あるいはマウス胎児由
来線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３にトランスフェクションし
た。ただし、^３５Ｓ−メチオニン含有新鮮培地の代わり
に、通常の新鮮培地を使用した。なお、ＨＴ１０８０細
胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞は、何れも潜在型ＭＭＰ−２
および潜在型ＭＭＰ−９を分泌しており（図６中の６６
ｋＤａおよび９７．４ｋＤａのバンドにそれぞれ相
当）、また、ＭＴ−ＭＭＰ遺伝子をトランスフェクショ
ンした細胞では、ＭＴ−ＭＭＰが発現していることを免
疫沈降実験により確認した（実施例４参照）。

【００４５】得られたトランスフェクタントを無血清培
地中で２４時間培養し、回収した培養上清をザイモグラ
フィーに供試した。培養上清をＳＤＳポリアクリルアミ
ド電気泳動用緩衝液（非還元）と混和後４℃で一晩放置
した後、１ｍｇ／ｍｌのカゼイン含有１０％ポリアクリ
ルアミドゲルを用い、電流２０ｍＡ、４℃で電気泳動を
行った。泳動終了後、ゲルを２．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００含有ゼラチナーゼ用緩衝液（５ｍＭ ＣａＣｌ
_２、１μＭ ＺｎＳＯ_４含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
７．６）で１５分間ゆっくり振盪させながら洗浄し、こ
の操作を２回繰り返した。次にゲルを１％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００含有ゼラチナーゼ用緩衝液中に浸し、３７
℃で一晩放置した。緩衝液を廃棄し、ゲルを０．０２％
クマシーブリリアントブルーＲ（５０％メタノール−１
０％酢酸に溶解）で１時間染色後、脱色液（５％メタノ
ール−７．５％酢酸）に浸し脱色した。

【００４６】図６に示すように、ＭＴ−ＭＭＰ遺伝子を
トランスフェクションしたＨＴ１０８０細胞では、新た
に６４ｋＤａと６２ｋＤａのバンドが生じ、潜在型ＭＭ
Ｐ−２の活性化が確認された。この活性型ＭＭＰ−２
は、細胞を１００μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡで処理
して誘導される活性型ＭＭＰ−２分子と同じ分子量を示
し、また抗ＭＭＰ−２モノクローナル抗体と特異的に反
応した。この活性化は、ベクター単独をトランスフェク
ションしたコントロールでは観察されなかった。一方、
潜在型ＭＭＰ−９は、コントロールの細胞と同様に分子
量の変化は認められず、活性化は認められなかった。こ
のＭＴ−ＭＭＰの発現に伴う潜在型ＭＭＰ−２の活性化
は、ＭＴ−ＭＭＰ遺伝子をトランスフェクションしたＮ
ＩＨ３Ｔ３細胞でも観察された。

【００４７】（ｂ）ＭＴ−ＭＭＰ発現細胞膜画分による
潜在型ＭＭＰ−２の活性化 前項（ａ）の記載と同様にＭＴ−ＭＭＰ遺伝子をクロー
ン化した組換えｐＳＧ５あるいはコントロールとしてベ
クターｐＳＧ５単独をリン酸カルシウム法によりアフリ
カミドリザル腎由来細胞ＣＯＳ−１にトランスフェクシ
ョンした。得られたトランスフェクタントからストロン
ジン（Ｓｔｒｏｎｇｉｎ）らの方法（ザジャーナル オ
ブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．）、第２６８巻、１４０３３〜１４０３９頁
（１９９３））に従い、細胞膜画分を調製した。

【００４８】トランスフェクタントをＰＢＳで洗浄後、
遠心により細胞を集め８．５％Ｓｕｃｒｏｓｅ、５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍ
ｉｄｅ、１０μｇ／ｍｌ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１μｇ
／ｍｌ ｐｅｐｓｔａｔｉｎＡ、１μｇ／ｍｌ ｌｅｕ
ｐｅｐｔｉｎ、１ｍＭ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕ
ｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ含有２５ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁した。細胞懸濁
液をＤｏｕｎｃｅ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒで破砕し、
破砕液を遠心分離（３０００×ｇ、１０分間、４℃）し
た。得られた上清をさらに超遠心分離（１００，０００
×ｇ、２時間）し、沈殿を５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ
Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ、１０μｇ／ｍｌ
ａｐｒｏｔｉｎｉｎ 、１μｇ／ｍｌ ｐｅｐｓｔａ
ｔｉｎ Ａ、１μｇ／ｍｌｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１ｍＭ
ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕ
ｏｒｉｄｅ含有２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）に懸濁した。この懸濁液を段階的ショ糖密度
勾配遠心（２０、３０、５０、６０％ Ｓｕｃｒｏｓｅ
溶液、１００，０００×ｇ、２時間、４℃）で分画し、
生じた細胞膜画分のバンドを回収した。この画分を再度
超遠心分離（１００，０００×ｇ、２時間）により沈殿
させた後、０．１ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．２５％Ｔｒｉ
ｔｏｎＸ−１００含有２５ｍＭＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐ
Ｈ７．５）に懸濁し、タンパク質終濃度１〜２ｍｇ／ｍ
ｌとなるように調整した。この懸濁液を超遠心分離（１
００，０００×ｇ、１．５時間、４℃）し不溶残渣を除
き得られた上清を細胞膜画分とした。

【００４９】ベクターｐＳＧ５単独またはＭＴ−ＭＭＰ
遺伝子をトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞およ
び無処理のＣＯＳ−１細胞からそれぞれ調製した細胞膜
画分（タンパク質含量２０μｇ）をＨＴ１０８０細胞の
培養上清と３７℃で２時間インキュベートした。これら
試料を用いて前項（ａ）に記載したザイモグラフィーを
行った。その結果、ＭＴ−ＭＭＰ遺伝子をトランスフェ
クションしたＣＯＳ−１細胞由来の細胞膜画分を用いた
場合のみ、新たな６４ｋＤａと６２ｋＤａのバンドが出
現し、ＨＴ１０８０細胞の培養上清中に存在する潜在型
ＭＭＰ−２の活性化が観察された（図７参照）。この潜
在型ＭＭＰ−２の活性化は、組換えＴＩＭＰ−２の添加
により阻害された。この結果から、細胞膜上に発現した
ＭＴ−ＭＭＰによる潜在型ＭＭＰ−２の活性化が示され
た。

【００５０】（ｃ）Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＭＴ−Ｍ
ＭＰ発現による浸潤能の促進 細胞の浸潤能の測定は、ボイデン チャンバー（Ｂｏｙ
ｄｅｎ Ｃｈａｍｂｅｒ）法（キャンサー リサーチ
（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）、第４７巻、３２３９〜３
２４５頁（１９８７））を改変して行い、操作はバイオ
コート マトリゲル インベージョンチャンバー（Ｂｅ
ｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の操作方法に従った。

【００５１】前述の（ａ）の記載と同様にＭＴ−ＭＭＰ
遺伝子をクローン化した組換えｐＳＧ５あるいはコント
ロールとしてベクターｐＳＧ５単独をリン酸カルシウム
法によりＨＴ１０８０細胞、あるいはＮＩＨ３Ｔ３細胞
にトランスフェクションした。これらの宿主細胞はいず
れも潜在型ＭＭＰ−２を分泌している。得られたトラン
スフェクタントを０．１％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ培地に懸
濁し、２×１０^５個の細胞をバイオコート マトリゲル
インベージョン チャンバー中の未コートフィルター
（ポアサイズ８μｍ）あるいは予め膨潤させたマトリゲ
ルコートフィルター上に接種した。２４時間、３７℃炭
酸ガスインキュベーター中で培養した後、フィルターを
１０秒間メタノール中に浸し固定した。次にヘマトキシ
リンで３分間水洗後、エオジンで１０秒間染色し、フィ
ルター下面に浸潤した細胞数を光学顕微鏡下（４００
倍）で計測した。

【００５２】ＭＴ−ＭＭＰ遺伝子をトランスフェクショ
ンしたＨＴ１０８０細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞では、
いずれもコントロールのベクター単独をトランスフェク
ションした細胞に比べ、２倍以上の浸潤した細胞が観察
された（図８マトリゲル参照）。すなわち、ＭＴ−ＭＭ
Ｐの発現により細胞の浸潤能が上昇したことが示され
た。また、この測定系に１０μｇ／ｍｌの組換えＴＩＭ
Ｐ−２を添加すると明らかに細胞の浸潤能が抑制される
ことが認められた（図８マトリゲル＋ｒＴＩＭＰ−２参
照）。

【００５３】

【配列表１】

【００５４】

【配列表２】

【００５５】

【配列表３】

【００５６】

【配列表４】

【００５７】

【配列表５】

【００５８】

【配列表６】

【００５９】

【配列表７】

【００６０】

【配列表８】

【００６１】

【配列表９】

【００６２】

【配列表１０】

【配列表１１】

【配列表１２】

【００６３】

【配列表１３】

【配列表１４】

【配列表１５】

【００６４】

【配列表１６】

【配列表１７】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＭＴ−ＭＭＰのアミノ酸配列のカイト・ドーリ
トル法による親水性、疎水性分布図である。

【図２Ａ】ＭＴ−ＭＭＰのアミノ酸配列と公知のＭＭＰ
ファミリー（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、Ｍ
ＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、Ｍ
ＭＰ−１１）のアミノ酸配列との配列上の相同性を比較
した図である。各図中の記号は、それぞれアミノ酸を表
し、ＡはＡｌａ、ＣはＣｙｓ、ＤはＡｓｐ、ＥはＧｌ
ｕ、ＦはＰｈｅ、ＧはＧｌｙ、ＨはＨｉｓ、ＩはＩｌ
ｅ、ＫはＬｙｓ、ＬはＬｅｕ、ＭはＭｅｔ、ＮはＡｓ
ｎ、ＰはＰｒｏ、ＱはＧｌｎ、ＲはＡｒｇ、ＳはＳｅ
ｒ、ＴはＴｈｒ、ＶはＶａｌ、ＷはＴｒｐ、ＹはＴｙｒ
に対応する。これらの２Ａ〜２Ｈの図は一体となって１
つの図を構成する。

【図２Ｂ】ＭＴ−ＭＭＰのアミノ酸配列と公知のＭＭＰ
ファミリー（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、Ｍ
ＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、Ｍ
ＭＰ−１１）のアミノ酸配列との配列上の相同性を比較
した図である。各図中の記号は、それぞれアミノ酸を表
し、ＡはＡｌａ、ＣはＣｙｓ、ＤはＡｓｐ、ＥはＧｌ
ｕ、ＦはＰｈｅ、ＧはＧｌｙ、ＨはＨｉｓ、ＩはＩｌ
ｅ、ＫはＬｙｓ、ＬはＬｅｕ、ＭはＭｅｔ、ＮはＡｓ
ｎ、ＰはＰｒｏ、ＱはＧｌｎ、ＲはＡｒｇ、ＳはＳｅ
ｒ、ＴはＴｈｒ、ＶはＶａｌ、ＷはＴｒｐ、ＹはＴｙｒ
に対応する。これらの２Ａ〜２Ｈの図は一体となって１
つの図を構成する。

【図２Ｃ】ＭＴ−ＭＭＰのアミノ酸配列と公知のＭＭＰ
ファミリー（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、Ｍ
ＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、Ｍ
ＭＰ−１１）のアミノ酸配列との配列上の相同性を比較
した図である。各図中の記号は、それぞれアミノ酸を表
し、ＡはＡｌａ、ＣはＣｙｓ、ＤはＡｓｐ、ＥはＧｌ
ｕ、ＦはＰｈｅ、ＧはＧｌｙ、ＨはＨｉｓ、ＩはＩｌ
ｅ、ＫはＬｙｓ、ＬはＬｅｕ、ＭはＭｅｔ、ＮはＡｓ
ｎ、ＰはＰｒｏ、ＱはＧｌｎ、ＲはＡｒｇ、ＳはＳｅ
ｒ、ＴはＴｈｒ、ＶはＶａｌ、ＷはＴｒｐ、ＹはＴｙｒ
に対応する。これらの２Ａ〜２Ｈの図は一体となって１
つの図を構成する。

【図２Ｄ】ＭＴ−ＭＭＰのアミノ酸配列と公知のＭＭＰ
ファミリー（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、Ｍ
ＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、Ｍ
ＭＰ−１１）のアミノ酸配列との配列上の相同性を比較
した図である。各図中の記号は、それぞれアミノ酸を表
し、ＡはＡｌａ、ＣはＣｙｓ、ＤはＡｓｐ、ＥはＧｌ
ｕ、ＦはＰｈｅ、ＧはＧｌｙ、ＨはＨｉｓ、ＩはＩｌ
ｅ、ＫはＬｙｓ、ＬはＬｅｕ、ＭはＭｅｔ、ＮはＡｓ
ｎ、ＰはＰｒｏ、ＱはＧｌｎ、ＲはＡｒｇ、ＳはＳｅ
ｒ、ＴはＴｈｒ、ＶはＶａｌ、ＷはＴｒｐ、ＹはＴｙｒ
に対応する。これらの２Ａ〜２Ｈの図は一体となって１
つの図を構成する。

【図２Ｅ】ＭＴ−ＭＭＰのアミノ酸配列と公知のＭＭＰ
ファミリー（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、Ｍ
ＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、Ｍ
ＭＰ−１１）のアミノ酸配列との配列上の相同性を比較
した図である。各図中の記号は、それぞれアミノ酸を表
し、ＡはＡｌａ、ＣはＣｙｓ、ＤはＡｓｐ、ＥはＧｌ
ｕ、ＦはＰｈｅ、ＧはＧｌｙ、ＨはＨｉｓ、ＩはＩｌ
ｅ、ＫはＬｙｓ、ＬはＬｅｕ、ＭはＭｅｔ、ＮはＡｓ
ｎ、ＰはＰｒｏ、ＱはＧｌｎ、ＲはＡｒｇ、ＳはＳｅ
ｒ、ＴはＴｈｒ、ＶはＶａｌ、ＷはＴｒｐ、ＹはＴｙｒ
に対応する。これらの２Ａ〜２Ｈの図は一体となって１
つの図を構成する。

【図２Ｆ】ＭＴ−ＭＭＰのアミノ酸配列と公知のＭＭＰ
ファミリー（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、Ｍ
ＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、Ｍ
ＭＰ−１１）のアミノ酸配列との配列上の相同性を比較
した図である。各図中の記号は、それぞれアミノ酸を表
し、ＡはＡｌａ、ＣはＣｙｓ、ＤはＡｓｐ、ＥはＧｌ
ｕ、ＦはＰｈｅ、ＧはＧｌｙ、ＨはＨｉｓ、ＩはＩｌ
ｅ、ＫはＬｙｓ、ＬはＬｅｕ、ＭはＭｅｔ、ＮはＡｓ
ｎ、ＰはＰｒｏ、ＱはＧｌｎ、ＲはＡｒｇ、ＳはＳｅ
ｒ、ＴはＴｈｒ、ＶはＶａｌ、ＷはＴｒｐ、ＹはＴｙｒ
に対応する。これらの２Ａ〜２Ｈの図は一体となって１
つの図を構成する。

【図２Ｇ】ＭＴ−ＭＭＰのアミノ酸配列と公知のＭＭＰ
ファミリー（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、Ｍ
ＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、Ｍ
ＭＰ−１１）のアミノ酸配列との配列上の相同性を比較
した図である。各図中の記号は、それぞれアミノ酸を表
し、ＡはＡｌａ、ＣはＣｙｓ、ＤはＡｓｐ、ＥはＧｌ
ｕ、ＦはＰｈｅ、ＧはＧｌｙ、ＨはＨｉｓ、ＩはＩｌ
ｅ、ＫはＬｙｓ、ＬはＬｅｕ、ＭはＭｅｔ、ＮはＡｓ
ｎ、ＰはＰｒｏ、ＱはＧｌｎ、ＲはＡｒｇ、ＳはＳｅ
ｒ、ＴはＴｈｒ、ＶはＶａｌ、ＷはＴｒｐ、ＹはＴｙｒ
に対応する。これらの２Ａ〜２Ｈの図は一体となって１
つの図を構成する。

【図２Ｈ】ＭＴ−ＭＭＰのアミノ酸配列と公知のＭＭＰ
ファミリー（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、Ｍ
ＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、Ｍ
ＭＰ−１１）のアミノ酸配列との配列上の相同性を比較
した図である。各図中の記号は、それぞれアミノ酸を表
し、ＡはＡｌａ、ＣはＣｙｓ、ＤはＡｓｐ、ＥはＧｌ
ｕ、ＦはＰｈｅ、ＧはＧｌｙ、ＨはＨｉｓ、ＩはＩｌ
ｅ、ＫはＬｙｓ、ＬはＬｅｕ、ＭはＭｅｔ、ＮはＡｓ
ｎ、ＰはＰｒｐ、ＱはＧｌｎ、ＲはＡｒｇ、ＳはＳｅ
ｒ、ＴはＴｈｒ、ＶはＶａｌ、ＷはＴｒｐ、ＹはＴｙｒ
に対応する。これらの２Ａ〜２Ｈの図は一体となって１
つの図を構成する。

【図３】ノーザンブロット分析による各種のヒト組織中
でのＭＴ−ＭＭＰ ｍＲＮＡの発現を相対的に示したも
のである。

【図４】ノーザンブロット分析によるヒト肺偏平上皮癌
２例の正常部および癌部におけるＭＴ−ＭＭＰ ｍＲＮ
Ａの発現を相対的に示したものである。

【図５】ＭＴ−ＭＭＰ ｃＤＮＡ導入ＨＴ１０８０細胞
中で発現したＭＴ−ＭＭＰタンパク質を免疫沈降法によ
り検出した結果を示したものである。図はデンシトメー
タによるスキャンを示したものであり、黒塗り部分が抗
ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体で免疫沈降したＭＴ−
ＭＭＰの位置を示す。

【図６】ＭＴ−ＭＭＰ ｃＤＮＡ導入ＨＴ１０８０細胞
およびＭＴ−ＭＭＰ ｃＤＮＡ導入ＮＩＨ３Ｔ３細胞の
培養上清のザイモグラフィーにより、ＭＴ−ＭＭＰの発
現による潜在型ＭＭＰ−２の活性化を示したものであ
る。

【図７】ＭＴ−ＭＭＰ ｃＤＮＡ導入ＣＯＳ−１細胞の
細胞膜画分による潜在型ＭＭＰ−２の活性化をザイモグ
ラフィーにより示したものである。

【図８】ＭＴ−ＭＭＰの発現による細胞の浸潤能の促進
を一部改変したボイデン チャンバー（Ｂｏｙｄｅｎ
Ｃｈａｍｂｅｒ）法により示したものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/02 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｐ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ // Ａ６１Ｋ 39/395 33/573 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/574 Ｚ 33/573 33/577 Ｂ 33/574 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 9282−4Ｂ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．，268（05. 07．93），Ｐ．14033−14039 Ｊ．ＮＡＴＬ．ＣＡＮＣＥＲ ＩＮＳ Ｔ．，85（03．11．93），Ｐ．1758− 1764 ＴＲＥＮＤＳ．ＧＥＮＥＴ．，６ （1990），Ｐ．121−125 ＣＵＲＲ．ＯＰＩＮ．ＣＥＬＬ ＢＩ ＯＬ．，５（５）（1993），Ｐ．891− 897

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｃ末端領域に膜結合型タンパク質に特徴
   的な配列表配列番号１の５３３位から５６２位までの疎
   水性アミノ酸の連続配列を有することを特徴とする天然
   型膜結合型マトリックスメタロプロテアーゼ。
2. 【請求項２】 Ｃ末端領域に膜結合型タンパク質に特徴
   的な配列表配列番号１の５３３位から５６２位までの疎
   水性アミノ酸の連続配列を有し、かつ１６０位から１７
   ３位、３２０位から３３３位及び４９８位から５１２位
   のアミノ酸配列を有することを特徴とする天然型膜結合
   型マトリックスメタロプロテアーゼ。
3. 【請求項３】 Ｃ末端領域に膜結合型タンパク質に特徴
   的な配列表配列番号１の５３３位から５８２位までの疎
   水性アミノ酸の連続配列を有し、かつ１位から１７３
   位、３２０位から３３３位及び４９８位から５１２位の
   アミノ酸配列を有することを特徴とする天然型膜結合型
   マトリックスメタロプロテアーゼ。
4. 【請求項４】 請求項１ないし請求項３のいずれかに記
   載された膜結合型マトリックスメタロプロテアーゼのア
   ミノ酸配列に対応する配列表配列番号２に記載された塩
   基配列を有するＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項４に記載された塩基配列を有する
   ＤＮＡ配列を有し、請求項１ないし請求項３のいずれか
   に記載された膜結合型マトリックスメタロプロテアーゼ
   を発現するプラスミド。
6. 【請求項６】 請求項４に記載された塩基配列を有する
   ＤＮＡ配列を有し、請求項１ないし請求項３のいずれか
   に記載された膜結合型マトリックスメタロプロテアーゼ
   を発現するプラスミドを有する宿主細胞。
7. 【請求項７】 請求項１ないし請求項３のいずれかに記
   載された膜結合型マトリックスメタロプロテアーゼを特
   異的に認識するモノクローナル抗体。