JP2005507373A - カテプシンb活性を中和するモノクロナール抗体及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
発明の技術分野
本発明は、カテプシンB活性を中和できるモノクロナール抗体に関する。特に、本発明は、カテプシンBの過剰発現及び/又は過剰活性に関連した病気、例えば癌 又は関節炎を治療及び発見するためのかかる抗体の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
リソソームシステインプロテイナーゼであるカテプシンB(Cat Bと略記する)は、腫瘍の増殖、浸潤(invasion)及び転移のプロセスに関与することが明らかにされている(Kos, J. and Lah, T.T., Oncology Reports 5: 1349-1361, 1996)。腫瘍カテプシンBが形質膜に輸送され得るか、あるいはプロフォーム(pro-form)として分泌され得るか又は細胞外マトリックス及び基底膜の構成成分の分解に関与すると思われる腫瘍細胞由来の活性酵素として分泌され得る(これは、転移プロセスにおいて重要なステップであると思われる)ということが明らかにされている(Sloane et al., Biochemical and Molecular
Aspects of Selected Cancers, T.G. Pretlow and T.P. Pretlow eds., Academic Press, New York, pp. 411-465, 1994)。カテプシンB活性は、典型的にはシステインプロテイナーゼの内因性阻害剤、例えば細胞内ステフィンA及びB並びに細胞外シスタチン、キニノーゲン及びα2マクログロブリンによって制御される。細胞外マトリックスの制御されないタンパク質分解を招き得る腫瘍カテプシンBの濃度増大が、対応するシステインプロテイナーゼ阻害剤の増加と釣り合わないことが明らかにされている。乳癌、頭頸部癌、結腸直腸癌及び肺癌の臨床研究において、腫瘍組織のCat Bの活性増大及びより攻撃的な腫瘍挙動に関連したタンパク質の濃度増大は、再発を早くし且つ生存全体を短くする(Kos, J. and Lah, T.T., Oncology Reports 5: 1349-1361, 1996)。Cat Bの著しい濃度増大もまた、乳癌、結腸直腸癌、肝臓癌、膵臓癌及び黒色腫をもつ患者の血清において認められている(Kos et al., Int. J. Biol. Markers, 15: 84-89, 2000)。
【0003】
一方、阻害能の低下もまた、癌の進行におけるカテプシンBの不適切な制御を説明するのに提案されている。例えば、ヒトの肉腫(sarcoma)から精製されたステフィンAは、肝臓ステフィンAに比べて低い阻害活性を示した(Lah et al., Biochim. Biophys. Acta., 993: 63-73, 1989)。肺の腫瘍組織において、カテプシンBは、E-64による不活性化に対して対照の肺組織由来のカテプシンBよりも耐性であった(Krepela et al., Int. J. Cancer, 61: 44-53, 1995)。さらにまた、さらに転移性の肺細胞由来のカテプシンBは、転移性の低い肺癌細胞株由来の酵素よりもE-64により種々の阻害率を示した(Spiess et
al., J. Histochem. Cytochem. 42: 917-929, 1994)。カテプシンB/シスタチンC複合体の濃度は、良性の病気をもつ患者又は健常対照群に比べて肺癌及び結腸直腸癌をもつ患者の血清において低いことが明らかにされた(Zore et al., Biol. Chem., 382: 2001)。
【0004】
現在、癌患者においては、システインプロテイナーゼの内因性阻害剤の腫瘍関連システインプロテイナーゼの過剰発現及び/又は過剰活性を効率的に釣り合わせる能力が危うくされている(compromised)と思われる。現在のところ、生体内でカテプシンBの阻害に影響を及ぼす種々の腫瘍関連因子について直接的な証拠はないが、カテプシンBの腫瘍関連翻訳後修飾、pH安定性の変化、活性化剤の存在又はグリコサミノグリカン(GAG)の結合(これらは全てカテプシンB活性部位の立体構造及び結果として生じる阻害剤の結合を変化させ得る)を報告する幾つかの生体外研究がある(Zore et al., Biol. Chem., 382 : 2001)。
【0005】
システインプロテイナーゼ阻害剤は癌を治療するための治療ツールを提供できることから、種々の天然タンパク質阻害剤及びその合成類縁体が調製され、その抗腫瘍効果について試験されている。あいにく、天然の阻害剤の特異性は、一つの特定の酵素に限定されていない。また、可逆的及び可逆的な小さな合成阻害剤が、さらに高い濃度で細胞障害性であることがわかった。従って、カテプシンBの過剰発現及び/又は過剰活性に関連した癌及びその他の病気、例えば関節炎、自己免疫疾患、喘息、神経変性疾患、歯周病、筋ジストロフィー、骨粗鬆症などを治療する別のツールに対する要求が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0006】
発明の要約
本発明に到る広範な研究の過程で、本発明者らは、カテプシンBに対する中和モノクロナール抗体が前記酵素の前記のタンパク質分解活性の特異的な阻害について興味を引く機会を提供することを見出した。
【0007】
従って、第一の要旨によれば、本発明は、カテプシンBに対してその生物学的活性を弱めるような中和モノクロナール抗体を提供する。
【0008】
別の態様によれば、本発明は、カテプシンBを認識し且つその生物学的活性を弱めるモノクロナール抗体であって、ネズミの可変部とヒトの定常部からなるものであるモノクロナール抗体(キメラ抗体)を提供する。
【0009】
さらに別の要旨によれば、本発明は、前記の特性をもつヒト化されたモノクロナール抗体を提供する。
【0010】
本発明はまた、一次抗体構造の一部分のみからなるポリペプチド断片であって、免疫グロブリン活性(ミニ抗体)の一つ又はそれ以上を有するポリペプチド断片を提供する。
【0011】
さらに別の要旨によれば、本発明は、かかるモノクロナール抗体を発現するハイブリドーマ細胞株であって、Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany 所在のDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)に2001年5月17日付けで寄託され、受託番号DSM ACC2506として受託されたハイブリドーマ細胞株を提供する。DSMZはブタペスト条約に従った国際寄託機関をもつ。
【0012】
また、本発明は、カテプシンBの過剰発現及び/又はその過剰活性に関連した病気を治療及び/又は診断するための本明細書に記載の抗体の使用を提供する。かかる病気は特に癌又は関節炎である。
【0013】
発明の詳細な説明
添付の図面において、
図1は、2A2モノクロナール抗体の等電位点電気泳動の結果を表す。一組のバンドが6.55〜7.2のpI範囲に集中しており、上記抗体のモノクロナール性を表している。
【0014】
図2は、BODIPYL FLカゼイン基質上で中和抗カテプシンB抗体を使用したカテプシンB活性の阻害の結果を表す。カテプシンBは陽性対照として使用した。
【0015】
図3-A〜3-Eは、本発明のモノクロナール抗体(MAb)によるマトリゲル(Matrigel)へのMCF-10A neoT細胞の浸潤の阻害の結果を表し(図3A)、比較として不可逆的阻害剤E-64よる阻害の結果(図3B)、CLIK-148よる阻害の結果(図3C)、ニワトリのシスタチンよる阻害の結果(図3D)及びSQAPI-様阻害剤よる阻害の結果(図3E)を表す。2A2モノクロナール抗体のモル濃度を規定するために、それを二価の阻害剤としてみなした。
【0016】
図4及び4-Aは、キメラH鎖の組立てについての工程図を表す。
【0017】
図5及び5-Aは、キメラL鎖の組立てについての工程図を表す。
【0018】
図6は、2A2モノクロナール抗体のH鎖可変部のヌクレオチド配列(配列表に配列番号1として示した)を表す。その推定されるアミノ酸領域をヌクレオチド配列の上欄に示す(配列表に配列番号2として示した)。
【0019】
図7は、2A2モノクロナール抗体のL鎖可変部のヌクレオチド配列(配列表に配列番号3として示した)を表す。その推定されるアミノ酸領域をヌクレオチド配列の上欄に示す(配列表に配列番号4として示した)。
【0020】
図8は、チャイニーズハムスターの卵巣(CHO)細胞で発現させたキメラ2A2抗体を用いて染色したヒトのカテプシンBのPAGE及びウェスタンブロットを表す。図のAは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動であり、組換えヒトカテプシンBのポリアクリルアミドゲル電気泳動(1)及び標準のポリアクリルアミドゲル電気泳動(2)である。図のBは、キメラ2A2抗体を用いて染色したカテプシンBのウェスタンブロット(1)である。セイヨウワサビペルオキシダーゼと複合させたヤギ抗ヒト抗体(IgG)を、二次抗体として使用した。基質として、0.05%ジアミノベンジジン(DAB)と、0.05M Tris/HCl緩衝液(pH7.5)に溶解した0.01%H2O2とを使用した。
【0021】
図9は、ELISAにおけるキメラ2A2抗体の結合を表す。モル濃度(10-6〜10-2M)の精製キメラ抗体2A2のアリコ−トを、カテプシンB(2μg/ml)で被覆したマイクロタイタープレートに加えた。ELISAは文献(Schweiger et al., J. Immunol. Methods, 201: 165-172, 1997)に記載のようにして行った。
【0022】
本明細書及び特許請求の範囲に記載の抗体は、カテプシンBを中和する能力をもつ。本発明において、「中和する」という用語は、生物学的活性を弱めることを意味する。これに関して、この弱化(impairment)は転移の進行を本質的に停止するための主題の抗体の特性を説明するらしいということが認められている。
【0023】
本発明の抗体は、抗体の産生に利用でき且つ適した動物、例えばマウス、ウサギ又はニワトリにおいて調製し得る。しかし、かかる抗体は、ヒトに使用される場合には、治療されるべき個体が投与された抗体に対して最終的に免疫応答を喚起する効果をもつという意味で免疫原性である。これらの理由により。上記抗体は、例えばキメラ化によって再設計し得る。このために、未変性の非ヒト可変領域を遺伝子組換え技術によってL鎖及びH鎖のヒト定常部に連結し、適当な細胞中でキメラ抗体を製造する。この方法により、元の非ヒト抗体の結合親和性が、免疫原性を著しく低下されながら、保存される。
【0024】
別の工程において、前記抗体はまたヒト化されていてもよい。この目的を達成するために、前記抗体の非ヒト部分の可変部がヒト立体配置(human conformation)に適合される。ヒト化抗体を調製する技法は、当該技術において、例えばHurle and Gross, Curr. Opin. Biotechnol., 5: 428-433, 1994 に示されているように周知である。
【0025】
前記の記載からみて、「抗体」という用語は、動物抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体だけではなく、前記の種類のミニ抗体、好ましくは断片、例えばFab、Fv及び/又はscFv部分をも包含するものと解釈される。
【0026】
前記のようにして変性された抗体は、大腸菌、酵母又は哺乳動物細胞などの適当な細胞中で製造できる。しかし、立体配置及び免疫原性の理由から、哺乳動物細胞が好ましい。その理由は、正常ヒト細胞のグリコシル化パターンに似たグリコシル化パターンを提供するからである。
【0027】
好ましい態様によれば、本発明のモノクロナール抗体のH鎖及びL鎖の可変部は、本明細書に添付の配列表に示されるようなものであり、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4として示される。
【0028】
本発明の抗体を発現できるハイブリドーマ細胞株は、Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany 所在の Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) に2001年5月17日付けで寄託され、受託番号DSM ACC2506として受託された。また、このハイブリドーマ細胞株も本発明の目的である。
【0029】
2A2キメラ抗体を安定して産生できるCHOクローンC6A2/CHOは、Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany 所在の Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) に2002年3月6日付けで寄託され、受託番号DSM ACC2537として受託された。このクローンもまた本発明の目的である。
【0030】
本発明の抗体がマトリゲル(Matrigel)、すなわち正常組織に似た人工マトリックスへの腫瘍細胞の浸潤を著しく低下させることを示すことができる。従って、本発明の抗体は、カテプシンBの濃度増加及び/又は活性増大に関連した病気、例えば癌又は関節炎を治療及び/又は診断するために使用し得る。特に、癌、例えば乳癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、肺癌、頭頸部癌、前立腺癌、卵巣癌及び黒色腫は、本発明の抗体を用いて首尾よく治療し得る。また、腫瘍新脈管形成も本発明の中和抗体を使用することによって阻止し得る。
【0031】
カテプシンBが関節炎の初期及び進行機において役割を果たすであろうことが意外にも知見された。従って、本発明の抗体はこれに関しても使用し得る。
【0032】
本発明の抗体は、非経口投与、すなわち皮下投与、筋肉内投与又は静脈内投与用の溶液用の溶液又は粉末などの適当であると思われるガレン形製剤に製剤し得る。鼻腔内処置又はその他の処置用のリポソーム、ステルスリポソーム、微小球及び固形ナノ粒子などの薬物送達システムを使用してもよい。前記抗体は、その標的指向効果及び治療効果を高め得る物資、例えば毒素、放射性ヌクレオチド、別のモノクロナール抗体、化学療法剤及び免疫抑制剤と共に使用してもよい。
【0033】
従って、本発明はまた、本明細書に記載の抗体を含有してなる医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は投与の経路に応じて、常用される担体又は賦形剤を含有することが認められるであろう。また、主治医は、治療すべき病気の対応状況を考慮に入れて適切な投与経路を選択するであろう。
【実施例】
【0034】
本発明を下記の非限定的実施例によって例証する。
【0035】
実施例
1.免疫処置
特異的モノクロナール抗体を調製するために、大腸菌内で発現させた高精製組換えヒトカテプシンB(Kuhelj et al., Eur. J. Biochem., 229: 533-539, 1996)でマウスを免疫処置した。4匹のBALB/cマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化させたカテプシンB(25μg/マウス)を用いて皮下に免疫処置し、次いで14日目、28日目及び42日目に不完全フロイントアジュバントに乳化させた上記と同量の抗原を腹腔内注射した。試験49日目に採血して、抗カテプシンB特異抗体の力価を、抗原固定化ELISA法を使用して測定した。最も高い力価をもつマウスに、56日目及び57日目に食塩水溶液に溶解したカテプシンB(30μg/マウス)を用いて腹腔内に追加免疫し、59日目に融合用に使用した。
【0036】
ハイブリドーマ産生
ハイブリドーマ産生用に、脾臓細胞9.5×106個と骨髄腫細胞(NS-1/1-Ag4-1)5.6×106個とをPEGを使用して融合させた(Koehler and Milstein, Nature 256: 495497, 1975)。融合後に、96ウエルの細胞培養プレート上でHAT補足DMEM培地を使用してハイブリドーマ細胞を増殖させた。HAT選別後に、ハイブリドーマ細胞の上清をカテプシンBに特異的な抗体の産生について、抗原固定化ELISA法を使用することにより試験した。
【0037】
中和抗カテプシンB抗体を産生するハイブリドーマ細胞のスクリーニング
カテプシンBに対する抗体を産生させるための陽性ハイブリドーマの上清を、蛍光定量法及び合成基質 Z-Arg-Arg-AMC (Bachem製、スイス国)を使用してカテプシンBに対する阻害活性についてさらに試験した。スクリーニングは、96ウエルの蛍光定量マイクロタイタープレートを用いて行った。カテプシンB(10μl、5×10-8M)、活性化用緩衝液(30μl、4.5mMシステイン)及び上清(50μl)を30分間プレインキュベートし、次いで上記基質(10μl、5μM)を加え、さらに15分間インキュベートした。ヨード酢酸(100μl、1mM)を加えることにより反応を停止させた。基質 Z-Arg-Arg-AMC はカテプシンBによって蛍光生成物 7-アミノ-4メチルクマリンに開裂した。その存在を、蛍光光度計で370nmの励起波長と460nmの発光波長を使用して検出した。DMEMを対照試料に使用した。最も高い阻害効果を示すクローン24個を24ウエルのマイクロタイタープレートでサブクローン化した。
10日後に、個々のクローンから得た上清を上記と同じ条件で基質 Z-Arg-Arg-AMCに対して試験した。最も高いカテプシンB阻害活性をもつクローン10個を、最初に25cm2容の培養フラスコに移し、次いで75cm2容の培養フラスコに移した。アフィニティークロマトグラフィーを使用してプロテインAセファロース(セファロース)上で上清から抗体を単離した。
精製抗体をカテプシンBに対する阻害活性について、最初に前記のようにして基質 Z-Arg-Arg-AMC を使用し、次いで蛍光BODIPY FL色素標識カゼイン(Molecular Probes製、USA)を使用することにより試験した。後者については、カテプシンB(20μl、1×10-7M)を最初に活性化剤〔MES緩衝液(pH6.0)に溶解した10mMシステイン〕と共に15分間プレインキュベートした。次いで、モノクロナール抗体(50μl、1×10-7M)と基質(100μl、10g/ml)とを加え、得られた混合物を遮光したプレートシェーカー上で20℃で1時間インキュベートした。放出された蛍光BODIPY FL色素標識ペプチドの濃度は、活性カテプシンBの濃度に対応した。蛍光ペプチドを、励起波長/発光波長485nm/538nmで検出した。抗体なしでインキュベートしたカテプシンBを、陽性対照として使用した。抗体の存在下に試料中で測定された蛍光の減少は、単離された抗体の阻害活性を示した。
【0038】
2.選択された阻害抗体の生化学的特定
中和抗体による腫瘍細胞浸潤の阻害
ヒトの乳房表皮細胞株MCF10A neoT を、母細胞不死化(parental immortalized)細胞株 MCF10A (Soule et al., Cancer Res., 50: 6075-6086, 1990)から、ネオマイシン耐性遺伝子及びヒトT-24突然変異Ha-ras 癌遺伝子(Ochieng et al., Invasion Metastasis 11: 38-47, 1991)を含有するプラスミドを使用して移入することにより誘導し且つ米国デトロイト所在のウェイン州立大学(Wayne State University)のB. Sloane教授から入手した。 前記の細胞を、75cm2容プラスチック製細胞培養フラスコ(Falcon製、USA)中で、12.5mM HEPES(Sigma製、USA)、5%ウシ胎児血清(Hyclone製、USA)、10μg/mlインスリン、0.5μg/mlのヒドロコルチゾン、0.02μg/mlの表皮成長因子(全てSigma製、USA) 及び抗生物質(ペニシリン、ストレプトマイシン、Krka, d.d., スロベニア)を補足したDMEM/F12培地(1:1)中で単層として37℃で5%CO2で、80%のコンフルエンス(confluence)まで培養した。継体培養については、上記細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS)中で0.05%トリプシン及び0.02%エチレンジアミン四酢酸(EDTA)で離散させた。この細胞を浸潤及び生死判別検定に使用する前に、PBS(pH7.4)に溶解した4%EDTAと0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)とを離散に使用した。実験に使用した細胞の生存率は、ニグロシンを用いて染色することにより測定すると少なくとも90%であった。CMパパイン-セファロースカラムを用いてアフィニティークロマトグラフィーによりシステインプロテイナーゼ阻害剤を消耗させたたウシ胎児血清の存在下で、細胞を増殖させた(Kos et al., 1992)。手短に言えば、0.02MのPBS緩衝液(pH7.4)を用いて1:2(容量/容量)に希釈した血清20mlを、CMパパイン-セファロース(スウェーデン国所在のPharmacia製)10mlと共に20分間インキュベートし、カラムに充填した。コンパートメント(3ml)を、BANA(Bz-DL-Arg-2-Nnap、Serva製、ドイツ国)を用いて残存阻害活性について試験し、次いで使用するまで−20℃で保存した。
前記細胞を、文献(Mosmann, J. Immunol. Methods, 65: 55-63, 1983) に記載のようにしてMTT比色検定法により定量した。この検定法は、生存細胞中に存在するミトコンドリア酵素 コハク酸デヒドロゲナーゼによる黄色のテトラゾリウム塩、すなわち3-4,5-ジメチルチアゾール-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)(Sigma製、USA)の水不溶性のホルマザン結晶への開裂に基づいている。前記のホルマザン結晶をイソプロパノールを使用して可溶化し、ELISAリーダー(SLT、Rainbow)を用いて570nm、参照フィルター690nmで光学濃度を測定した。
【0039】
得られた中和モノクロナール抗体の効果を、下記の種々の天然又は合成システインプロテイナーゼの効果と比較した。
1. 不可逆性阻害剤E-64、すなわちトランス-エポキシスクシニル-L-ロイシルアミド-(4-グアニジノ)ブタン(Sigma社製、USA) − システインプロテイナーゼの一般的な阻害剤(Barret et al., Biochem. J. 201: 189-198, 1982)
2. 可逆性緊密結合タンパク質阻害剤ニワトリシスタチン − システインプロテイナーゼの一般的な阻害剤(Kos et al., Agents Actions 38: 331-339, 1992)
3. CLIK-148、すなわち徳島文理大学の勝沼信彦教授から提供されたエポキシスクシニルペプチド誘導体(Premzl et al., Biol. Chem., 382: 2001) − カテプシンLの阻害剤
4. ペプスタチンA(Sigma社製、USA) − カテプシンDの阻害剤
5. SQAPI様阻害剤 − カボチャ〔ペポカボチャ(Cucurbita pepo)〕から単離したカテプシンDのタンパク質阻害剤(Christeller et al., Eur. J. Biochem., 254: 160-167, 1998)。
【0040】
中和モノクロナール抗体及び種々の阻害剤の細胞障害性を文献〔Holst-Hansen and Brunner, Cell Biology, A Laboratory Handbook, 2nd ed. (Academic Press), pp.16-18, 1998〕に記載のようにして試験した。手短に言えば、細胞を96ウエルマイクロタイタープレート(Costar製、USA)にウエル当たり細胞5×104個/200μlの最終濃度まで加えた。適当な濃度のモノクロナール抗体、阻害剤又は対照培地を加えた。このプレートを37℃及び5%CO2で24時間インキュベートした。培地を注意深く除去し、0.5mg/ml濃度のMTTを200μl加え、次いで37℃及び5%CO2で37時間インキュベートした。培地を除去し、ホルマザン結晶を200μl/ウエルのイソプロパノールに溶解した。吸光度を前記のようにして測定した。試験は全て四重に行った。
【0041】
浸潤に対するモノクロナール抗体及び種々のプロテイナーゼ阻害剤の効果を、文献(Holst-Hansen et al. Clin. Exp. Metastasis, 14: 297-307, 1996) に記載の部分改変法を使用して試験した。12mmポリカーボネートフィルター、12μmの細孔サイズをもつTranswells(Costar製、USA)を使用した。100μg/ml濃度のフィブロネクチン(Sigma製、USA) 25μlを、前記フィルターの下側に施用し、それを滅菌チャンバー中で1時間放置して乾燥した。前記フィルターの上側を1mg/ml濃度のマトリゲル(Becton Dickinson製、USA) 100μlで被覆し、100μlのDMEM/F12を加えた。マトリゲルを滅菌チャンバー中で、室温で一夜乾燥し、次いで培地200μlを用いて37℃で1時間再構成した。上部コンパートメント(compartments)に、適当な濃度の阻害剤を含有する細胞懸濁物(最終濃度 細胞4×105個/ml)0.5mlを満たした。下部コンパートメントに上記と同じ濃度の阻害剤を含有する培地1.5mlを満たした。プレートを37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。MTTを上部及び下部コンパートメントに、最終濃度0.5mg/mlまで加え、このプレートをさらに3時間インキュベートした。両方のコンパートメントから培地を別々にエッペンドルフ管に移し、6200rpmで5分間遠心分離した。上清を捨て、残ったホルマザン結晶をイソプロパノール1mlに溶解した。色の強さを前記のようにして測定した。対照として、細胞を適切な容量のメタノール、蒸留水及び50mM NaHCO3、0.3M NaCl、前記溶媒であってモノクロナール抗体及び阻害剤の濃厚溶液の調製に使用した前記溶媒を含有する培地(pH7.5)を用いてインキュベートした。浸潤を対照と比較したマトリゲル被覆フィルターに浸透する細胞のパーセントとして記録し、OD下部/OD下部+OD上部 ×100として算出した。試験は全て三重に行った。
【0042】
3.キメラ抗体の組み立てと発現
カテプシンBに対するモノクロナール抗体(MAb)を産生するハイブリドーマからの全RNAの調製
グアニジニウム法を使用することによって2A2ハイブリドーマ細胞株1.58×108個から全RNAを単離した。
【0043】
cDNAの第一の鎖の合成
cDNAはRT-PCRにより合成した。
【0044】
PCRによるMAbのVL及びVHの遺伝子の増幅並びにこれらの配列の決定
2組のプライマーをPCRに使用した:
L鎖について:
A
フォワードプライマー(配列番号5):
NK4: 5´-GATGGATATCGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGG-3´
バックワードプライマー(配列番号6):
NK3: 5´-GTGCCTCGAGTCGACTTAGCACTCATTCCTGTTGAATCTT-3´
B
フォワードプライマー (配列番号7):
L5V: 5´-GTGTGCACTCTGATATTGTGATG-3´
バックワードプライマー (配列番号8):
L3V: 5´-GGTGCAGCCACAGTCCGTTTTATTTC-3´
【0045】
H鎖について:
A
フォワードプライマー (配列番号9):
NK-HD5: 5´-GTGAGAGCTCSAGGTSMARCTGCAGSAGTCT-3´
バックワードプライマー (配列番号 10):
nH3V: 5´-GGTGGTCGACGCTGAGGAGACGGT-3´
B
フォワードプライマー (配列番号11):
H5V: 5´-GTGTGCACTCTGAGGTGCAGCTG-3´
バックワードプライマー (配列番号12):
H3V: 5´-TGGTCGACGCTGAGGAGACGGT-3´
【0046】
PCRは、GeneAmp PCR System 2400(PERKIN ELMER製)でL鎖プライマー(プライマー NK4 及び NK3)とH鎖プライマー(プライマー NK-HD5 及び nH3V)とを用いてそれぞれ30サイクル以内で、次の条件:すなわち予備変性を95℃で5分間;変性を95℃で30秒間;アニーリングを50℃で30秒間及び鎖伸長を72℃で1分間の条件で行った。PCR生成物を1%アガロースゲル上で調べ、次いでGENELEAN Kitを用いてさらに精製するために切り出した。 L鎖及びH鎖のPCR生成物を、ベクターpUC19及びpGEM-T Easy それぞれにクローン化した。これらの配列を装置ABI PPISM 310 遺伝子分析装置(PERKIN ELMER製)を用いて調べた。
【0047】
キメラL鎖及びH鎖の組立て
キメラL鎖及びキメラH鎖それぞれを組み立てた。マウスVL及びVH をヒトIgG定常部(CK及びCHIそれぞれ)に連結し、次いで発現ベクターpcDNA3に挿入した。
【0048】
L鎖
VL断片を、プライマー L5V及びL3Vを用いて次の条件:すなわち予備変性を95℃で5分間;変性を95℃で30秒間;アニーリングを55℃で30秒間及び鎖伸長を72℃で1分間の条件で増幅させた後に、得られたPCR生成物を、ヒトCK遺伝子を含有するpUC/hCKにサブクローン化した。
最初に、細胞外培地へのタンパク質の分泌に必要なリーダーペプチドを有する組換えキメラ鎖を提供するために設計されたベクターpUTSEC (Li, E. et al., 1997) に、キメラL鎖をクローン化した。最後に、該キメラL鎖と、マウスH鎖免疫グロブリン分泌シグナルをコードする163 bpゲノム配列とを、真核発現ベクター pcDNA3中にクローン化した。配列決定をそれぞれのベクター中で行い、正しい挿入を確認した。
【0049】
H鎖
VH断片を、プライマー H5V及びH3Vを用いて次の条件:すなわち予備変性を95℃で5分間;変性を95℃で30秒間;アニーリングを55℃で30秒間及び鎖伸長を72℃で1分間の条件で増幅させた後に、得られたVHドメインPCR生成物をベクターpUTSEC中にサブクローン化し、次いでヒトCγ1領域の遺伝子を含有するベクターpUC/hIgGlにサブクローン化した。また、キメラH鎖も真核発現ベクターpcDNA3にクローン化した。配列決定をそれぞれのベクター中で行い、正しい挿入を確認した。
【0050】
Sp2/0ネズミ骨髄腫細胞又はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中への組換えL鎖及びH鎖の移入
約1×107個のマウス骨髄腫Sp2/0細胞又はCHO細胞を、冷PBS(10.1mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4、137mM NaCl、3mM KC1、pH7.2)0.5mlに再懸濁し、0.4cmの電極間隙をもつエレクトロポーレーション用キュベットに入れた; 10μgのBgl II-線状プラスミド(L鎖 ■ pcDNA3及びH鎖 - pcDNA3精製プラスミド)を細胞に加え、エレクトロポーレーションを、キャパシタンスエクステンダーを備えたBio-Rad製Gene Pulserで960μF、290Vで単一パルスで行った。エレクトロポーレーション後に、細胞を氷上で5〜10分間保持し、洗浄し、10%FCS RPMI 1640培地30mlに再懸濁し、次いで10cmシャーレに細胞3〜4×105個/シャーレの濃度で接種した。
24時間後に、G-418を最終濃度400μg/mlで含有する選択培地を加えた。選択したクローンの上清を、カテプシンBで被覆したプレート上でELISA法により選別して分泌されたキメラMAbの存在を検出した。また、ウェスタンブロットも使用してキメラ MAbの発現生成物及び親和性を調べた。
キメラ抗体を単離し、ネズミ抗体について前記したようにして腫瘍細胞浸潤の阻害について試験した。
【0051】
配列
下記の配列が本出願に含まれる:
配列番号1: 2A2モノクロナール抗体H鎖可変部のヌクレオチド配列
配列番号2: 2A2モノクロナール抗体H鎖可変部のヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸領域
配列番号3: 2A2モノクロナール抗体L鎖可変部のヌクレオチド配列
配列番号4: 2A2モノクロナール抗体L鎖可変部のヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸領域
配列番号5: L鎖用フォワードプライマー NK4
配列番号6: L鎖用バックワードプライマー NK3
配列番号7: L鎖用フォワードプライマー LSV
配列番号8: L鎖用バックワードプライマー L3V
配列番号9: H鎖用フォワードプライマー NK-HD5
配列番号10: H鎖用バックワードプライマー nH3V
配列番号11: H鎖用フォワードプライマー H5V
配列番号12: H鎖用バックワードプライマー H3V
【図面の簡単な説明】
【0052】
【図1】精製2A2モノクロナール抗体の等電位点電気泳動の結果を表す。
【図2】BODIPYL FLカゼイン基質上で中和抗カテプシンB抗体を使用するカテプシンB活性の阻害の結果を表す。
【図3−A】本発明のモノクロナール抗体(MAb)によるMCF-10A neoT細胞のマトリゲルへの浸潤の阻害の結果を表す。
【図3−B】不可逆的阻害剤E-64よるMCF-10A neoT細胞のマトリゲルへの浸潤の阻害の結果を表す。
【図3−C】CLIK-148によるMCF-10A neoT細胞のマトリゲルへの浸潤の阻害の結果を表す。
【図3−D】ニワトリのシスタチンによるMCF-10A neoT細胞のマトリゲルへの浸潤の阻害の結果を表す。
【図3−E】SQAPI-様阻害剤によるMCF-10A neoT細胞のマトリゲルへの浸潤の阻害の結果を表す。
【図4】キメラH鎖の組立てに関する工程図を表す。
【図4−A】キメラH鎖の組立てに関する工程図を表す。
【図5】キメラL鎖の組立てに関する工程図を表す。
【図5−A】キメラL鎖の組立てに関する工程図を表す。
【図6】2A2モノクロナール抗体のH鎖可変部のヌクレオチド配列(配列表に配列番号1として示した)を表し、その推定されるアミノ酸領域(配列表に配列番号2として示した)をヌクレオチド配列の上欄に示す。
【図7】2A2モノクロナール抗体のL鎖可変部のヌクレオチド配列(配列表に配列番号3として示した)を表し、その推定されるアミノ酸領域(配列表に配列番号4として示した)をヌクレオチド配列の上欄に示す。
【図8】チャイニーズハムスターの卵巣(CHO)細胞で発現させたキメラ2A2抗体を用いて染色したヒトのカテプシンBのPAGE及びウェスタンブロットを表す。Aは組換えヒトカテプシンBのポリアクリルアミドゲル電気泳動(1)及び標準のポリアクリルアミドゲル電気泳動(2)を表す。Bはキメラ2A2抗体を用いて染色したウェスタンブロッ-カテプシンB(1)を表す。
【図9】ELISAにおけるキメラ2A2抗体の結合を表す。
【配列表フリーテキスト】
【0053】
次のフリーテキストが配列表に含まれる:
配列番号9:人工的配列の説明: さらに別の制限部位を有するH鎖用フォワードプライマー
[配列表]
Claims (18)
- カテプシンBに対する中和モノクロナール抗体。
- 前記抗体がネズミの可変部とヒトの定常部とからなるもの(キメラ抗体)である請求項1に記載の抗体。
- 前記モノクロナール抗体のH鎖及びL鎖の可変部が配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4に示すものである請求項2に記載の抗体。
- 前記抗体がヒト化されているものである前記請求項のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体がミニ抗体である請求項1に記載の抗体。
- 前記請求項のいずれか1項に記載のモノクロナール抗体を発現する細胞。
- Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)に2001年5月17日付けで受託番号DSM ACC2506として寄託された請求項6に記載の細胞。
- Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)に2002年3月6日付けで受託番号DSM ACC2537として寄託されたクローンであって、請求項1又は2のいずれかに記載のキメラ抗体の安定な産生を可能にするクローン。
- 高められたカテプシンB活性に関連した病気を治療及び/又は診断するための請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体の使用。
- 前記の高められた活性がカテプシンBの濃度増大に由来するものである請求項9に記載の使用。
- 前記の病気が癌又は関節炎である請求項9又は10のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体を含有する医薬組成物。
- 高められたカテプシンB活性に関連した病気を治療及び/又は診断するための請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体。
- 高められたカテプシンB活性に関連した病気を治療及び/又は診断するための抗体であって、その活性がカテプシンBの濃度増大に由来するものである請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体。
- 高められたカテプシンB活性に関連した病気を治療及び/又は診断するための抗体であって、前記の病気が癌又は関節炎である請求項1〜5に記載の抗体。
- 高められたカテプシンB活性に関連した病気を治療及び/又は診断するための医薬を製造するための請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体の使用。
- 前記の高められた活性が高められた濃度のカテプシンBに由来するものである請求項16に記載の使用。
- 前記の病気が癌又は関節炎である請求項16又は17のいずれかに記載の使用。
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