WO2004031241A1 - ズブチリシン様プロプロテインコンベルターゼ・ｐａｃｅ４に対するモノクローナル抗体及びその利用 - Google Patents

ズブチリシン様プロプロテインコンベルターゼ・ｐａｃｅ４に対するモノクローナル抗体及びその利用 Download PDF

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WO2004031241A1
WO2004031241A1 PCT/JP2003/012712 JP0312712W WO2004031241A1 WO 2004031241 A1 WO2004031241 A1 WO 2004031241A1 JP 0312712 W JP0312712 W JP 0312712W WO 2004031241 A1 WO2004031241 A1 WO 2004031241A1
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WO
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pace4
antibody
monoclonal antibody
subtilisin
protein
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PCT/JP2003/012712
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French (fr)
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Yoshiko Matsuda
Akihiko Tsuji
Original Assignee
Techno Network Shikoku Co., Ltd.
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
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    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)

Definitions

  • Subtilisin-like protein convertase ⁇ against PAC E4
  • the present invention relates to a subtilisin-like protein converter involved in processing of a factor belonging to the transforming growth factor-j8 (TGF- / 3) related family.
  • Ming relates to the use of the monoclonal antibody.
  • pro-TGF-j8 pro-TGF-] 3
  • propeptide region of pro-TGF- 9 was It is cleaved (processed) by a protease that recognizes a basic amino acid pair (such as Arg-Arg [RR] or Lys-Arg [K-R]) and converted to a mature, biologically active form.
  • a protease that recognizes a basic amino acid pair (such as Arg-Arg [RR] or Lys-Arg [K-R]) and converted to a mature, biologically active form.
  • proteases processing proteases
  • PC1 also called PC3
  • PC2, PC4, PC6 also called PC5
  • PCSffC proteases
  • SPC subtilisin-like protein proteinase
  • subtilisin-like protein proteinases are composed of a signal peptide (SP), a propeptide (Pro), It has a subtilisin-like catalytic domain (SCD) and a homo B domain (HomoB) in common with each other.
  • SP signal peptide
  • Pro propeptide
  • HomoB homo B domain
  • the amino acid sequence of the subtilisin-like catalytic domain hereinafter, also simply referred to as “catalytic domain” or “SCD” that contributes to protease activity has very high homology between the SPC families, and The cleavage specificities are also very similar.
  • PACE 4 is particularly important for the differentiation and proliferation of brain and nerves, and its expression is regulated by the neural differentiation transcription factor hASH-1. [Matsuda, Y., and Tsuji, A., et al., Bioce. J. 360, 683-689, (2001)]. In fact, mice lacking PAC E4 do not form brains. In addition, the present inventors have reported that PACE 4 plays an important function in bone differentiation and eye formation through activation of chondromodulin, which is a cartilage differentiation factor and has an angiogenesis inhibitory action. Is revealed.
  • a TDCV5 cultured cells with endochondrogenic bone differentiation ability show a drastic increase in PACE4 expression before calcification, and the inhibition of PACE4 activity by a Ca-dependent serine protease inhibitor causes the chondrogenic differentiation. Is completely suppressed [Matsuda, Tsuji et al., The 74th Annual Meeting of the Japanese Society for the Study of Iridani (October 2001); Biochemistry, 73, 8, 779, (2001)].
  • PAC E4 is considered to be an important processing protease that particularly controls nerves and bones.
  • subtilisin-like protein convertase is involved in the activity of the viral particle coat protein, which determines the infectivity of the virus, and the activity of the bacterial toxin [Garten, W., et al., Biochimie 76, 217-225, (1994); Gordon, VM, et al., Infect. I. thigh un. 65, 3370-3375, (1997)], and its inhibitors are also likely to be therapeutics for these infectious diseases.
  • An object of the present invention is to provide an antibody that specifically recognizes and binds to PAC4 belonging to the subtilisin-like protein convertase family.
  • the present invention also relates to the use of the antibody, specifically, for example, an immunological reagent utilizing the specific binding of the antibody to PACE4 (eg, a reagent for specific detection of PACE4),
  • An object of the present invention is to provide a drug (for example, a drug for preventing or treating a disease caused by abnormal expression of PACE4) and a method for specific detection of PACE4. It is a further object of the present invention to provide a method for searching for a substance useful for treating a disease caused by abnormal expression of PACE4.
  • subtilisin-like protein convertase 'PACE4 also simply referred to as "PACE4"
  • PACE4 subtilisin-like protein convertase 'PACE4
  • the monoclonal antibody is useful for diagnosing and elucidating various diseases associated with abnormal expression of PACE4, including the humanized antibody thereof, and for treating the PACE4-related disease. I was convinced that Kaboro could effectively develop useful drugs. The present invention has been completed based on such findings.
  • the present invention provides the following monoclonal antibodies:
  • subtilisin-like protein convertases (SPCs), they react with PAC4 and do not react with furin, PC1, PC2, PC4, PC6 and PC8. antibody.
  • the monoclonal antibody includes the following embodiments: (1-1) an antibody against a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an epitope portion, wherein the subtilisin-like protein is A monoclonal antibody characterized in that it reacts with PACE 4 and does not react with furin, PC1, PC2, PC4, PC6 and PC8 among the compeltases (SPC).
  • (1-1) an antibody against a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an epitope portion
  • the subtilisin-like protein is A monoclonal antibody characterized in that it reacts with PACE 4 and does not react with furin, PC1, PC2, PC4, PC6 and PC8 among the compeltases (SPC).
  • the humanized antibody can be applied to the prevention or treatment of diseases that occur in connection with abnormal expression of PACE4.
  • the present invention provides a chimeric antibody, particularly the monoclonal antibody described in (3) above.
  • a humanized antibody human-type chimeric antibody, human-type CDR-grafted antibody.
  • PACE4 subtilisin-like protein proteinases
  • furin furin
  • PC1, PC2, PC4, PC6 subtilisin-like protein proteinases
  • the present invention relates to the following hybridomas and a method for producing a monoclonal antibody using the same.
  • subtilisin-like protein convertases (SPCs), produce monoclonal antibodies that react with PAC4 and do not react with furin, PC1, PC2, PC4, PC6 and PC8 High Pridoma.
  • the hybridoma includes the following embodiments:
  • Hybridoma (Mouse Hybridoma-PACE4) with accession number FERM BP—08498 (transferred from FEM P-19048 deposited on October 1, 2002) 0
  • the hybridoma according to any of the above (2), (2-1) to (2-3) is cultured in vivo or in vitro, and reacted with PACE4 from the body fluid or culture. And (c) collecting a monoclonal antibody which does not react with furin, PC1, PC2, PC4, PC6 and PC8. A method for producing a monoclonal antibody.
  • the present invention also provides a PACE 4 detection reagent kit described in (4) below. According to the detection reagent kit, PACE4 can be detected specifically and easily. It works.
  • the present invention is a binder for PACE 4 described in the following (5). Since the binding agent can specifically bind to PACE4, it can be applied to the treatment or prevention of a disease caused by abnormal expression of PACE4.
  • the monoclonal antibody or a fragment thereof may be labeled with any labeling material.
  • the present invention is a method for specifically detecting PACE4 described in (6) below.
  • the detection method it is possible to elucidate and diagnose a disease that occurs in association with abnormal expression of PACE4.
  • the present invention is a method for searching for an active ingredient of a therapeutic drug for a disease associated with abnormal expression of PACE4 described in (7) below.
  • disease related to abnormal expression of PACE4 includes diseases caused by abnormal expression of PACE4 (including both increase and decrease of expression, the same applies hereinafter), and abnormal expression of PACE4. Both diseases associated with
  • FIG. 1 is a drawing showing the activation mechanism of a TGF / 3-related binding factor by a processing protease (subtilisin-like protein convertase).
  • Figure 2 is a schematic structural diagram showing the domain regions of the families of subtilisin-like protein convertases (furin, PC2, PC1 / 3, PC4, PACE4, PC5 / 6, PC7 / 8). is there.
  • SP indicates a signal peptide
  • Pro indicates a peptide
  • SCD indicates a subtilisin-like catalytic region
  • HomoB indicates a homo B domain
  • CRR indicates a cysteine-rich domain
  • TMD indicates a membrane-bound domain.
  • FIG. 3 is a structural schematic diagram showing each domain region of various isoforms of human PACE4.
  • FIG. 4 is a drawing comparing the amino acid sequence of PACE4 for rat (upper), mouse (middle), and human (lower) (PACE4A-I) (continued from FIG. 5).
  • “ ⁇ ”, “:” and “ ⁇ ” indicate that the amino acids between the three mammals are amino acids with similar properties (“ ⁇ ”), amino acids with the same liquidity or polarity (salts).
  • the signal peptide region is from amino acid number 1 to 63
  • the propeptide region is from amino acid number 64 to
  • L position 49 the subtilisin-like catalytic region is amino acid number 150.
  • the homo-B region is located at amino acid positions 496-634
  • the cysteine-rich region is located at amino acid positions 695-969.
  • FIG. 5 is a continuation of FIG. 4 showing the amino acid sequence of PACE4.
  • FIG. 6 shows the results of the experiment in Example 1 (3-2) (i) (iii), that is, the expression of yeast cells expressing PACE 4 in the PACE4-specific antibody-producing clones (1-D-1, 1-D-6). The results of Western blotting using ( ⁇ 680) as an antigen are shown.
  • the lane indicated by “Mock” also shows the results of Western blotting using an empty expression vector (Mock) into which the PACE4 gene was not inserted as an antigen. From these results, the PACE 4 specific antibody-producing clones (1-D-1, 1-D-6) did not react with proteins derived from yeast cells (Mock), and did not react with PACE 4 ( ⁇ 680) (molecular weight 76 kDa). In addition, it can be seen that it reacts specifically with its degradation products.
  • FIG. 7 shows the results of the experiment in Example 1 (3-2) (ii) (iii), that is, the PACE4-specific antibody-producing clone (1-D-6) was subjected to Western blotting using HEK293 cell-expressing PACE4 as an antigen.
  • the result of the tent is shown (PACE4 lane).
  • the results of Western blotting using an empty expression vector that does not incorporate the PACE4 gene as an antigen are also shown (Mock lane).
  • FIG. 8 shows the results of the immunoprecipitation method in Example 1 (3-3).
  • PAC E4 specific antibody-producing clones (1D-1, 1D-6) (Fig. B, 0 and a monoclonal antibody prepared using PACE4 SCD as an antigen (anti-SCD antibody (anti-SCD))
  • Fig. A Cell extracts (c) and culture supernatant (m) of HEK293 cells expressing the enzymes (PC1, furin, PC6A, PC6B, PACE4, PC8) and HEK293 cells (Mock) into which the expression vector was introduced were used. The results showing the reactivity (immunoprecipitation reaction) are shown.
  • Fig. 9 shows various SPC families (Mock, Furin, PC1 from the left lane) of a monoclonal antibody (anti-HomoB antibody) prepared using the homo B domain located at the C-terminal side of the catalytic region (SCD) of PACE 4 as an antigen.
  • FIG. 7 shows the results of examining the reactivity with PC2, PC6A, PC6B, PC8, PACE4A-I, and PACE4A-II) by immunoprecipitation.
  • the monoclonal antibody of the present invention is an antibody prepared using a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an epitope as an antigen, and is specific for subtilisin-like protein proteinase PACE4 (PACE4). It is characterized by having reactivity.
  • PAC E4A-I is the first identified PACE4, consisting of a signal peptide (SP), a propeptide (Pro), a subtilisin-like catalytic region (SCD), and a homo B domain (homo B) It consists of a domain structure common to SPC families and a CRR region located at the C-terminal side.
  • PACE 4B lacks the homo B domain and CRR region, and PACE 4 C and PACE 4CS contain most of the homo B domain but lack the CRR region.
  • PACE 4D lacks the signal peptide, propeptide and CRR region.
  • PACE4E-I has a domain structure similar to that of PACE4A-I, but has a unique amino acid sequence having a short CRR region and a hydrophobic cluster at the C-terminal side.
  • PACE4A- ⁇ and PACE4E-II in which 13 amino acids have been deleted immediately before the CRR region. All of these isoforms have a common SCD, and have an amino acid sequence specific to each isoform on the C-terminal side.
  • PACE4 targeted by the present invention is not limited as long as it has an SCD consisting of an amino acid sequence identical to or homologous to SCD (SEQ ID NO: 2) derived from human PACE4. Of course, it does not matter whether the tissue of origin is a different isoform. Therefore, PACE 4 targeted by the present invention includes human-derived PACE 4 (PACE4A-I) (SEQ ID NO: 3) and various other isoforms (PACE4A-11, PACE4B, PACE4C, PACE4CS, PACE4D, PACE4E-I, PACE4E-II, etc.).
  • FIGS. 4 and 5 show the comparison of the amino acid sequences of rat PACE4, mouse PACE4 and human PACE4.
  • the subtilisin-like catalytic domain (SCD) of rat PACE4 and mouse PACE4 has an amino acid sequence very similar to the SCD of human PACE4.
  • the entire amino acid sequence of rat PACE4 is shown in SEQ ID NO: 4
  • the partial amino acid sequence of mouse PACE4 is shown in SEQ ID NO: 5.
  • PACE 4 targeted by the present invention may be PACE 4 derived from an organism having an SCD having an amino acid sequence homologous to the human PACE4-derived SCD (SEQ ID NO: 2).
  • non-human species include, but are not limited to, various mammals such as mice, rats, puppies, bushes, goats, foxes, and monkeys. Preferred are mice and rats.
  • the SCD partially has the amino acid sequence of “GI RPNYIDJ” shown in SEQ ID NO: 1 and the entire amino acid sequence of SCD is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (human-derived PACE4- Non-human animal PACE 4 having a homology (identity) of 70% or more, preferably 85% or more, more preferably 95% or more with SCD (I SCD amino acid sequence).
  • homology (identity) of an amino acid sequence can be calculated immediately by a known method. Examples of such a method include, but are not limited to, Computational Molecular Biology (Edited by AM Lesk, Oxford University Press 1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Edited by DW Smith, Academic Press 1993); Computer Analysis of Sequence Data (Part 1, AM Griffin and H.G.Griffin ed., Human Press 1994); G. von Heinle, Sequence Analysis in Molecular Biology (Academic Press 1987)); Sequence Analysis Primer (M. Gribskov and J. Devereux ed., M. Stockton Press 1991) And Carill et al., 1998, SIAM J. Applied Math., 48: 1073.
  • a preferred method of determining homology is between the amino acid sequences being tested. Designed to maximize match. Methods for determining homology are described in commercially available computer programs. The preferred computer program method for determining homology between two amino acid sequences is not particularly limited,
  • PACE 4 targeted by the present invention includes, as far as it is described above, an isoform of PACE 4 derived from an animal other than a human (non-human animal).
  • the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 corresponds to the region of amino acid numbers 293 to 300 of human PAC E4 (SEQ ID NO: 3) (also the amino acid number 144 of SCD of human PACE4 (SEQ ID NO: 2)). ⁇ 151 region).
  • the peptide having the peptide consisting of the amino acid sequence as an epitope portion is a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an antigen having a part thereof and capable of producing the monoclonal antibody of the present invention. It is not limited to as long as it has characteristics.
  • a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a carrier protein bound thereto can be mentioned.
  • the carrier protein may be any protein that is not present in humans and other mammals, or any protein that is not identical or similar to proteins that are present in humans and other mammals, and includes those commonly used in the art. Can be widely used. Specific examples include keyhole limpet hemocyanin (KLH), and glutusthione S-transferase (GST) derived from Schistosoma japonic TM (Schistosoma japonicum).
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • GST glutusthione S-transferase
  • the monoclonal antibody of the present invention can be produced, for example, by culturing a clone that produces an antibody that recognizes the peptide or the like as an antigen.
  • Such a clone can be prepared according to a usual cell fusion method. Specifically, a fused eight hybrid is formed between an antibody-producing cell and a myeloma cell, the hybrid is cloned, and then a clone that produces an antibody that recognizes the peptide as an antigen is cloned from among the clones. It can be prepared by selection.
  • the antibody-producing cells used herein include a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 as a peptide, particularly preferably a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a peptide of the amino acid sequence or a carrier protein.
  • a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 as a peptide particularly preferably a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a peptide of the amino acid sequence or a carrier protein.
  • Examples include spleen cells, lymph node cells, and B lymphocytes obtained from an animal immunized using the conjugate as an antigen (immunogen).
  • Preparation of such antibody-producing cells can be performed according to a conventional method.
  • the antigen is emulsified and suspended in complete or incomplete Freund's adjuvant immediately before injection, and the animal is injected subcutaneously or intraperitoneally several times every two to three weeks (preferably three times).
  • Immunize The animal to be immunized is not particularly limited as long as it is a mammal other than a human, and examples thereof include a mouse, a rat, a poma, a goat, a heron, a penis, and a monkey.
  • antibody-producing cells such as splenocytes are collected from the immunized animal.
  • the myeloma cells those derived from mice, rats, pomas, goats, puppies, pelvis, monkeys, and the like are used. It is preferable that the myeloma cells be derived from animals of the same species as the antibody-producing cells.
  • mouse myeloma cells such as P3UI and SP-2 / 0-Agl4 [Nature 277, 131-133 (1979) 3] are used as fusion partners of mouse spleen cells.
  • Cell fusion is carried out, for example, by the method described in Nature 256, 495-497 (1975), or the method of Ueda et al. Described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 5122-5126 (1981), or to this. This is done in a similar manner.
  • the reaction is carried out using 30 to 50% polyethylene glycol (average molecular weight 1000 to 4000) at 30 to 40 ° C for about 1 to 3 minutes. More preferably, the reaction is carried out by using 30 to 50% polyethylene glycol (average molecular weight 4000) at 37 ° C for about 1 to 3 minutes.
  • the hybridoma obtained by cell fusion is cultured in a microplate, for example, and HAT medium (hypoxanthine 100 M, aminopterin 0.4 M, thymidine)
  • HAT medium hyperxanthine 100 M, aminopterin 0.4 M, thymidine
  • the resulting hybridomas are then tested for antigen binding and then subjected to a screening step for a PACE4-specific antibody-producing clone.
  • the antibody titer in the culture supernatant of the well in which proliferation was observed was determined by the EIA (Enzyme Immunoassay) method or ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) method using an antigen peptide as an antigen for screening [Miller , ME, Lancet, 1, 665 (1971)] to identify PACE 4 antibody-producing clones.
  • EIA Enzyme Immunoassay
  • ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
  • accession number F ERM BP-08498 (a pig from FERM P-19048, which was domestically deposited with the Japanese depositary institution on October 1, 2002) is described in detail in Examples. (Transferred to the International Depositary under the East Treaty) Hybrid Mouse (Mouse Hybridoma-PACE4).
  • the monoclonal antibody of the present invention is produced in a body fluid or culture by culturing the thus obtained hybridoma clone in vivo or in vitro in the same manner as ordinary animal cells.
  • the former method can be carried out, for example, by transplanting the above hybridoma clone into the abdominal cavity of a Ba1bZc mouse to which 0.5 ml of pristane has been administered in advance. 7 to 14 days after the transplantation, ascites containing a high concentration of the monoclonal antibody is produced, so that the monoclonal antibody of the present invention can be collected from the ascites.
  • the method for recovering the monoclonal antibody of the present invention from a culture of a hybridoma clone or a body fluid such as ascites is not limited, but any known method for purifying IgG, for example, anion exchanger, hydroxyapatite, Various types of column chromatography using protein A or G immobilized column and protamine immobilized column etc., ammonium sulfate fractionation method, PEG fractionation method, ethanol fractionation method, hypotonic buffer precipitation method, etc. it can. 2003/012712
  • the monoclonal antibody of the present invention can be preferably obtained as IgG.
  • the monoclonal antibody of the present invention is not the whole PACE4, the SCD of PACE4 or the monoclonal antibody obtained using the homo B domain of PACE4 as an antigen, and the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of a part of PACE4 SCD is referred to as an epitope section.
  • the monoclonal antibody of the present invention prepared using the specific peptide fragment present in the SCD of PACE4 as an antigen is a monoclonal antibody prepared using the whole PACE4, the SCD of PACE4 or the homo B domain of PACE4 as an antigen.
  • subtilisin-like protein convertase family with a similar structure and cleavage specificity to PACE4, such as furin, PCI (PC3), PC2, PC4, PC6 (PC5) and Reacts specifically with PACE4 without reacting with PC 8 (PC 7).
  • PACE 4 can be selectively and specifically selected from one of the SPC families (or a composition in which the SPC family is mixed) using an immunoassay. Can be detected. Therefore, the monoclonal antibody of the present invention can be used as an immunological reagent for examining the tissue localization of PACE 4 expression and the degree of its expression, and for detecting and quantifying PACE 4 that may be present in a subject.
  • an immunological reagent for examining the tissue localization of PACE 4 expression and the degree of its expression and for detecting and quantifying PACE 4 that may be present in a subject.
  • a reagent for immunoelectrophoresis or a reagent for immunoassay for example, a reagent for immunoelectrophoresis or a reagent for immunoassay.
  • the monoclonal antibodies targeted by the present invention include not only monoclonal antibodies derived from non-human animals represented by a monoclonal antibody produced by a hybridoma (Mouse Hybridoma-PACE4) having accession number F ERM BP-08498, but also An antibody obtained by modifying the monoclonal antibody using a gene recombination technique or the like, for example, a chimeric antibody is included.
  • a chimeric antibody is preferably a humanized antibody, and such a humanized antibody includes a human-type chimeric antibody and a human-type complementarity determining region (CDR) -grafted antibody.
  • Such a humanized antibody has reduced immunogenicity (antigenicity) to humans, and therefore, the monoclonal antibody of the present invention can be used, for example, in the prevention or treatment of diseases caused by abnormal expression of PACE4. It is an embodiment that is preferably used when applied to humans for any purpose.
  • human CDR-grafted antibodies have lower immunogenicity to humans and are more suitable forms of antibodies (Riechmann, L., et al., Nature 332, 323-327 (1988); Isaacs, JD et al., Lancet 340, 748-752 (1992)).
  • Basic methods for producing these chimeric antibodies are known in the art (for example, refer to WO97 / 0767K, JP-T-2000-515372), and have already been established.
  • CDR complementarity determining region
  • FR framework region
  • Kabat et al. Have collected a large number of primary sequences of the heavy and light chain variable regions, and have created a table that classifies each primary sequence into CDRs and FRs based on sequence conservation (Kabato et al., SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No. 91-3242, E Kabatt et al.).
  • each FR has been classified into a plurality of sub-dups having common amino acid sequences, and it has been found that there is a corresponding framework between human and mouse.
  • a human chimeric antibody is composed of a non-human animal heavy chain (H chain) variable region (V region) (hereinafter referred to as VH) and a light chain (L chain) variable region (V region) (hereinafter referred to as VL). ) And an H chain constant region (C region) of a human antibody (hereinafter referred to as CH) and an L chain C region (hereinafter referred to as CL) of a human antibody (for example, Proc. Natl. Acad. Scl. USA 81, 6851-6855 (1984), etc.).
  • H chain constant region C region
  • CL L chain C region
  • the human chimeric antibody targeted by the present invention is obtained by obtaining cDNAs encoding VH and VL from a hybridoma producing the aforementioned monoclonal antibody having specific binding to PACE4, and obtaining human antibody CH and human antibody It can be produced by inserting a human-type chimeric antibody expression vector by inserting it into an expression vector for animal cells having a gene encoding CL, and expressing the vector by introducing it into animal cells.
  • the human CDR-grafted antibody means an antibody obtained by replacing the CDRs of VH and VL of a non-human animal antibody with the CDR sequence of an antibody of a non-human animal, respectively.
  • the human CDR-grafted antibody targeted by the present invention includes VH and VL of any human antibody with CDR sequences of VH and VL of a monoclonal antibody derived from a non-human animal having specific binding to PACE4.
  • CDNAs encoding the V regions in which the CDR sequences of each of the above have been replaced are inserted into human cell expression vectors having genes encoding the human antibody CH and human antibody CL, respectively.
  • the antibody can be produced by constructing an antibody expression vector, introducing it into animal cells, and expressing it. To prepare a human CDR-grafted antibody, it is necessary to design the amino acid sequence of the variable region so that the entire CDR sequence of the antibody of the non-human animal and a part of the amino acid residues of the FR sequence are transplanted into the human antibody. There is.
  • This design can be performed according to the following method.
  • an antibody derived from a non-human mammal having a CDR to be transplanted is defined as “donor”, and a human antibody to which a CDR is transplanted is defined as “acceptor”.
  • donor an antibody derived from a non-human mammal having a CDR to be transplanted
  • acceptor a human antibody to which a CDR is transplanted
  • FR is selected from a primary sequence library of human antibodies.
  • selection methods enable the amino acid identity of the FR portion to be at least 70% or higher between Donna and Axep.
  • HAMA response human anti-mouse antibody response
  • the human antibody portion of the human chimeric antibody and human CDR-grafted antibody of the present invention comprises: It may belong to the immunoglobulin (Ig) class, but the IgG type is preferred. Any of the C regions of immunoglobulin such as IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 belonging to the IgG type can be used.
  • II. Reagent kit for detecting PACE4 and method for specific detection of PACE4 using the same The monoclonal antibody of the present invention is used for detecting and measuring PACE4 using immunoelectrophoresis or immunoassay. It can be used effectively as a specific binding reagent for 4 or a specific detection reagent (immunological reagent).
  • immunoassay examples include a direct or indirect competitive assay or a non-competitive assay (for example, a sandwich method).
  • immunoelectrophoresis or immunoassay includes Western blotting, immunofluorescence, immunoenzymatic immunoassay (ELISA), radiolabeled immunoassay (RIA), immunohistochemistry, immunocytochemistry, etc.
  • ELISA immunoenzymatic immunoassay
  • RIA radiolabeled immunoassay
  • immunohistochemistry immunocytochemistry
  • immunocytochemistry etc.
  • Immunohistochemical staining method ABSC method, CSA method, etc.
  • immunoprecipitation method etc.
  • the present invention provides a reagent kit for specifically detecting or measuring PACE4 using immunoelectrophoresis or immunoassay.
  • the present invention is a reagent kit for detecting and measuring the presence or amount of PACE4 in a test sample by utilizing an antigen-antibody reaction, wherein the above-described monoclonal antibody of the present invention is used for PACE4. It is characterized in that it is contained as a specific binding reagent component or a specific detection reagent component. Further, instead of the monoclonal antibody of the present invention, a partial fragment thereof having specific binding to PACE 4 (hereinafter, also simply referred to as “antibody fragment”) can be used.
  • antibody fragments include Fab (fragment of antigen binding), F (ab) Fab 'having a specific binding property to PACE4, single chain antibody (single chain Fv; hereinafter, referred to as scFv), dimerization Body V region fragments (hereinafter, referred to as Diabody), disulfide stabilized Fv (hereinafter, referred to as dsFv), peptides including CDR, and the like.
  • Fab consists of two disulfides bridging two heavy chains in the hinge region of IgG. TJP2003 / 012712
  • the Fab used in the present invention can be obtained by treating the above monoclonal antibody of the present invention with papain.
  • Fabs can also be produced by inserting the DNA encoding the Fab of the monoclonal antibody of the present invention into an expression vector for animal cells, and expressing the vector by introducing the vector into animal cells. be able to.
  • F (ab ') 2 is obtained by degrading the lower part of the two SS bonds in the hinge region of IgG with the enzyme trypsin. It is an antibody fragment having 10,000 antigen-binding activities.
  • F (ab ') 2 used in the present invention can be obtained by trypsinizing the above monoclonal antibody of the present invention.
  • F (ab ') 2 encoding the monoclonal antibody can be introduced into an expression vector for animal cells, and the vector can be expressed by introducing the vector into animal cells.
  • ab ') 2 can be manufactured.
  • Fab ′ is an antibody fragment having a molecular weight of about 50,000 and having an antigen-binding activity in which the SS bond between the hinges of F (ab ′) 2 is cleaved.
  • Fal) ′ used in the present invention can be obtained by treating the above-mentioned monoclonal antibody of the present invention with a reducing agent dithiothreitol.
  • Fab ′ can also be produced by inserting a DNA encoding Fab ′ of the monoclonal antibody into an expression vector for animal cells, and expressing the vector by introducing the vector into animal cells.
  • scFv is a VH-P-VL or VL-P-VH polypeptide in which one VH and one VL are linked using an appropriate peptide linker (hereinafter referred to as P), and has an antigenic activity.
  • P an appropriate peptide linker
  • Is an antibody fragment having The VH and VL contained in the scFv used in the present invention may be those of the above-described monoclonal antibody of the present invention.
  • the scFv used in the present invention is obtained by obtaining cDNAs encoding VH and VL from a hybridoma producing the monoclonal antibody of the present invention, constructing an scFv expression vector, and introducing it into E. coli, yeast, or animal cells. By doing so, it can be expressed and produced.
  • the amino acid residue to be substituted for the cysteine residue can be selected based on the prediction of the three-dimensional structure of the antibody according to the method shown by Reiter et al. (Protein Engineering, 7, 697 (1994)).
  • VH or VL contained in the ds Fv used in the present invention may be those of the monoclonal antibody of the present invention.
  • the dsFv used in the present invention is obtained by obtaining cDNAs encoding VH and VL from a hybridoma producing the monoclonal antibody of the present invention, inserting the DNA into an appropriate expression vector, and inserting the dsFv expression vector into the dsFv expression vector.
  • the expression vector can be produced by introducing the expression vector into E. coli, yeast, or animal cells and expressing it.
  • Diabody is an antibody fragment that forms a dimer of scFvs with the same or different antigen-binding specificities.An antibody fragment that has a bivalent antigen-binding activity for the same antigen or a bispecific antigen-binding activity for a different antigen It is.
  • the diabody of the present invention is, for example, a bivalent diabody which specifically reacts with the monoclonal antibody of the present invention, obtains cDNA encoding VH and VL of the monoclonal antibody of the present invention, and A DNA encoding a sc Fv having a 10-residue polypeptide linker is constructed, the DNA is inserted into an expression vector for animal cells, and the expression vector is introduced into animal cells to express Diabody. Thus, it can be manufactured.
  • the peptide containing CDR is composed of at least one region of CDR of VH or VL. Multiple CDRs can be linked directly or via a suitable peptide linker.
  • the peptide containing the CDR used in the present invention is obtained by obtaining cDNA encoding VH and VL of the monoclonal antibody of the present invention, constructing a DNA encoding the CDR, and transforming the DNA into animal cells. By introducing the vector into an expression vector for expression and introducing the vector into animal cells for expression. Further, the peptide containing CDR can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (tributyloxycarponyl method).
  • the monoclonal antibody of the present invention or the various antibody fragments described above can be used as it is as a reagent for immunoassay, or can be used in the form of being bound to a solid support.
  • the solid to which these monoclonal antibodies and antibody fragments bind those well known in the art can be used arbitrarily, for example, glass, polystyrene, polypropylene, polyethylene, dextran, nylon, amylase, natural Z-modified cellulose, polyacrylamide, agar and magnesite. Can be mentioned.
  • These solid supports include reaction tray wells, test tubes, polystyrene beads, magnetic beads, nitrocellulose strips, membranes, latex particles, and the like.
  • a method for binding a monoclonal antibody or the like to these solid supports is also known, and the present invention can also be applied to the known method.
  • the monoclonal antibodies and fragments thereof of the present invention may be used as such as immunological reagents for immunoelectrophoresis and immunoassay, or may be used in the form of a labeled product labeled with any labeling agent. You can also.
  • Labeling agents that can be used in the present invention include enzymes known in the art as binding labeling agents to monoclonal antibodies (eg, alkaline phosphatase (ALP), peroxidase (HRP), etc.), radioisotopes (eg, , 125 1, 3 H, l4 C , etc.), fluorescent compounds (e.g., full-O receptacle I Ni Sochi oscillation Aneto (FITC), Te Bok Ramechiru port one da Min I Seo thio Xia Ne Ichito (RITC), etc.), chemiluminescence Compounds, bioluminescent compounds, and IN- (2,2,6,6-tetramethyl-1-oxyl-4-piperidyl) -5N- (aspartate) -1,2,4-dinitrobenzene (TO PA) Can be.
  • ALP alkaline phosphatase
  • HRP peroxidase
  • radioisotopes eg, , 125 1, 3 H
  • the immunoassays using these as labeling agents are described in Enzyme Immunoassay (EIA), Enzyme Immunometric Assay (ELISA), Radioimnoassay (R1), and Fluorescent Immunoassay. , Luminous Imnoassay, spin Imnoassy, etc. Preferred are enzymes, fluorescent compounds, and chemiluminescent compounds.
  • the method of labeling with these labeling agents, the method of indirect modification with labeling, and the method of detecting them can be performed according to a method known per se (“Monoclonal Antibody” by Tatsuo Iwasaki et al.). , Kodansha Sientifik, 1984; Enzyme Immunoassay, 2nd Edition, Eiji Ishikawa et al., Medical Shoin, 1982, etc.).
  • the reagent kit of the present invention contains the above-mentioned monoclonal antibody of the present invention, its antibody fragment or its labeled substance, an appropriate reaction solution depending on its use such as immunoelectrophoresis or immunoassay. Diluent, washing solution, transfer solution, electrophoresis solution, reaction stop solution, anti PC leak 003/012712
  • a body detection reagent, a labeling activity measuring reagent, a staining solution, a reaction plate, a nitrocell orifice, a polyacrylamide gel, or the like may be included.
  • the antibody detection reagent include a secondary antibody that binds to the monoclonal antibody of the present invention, such as an anti-IgG antibody or protein A labeled with a radioactive substance or an enzyme. .
  • PAC4 By using the above-mentioned reagent kit containing the monoclonal antibody, antibody fragment or a labeled product thereof of the present invention as a binding or detection reagent, PAC4 can be specifically and specifically obtained according to general immunoelectrophoresis and immunoassay. It is easy to detect and measure.
  • the present invention also provides a method for the specific detection of PAC using the monoclonal antibody, the antibody fragment or the label thereof of the present invention as a specific binding reagent or a specific detection reagent for PAC4.
  • the detection method of the present invention essentially requires the use of the monoclonal fold, the antibody fragment or the label thereof of the present invention as a specific binding reagent or a specific detection reagent for PACE4.
  • other basic operations and the like are not particularly limited, and a commonly used method in an ordinary immunoelectrophoresis or immunoassay can be widely used. Therefore, the antigen-antibody reaction using the monoclonal antibody or the like of the present invention, and the reaction conditions between the resulting antigen-antibody conjugate and the antibody detection reagent are not particularly limited, and the conditions in a normal immune reaction are employed. Usually, under a temperature condition of 45 ° C.
  • the method may be a method in which the mixture is left for about 40 hours, preferably about 1 to 20 hours, or is incubated.
  • the PACE4 detection method using the above-described reagent kit containing the antibody can be used for a test sample (eg, blood, urine, bone marrow, B PACE 4) and the specific detection of PAC E4 in various tissues, the distribution measurement of PACE 4 expressing tissues, and the purification of PAC E 4 using affinity.
  • a test sample eg, blood, urine, bone marrow, B PACE 4
  • 4 Useful for immunochemical and immunohistological diagnosis of various diseases with abnormal expression (or caused by abnormal PACE 4 expression). It has been reported that mice lacking PACE4 exhibit hypoplasia of the forehead and monocular disease and die in the form of embryos (Cost am, DB, et al, Genes. Dev. 14, 1146-1155 ( Image)).
  • the PACE4 gene has also been found to be a target gene for the j3 HL-LH transcription factor hASH-1 that is essential for neurogenesis (Biochemical J. Vol. 360, pp. 683-689, 2001).
  • the PACE4 gene is a cartilage differentiation factor and plays an important role in bone differentiation and eye formation via activation of chondromodulin, which has angiogenesis inhibitory action (see No. 74th Annual Meeting of the Biochemical Society of Japan (October 2001); Biochemistry, 73, 8, 779, (2001)).
  • PACE 4 is responsible for controlling the proliferation and differentiation of nerve cells and bone cells, and its abnormal expression (enhancement or reduction) is caused by, for example, neurodegenerative diseases, endochondroma, and chondrodysplasia. It is thought to be related to the onset of the disease.
  • diseases associated with the abnormal expression (up-regulation, deficiency / decrease) of PACE 4 described above include, for example, neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease and Huntington's disease, cartilage hyperplasia, and cartilage dysplasia. And bone diseases such as endochondroma and osteoarthritis, and cancer diseases such as skin cancer, breast cancer, adenocarcinoma, squamous cancer and neuroblastoma. III. PACE 4 binding agent and its use
  • the monoclonal antibody of the present invention does not react with furin, PC1, PC2, PC4, PC6 and PC8 among subtilisin-like protein convertases (SPCs), and specifically recognizes PACE4. And combine.
  • the antibody fragment targeted by the present invention also has its binding specificity. Therefore, the monoclonal antibody and the antibody fragment thereof of the present invention are effective as a specific binding agent (binding preparation) for PAC E4 and as an active ingredient thereof, not only in Yi tro, but also in vivo and ex vivo. Can be used for
  • the binding agent in vivo and ex vivo is useful for prevention or treatment of various diseases caused by abnormal expression (up-regulation, dysregulation / reduction) of PACE4.
  • the monoclonal antibody and the antibody fragment thereof of the present invention can be produced by any method known in the technical field of pharmaceutics, alone or together with a pharmaceutically acceptable carrier or additive, so that the antibody can be administered to a human or non-human animal. It is provided as a finished pharmaceutical preparation.
  • the administration route may be any route suitable for treatment, such as oral administration, oral administration (oral (sublingual), intratracheal), rectal, subcutaneous, intradermal, muscle, intraperitoneal, intravenous, etc. And parenteral administration.
  • the parenteral administration route such as intravenous
  • the parenteral administration route such as intravenous
  • the administration form include tablets, capsules, powders, granules, syrups, sprays, emulsions, suppositories, injections, patches, creams, ointments and the like, depending on the above administration route.
  • preparation forms include pharmaceutical agents such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, flavoring agents, solubilizing agents, suspending agents, and coating agents. It can be prepared using commonly used carriers and auxiliaries.
  • the dose and frequency of administration to humans or non-human animals vary depending on the type, severity, administration method, age, body weight, etc. of the disease to be prevented or treated, and can be appropriately set in consideration of these.
  • the present invention provides a method for screening a substance (candidate substance) that is effective for treating a disease caused by abnormal expression of PACE4 or accompanied by abnormal expression of PACE4.
  • the screening method of the present invention comprises the following steps (a), (b) and (c): (a) contacting a test substance with a cell capable of expressing PACE4;
  • Examples of cells used for such screening include cells having the gene of PACE 4 or its isoform, irrespective of biological species such as humans and other mammals (for example, mice and rats). be able to. Specifically, human embryonic kidney-derived HEK293 cells, human fetal liver cancer-derived HepG2 cells, human neuroblastoma cultured cells, human giant sphere-derived Dami cells, monkey kidney-derived Cos-1 cells, rat pituitary-derived GH4C1 cells And cells capable of expressing PACE 4Z isoform such as mouse pituitary-derived AtT_20 cells.
  • test sample can be brought into contact with the above-mentioned cells or an aggregate (tissue) thereof.
  • test samples include, but are not limited to, cell extracts, expression products of gene libraries, synthetic low molecular weight compounds, synthetic peptides, natural compounds, and the like.
  • the conditions under which the test substance is brought into contact with the cells are not particularly limited. However, it is preferable to select culture conditions (temperature, pH, and ⁇ earth composition) that do not kill the cells and can express PACE4. preferable.
  • the screening method of the present invention which searches for a substance that suppresses PACE4 expression and reduces Z, is a disease that occurs in association with abnormal expression (up-regulation) of PACE4, such as the abnormal expression of PACE4 (described above).
  • Diseases that occur in association with increased expression, underexpression / decreased expression include, for example, neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease and Huntington's disease, cartilage hyperplasia, cartilage dysplasia, endochondroma and osteoarthritis. It can be effectively used to obtain a candidate substance as an active ingredient of a drug for preventing or ameliorating bone diseases such as skin cancer, breast cancer, adenocarcinoma, squamous cancer, and neuroblastoma.
  • the screening of such candidate substances can be specifically performed as follows. That is, when a cell expressing PACE4 is used, when the test substance is brought into contact with the cell, the PACE4 of the cell contacted with the test substance is measured. The expression level is lower than the PACE4 expression level of control cells not contacted with the test substance. If cells that require an expression inducer for PACE4 expression are used, use the expression inducer.
  • the test substance can be selected as a candidate substance when the expression of PACE4 in the cells contacted with the test substance in step is lower than the expression of PACE4 in control cells not contacted with the test substance in the presence of the expression inducing substance. it can.
  • the screening method of the present invention which searches for a substance that suppresses the expression of PACE4 and that reduces Z, is an active ingredient of a drug for preventing or ameliorating a disease that occurs in connection with abnormal expression (increased expression) of PACE4 such as skin cancer. Can be effectively used to obtain candidate substances.
  • screening for a candidate substance as an active ingredient of a preventive or ameliorating drug for a disease caused by insufficient or reduced expression of PACE4 can be performed as follows. That is, when cells expressing PACE 4 are used, when the test substance is brought into contact with the cells, the expression level of PACE 4 in the cells contacted with the test substance does not bring the test substance into contact. If the expression level is higher than the expression level of PACE 4 in control cells, or if cells that require an expression inducer for PAC E4 expression are used, the test substance was contacted in the presence of the expression inducer. The test substance can be selected as a candidate substance when the expression of PACE 4 in the cells is higher than the expression of PACE 4 in control cells not contacted with the test substance in the presence of the expression inducer.
  • the measurement of the expression level of PACE4 in such a screening method of the present invention can be performed using the monoclonal antibody of the present invention or a labeled product thereof as a detection reagent. Specifically, the amount of PAC E4 (protein) in the cell fraction of the cells, preferably in the cell extract, is detected and quantified using the monoclonal antibody of the present invention, its antibody fragment or a labeled product thereof. Methods can be mentioned.
  • Substances selected and obtained from the test substances in this way include diseases associated with abnormal expression of PACE4 (upregulated expression, decreased expression Z), such as Parkinson's disease and Huntington's, which are associated with excessive abnormalities of PACE4.
  • Neurodegenerative diseases such as diseases, cartilage hyperplasia, cartilage dysplasia, bone diseases such as endochondroma and osteoarthritis, and skin It is a promising candidate for a drug that prevents, alleviates, and suppresses (improves, treats) cancer diseases such as cancer, breast cancer, adenocarcinoma, squamous cancer, and neuroblastoma.
  • the candidate substances selected by the above-described screening method of the present invention are further subjected to a drug efficacy test, a safety test, and a clinical test using a disease model animal, whereby a more practical preventive or therapeutic drug is obtained. Can be obtained.
  • the substances selected in this manner can be industrially produced by chemical synthesis, biological synthesis (enzyme) or genetic manipulation based on the results of the structural analysis.
  • the monoclonal antibody of the present invention specifically recognizes and reacts with subtilisin-like protein convertase. PACE4, it is useful for specific detection and specific binding of the PACE4.
  • the monoclonal antibody (PACE4 detection reagent containing the same) of the present invention and the specific detection of PACE4 using the same it is possible to immunochemically examine the expression distribution of PACE4 in living organisms. It is possible to elucidate the physiological action and significance of PACE 4 in more detail.
  • the monoclonal antibody of the present invention (a PACE detection reagent containing the same) and a specific detection method of PACE 4 using the same are useful for various abnormalities associated with abnormal expression of PACE 4 (upregulated expression, deficient expression / decreased expression).
  • diseases include, for example, neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease and Huntington's disease, cartilage hyperplasia, cartilage dysplasia, bone diseases such as endochondroma and osteoarthritis, skin cancer, breast cancer, gland Cancer diseases such as cancer, squamous cancer and neuroblastoma can be mentioned.
  • the monoclonal antibody of the present invention is a humanized antibody having specific binding to PACE4, particularly a human chimeric antibody and a human CDR graft. It can be suitably used for preparing antibodies.
  • Such human chimeric antibodies and human CDR-grafted antibodies can be used for the prevention or treatment of various diseases caused by abnormal expression of PACE4.
  • a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 [amino acid sequence of GI RPNY ID: PAC E4 (SEQ ID NO: 3) at positions 293 to 300] was synthesized by a solid phase method, and then this was cross-linked to hemosyanin.
  • an antigen peptide was prepared.
  • Hemocyanin was treated with N-eihylraaleimide in advance to block the SH group of hemosyanin, and then used for a cross-linking reaction with the peptide.
  • the cross-linking reaction was carried out using GMBS [N- (4-Maleimidobotyryloxy) succininiide], which is commercially available from Dojin Chemical Research Institute, according to the manual.
  • An aqueous solution of the antigenic peptide prepared in (1) (dissolved in 2 ml PBS, equivalent to 0.275 mg of the purified peptide) was mixed with an equal amount of Freund's complete adjuvant, and the mixture was used with an 8-week-old BALB / c mouse female (Japan). Three animals were immunized. Specifically, an amount equivalent to 91.7 g of the purified peptide per mouse was administered intraperitoneally as a 0.656 ml solution. 25 days after the first immunization, an antigen peptide solution (equivalent to purified peptide 86) mixed with an equal amount of Freund's incomplete adjuvant was boosted intraperitoneally.
  • 0.2 ml of the antigen peptide solution (corresponding to 50 g of purified peptide) was injected into the tail vein of the mouse to obtain the final immunization.
  • the spleen of the mouse was removed, homogenized in 5 ml of growth medium (DMEM without fetal serum and antibiotics), and then splenocytes were separated and obtained by centrifugation.
  • the thus obtained spleen cells are mixed with myeoma cells (ATCC code; CRL-1581 (cell name: Sp2 / 0-Agl4)) so that the cell number becomes 10: 1, and a cell suspension is obtained.
  • the cells obtained by centrifugation were suspended in 1 ml of DMEM (PEG4000 solution) containing 50% (w /) of polyethylenedaricol (PEG), and the PEG concentration was gradually diluted with 10 ml of DMEM medium.
  • the cells were separated with a centrifuge at 5%.
  • the cells were suspended in 45 ml of HT medium (SxlO ⁇ l) and seeded at a rate of 0.1 ml / well on five 96-well plates.
  • the above-mentioned hybridoma culture supernatant was subjected to enzyme-linked immunoassay (EIA method) using the above antigen peptide (GIRPNYID), and a PACE4 antibody-producing positive clone was screened.
  • EIA method enzyme-linked immunoassay
  • the above antigen peptide solution (GI RPNY ID) (lO ⁇ g / ml) was added to each well of a 96-well EIA microtiter plate at 50 ° C, and left at 37 ° C for 1B. .
  • 300% 1% serum albumin (dissolved in PBS, Sigma) was added thereto at 300 ° C., and reacted at room temperature.
  • each well was washed three times with PBS3001.
  • the culture supernatant of the cloned hybridoma cells was added in an amount of 50 1 each, and reacted at room temperature for 1 hour.
  • PACE 4 antibody-producing clones thus identified (positive clones) were then subjected to Western blotting using human PACE 4 expressed in yeast [ ⁇ 680, the region of amino acid number 64-679 (propeptide, PACE4) comprising the amino acid sequence of a subtilisin catalytic region and a homozygous region) and human PACE4 expressed in human embryonic kidney-derived HEK293 cells.
  • this fragment was incorporated into yeast expression vector PHILS-1 (manufactured by Invitrogen) digested with Xhol and BamHI, and transformed into E. coli. After selecting a clone containing pHILS-1, the plasmid was purified from the cultured clone by alkaline SDS.
  • Yeast was cultured for 30 hours in YPD medium (1% yeast extract, 2% pepton, 2% (Glucose), 0.7 ml of the culture was centrifuged, the precipitate obtained was suspended in water, and the centrifuged precipitate was mixed with Sail-linearized proPACE4A680 / pHILS-1 plasmid, and the PLATE solution ( The mixture was mixed with 40% polyethyleneglycol, 0.1 M LiCl, lOmM Tris-HCl, pH7.5, ImMEDTA) and reacted at room temperature for 10 hours.After the reaction, RD medium (1 M glucitol, 1% dextrose, 1.34% YNB, 4xl0 " 5 Biotin, 0.005% amino acids) was inoculated and reacted at 30 ° (:, 13 days).
  • YPD medium 1% yeast extract, 2% pepton, 2% (Glucose)
  • the mixture was mixed with 40% polyethyleneglycol, 0.1 M LiCl,
  • the resulting yeast MGY medium (1.34% YNB, 1% glycerol , 4x10- 5% biotin) and cultivated in, after Cimicifuga with Zymolyase, after lysis with SDS, and reaction with 5 M potassium acetate. After the supernatant obtained after centrifugation was precipitated with isopropanol, genomic DNA was separated by RNase treatment, phenol extraction, chloroform extraction, and ethanol precipitation. Yeast clones containing the proPACE AGSO / HILS-1 plasmid were screened by PCR to obtain the desired yeast clones.
  • Yeast transformed, BMGY medium and cultured with shaking at (1% yeast extract, 2% pepton, 0.1M potassium phosphate, pH6.0, 1.34% YNB, 4xl0- 5% biolin, 1% glycerol) at 30 ° C, Add this to BMMY medium (1% yeast extract, 2% pepton, 0.1M potassium phosphate, pH 6.0, 1.34% YNB, 4xl0 " 5 % biotin, 1 ⁇ methanol) so that the turbidity becomes 1, and add 30 °
  • the cells were cultured for 48 hours in C. The cells were collected by centrifugation, solubilized with SDS-PAGE sample solution, and used as a sample for ⁇ ⁇ ⁇ estamplot ..
  • Yeast recombinant human PACE 4 was identified as a protein with a molecular weight of 780 kDa.
  • Human PACE4 cDNA was cloned from a human placenta cDNA library (Mori, K., et al., J. Biochem. 121, 941-948 (1997)). The full-length human PACE4c DNA was digested with Sail and cloned into ALTERMAX (promega). The expression vector was transfected into human embryonic kidney-derived cultured cells (HEK293) using FuGene (Roche) according to the manufacturer's protocol.
  • the culture solution was replaced with Opii-MEM (manufactured by Gibco Life Science), and the reaction was further performed for 24 hours. After centrifugation, the culture was concentrated by ultrafiltration to obtain a sample for Western plot. The expression level of PACE4 was confirmed by Western blotting using anti-SCD antibody and anti-PACE4HomoB antibody.
  • Tris-HCl, H7.5, dissolved in 0.15 M NaCl Tris-HCl, H7.5, dissolved in 0.15 M NaCl. Then, it was washed with TTBS ( ⁇ Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M NaCI, 0.05% Tween 20).
  • the nitrocellulose membrane thus prepared was allowed to react with the hybridoma culture supernatant identified in (3-1) at room temperature for 15 hours, followed by TTBS (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M NaCI, 0.05% Tween20).
  • TTBS 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M NaCI, 0.05% Tween20.
  • the obtained nitrocellulose membrane was washed with TBS and TTBS, and chemically colored using a Pierce Super Signal Coloring Kit (manufactured by Pierce), and the PACE 4 antibody-producing clone cloned by the EIA method in (3-2) above was obtained. The production of antibodies against PACE 4 was confirmed.
  • PC2 and? C4 has not been tested because its amino acid sequence and its localization in tissue expression do not suggest reactivity with the PAC4 antibody-producing clone.
  • the amino acid sequences of PC 2 and PC 4 corresponding to the epitope region (GI RPNYID) used as the antigen peptide in the preparation of the monoclonal antibody of the present invention are “SHMPQL ID” and “ (2) PC2 is expressed only in endocrine cells such as kidney islets of Langerhans, PC4 is expressed only in testis, and PACE4 is expressed in SLQPQHIH. The reason is that the cells can be clearly distinguished from the cells to be treated.
  • the immunoprecipitation method was specifically performed according to the following procedure.
  • the expression vectors for furin, PC1, PC6A, PC6B and PC8 are described in Example 1 (3) (3-2) (ii) in the section entitled ⁇ Preparation of human PACE 4 expression vector for mammalian cell expression ''. It can be prepared according to the method described.
  • expression vectors for furin, PC1, PC6A and PC6B Trancatedmouse furin (deleting the C-terminal membrane-binding region) provided by Dr. Kazuhisa Nakayama (University of Tsukuba)
  • PCI expression vectors PCl / pCMV
  • mousePC6A and PC6B expression vectors PC6A / pRcCMV, PC6B / pRcCMV
  • PC8 was prepared by incorporating PC8 cDNA provided by Dr. T ⁇ Martin (University of Melbourne, Australia) into pALTERMAX (Promega).
  • each prepared enzyme expression vector was transfected into HEK293 cells (obtained from ATCC) using FuGene (Roche).
  • the cell extract (c) and the culture supernatant (m) were collected from the culture solution, and each of them was collected with 4X immunoprecipitation buffer (1.6MKC1, 4M TritonX-100, 0.4M Tris-HCl, H7.5, 2.5 mM EDTA, 5 mg / ml protease inhibitor, leupeptin, E-64, pepstatin, cymostatin) was added to one-third of the culture volume, and the PACE4 antibody-producing clone obtained above was added thereto, and reacted overnight at 4t :.
  • 4X immunoprecipitation buffer 1.6MKC1, 4M TritonX-100, 0.4M Tris-HCl, H7.5, 2.5 mM EDTA, 5 mg / ml protease inhibitor, leupeptin, E-64, pepstatin, cymostatin
  • the prepared gel was exposed to X-ray film (several days at -80 ° C) and developed.
  • Fig. 8 As shown in Fig. 8 (A), when anti-SCD antibody (anti-SCD) was used as an antibody in the comparative test, all cells expressing PC1, PC6A, and PACE4 (all secreted enzymes) Reacts with anti-SCD for both cell extract (c) and culture supernatant The band was confirmed. In addition, a band reacting with the anti-SCD antibody (anti-SCD) was confirmed in the cell extract (c) of all the cells expressing furin, PC6B, and PC8 (all of which are membrane-bound enzymes) ( In PC6B, a slightly solubilized sheddinng form was detected in the culture supernatant (m)).
  • the band with a molecular weight of about 68 kDa is found in all cell extracts (c), including Mock (an empty expression vector into which no foreign gene is inserted), and is a non-specific band derived from the cell extract. It was determined that there was.
  • the antibody (anti-SCD antibody (anti-SCD)) prepared using the catalytic region (SCD) of PACE4 as an antigen reacts with all SPC families and becomes specific for PAC E4. Not confirmed.
  • Antibodies (anti-HomoB antibodies) prepared using a homo B domain located on the C-terminal side of the catalytic region (S CD) of PACE4 as an antigen are not limited to PACE 4 (PACE4-II, PACE4-I), It also reacted with the SPC family (furin, PC1, PC2, PC6A, PC6B, and PC8) and was found to be nonspecific for PACE 4 (Figure 9).
  • the immunoprecipitation reaction using the culture supernatant (m) of the hybridoma clones (ID-1 and ID-6) as an antibody gave a non-specificity of 68 kDa.
  • the only bands detected other than the band were PACE 4 expressing cells (cell extract (c) 110 kDa, culture supernatant (m) 103 kDa).
  • these bands were consistent with the PACE 4 band obtained for the anti-SCD antibody (anti-SCD) from the molecular weight. From these results, it was confirmed that the above hybridomas (1D-1, ID-6) produced highly specific monoclonal antibodies that bind only to PACE4 among SPC families.
  • the monoclonal antibody specifically binds to PAC in both denatured and undenatured SDS states. This shows that the antibody reacts.
  • the hybridoma (1-D-1) obtained above was named "Mouse Hybridoma-PACE4" and, as of October 1, 2002, 1-chome, Tsukuba-Higashi, Ibaraki, Japan No. 1
  • the microorganism is displayed on the Patent Organism Depositary, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, which has an address at Chuo No. 6: (Display for identification attached by the depositor) Mou se Hy bri doma—PACE4, ( Accession number) FERM P— Deposited in Japan as 19048. Then, on September 29, 2003, it was transferred to an international deposit under the Bush Treaty, and was deposited as (accession number) FERM BP-08498.
  • a DMEM containing 4.5 g / L glucose, 10% fetal serum and 10% fetal serum, and antibiotics penicillin G100,000 monostreptomycin sulfate 0.1 g / L, gentamicin 10 mg / L, anteforin B 0.2 mg / L
  • antibiotics penicillin G100,000 monostreptomycin sulfate 0.1 g / L, gentamicin 10 mg / L, anteforin B 0.2 mg / L
  • the cells were cultured in a medium (Sigma). After reaching Konfuruento, cells were washed twice centrifugation with PBS, and cell density of 2 ⁇ 3xl0 6 Zml in DMEM medium (Sigma) containing ⁇ shea fetal serum free 4.5 g / L glucose and antibiotics After confirming that the survival rate was 10% or less, the culture supernatant was collected.
  • the mixture was concentrated by filtration with ammonium sulfate and fractionation with ammonium sulfate.
  • the concentrated culture solution was dialyzed against PBS, applied to Protein G-Sepharose column (Aiersham-Pharmacia), washed with 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0, and then eluted with 0.1 M Glycine-HC1, pH 2.7. .
  • the monoclonal antibody of the present invention specifically recognizes and reacts with subtilisin-like protein convertase 'PACE4, it is useful for specific detection and specific binding of the PACE4.
  • an antibody fragment thereof, or a label thereof the expression distribution of PACE 4 in a living tissue can be examined immunochemically. It is possible to elucidate the physiological effects and significance in more detail.
  • the method for specific detection of PACE4 using the monoclonal antibody of the present invention, its antibody fragment, or a labeled product thereof is associated with abnormal expression of PACE4 (increased expression, decreased expression Z). It is useful for immunological and immunohistological diagnosis of various diseases.
  • Monoclonal antibodies of the present invention particularly mice specifically described in the Examples below
  • the derived monoclonal antibody can be suitably used for the preparation of a humanized antibody having specific binding to PACE4, in particular, a human chimeric antibody / human CDR-grafted antibody.
  • Strong human chimeric antibodies and human CDR-grafted antibodies can be used for the prevention or treatment of various diseases caused by abnormal expression of PACE4.

Abstract

ズブチリシン様プロプロテインコンベルターゼファミリーに属するＰＡＣＥ４を特異的に認識する抗体を提供する。また、当該抗体の用途、例えばそれが有するＰＡＣＥ４に対する特異的結合性を利用した免疫学的試薬、及び免疫学的検出法を提供する。当該抗体は、配列番号１のアミノ酸配列をエピトープ部として有するペプチドに対するモノクローナル抗体であって、ズブチリシン様プロプロテインコンベルターゼのうち、ＰＡＣＥ４と反応し、フリン、ＰＣ１、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＣ６及びＰＣ８とは反応しないことを特徴とするモノクローナル抗体である。

Description

ズブチリシン様プロプロティンコンベルターゼ · P AC E 4に対する
モノクローナル抗体及びその利用
技術分野
本発明はトランスフォーミング増殖因子- j8 (TGF-/3) 関連ファミリーに 属する因子のプロセシングに関与するズブチリシン様プロプロティンコンベルタ 明
ーゼ' PACE4に特異的に結合するモノクローナル抗体に関する。 さらに本発 細 1
明は、 当該モノクローナル抗体の用途に関する。
書 背景技術
多細胞生物において細胞の分化、 '増殖は、 非常に多くの成長及び分化因子の巧 妙な作用によって調節されている。 これらの成長及び分化因子群の発生時期や、 それらの細胞特異的な発現調節機構及び活性化機構の解明は、 生命発生の仕組み を明らかにするだけでなく、 これらの因子の発現異常に起因して生じる各種の疾 患の治療法を確立し、 またその治療薬を開発するためにも重要である。 .
こうした分化因子群のなかでも、 TGF^一関連ファミリーに属する因子は多 様な細胞分化を制御しており、 特に神経分化、 筋肉分化または骨分化の異常に伴 う多くの疾患の治療薬としても有望視されている。 図 1に示すように、 これらの 分ィ匕因子は不活性な前駆体 (prepro-TGF-j8, pro - TGF- ]3) として合成され た後、 pro- TGF- )9のプロペプチド領域が塩基性アミノ酸対 (Arg-Arg [R-R]、 または Lys- Arg [K- R]など） を認識するプロテアーゼによって切断 （プロセッシ ング） されて、 生理活性を有する成熟体に変換される。
現在、 ヒトに関しては、 このプロセシングを行うプロテア一ゼ （プロセシング プロテア一ゼ） として、 7種類のもの〔PACE4、 フリン、 PC1(PC3とも言われる）、 PC2、 PC4, PC6 (PC5とも言われる）及び PCSffC?とも言われる）〕 が同定されてい る。 これらはいずれもバクテリアのプロテア一ゼであるズプチリシンと構造類似 した触媒領域 （ズプチリシン様触媒領域） を有する C a依存性セリンプロテア一 ゼであり、 ズブチリシン様プロプロテインコンペルターゼ （略称して 「SPC」 と称される）と総称されている〔松田、辻ら、 「蛋白質核酸酵素」 Vol.42， No.14, 2355-2361, (1997)〕。
上記 7種のズブチリシン様プロプロテインコンペルターゼ （以下、 これらを総 称して 「S PCファミリー」 ともいう） は、 図 2に示すように、 シグナルべプチ ド （SP)、 プロペプチド （Pro)、 ズブチリシン様触媒領域（SCD)、 及びホモ Bドメ イン（HomoB) を互いに共通して有する。中でもプロテア一ゼ活性に寄与するズブ チリシン様触媒領域 （以下、 単に 「触媒領域」 または 「SCD」 とも称する） の アミノ酸配列は、 S PCファミリ一間で非常に相同性が高く、 プロテアーゼとし ての切断特異性も極めて類似している。 しかし、 ノックアウトマウスの研究など 遺伝学的なアプローチによって、 これらファミリーの酵素は、 それぞれ異なる分 化因子の活性化に寄与していることが判明している CRoebroek, A. J.M., et a 1., Development 125, 4863-4876, (1998) ； Const am, D.B. et al.， Genes. Dev.14, (2000) 1146—1155)〕。
本発明者らは既に、 これら S PCファミリープロテア一ゼの中でも、 PACE 4は特に脳や神経の分化増殖に重要であり、神経分化転写因子 h ASH- 1によつ て発現が制御されていることを報告している〔Matsuda,Y.， and Tsuji,A., et al.， Bioc ei. J. 360, 683-689, (2001)〕。 事実 P AC E 4を欠損したマウスは脳が形 成されない。 また本発明者らは、 PACE 4は、 軟骨分化因子であって且つ血管 新生阻害作用を有するコンドロモジュリンの活性化を介して、 骨分化や目の形成 においても重要な機能を担っていることを明らかにしている。 内軟骨性骨分化能 を有する A TDCV5培養細胞は、石灰化する前に P A C E 4の発現量が激増し、 また C a依存性セリンプロテアーゼの阻害剤で PACE 4の活性を阻害するとそ の軟骨分化が完全に抑制される 〔松田、 辻ら、 第 74回日本生ィ匕学会大会 (2001年 10月）；生化学， 73巻， 8号, 779頁， (2001)〕。このように P AC E 4は、特に神経、 骨分ィ匕の制御を司る重要なプロセシングプロテア一ゼであると考えられる。
またズブチリシン様プロプロテインコンベルタ一ゼは、 ウィルスの感染性を決 定するウィルス粒子外殻蛋白の活性ィヒゃ細菌毒素の活性ィ匕にも関与していること が判明しており〔Garten，W.， et al., Biochimie 76, 217-225, (1994) ; Gordon, V.M. , et al., Infect. I腿 un. 65, 3370-3375, (1997)〕、 その阻害剤はこれらの感染症 の治療薬となる可能性も高い。
しかしながら、 前述するように S P Cファミリ一は互いに非常に類似した構造 並びに切断特異性を有するため、 PACE4のみを選択的に認識する抗体は未だ 取得されておらず、 ゆえに PACE4の発現およびタンパク機能の研究は遅れて いるのが実情である。 特に PACE4は、 微量で生理活性を発揮する分化増殖因 子群を基質とすることから予測できるように、 夕ンパクとしての発現量は超微量 であり、 ヒトの組織や血液中の PACE 4量を測定し、 病気の診断に利用するた めには、 PACE4に対して厳密な特異性を有し、 抗体価の高い抗体の取得が必 須である。また、 PACE4に対して高い特異性を有する抗体またはその断片は、 PACE4の異常発現及び産生に関連して生じる疾患のための免疫学的治療に有 用である。 発明の開示
本発明の目的は、 ズブチリシン様プロプロテインコンベルタ一ゼファミリーに 属する P A C E 4を特異的に認識し、結合する抗体を提供することである。また、 本発明は、 当該抗体の用途、 具体的には、 例えば当該抗体が有する PACE 4に 対する特異的結合性を利用した免疫学的試薬 （例えば、 PACE4の特異的検出 試薬)、免疫学的薬物（例えば、 PACE 4の異常発現に関連して生じる疾患の予 防'治療薬)、及び PACE4の特異的検出法を提供することを目的とする。 さら に本発明の目的は、 PACE 4の異常発現に関連して発生する疾患の治療に有用 な物質の探索方法を提供することである。
本発明者らは鋭意研究を行った結果、 ズブチリシン様プロプロティンコンベル ターゼ ' PACE4 (単に 「PACE4」 ともいう） 中の特定のアミノ酸配列を ェピトープとするペプチドを免疫原として調製されるモノクローナル抗体が、 構 造的にもまた切断特異性においても、 当該 PACE 4と類似する他のズブチリシ ン様プロプロテインコンベル夕一ゼファミリー 〔フリン、 PC I (PC 3ともい われる）、 PC2、 PC4、 PC6 (PC5ともいわれる）及び P C 8 (PC7と もいわれる）〕 と反応することなく、 PACE 4を特異的に認識し反応することを 見いだした。そして、当該モノクロ一ナル抗体は、そのヒト化抗体なども含めて、 PACE4の異常発現に関連して生じる種々の疾患の診断やその解明に有用であ るとともに、 当該 P A C E 4関連疾患の治療に有用な薬物の開発に有効に禾幌で きることを確信した。 本発明はかかる知見に基づいて完成したものである。
すなわち、 本発明は下記に掲げるモノクローナル抗体である：
(1) ズブチリシン様プロプロテインコンベルタ一ゼ （SPC) のうち、 PA CE4に反応し、 フリン、 PC1、 PC2、 PC 4、 PC 6及び PC 8とは反応 しないことを特徴とするモノク口一ナル抗体。
具体的には、 当該モノクローナル抗体には下記の態様のものが含まれる： (1-1) 配列番号 1のアミノ酸配列をェピト一プ部として有するペプチドに対す る抗体であって、 ズブチリシン様プロプロテインコンペルターゼ（SPC) のう ち、 PACE 4と反応し、 フリン、 PC 1、 PC2、 PC 4、 PC 6及び PC 8 とは反応しないことを特徴とするモノクローナル抗体。
(1-2) 配列番号 1のアミノ酸配列からなるぺプチドとキヤリァ夕ンパクとの結 合物を抗原として調製される抗体であって、 ズブチリシン様プロプロティンコン ベ/レターゼ (SPC) のうち、 PACE 4と反応し、 フリン、 PC1、 PC 2、 PC 4、 PC 6及び PC 8とは反応しないことを特徴とするモノクローナル抗体。 (1-3) 受託番号 F ERM BP— 08498 (2002年 10月 1日に寄託した FERM P- 19048号より移管） のハイプリドーマ （Mouse Hybridoma-PACE4) によって産生 されるモノクローナル抗体。
(1-4)キメラ抗体である上記（1)、 （卜 1)または (1-2)のいずれかに記載されるモ ノクローナル抗体。
(1-5) キメラ抗体が、 ヒト化抗体である上記 （卜 4)に記載されるモノクローナル 饥体。
(1-6) ヒト化抗体が、 ヒト型キメラ抗体またはヒト型 CDR移植抗体である上記 (1-5) に記載されるモノクローナル抗体。
当該ヒト化抗体は、 PACE 4の異常発現に関連して発生する疾患の予防また は治療に応用することが可能である。
また、本発明は、 上記 (ト 3)に記載するモノクローナル抗体の、 キメラ抗体、特 にヒト化抗体 （ヒト型キメラ抗体、 ヒト型 CDR移植抗体） の調製のための使用 に関する。言い換えれば、上記 (1-3)に記載するモノクローナル抗体を用いて、 ズ プチリシン様プロプロテインコンペルターゼ （SPC) のうち、 PACE4と反 応し、 フリン、 PC1、 PC 2、 PC 4、 PC 6及び PC 8とは反応しないキメ ラ抗体、 特にヒト化抗体を製造する方法に関する。
さらに、 本発明は下記に掲げるハイプリドーマ、 及びそれを用いたモノクロ一 ナル抗体の製造方法である；
(2) ズブチリシン様プロプロティンコンベルタ一ゼ (SPC) のうち、 PA CE4と反応し、 フリン、 PC1、 PC2、 PC4、 PC6及び PC8とは反応 しないことを特徵とするモノク口一ナル抗体を産生するハイプリドーマ。
具体的には、 当該ハイプリドーマには下記の態様のものが含まれる：
(2-1) 配列番号 1のァミノ酸配列をェピトープ部として有するぺプチドに対す る抗体であって、 ズブチリシン様プロプロティンコンベルタ一ゼ (SPC) のう ち、 PACE4と反応し、 フリン、 PC1、 PC2、 PC4、 PC6及び PC8 とは反応しないことを特徴とするモノクロ一ナル抗体を産生するハイプリドーマ。 (2-2) 配列番号 1のアミノ酸配列からなるぺプチドとキヤリァ夕ンパクとの結 合物を抗原として調製される抗体であって、 ズブチリシン様プロプロテインコン ベルタ一ゼ (SPC) のうち、 PACE4と反応し、 フリン、 PC 1、 PC2、 P C 4、 PC 6及び P C 8とは反応しないことを特徵とするモノク口一ナル抗体 を産生するハイプリドーマ。
(2-3)受託番号 FERM BP— 08498 (2002年 10月 1日に寄託した FEM P-19048号より移管） のハイブリドーマ (Mouse Hybridoma-PACE4)0
(3) 上記（2)、 （2-1)〜（2 - 3)のいずれかに記載のハイプリド—マを生体内ま たは生体外で培養し、 その体液または培養物から PACE 4と反応し、 フリン、 PC 1、 PC2、 PC4、 P C 6及び P C 8とは反応しないモノクローナル抗体 を採取することを特徴とする、上記（1)、 （ト 1)〜（卜 3)のいずれかに記載するモ ノク口一ナル抗体の製造方法。
また本発明は下記 (4) に記載する PACE 4の検出試薬キットである。 当該 検出試薬キットによれば、 PACE4の検出を特異的に且つ容易に行うことが可 能となる。
(4) (1)、 (1-1) 〜 （卜 6) のいずれかに記載のモノクロ一ナル抗体、 PACE 4に対して特異的結合性を有するその断片、 またはそれらの標識物を P ACE4 に対する特異的結合試薬または特異的検出試薬として含む、 PACE 4検出用試 薬キッ卜。
さらに本発明は下記 (5) に記載する PACE 4に対する結合剤である。 当該 結合剤は、 PACE 4に対して特異的に結合することができるので、 PACE 4 の異常発現に関連して発生する疾患の治療または予防に応用することが可能とな る。
(5) (1)、 (1-1) 〜（卜 6) のいずれかに記載のモノクローナル抗体、 または？
ACE4に対して特異的結合性を有するその断片からなるか、 またはそれらのい ずれかを含む、 PACE 4に対する結合剤。 なお、 当該モノクローナル抗体また はその断片は、 任意の標識材で標識されていてよい。
さらに本発明は下記 （6) に記載する PACE4の特異的検出方法である。 当 該検出方法を利用することにより、 PACE4の異常発現に関連して発生する疾 患の解明並びに診断が可能となる。
(6) (1)、 (1-1) 〜（1-6) のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその 標識物を P AC E 4に対する特異的結合試薬または特異的検出試薬として用いる 工程を有する、 P AC E 4の特異的検出方法。
さらに本発明は、 下記 (7) に掲げる PACE 4の異常発現に関連する疾患の 治療薬の有効成分を探索する方法である。 なお、 本明細書において 「PACE4 の異常発現に関連する疾患」 には、 PACE 4の異常発現 （発現の増加及び減少 の両方を含む、 以下同じ） に起因して生じる疾患、 及び PACE4の異常発現を 伴う疾患の両方が含まれる。
(7) 下記の （a)、 （b)および（c)の工程を含む、 PACE4の異常発現に 関連する疾患の予防または治療薬の有効成分のスクリーニング方法：
( a ) 被験物質を P A C E 4を発現し得る細胞に接触させる工程、
(b) (1)、 (1-1)〜（1-6)のいずれかに記載するモノクローナル抗体を用いて、 被験物質を接触させた細胞における P A C E 4の発現量を測定し、 同様にして被 験物質を接触させない上記に対応する対照細胞における P A C E 4の発現量を測 定して、 両者を比較する工程、
(c) (b)の比較結果に基づいて、 PACE 4の発現量を増加または低下させる被 験物質を選択する工程。 図面の簡単な説明
図 1は、 T G F /3関連分ィ匕因子のプロセシングプロテアーゼ （ズブチリシン様 プロプロテインコンベルターゼ） による活性化機構を示す図面である。
図 2は、ズプチリシン様プロプロティンコンベルタ一ゼのフアミリー（フリン、 PC 2、 PC 1/3、 PC4、 PACE4、 PC 5/6、 PC 7/8) の各ドメ イン領域を示す構造模式図である。 図中、 SPはシグナルペプチド、 Pr oはプ 口ペプチド、 SCDはズブチリシン様触媒領域、 HomoBはホモ Bドメイン、 CRRはシスティンリッチドメイン、 TMDは膜結合ドメインを示す。
図 3は、 ヒ卜 PACE4の各種アイソフォームの各ドメイン領域を示す構造模 式図を示す。
図 4は、 PACE4のアミノ酸配列を、 ラット （上段)、 マウス （中段)、 及び ヒト （下段） (PACE4A-I) についてそれぞれ対比した図面である （図 5に続く）。 なお、 図中、 「·」、 「：」 及び 「★」 は、 それぞれ 3種の哺乳類間のアミノ酸が、 類似した性質を有するアミノ酸（「·」）、同じ液性または極性を有するアミノ酸 (塩 基性アミノ酸、酸性アミノ酸、 疎水性アミノ酸など） （「：」）、 及び同一のァミノ 酸（「★」） であることを示す（図 5において同じ）。 なお、 ヒト PACE4のアミ ノ酸配列において、 N末端から数えて、 シグナルペプチド領域はアミノ酸番号 1 〜63位、 プロペプチド領域はアミノ酸番号 64〜； L 49位、 ズブチリシン様触 媒領域はアミノ酸番号 150〜454位、 ホモ B領域はアミノ酸番号 496〜 6 34位、 システィンリッチ領域はアミノ酸番号 695〜969位に位置する。 図 5は、 PACE4のァミノ酸配列を示す図 4の続きである。
図 6は、 実施例 1 (3-2) (i)(iii)における実験の結果、 すなわち、 PACE4 特異抗体産生クローン （1— D- 1、 1-D-6) について、 酵母細胞発現 PACE 4 (Δ680) を抗原としてウエスタンブロッテイングを行った結果を示す （各クロ P 霞麵 12712
8
ーンについて「Δ680」で示すレーン）。また対照として、 「Mock」に示すレーンに、 PACE 4遺伝子を挿入しない空の発現ベクター （Mock) を抗原としてウェス夕 ンブロッテイングを行った結果を併せて示す。 この結果から、 PACE 4特異抗 体産生クローン （1- D- 1、 1-D-6) は、 酵母細胞 （Mock) に由来する蛋白質 とは反応せず、 PACE 4 (Δ680) (分子量 76kDa)並びにその分解産物と特異的 に反応することがわかる。
図 7は、 実施例 1 (3-2) (ii)(iii)における実験の結果、 すなわち、 PACE 4特異抗体産生クローン （1- D- 6) について、 HEK293細胞発現PACE4を抗 原としてウエスタンブロッテイングを行った結果を示す (PACE4レーン)。 また対 照として、 PACE 4遺伝子を揷入しない空の発現ベクターを抗原としてウェス タンブロッテイングを行った結果を併せて示す （Mockレーン）。 この結果から、 PACE 4特異抗体産生クローン （1- D- 6) は、 酵母細胞 （Mock) に由来する 蛋白質とは反応せず、 PACE4 (分子量 103kDa) と特異的に反応することがわ かる。
図 8は、実施例 1 (3-3) における免疫沈降法の結果を示す。すなわち、 PAC E4特異抗体産生クローン （1D— 1、 1D-6) (図 B、 0 及び PACE4の S C Dを抗原として作製したモノクローナル抗体 (抗 SCD抗体 (anti-SCD)) (図 A) と、 各酵素 （PC1,フリン、 PC6A,PC6B, PACE4,PC8) を発現する HEK293細胞、 及び 発現べクタ一を導入した HEK293細胞 (Mock)の各細胞抽出液（ c )と培養上清 (m) との反応性 （免疫沈降反応） をみた結果を示す。
図 9は、 PACE 4の触媒領域 (SCD) の C末端側に位置するホモ Bドメイ ンを抗原として作製したモノクローナル抗体 （抗 HomoB抗体） について、 各種の SPCファミリー （左レーンから Mock、 フリン、 PC1、 PC2、 PC6A、 PC6B, PC8、 PACE4A-I,及び PACE4A-II) との反応性を、免疫沈降法によって調べた結果を示す 図である。 発明を実施するための最良の形態
I. モノクローナル抗体、 及びその製造方法 本発明のモノクローナル抗体は、 配列番号 1のアミノ酸配列をェピトープ部と して有するぺプチドを抗原として作成される抗体であって、 ズブチリシン様プロ プロテインコンペルターゼ · PACE4 (PACE4) に対して特異的反応性を 有することを特徴とする。
PACE 4は、 内分泌系組織では下垂体、 大脳、 小脳、 嗅球及び心筋に、 また 非内分泌系組織では肝臓に強く発現していることが報告されており (Endocrinology, 136, 357-360, (1995); Biochimie, 76, 197-209, (1994); Hitochei Cell Biol., 108, 95-113, (1997))、 また、 マウスの発生過程において ステージ特異的に特有の発現パ夕一ンを示すことから、 BMP等の活性化に寄与 している可能性も示唆されている (： [.Cell. Biol.，134， 18卜 191 (1996))。
ヒト PA C E 4には、 C末端側のアミノ酸配列の異なる複数のアイソフォーム が存在することが知られており、 現在 8種類 (PACE4A- 1. PACE4A-II, PACE4B, PACE4C, PACE4CS, PACE4D, PACE4E-I, PACE4E-II)のァイソフォームが c DNAク ローニングより同定されている (Biochem. Biophys. Res. Commun. , 200, 943-950 (1994)； J. Biochem.) Tokyo), 121, 941-948 (1997)； FEBS Lett. , 396, 3卜 36(1996))。 図 3に各ァイソフォームのドメイン構造を示す。 P AC E 4 A- Iは最初に同定さ れた PACE4であり、 シグナルペプチド （SP)、 プロペプチド （P r o)、 ズ プチリシン様触媒領域（SCD)、 及びホモ Bドメイン（ホモ B) よりなる SPC フアミリーに共通するドメイン構造と、 C末端側に存在する C R R領域から構成 されている。 PACE 4 Bはホモ Bドメイン及び CRR領域を欠き、 PACE 4 C及び PACE4CSは、 ホモ Bドメインの大部分を含むが CRR領域を欠いて いる。 PACE 4 Dはシグナルペプチド、 プロペプチド及び CRR領域を欠く。 PACE4E-Iは、 PACE4A-Iと類似したドメイン構造を有するが、 CRR 領域が短く、 C末端側に疎水性クラスターをもつ特有のアミノ酸配列を有する。 また、 CRR領域の直前で 13アミノ酸が欠失した PACE4A- Π と PACE 4E-II も存在する。 これらのァイソフォームはいずれも共通の S CDを有し、 C末端側に各ァイソフォーム特異的なアミノ酸配列を有している。
本発明が対象とする PACE4は、 ヒト PACE4由来の S C D (配列番号 2 ) と同一またはそれと相同するアミノ酸配列からなる S CDを有するものであれば よく、 由来組織の別ゃァイソフォームの別を問わない。 ゆえに本発明が対象とす る PACE 4には、 ヒト由来の PACE 4 (PACE4A-I) (配列番号 3)、 及びその 他の各種のアイソフォーム (PACE4A- 11、 PACE4B, PACE4C, PACE4CS, PACE4D, PACE4E-I、 PACE4E-I Iなど） が含まれる。
また、 上記の限りにおいて PACE 4が由来する生物種の別も問わない。 例え ば、 図 4及び図 5に、 ラット PACE4、 マウス PACE4及びヒト PACE4 のァミノ酸配列の対比を示す。 これから分かるように、 ラッ卜 P A C E 4及びマ ウス PACE 4のズブチリシン様触媒領域 (SCD) は、 ヒト PACE4の SC Dと極めて類似したアミノ酸配列を有する。 なお、 ラット PACE4の全アミノ 酸配列を配列番号 4に、 マウス PACE4の部分ァミノ酸配列を配列番号 5に示 す。 このように本発明が対象とする PACE 4は、 かかるヒト PACE4由来 S CD (配列番号 2) とアミノ酸配列が相同する SCDを有する生物種に由来する PACE 4であってもよい。かかるヒト以外の生物種としては、制限されないが、 例えばマウス、 ラット、 ゥサギ、 ブ夕、 ャギ、 ゥシまたはサル等の各種の哺乳類 を挙げることができる。 好ましくはマウス及びラットである。
具体的には、 その S CDが、 一部に配列番号 1に示す 「G I RPNYIDJ の ァミノ酸配列を有し、 かつ S C Dの全ァミノ酸配列が配列番号 2に示すァミノ酸 配列（ヒト由来 PACE4- Iの SCDのアミノ酸配列） と 70 %以上、好ましく は 85%以上、 より好ましくは 95%以上の相同性 （同一性） を有する、 非ヒト 動物の PACE 4を挙げることができる。
なお、 アミノ酸配列の相同性 （同一性） は、 既知の方法でただちに計算するこ とができる。かかる方法としては、特に制限されないが、 Computational Molecular Biology (A. M. Lesk 編、 Oxford University Press 1988) ； Biocomputing： Informatics and Genome Projects (D. W. Smith編、 Academic Press 1993)； Computer Analysis of Sequence Data (Part 1, A. M. Griffin and H. G .Griffin編、 Human Press 1994)； G. von Heinle, Sequence Analysis in Molecular Biology (Academic Press 1987))； Sequence Analysis Primer (M. Gribskov and J.Devereux編、 M. Stockton Press 1991)； and Carillら、 1998, SIAM J. Applied Math. , 48 :1073 が挙げられる。 相同性を決定する好ましい方法は、 試験を行うアミノ酸配列間の 一致が最大となるように設計される。 相同性を決定する方法は、 商業的に入手可 能なコンピュータプログラムに記載されている。 2つのアミノ酸配列間の相同性 を決定する好ましいコンピュータプログラム法は、 特に制限されないが、 GAP
(Devereux ら、 1984, Nucleic acid Res., 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Medison, WI)、 BLASTPおよび FASTA (Altschul ら、 1990, J. Mol. Biol.215:403-410) を含む GC Gプログラムパッケージが挙げられ る。 BLASTXプログラムは、パイォテクノロジ一情報センタ一（National Center for Biotechnology Information, NCBI)および他の供給源 (Altschul ら、 B1AST anual
(NCB NLM NIH, Bethesda, MD)； Altschul ら、 1990、 同上） より入手可能であ る。 既知のスミス 'ウォーターマンアルゴリズムも、 同一性を決定するのに使用 できる。
また、 本発明が対象とする PACE 4には、 上記限りにおいて、 上記ヒト以外 の動物 （非ヒト動物） に由来する PACE 4のアイソフォ一ムもまた含まれる。 本発明において配列番号 1のアミノ酸配列を有するぺプチドは、 ヒト P AC E 4 (配列番号 3) のアミノ酸番号 293〜300の領域（またヒト PACE 4の S CD (配列番号 2)のアミノ酸番号 144〜151の領域)に位置する部分ペプチドである。 当該アミノ酸配列からなるぺプチドをェピトープ部として有するぺプチドとして は、 配列番号 1のアミノ酸配列からなるペプチドか、 またはそれを一部に有する ものであって、 本発明のモノクローナル抗体を作成し得る抗原特性を有するもの であれば に制限されない。 好ましくは、 配列番号 1のアミノ酸配列からなるぺ プチドにキヤリァタンパクを結合させたものを挙げることができる。
ここでキャリアタンパクとしては、 ヒト及びその他の哺乳類に存在しないタン パク、 またはヒト及びその他の哺乳類に存在するタンパクと同一または類似性の ないタンパクであればよく、 当業界で通常使用されるものを広く用いることがで きる。 具体的にはスカシガイのへモシァニン （KLH) や Schistosoma japonic™ (日本住血吸虫）由来グル夕チオン S-トランスフェラーゼ （GST) 等 を例示することがでさる。
本発明のモノクローナル抗体は、 例えば、 前記ペプチド等を抗原として認識す る抗体を産生するクローンを培養することによって製造することができる。 この JP2003/012712
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ようなクローンは、 通常の細胞融合法に従って調製することができる。 具体的に は、 抗体産生細胞と骨髄腫細胞との間に融合八イブリツドを形成させ、 該ハイブ リッドをクローン化し、 次いでかかるクローンの中から前記ペプチドを抗原とし て認識する抗体を産生するクローンを選択することによって調製することができ る。
ここで用いる抗体産生細胞としては、 配列番号 1に示すアミノ酸配列をェピト ープとして有するぺプチド、 特に好ましくは配列番号 1に示すァミノ酸配列から なるぺプチドまたはそのべプチドとキヤリァタンパクとの結合物を抗原 (免疫源） として用いて免疫した動物から取得される脾細胞、 リンパ節細胞及び Bリンパ球 を例示することができる。
かかる抗体産生細胞の調製は、 常法に従って行うことができる。 例えば、 まず 当該抗原を注射直前に完全もしくは不完全フロイントアジュバント中で乳化、 懸 濁させ、 動物の皮下又は腹腔内に 2〜 3週間毎に数回 （好ましくは 3回） 注射を 繰り返すことにより動物を免疫させる。 免疫させる動物としては、 ヒト以外の哺 乳動物であれば特に制限されず、 例えばマウス、 ラット、 ゥマ、 ャギ、 ゥサギ、 ゥシまたはサル等を例示することができる。 抗原の静脈内投与による最終免疫よ り 3〜5日後、 免疫動物から脾細胞などの抗体産生細胞を分取する。
骨髄腫細胞としては、 マウス、 ラット、 ゥマ、 ャギ、 ゥサギ、 ゥシまたはサル 等に由来するものが使用されるが、 上記抗体産生細胞と同種の動物由来であるこ とが望ましい。例えば、マウス脾細胞の融合の相手としては P3UI及び SP- 2/0- Agl4 [Nature 277, 131-133 (1979)3 等のマウス骨髄腫細胞が用いられる。
細胞融合は、例えば、 Nature 256, 495-497 (1975)に記載の方法や、 Proc. Nat l. Acad. Sci. USA 78, 5122-5126 (1981)に記載される Uedaらの方法又はこれに準 ずる方法によって行われる。 通常、 30〜50%ポリエチレングリコール （平均分子 量 1000〜4000) を用いて、 30〜40°Cで、 1〜 3分間程度反応させることによって 行われる。より好ましくは、 30〜50%ポリエチレングリコール（平均分子量 4000) を用いて、 37°Cで、 1〜3分間程度反応させることによって行われる。
細胞融合によって得られたハイプリドーマは、 例えば、 マイクロプレート中で 培養し、 HAT培地（ヒポキサンチン 100 M、 アミノプテリン 0. 4 M、 チミジ ン 16 Mを含む基礎培地）等を用いて生育させ、 次いで生育したハイブリド一マ について抗原結合性を検定し、 さらに PACE 4特異抗体産生クロ一ンのスクリ 一二ング工程に供される。
具体的には、 増殖の見られたゥエルの培養上清中の抗体価を、 抗原ペプチドを スクリーニング用抗原として用いた E I A (Enzyme Immunoassay) 法または EL I SA (Enzyme- linked immunosorbent assay) 法 [Miller, M. E. , Lancet, 1， 665 (1971)〕 等、 の酵素抗体法によって測定し、 PACE 4抗体産生クローンを 同定する。 次いで同定したクローンの中から、 PACE 4に反応して、 他のズブ チリシン様プロプロテインコンベル夕一ゼである、 例えばフリン、 PCI (PC 3)、 PC 2, PC4、 PC6 (PC 5) 及び P C 8 (PC 7) に反応しない PA C E 4特異抗体産生クローンを、 例えばウェスタンプロット法または免疫沈降法 等によって確認し選択する。 このようにして得られるハイプリド一マの一例とし て、 実施例に詳述する、 受託番号 F ERM BP— 08498 (2002年 10月 1 日に日本寄託機関に国内寄託した FERM P- 19048号よりブタぺスト条約上の国際寄 託機関に移管） のハイブリドーマ （Mouse Hybridoma-PACE4) を挙げることができ る。
斯くして得られるハイプリドーマクローンを、 通常の動物細胞と同様に、 生体 内または生体外で培養することにより、 体液中または培養物中に本発明のモノク 口一ナル抗体が産生される。 前者の方法として、 具体的には、 上記ハイプリド一 マクローンを、 例えば、 あらかじめ 0.5ml のプリスタンを投与した B a 1 bZ cマウスの腹腔内へ移植することによって行うことができる。 移植後 7〜14日 後にモノク口一ナル抗体を高濃度に含む腹水が産生されるので、 当該腹水より本 発明モノク口一ナル抗体を採取することができる。
ハイブリド一マクローンの培養物や腹水などの体液から本発明のモノクローナ ル抗体を回収する方法としては、 制限されないが、 I gGの精製方法として既知 の方法、 例えば、 陰イオン交換体、 ヒドロキシアパタイト、 プロテイン A又は G 固定化カラム及びプロタミン固定化カラム等を用いた各種のカラムク口マトダラ フィ一、 硫安分画法、 PEG分画法、 エタノール分画法及び低張緩衝液沈殿法等 を挙げることができる。 2003/012712
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以上の如くして本発明のモノクローナル抗体は、 好適には I gGとして取得す ることができる。
本発明のモノクローナル抗体は、 PACE4全体、 PACE4の SCDまたは PACE4のホモ Bドメインを抗原として得られるモノクローナル抗体のいずれ でもなく、 PACE4の SCDの一部のアミノ酸配列 （配列番号 1) をェピトー プ部とするペプチド （キャリアタンパクとの結合物を含む） を抗原として得られ るモノクローナル抗体であることを特徴とする。 かかる PACE 4の S CD内に 存在する特定のぺプチド断片を抗原として調製される本発明のモノクローナル抗 体は、 PACE4全体、 PACE4の SCDまたは PACE4のホモ Bドメイン を抗原として調製されるモノクローナル抗体と異なって、 PACE4と類似の構 造並びに切断特異性を有する他のズブチリシン様プロプロティンコンベルタ一ゼ (SPC) ファミリー、 例えばフリン、 PCI (PC3)、 PC 2, PC4、 PC 6 (PC 5) 及び PC 8 (PC 7) と反応することなく、 PACE4に対して特 異的に反応する。
このため、 本発明のモノクロ一ナル抗体によれば、 免疫測定法を利用して、 S PCファミリ一の中 （または S PCファミリーが混在する組成物の中） から PA CE 4を選択的且つ特異的に検出することができる。 よって、 本発明のモノクロ ーナル抗体は、 P A C E 4発現の組織局在性やその発現の程度を調べたり、 被験 体中に存在し得る P AC E 4を検出したり定量するための免疫学的試薬 (例えば、 免疫電気泳動用試薬や免疫測定用試薬など）として有効に使用することができる。 本発明が対象とするモノクローナル抗体には、 受託番号 F ERM BP-08 498のハイブリドーマ（Mouse Hybridoma-PACE4)が産生するモノクロ一ナル抗 体で代表される非ヒト動物由来のモノクローナル抗体だけでなく、 当該モノク口 ーナル抗体を遺伝子組み換え技術等を用いて改変した抗体、 例えばキメラ抗体が 含まれる。 かかるキメラ抗体として、 好ましくはヒト化抗体であり、 かかるヒト 化抗体にはヒト型キメラ抗体、 及びヒ卜型相補性決定領域 （co即 lementary determining determining: CDR)一移植抗体が含まれる。かかるヒト化抗体は、 ヒトに対する免疫原性 （抗原性） が低減されているため、 本発明のモノクローナ ル抗体を、 例えば PACE 4の異常発現に関連して発生する疾患の予防や治療な どを目的としてヒトに適用する場合に、 好適に使用される態様のものである。 中 でもヒト型 CDR移植抗体は、 ヒトに対する免疫原性がより低く、 より好適な態 様の抗体である (Riechmann, L., et al., Nature 332, 323-327 (1988); Isaacs, JD. et al., Lancet 340, 748-752 (1992))。 これらキメラ抗体の基本的な製造方 法は、 当業界において公知であり （例えば、 WO97/0767K 特表 2000- 515372号 公報参照のこと）、 既に確立した技術になっている。
なお、超可変領域 (variable region) が抗原結合部位の形成に関与しているこ とから、 当該超可変領域を相補性決定領域（以下、 「CDR」 という） と、 2つの CDRに挟まれた部分をフレームワーク （frame work region：以下 「FR」 とい う。） とそれぞれ呼ばれている。カバトらによって、 重鎖、軽鎖の可変領域の一次 配列を多数収集し、 配列の保存性に基づき、 それぞれの一次配列を CD Rおよび FRに分類した表が作成されている （カバトら、 SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No.91-3242, E Kabatt et al.参照)。 また、 各 FRは、 アミノ酸配列が共通の特徴を有する複数のサブダル一プに分類 されており、 ヒトとマウスの間で対応するフレームワークが存在することも見い だされている。
ヒト型キメラ抗体は、 ヒト以外の動物の抗体重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域) (以下、 VHと表記する） および軽鎖 （L鎖） 可変領域 （V領域） （以下、 VLと 表記する） とヒト抗体の H鎖定常領域 （C領域） （以下、 CHと表記する）および ヒト抗体の L鎖 C領域 （以下、 CLと表記する） とからなる抗体を意味する （例 えば、 Proc. Natl. Acad. Scl. U.S.A. 81, 6851-6855 (1984)等参照のこと）。 本 発明が対象とするヒト型キメラ抗体は、 PACE 4に特異的結合性を有する前述 のモノクローナル抗体を生産するハイプリドーマより、 VHおよび VLをコード する c DNAを取得し、 ヒト抗体 CHおよびヒト抗体 C Lをコ一ドする遺伝子を 有する動物細胞用発現べクタ一にそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現べクタ 一を構築し、 動物細胞へ導入することにより発現させることにより製造すること ができる。
ヒト型 CDR移植抗体は、 ヒト抗体に、 非ヒト動物の抗体の VHおよび VLの CDRを非ヒト動物の抗体の CDR配列でそれぞれ置換した抗体を意味する （例 えば、 P.T.Jones et al.， Nature 321, 522, (細）。 本発明が対象とするヒト 型 CDR移植抗体は、 PACE 4に特異的結合性を有する非ヒ卜動物に由来する モノクローナル抗体の VHおよび VLの CD R配列で任意のヒト抗体の VHおよ び VLの CD R配列をそれぞれ置換した V領域をコードする c DNAを構築し、 ヒト抗体の CHおよびヒト抗体の CLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発 現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型 CD R移植抗体発現ベクターを構築し、 動 物細胞へ導入し、 発現させることにより製造することができる。 なお、 ヒト型 C DR移植抗体の作成には、 非ヒト動物の抗体の CDR配列全体及び FR配列の一 部のアミノ酸残基をヒト抗体に移植するように、 可変領域のアミノ酸配列を設計 する必要がある。
この設計は、 以下の方法に従って行うことができる。 一般に、 移植すべき CD Rを有する非ヒト哺乳動物由来抗体は「ドナ一（donor)」、 CDRが移植される側 のヒト抗体は「ァクセプター （acceptor)」 と定義されるが、本発明もこの定義に 従う。 ヒト化のデザィンを行う場合、 ァクセプタ一のサブグループの選択指針と しては、 （1)天然のアミノ酸配列を有する公知のヒト抗体の免疫グロブリン重鎖、 軽鎖の天然の組み合わせをそっくりそのまま用いる、 （2)重鎖、軽鎖が属するサブ ダル一プとして組み合わせは保存するが、 重鎖、 軽鎖としては、 それぞれ異なる ヒト抗体に由来し、 ドナーの重鎖、 軽鎖のアミノ酸配列と同一性が高いアミノ酸 配列、 またはコンセサス配列を用いる、 方法がある。 本発明においても、 上記の 指針に従うことができるが、 これらと異なる方法として、 （3)サブグループの組み 合わせを考慮することなく、 ドナ一の FRと最も同一性の高い重鎖、 軽鎖の FR をヒト抗体の一次配列ライブラリ一の中から選択するという方法を採用すること も可能である。 これらの選択法により、 ドナ一およびァクセプ夕一間での、 FR 部分のアミノ酸の同一性を少なくとも 70%以上とすることが可能となる。 この 方法を採用することにより、 ドナーより移植するアミノ酸残基の数をより少なく することが可能となり、 ヒト抗マウス抗体応答 （Human ant i mouse antibody response ： HAMA応答） の誘導 （シュロッフら、 Cancer Res., 45, 879-885 (1985)) を減少させることができる。
本発明のヒト型キメラ抗体およびヒト型 CDR移植抗体のヒト抗体部分は、 い ずれのィムノグロブリン （Ig) クラスに属するものでもよいが、 I gG型のもの が好適である。 I gG型に属する I gGl、 I gG 2、 I gG3、 I gG4等の ィムノグロプリンの C領域のいずれも用いることができる。 II. PACE4検出用試薬キット及びそれを用いた PACE 4の特異的検出方法 本発明のモノク口一ナル抗体は、 免疫電気泳動法または免疫測定法を利用して PACE4を検出し測定するにあたって、 P A C E 4に対する特異的結合試薬ま たは特異的検出試薬 （免疫学的試薬） として有効に使用することができる。 ここ で、 免疫測定法の例としては、 直接または間接の競合アツセィまたは非競合アツ セィ （例えば、 サンドイッチ法等） 挙げることができる。 また、 免疫電気泳動法 または免疫測定法には、 ウエスタンプロット法、 蛍光抗体法、 免疫酵素抗体法 (ELISA)、 放射性物質標識免疫抗体法（RIA法)、 免疫組織染色法や免疫細胞染色 法などの免疫組織化学染色法 （ABC法、 CSA法など)、 免疫沈降法などが含まれる (単クローン抗体実験マニュアル、 講談社サイエンティフィック（1987)；続生化 学実験講座 5、 免疫生化学研究会 （東京化学同人 （1986)など)。
本発明は、 P A C E 4を免疫電気泳動法または免疫測定法を利用して特異的に 検出または測定するための試薬キットを提供する。 当該本発明は、 被験試料中の PACE4の存在またはその量を、 抗原一抗体反応を利用して検出測定するため の試薬キットであり、 前述する本発明のモノクロ一ナル抗体を PACE 4に対す る特異的結合試薬成分または特異的検出試薬成分として含むことを特徴とするも のである。 また、 本発明のモノクローナル抗体に代えて、 PACE 4に対する特 異的結合を有するその部分断片 （以下、 これを単に 「抗体断片」 ともいう） を用 いることもできる。
かかる抗体断片としては、 P A C E 4に対する特異的結合性を有する F ab (fragment of antigen binding) , F (ab ) Fab'、 一本鎖抗体 (single chain Fv; 以下、 scFvと表記する）、 2量化体 V領域断片 （以下、 Diabodyと表記する）、 ジ スルフイド安定化抗体 (di sulfide stabilized Fv; 以下、 dsFv と表記する）、 CDRを含むぺプチド等を挙げることができる。
Fabは、 I gGのヒンジ領域で 2本の H鎖を架橋している 2つのジスルフィド TJP2003/012712
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結合 （S-S結合） の上部のペプチド部分を酵素パパインで分解して得られた、 H 鎖の N末端側約半分と L鎖全体で構成された、 分子量約 5万の抗原結合活性を有 する抗体断片である。本発明で使用される Fabは、 上記本発明のモノクローナル 抗体をパパイン処理して得ることができる。 または、 上記本発明のモノクローナ ル抗体の Fabをコ一ドする DNAを動物細胞用発現ベクターに挿入し、該ベクタ 一を動物細胞へ導入することにより発現させることによつても Fab を製造する ことができる。
F(ab')2は、 I gGのヒンジ領域の 2個の S-S結合の下部を酵素トリプシンで 分解して得られた、 2つの Fab領域がヒンジ部分で結合して構成された、分子量 約 10万の抗原結合活性を有する抗体断片である。 本発明で使用される F(ab')2 は、 上記本発明のモノクローナル抗体をトリプシン処理して得ることができる。 または、 当該モノクローナル抗体の F (ab')2をコードする DNAを動物細胞用発 現べクターに揷入し、 該べク夕一を動物細胞へ導入することにより発現させるこ とによっても F(ab')2を製造することができる。
Fab'は、上記 F (ab')2のヒンジ間の S- S結合を切断した分子量約 5万の抗原結 合活性を有する抗体断片である。本発明で使用される Fal)'は、上記本発明のモノ ク口一ナル抗体を還元剤ジチォスレイトール処理して得ることができる。または、 当該モノクローナル抗体の Fab'をコードする DNAを動物細胞用発現ベクター に挿入し、 該ベクターを動物細胞へ導入することにより発現させることによって も Fab'を製造することができる。
scFv は、 一本の VHと一本の VLとを適当なペプチドリンカ一 （以下、 Pと 表記する） を用いて連結した、 VH- P- VLないしは VL- P- VHポリペプチド で、 抗原活性を有する抗体断片である。 本発明で使用される scFvに含まれる V Hおよび VLは、 上記本発明のモノクローナル抗体のものであればよい。 本発明 で使用される scFvは、 本発明のモノク口一ナル抗体を生産するハイプリドーマ より VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、 scFv発現ベクターを構築 し、 大腸菌、 酵母、 あるいは動物細胞へ導入することにより発現させ製造するこ とができる。
dsFvは、 VHおよび VL中のそれぞれ 1アミノ酸残基をシスティン残基に置 2003/012712
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換したポリペプチドを S-S結合を介して結合させたものをいう。 システィン残基 に置換するアミノ酸残基は Re i terらにより示された方法 (Protein Engineering, 7, 697 (1994))に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。 本発明で使用される ds Fvに含まれる VHあるいは VLは、 本発明のモノクロ一 ナル抗体のものであればよい。 本発明で使用される ds Fvは、 本発明のモノクロ ーナル抗体を生産するハイプリドーマより VHおよび V Lをコードする c DN A を取得し、 適当な発現べクタ一に挿入して ds Fv発現べクタ一を構築し、 該発現 ベクターを大腸菌、 酵母、 あるいは動物細胞へ導入し、 発現させることにより製 造することができる。
Diabodyは、 抗原結合特異性の同じまたは異なる sc Fvが 2量体を形成した抗 体断片で、 同じ抗原に対する 2価の抗原結合活性または異なる抗原に対する 2特 異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。 本発明の Diabodyは、 例えば、 本 発明のモノクロ一ナル抗体に特異的に反応する 2価の Diabodyは、 本発明のモノ クロ一ナル抗体の VHおよび VLをコードする c DNAを取得し、 3〜1 0残基 のポリペプチドリンカ一を有する sc Fvをコードする D NAを構築し、 該 D NA を動物細胞用発現ベクターに挿入し、 該発現ベクターを動物細胞へ導入すること により Diabodyを発現させることにより、 製造することができる。
C D Rを含むペプチドは、 VHまたは VLの C D Rの少なくとも 1領域以上を 含んで構成される。 複数の C D Rは、 直接または適当なペプチドリンカ一を介し て結合させることができる。 本発明で使用される C D Rを含むペプチドは、 本発 明のモノクローナル抗体の V Hおよび V Lをコードする c D N Aを取得した後、 C D Rをコ一ドする D NAを構築し、 該 D NAを動物細胞用発現ベクターに揷入 し、 該ベクターを動物細胞へ導入することにより発現させることにより、 製造す ることができる。 また、 CD Rを含むペプチドは、 Fmoc法 (フルォレニルメチル ォキシカルポニル法)、 tBoc法 （卜ブチルォキシカルポニル法） 等の化学合成法 によって製造することもできる。
本発明のモノク口一ナル抗体または上記各種の抗体断片は、 免疫測定用の試薬 として、 そのままで使用されても、 また固体支持体に結合した形態で使用するこ ともできる。 ここでこれらのモノクローナル抗体及び抗体断片を結合させる固体 支持体としては、 当業界で周知のものを任意に使用することができ、 例えばガラ ス、 ポリスチレン、 ポリプロピレン、 ポリエチレン、 デキストラン、 ナイロン、 アミラーゼ、 天然 Z変性セルロース、 ポリアクリルアミド、 寒天およびマグネ夕 イトなどを挙げることができる。 なお、 これらの固体支持体には、 反応トレイの ゥエル、 試験管、 ポリスチレンビーズ、 マグネチックビーズ、 ニトロセルロース ストリップ、 膜、 ラテックス粒子等が含まれる。 これらの固体支持体へのモノク ローナル抗体等の結合方法も公知であり、 本発明もまた当該公知の方法を適用す ることができる。
また本発明のモノクローナル抗体及びその断片は、 免疫電気泳動用及び免疫測 定用などの免疫学的試薬として、 そのままでもよいし、 また任意の標識剤で標識 された標識物の形態で使用することもできる。 本発明で使用可能な標識剤として は、 モノクローナル抗体への結合標識剤として当業界で公知の酵素 （例えばアル カリホスファターゼ (AL P)、 ペルォキシダ一ゼ (HR P) 等)、 放射性同位体 (例えば、 125 1、 3H、 l4C等)、 蛍光性化合物 (例えばフルォレセィンィソチオシ ァネート （F I T C)、 テ卜ラメチル口一ダミンィソチオシァネ一ト (R I T C) 等)、化学発光性化合物、 生物発光性化合物及び I N— ( 2 , 2 , 6 , 6—テトラ メチルー 1一ォキシルー 4ーピペリジル) - 5 N - (ァスパルテート) 一 2 , 4 ージニトロベンゼン （TO P A) 等を広く挙げることができる。 なお、 これらを 標識剤として使用する免疫測定法は、ェンザィムィムノアッセィ （E I A)、ェン ザィムィムノメトリックアツセィ (E L I S A)、ラジオィムノアッセィ (R 1 )、 蛍光ィムノアツセィ、 発光ィムノアツセィ、 スピンィムノアッセィ等と称されて いる。 好ましくは、 酵素、 蛍光性化合物、 及び化学発光性化合物である。 尚、 こ れらの標識剤による標識方法や間接的な標識ィヒによる修飾方法、 並びにそれらの 検出方法等は、 自体公知の方法に従って行うことができる （「単クローン抗体」岩 崎辰夫他著、講談社サイェンティフイク、 1984 ;「酵素免疫測定法」第 2版、 石川 栄治他著、 医学書院、 1982等)。
本発明の試薬キットには、 上記本発明のモノクローナル抗体、 その抗体断片ま たはそれら標識物のほカゝ、 免疫電気泳動法または免疫測定法などその用途に応じ て、 更に適当な反応液、 希釈液、 洗浄液、 転写溶液、 泳動溶液、 反応停止液、 抗 PC漏 003/012712
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体検出試薬、 標識活性測定試薬、 染色液、 反応プレート、 ニトロセル口一スフィ ル夕一、 ポリアクリルアミドゲル等が含まれていてもよい。 なお、 ここで抗体検 出試薬としては、 本発明のモノクロ一ナル抗体と結合する二次抗体、 例えば放射 性物質や酵素などで標識した抗 I g G抗体やプロティン A等を挙げることができ る。
本発明のモノクローナル抗体、 抗体断片またはそれらの標識物を結合または検 出試薬として含む上記試薬キットを利用することにより、 一般の免疫電気泳動法 及び免疫測定法に従い、 PA C E 4を特異的に且つ簡便に検出及び測定すること がでさる。
ゆえに本発明は、 本発明のモノクローナル抗体、 抗体断片またはそれらの標識 物を P A C E 4に対する特異的結合試薬または特異的検出試薬として用いる P A C E の特異的検出方法をも提供するものである。
本発明の検出方法は、 本発明のモノクローナル折体、 抗体断片またはそれらの 標識物を P A C E 4に対する特異的結合試薬または特異的検出試薬として使用す ることを必須とするものであって、 その限りにおいて、 他の基本的操作等は特に 制限されることなく、 通常の免疫電気泳動法または免疫測定法における慣用の方 法を広く採用することができる。 故に、 本発明のモノクローナル抗体等を利用し た抗原一抗体反応、 及び生じた抗原—抗体結合物と抗体検出試薬との反応条件も 特に制限されず、通常の免疫反応における条件が採用される。通常、 4 5 °C以下、 好ましくは約 4〜 4 0 °C、 より好ましくは 2 5〜 4 0 °C程度の温度条件下、 p H が約 5〜 9程度の下で、 約 0 . 5〜 4 0時間、 好ましくは 1〜 2 0時間程度放置 するかもしくはィンキュベ一ションする方法を挙げることができる。
本発明のモノクローナル抗体及びその抗体断片は P A C E を特異的に認識す るため、 当該抗体を含む上記試薬キットを利用した P A C E 4検出法は、 被験試 料 （例えば、 血液、 尿、 骨髄液、 B垂液等） や各種組織中の P AC E 4の特異的検 出やそれによる P A C E 4発現組織の分布測定、 及びァフィ二ティ一を利用した P AC E 4の精製に利用されるほか、 P A C E 4発現の異常を伴う （または P A C E 4発現の異常に起因する） 種々の疾患の免疫化学的及び免疫組織学的診断に 有用である。 PACE4を欠損したマウスは前頭部の形成不全、 単眼症を呈し、 ェンブリオ のままで死亡することが報告されている （Cost am, D. B.， et al,， Genes. Dev. 14, 1146- 1155 (画)）。 また PACE4遺伝子は、 神経発生に不可欠である j3 H LH型転写因子 h ASH— 1の標的遺伝子であることも分かってきている (Biochemical J. Vol.360, pp.683-689, 2001)。 また、 PACE 4遺伝子は軟骨 分化因子であり、 血管新生阻害作用を有するコンドロモジュリンの活性化を介し て骨分化や目の形成においても重要な働きを担っていることが報告されている (第 74回日本生化学会大会 (2001年 10月）；生化学, 73巻， 8号， 779頁，（2001))。 こうした従来の研究から、 P A C E 4は神経細胞や骨細胞の増殖や分化の制御を 司っており、 その発現異常 （亢進、 低下） は、 例えば神経変性疾患、 内軟骨腫、 及び軟骨形成不全等の疾患の発症に関連していると考えられる。
また、 最近、 皮膚ケラチノサイト （角化細胞） に PACE4発現べクタ一を導 入し、 PACE 4を過剰発現するようにすると、 細胞が転移性の高い癌細胞に変 化することが報告されている （Carcinogenesis, Vol.23, No.4, pp.565-672, (2002))。 このことから、 PACE4を異常発現 （過剰発現） は、 皮膚癌、 特に 転移性の皮膚癌の発生と関連していると考えられる。 この場合、 PACE 4を異 常発現 （過剰発現） を抑制/低減することによって、 当該疾患の発生を予防し、 また改善することができると期待される。
ゆえに、 前述する PACE 4の異常発現 （発現亢進、 発現不全/減少） に関連 して生じる疾患としては、 例えばパーキンソン病やハンチントン病などの神経変 性疾患、 軟骨過形成症、 軟骨骨形成異常症、 内軟骨腫及び変形性骨関節症などの 骨疾患、 並びに皮膚癌、 乳癌、 腺癌、 扁平癌及び神経芽腫などの癌疾患を挙げる ことができる。 III. PACE 4結合剤、 及びその利用
本発明のモノクローナル抗体は、 前述するように、 ズブチリシン様プロプロテ インコンベルターゼ (SPC) のうち、 フリン、 PC1、 PC2、 PC 4、 PC 6及び P C 8とは反応せず、 PACE4を特異的に認識し結合するものである。 また上記本発明が対象とする抗体断片も、 その結合特異性を備えるものである。 従って、 本発明のモノクローナル抗体及びその抗体断片は、 P AC E 4に対する 特異的結合剤 （結合用製剤） として、 またその有効成分として、 in Yi troのみな らず、 in vivo及び ex vivoにおいて有効に使用することができる。
当該結合剤の in vivo及び ex vivoでの使用は、 P A C E 4の異常発現 （発現 亢進、 発現不全/減少） に関連して生じる種々の疾患の予防または治療に有用で ある。 この場合、 本発明のモノクローナル抗体及びその抗体断片は、 ヒトまたは 非ヒト動物に投与できるように、 単独もしくは薬学上許容される担体または添加 剤とともに、 製剤学の技術分野において公知の任意方法によって製造された医薬 製剤として提供される。 投与経路は、 治療に際して適した経路を採用することが でき、 経口投与、 または口腔内 （舌下)、 気道内等の経口投与、 直腸内、 皮下、 皮 内、 筋肉、 腹腔内、 静脈内等など非経口投与を挙げることができる。 消化分解を 考慮すれば、望ましくは静脈内などの非経口投与経路である。投与形態としては、 上記投与経路に応じて、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、 シロップ剤、噴霧剤、 乳剤、 坐剤、 注射剤、 貼付剤、 クリーム剤、 軟膏剤などを挙げることができる。 かかる製剤形態には、 その形態に応じて、 陚形剤、 結合剤、 崩壊剤、 滑沢剤、 矯 味矯臭剤、 溶解補助剤、 懸濁剤、 及びコーティング剤など、 医薬の技術分野にお いて通常使用される担体や補助剤を用いて調製することができる。
ヒトまたは非ヒト動物への投与量や投与回数は、 予防 ·治療目的とする疾患の 種類、 その程度、 投与方法、 年齢や体重などによって異なり、 これらを考慮して 適宜設定することができる。
I V. ズブチリシン様プロプロテインコンベルタ一ゼ ' P A C E 4の異常発現に 関連する疾患の治療に有効な物質のスクリ一ニング方法
本発明は、 P A C E 4の異常発現に起因するか又は P A C E 4の異常発現を伴 う疾患の治療に有効な物質 （候補物質） のスクリーニング方法を提供する。 本発明のスクリーニング方法は、次の（a)、（b)および（c )の工程を含む：（a) 被験物質を P A C E 4を発現し得る細胞に接触させる工程、
( b)本発明のモノクローナル抗体を用いて、被験物質を接触させた細胞における P A C E 4の発現量を測定し、 同様にして被験物質を接触させない上記に対応す る対照細胞における PACE 4の発現量を測定して、 両者を比較する工程、 (c) (b)の比較結果に基づいて、 PACE 4の発現量を増加または低下させる被 験物質を選択する工程。
かかるスクリ一エングに用いられる細胞としては、 P A C E 4またはそのアイ ソフォームの遺伝子を有する細胞を、 ヒト及びその他の哺乳動物 （例えば、 マウ ス、 ラットなど） 等の生物種の別を問わず挙げることができる。 具体的には、 ヒ ト胎児腎臓由来 HEK293細胞、ヒト胎児肝癌由来 HepG2細胞、ヒト神経芽細胞種培 養細胞、 ヒト巨大球由来 Dami細胞、サル腎臓由来 Cos- 1細胞、 ラット下垂体由来 GH4C1細胞、マウス下垂体由来 AtT_20細胞などの PACE 4Zァイソフォーム発 現可能な細胞を挙げることができる。
上記候補物質となり得るものとしては、 制限されないが、 核酸、 ペプチド、 タ ンパク、 有機化合物、 無機化合物などであり、 スクリーニングは、 具体的にはこ れらの候補物質となり得る被験物質を含む試料 （被験試料） を上記細胞またはそ の集合体 （組織） と接触させて行うことができる。 かかる被験試料としては、 細 胞抽出物、 遺伝子ライブラリーの発現産物、 合成低分子化合物、 合成ペプチド、 天然化合物などが挙げられるが、 これらに制限されない。
また、 スクリーニングに際して、 被験物質と細胞とを接触させる条件は、 特に 制限されないが、細胞が死滅せず、且つ PACE 4が発現できる培養条件（温度、 pH、 ±咅地組成） を選択するのが好ましい。
PACE4の発現を抑制 Z低減する物質を探索する本発明のスクリ一二ング方 法は、 に PACE4の異常発現 （発現亢進） に関連して発生する疾患、 例えば、 前述する PACE 4の異常発現 （発現亢進、 発現不全/減少） に関連して生じる 疾患としては、 例えばパーキンソン病やハンチントン病などの神経変性疾患、 軟 骨過形成症、 軟骨骨形成異常症、 内軟骨腫及び変形性骨関節症などの骨疾患、 並 びに皮膚癌、 乳癌、 腺癌、 扁平癌及び神経芽腫などの癌疾患の予防または改善薬 の有効成分となる候補物質の取得に有効に利用することができる。
こうした候補物質のスクリ一ニングは、 具体的には下記のようにして行うこと ができる。 すなわち、 PACE4が発現している細胞を用いる場合には、 該細胞 に被験物質を接触させた場合に、 当該被験物質を接触させた細胞の PACE 4の 発現レベルが、 被験物質を接触させない対照細胞の P A C E 4発現レベルに比し て低くなること、 また P A C E 4の発現に発現誘導物質を必要とする細胞を用い る場合には、 発現誘導物質存在下で被験物質を接触させた細胞の PACE 4発現 が、 発現誘導物質存在下で被験物質を接触させない対照細胞の P A C E 4発現よ りも低くなることをもって、 当該被験物質を候補物質として選択することができ る。
PACE 4の発現を抑制 Z低減する物質を探索する本発明のスクリーニング方 法は、 皮膚癌等のように PACE4を異常発現 （発現亢進） に関連して発生する 疾患の予防または改善薬の有効成分となる候補物質の取得に有効に利用すること ができる。
一方、 PACE4の発現不全または低下に関連して発生する疾患の予防または 改善薬の有効成分となる候補物質のスクリーニングは、 下記のようにして行うこ とができる。 すなわち、 PACE 4が発現している細胞を用いる場合には、 該細 胞に被験物質を接触させた場合に、 当該被験物質を接触させた細胞の P A C E 4 の発現レベルが、 被験物質を接触させない対照細胞の PACE 4の発現レベルに 比して高くなること、 また P AC E 4の発現に発現誘導物質を必要とする細胞を 用いる場合には、 発現誘導物質存在下で被験物質を接触させた細胞の P A C E 4 発現が、 発現誘導物質存在下で被験物質を接触させない対照細胞の P A C E 4発 現よりも高くなることをもって、 当該被験物質を候補物質として選択することが できる。
このような本発明のスクリ一二ング方法における P A C E 4の発現量の測定は、 本発明のモノクローナル抗体またはその標識物を検出試薬として用いて行うこと ができる。 具体的には、 前記細胞の細胞画分、 好ましくは細胞抽出物中の P AC E4 (タンパク） の量を本発明のモノクローナル抗体、 その抗体断片またはそれ らの標識物を利用して検出定量する方法を挙げることができる。
斯くして被験物質の中から選択取得される物質は、 PACE4の発現異常 （発 現亢進、 発現不全 Z低下） に関連する疾患、 例えば PACE 4の過剰異常に関連 して発症するパーキンソン病やハンチントン病などの神経変性疾患、 軟骨過形成 症、 軟骨骨形成異常症、 内軟骨腫及び変形性骨関節症などの骨疾患、 並びに皮膚 癌、 乳癌、 腺癌、 扁平癌及び神経芽腫などの癌疾患を予防、 緩和、 抑制 （改善、 治療） する薬物の有力な候補物質となる。
上記本発明のスクリーニング方法によって選別される候補物質は、 さらに疾患 モデル動物を用いた薬効試験、 安全性試験、 さらに臨床試験に供されることによ り、 より実用的な予防薬や治療薬を取得することができる。 このようにして選別 された物質は、 さらにその構造解析結果に基づいて、 化学合成、 生物学合成 （発 酵） または遺伝子学的操作によって、 工業的に製造することができる。
本発明のモノクローナル抗体は、 ズブチリシン様プロプロティンコンベル夕一 ゼ. PACE4を特異的に認識し反応するため、 当該 PACE 4の特異的検出及 び特異的結合に有用である。 かかる本発明のモノクロ一ナル抗体 （これを含む P ACE4検出試薬） 並びにそれを利用した PACE 4の特異的検出によれば、 生 体 戠における P A C E 4の発現分布を免疫化学的に調べることができ、 P A C E 4の生理学的作用並びに意義をより詳細に解明することが可能となる。 また、 本発明のモノクローナル抗体 （こ ήを含む PACE検出試薬） 並びにそれを利用 した PACE 4の特異的検出法は、 PACE 4の異常発現 （発現亢進、 発現不全 /減少） に関連して生じる種々の疾患の免疫化学的及び免疫組織学的診断に有用 である。 これらの疾患としては、 例えばパーキンソン病やハンチントン病などの 神経変性疾患、 軟骨過形成症、 軟骨骨形成異常症、 内軟骨腫及び変形性骨関節症 などの骨疾患、 並びに皮膚癌、 乳癌、 腺癌、 扁平癌及び神経芽腫などの癌疾患を 挙げることができる。
本発明のモノクローナル抗体、 特に後述する実施例に具体的に記載するマウ ス由来のモノク口一ナル抗体は、 PACE4に特異的結合性を有するヒト化抗体、 特にヒト型キメラ抗体ゃヒト型 CDR移植抗体の調製のために好適に使用するこ とができる。 かかるヒト型キメラ抗体やヒト型 CD R移植抗体は、 PACE 4の 異常発現に関連して生じる種々の疾患の予防または治療に利用することが可能で ある。 実施 例
以下、 本発明の内容を以下の実施例を用いて具体的に説明する。 但し、 本発明 はこれらに何ら限定されるものではない。
実施例 1
(1) 抗原ペプチドの調製
配列番号 1に記載するアミノ酸配列を有するペプチド 〔G I RPNY ID： P AC E 4のアミノ酸配列（配列番号 3 ) 293〜300位領域〕を固相法により合成し、 次いでこれをへモシァニンに架橋して、 抗原ペプチドを調製した。 なお、 へモシ ァニンは予め N- eihylraaleimideで処理し、へモシァニンの SH基をブロックした 後、 ペプチドとの架橋反応に用いた。 架橋反応は、 市販されている同仁化 究 所の GMBS [N-(4-Maleimidobotyryloxy)succininiide] を用いて、 そのマ二 ュアルに従って行った。
(2) 八イブリドーマの調製
(1)で調製した抗原ペプチドの水溶液 (2ml PB Sに溶解、精製ペプチド 0.275mg に相当） を等量のフロイント完全アジュバントと混合し、 これを用いて 8週齢の BALB/cマウス雌（日本クレア社製） 3匹を免疫した。 具体的には、 マウス 1匹あ たりそれぞれ精製べプチド 91.7 gに相当する量を 0.656mlの溶液として腹腔内 に投与した。 1回目の免疫から 25日後にフロイント不完全アジュバントと等量混 合した抗原ペプチド溶液 （精製ペプチド 86 に相当） を腹腔に追加免疫した。 さらに初回免疫から 40日後、抗原べプチド溶液 0.2ml (精製べプチド 50 gに相 当） をマウスの尾静脈に注射し最終免疫とした。 その 3日後に、 マウスの脾臓を 取り出し、 5mlの増殖培地（ゥシ胎児血清と抗生物質を含まない DMEM) 中で ホモジナイズし、 次いで遠心分離によって脾細胞を分離取得した。
斯くして得られた脾細胞にミエ口一マ細胞 〔ATCCコード； CRL-1581 (細胞名： Sp2/0-Agl4)) を細胞数が 10 : 1になるように混合して細胞懸濁液を調製し、 遠 心分離により得られた細胞を 1 mlのポリエチレンダリコール（P E G) 50% (w/ ) 含む DMEM (PEG4000溶液） に懸濁し、 徐々に DMEM培地 10mlで希釈し て PEG濃度を 5%とし、 細胞を遠心分離機で分離した。 細胞を HT培地 45ml に懸濁し（ SxlO ^l) 96穴プレート 5枚に 0.1ml/ゥエルの割合で植えた。 5 % C〇2存在下で 12時問培養した後、 HA2T培地 (0.8 M アミノプテリン含有 HT培地） を 0. lmlZゥエルの割合で加え、 5%C〇2存在下、 37°Cでコロニーが 形成されるまで静置培養した。
1週間後、 432個形成されたコロニーの数と大きさを各ゥエルごとに確認し、 直径が lmm以上のコロニーを含むゥエルの抗体価を E I A法で調べ、 限界希釈 法で抗体産生細胞をクローニングした。
(3) PACE 4特異抗体産生クローンの調製
(3-1) E I A法
上記のハイプリドーマ培養上清について、 上記抗原ペプチド （GI RPNYI D) を用いて酵素結合ィムノアッセィ （E IA法） を行い、 PACE4抗体産生 陽性クローンをスクリーニングした。
具体的には、 96穴 E I A用マイクロタイ夕一プレートの各ゥエルに上記抗原べ プチド溶液 (G I RPNY I D) (lO^g/ml) を 50 1ずつ加え、 37°Cで一 B免放置 した。次に 1 %ゥシ血清アルブミン（Sigma社、 PBSに溶解）を 300 1ずつ加え、 室温で反応した。 反応 30分後、 各ゥエルを PBS300 1で 3回洗浄した。 次に クローン化したハイプリド一マ細胞の培養上清を各々 50 1加え、 室温で 1時間 反応した。 反応後 300 1の PBSで各ゥエルを 6回洗浄し、 1000倍希釈したャ ギ抗マウス I g (G + A+M) 抗体 （Cappel製） を各ゥエルに 50 1ずつ加え、 室温で 1時間反応した。次いで 300 1の P B Sで各ゥエルを 6回洗浄し、ペルォ キシダ一ゼ基質混液（50mMリン酸ナトリウム、 pH4.5、 0.02% 過酸化水素、 2mM ABTS (2, 2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid di ammonium salt)) を各ゥエルに 50ml加え、 室温で 20分発色させた。 反応終了後マイクロ 夕イタ一リーダ一で 415nmの吸光度を測定し、 P A C E 4抗体産生クロ一ンをス クリーニングした。
斯くして同定された PACE 4抗体産生クローン （陽性クロ一ン） について、 次にウェスタンプロット法を用いて、 酵母に発現したヒト PACE 4 〔Δ680、 アミノ酸番号 64-679の領域（プロべプチド、ズブチリシン用触媒領域及びホモ Β 領域を含む）のアミノ酸配列からなる PACE4〕、およびヒト胎児腎臓由来 HE K293細胞に発現したヒト PACE4に対する反応性を確認した。
(3-2) ウェスタンプロット法
(i) 酵母での組換えヒト PACE 4 (Δ680) の発現 酵母 （メタノール資化性酵母、 Pichia Pastoris,インビトロゲン社製） を宿主 として、 遺伝子組換え法によりプロペプチドから 679番目のアミノ酸を含む PA CE4 (Δ680) を発現産生させた。 具体的には PQE30ベクタ一に組み込まれたプ 口ペプチドから 679番目のアミノ酸を含む PACE 4を PC R法で増幅し、 C末 端に His- Tagを含む pro PACE4A680断片を調製した。次にこの断片を Xhol, BamHI で消化した酵母発現べクタ一 PHILS- 1 (インビトロゲン社製） に組み込み、 大腸 菌にトランスフォームした。 目的べクタ一 proPACE4A68( pHILS- 1を含むクロ一 ンを選択後、培養したクローンからプラスミドをアルカリ SDS法にて精製した。 酵母は 30時間 YPD培地 (1% yeast extract, 2% pepton, 2% glucose) で培養後、 そのうち 0.7mlの培養液を遠心して得られた沈殿を水で懸濁し、 さら に遠心した沈殿に Sailで直鎖化した proPACE4A680/pHILS- 1プラスミドと混合 し、 PLATE溶液 (40% polyethyleneglycol, 0.1M LiCl, lOmM Tris-HCl, pH7.5, ImMEDTA)と混合し、室温で 10時間反応した。反応後、 RD培地（1M glucitol, 1% dextrose, 1.34% YNB, 4xl0"5 biotin, 0.005 % amino acids) に植菌し、 30° (：、 13日間反応した。
得られた酵母を MGY培地 (1.34% YNB, 1 % glycerol, 4x10— 5% biotin) で培養し、 zymolyaseで処埋したのち、 SDSで溶菌後、 5 M酢酸カリウムと反 応した。 遠心後得られた上清をイソプロパノール沈殿後、 RNase処理、 フエノ ール抽出、クロ口ホルム抽出、エタノール沈殿によってゲノム DN Aを分離した。 proPACE AGSO/ HILS-lプラスミドを含む酵母クローンを P C R法によってス クリーニングし、 目的酵母クロ一ンを得た。 形質転換した酵母を、 BMGY培地 ( 1 % yeast extract, 2 % pepton, 0.1M potassium phosphate, pH6.0, 1.34% YNB, 4xl0-5% biolin, 1 % glycerol) で 30°Cで振盪培養し、 これを濁度が 1に なるように BMMY培地 （1% yeast extract, 2% pepton, 0.1M potassium phosphate, pH6.0, 1.34% YNB, 4xl0"5% biotin, 1 ^methanol) に加え、 30°C で 48時間培養した。 菌体を遠心操作により集め SDS- PAGE試料液で可溶化後、 ゥ エスタンプロット用試料とした。酵母組換えヒト P A C E 4は分子量 780kDaの夕 ンパクとして同定された。
(ii) 哺乳類細胞発現用ヒト P A C E 4発現ベクターの作製と発現 2003/012712
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ヒト PACE4 cDNAは、 ヒト胎盤 c DNAライブラリ一よりクロ—ニング した (Mori, K., et al., J. Biochem. 121, 941-948 (1997))。 完全長ヒト PA CE 4 c DNAは Sailで消化後、 ALTERMAX (プロメガ社製） にクローニングし た。 発現ベクターは FuGene (ロッシュ社製） を用いて、 メーカーのプロトコール に従ってヒト胎児腎臓由来培養細胞 (HEK293) にトランスフエクトした。
48時間後、 培養液を Opii- MEM (Gibco Life Science社製） に交換し、 さらに 24時間反応した。培養液を遠心後、 限外ろ過にて濃縮し、 ウエスタンプロット用 試料とした。 PACE4発現量は、 抗 SCD抗体、 抗 PACE4HomoB抗体 を用いたウェスタンブロット法にて確認した。
(iii)ウェスタンブロット法による組換えヒト PACE 4に対するモノクロ一ナ ル抗体の反応性確認
上記（i) P A C E 4発現酵母細胞の溶解液、または（i i)PACE4発現べクタ一 をトランスフエクトした HEK293細胞の培養濃縮液を S D S電気泳動にかけ、二ト ロセルロース膜に転写し、 次いで膜を 3%スキムミルク溶液 （lOmM
Tris-HCl, H7.5, 0.15MNaClに溶解）でブロッキングした。次いで TTBS (ΙΟπιΜ Tris-HCl, pH7.5, 0.15M NaCI, 0.05% Tween20) で洗浄した。 斯くして調製した ニトロセルロース膜に （3-1) で確認したハイプリドーマ培養上清と室温で 15時 間反応させ、 次いで TTBS (lOmM Tris-HCl, pH7.5, 0.15M NaCI, 0.05% Tween20)溶液で 2回膜を洗浄後、 2次抗体としてペルォキシダ一ゼ架橋ャギ抗マ ウス免疫グロブリン I gG, M, A抗体（2000倍、 Cappel ¾：) と室温で 3時問反 応させた。 得られたニトロセルロース膜を TBS及び TTBSで洗浄し、 Pierce Super Signal発色キット （Pierce社製） を用いて化学発色させて、 上記（3- 2)で E I A法でクローニングした PACE 4抗体産生クローンについて、 PACE 4 に対する抗体産生を確認した。
(3-3) 免疫沈降法
次いで、 上記で P A C E 4に対する抗体産生が確認された各 P ACE4抗体産 生クローンについて、 さらに PACE 4特異抗体産生クロ一ンを選別するため、 免疫沈降法を用いて P A C E 4及びこれと構造が類似する他の SPCファミリー プロテア一ゼ （フリン、 PC1、 PC6A、 PC6B, PC8) との反応性を調べた。 2003/012712
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なお、 S P Cファミリ一プロテアーゼに属する他の酵素 P C 2及び？ C 4につ いては、 そのアミノ酸配列やその組織発現局在性から P A C E 4抗体産生クロー ンと反応性を示さないと考えられるため実験を行っていない。 具体的には、 （1) 本発明のモノクローナル抗体の作成において抗原べプチドとして使用したェピト ープ領域 （GI RPNYID) に相当する P C 2及び P C 4のアミノ酸配列は、 それぞれ 「SHMPQL ID」 及び 「SLQPQHIH」 であり、 上記抗原ぺプ チドと相同性がないこと、（2) P C 2は塍臓ランゲルハンス島などの内分泌細胞の みに、 PC 4は睾丸のみに発現しており、 PACE 4が発現する細胞と明確に区 別できること等を理由として挙げることができる。
免疫沈降法は、 具体的には下記の手順に従って行った。
1)発現べクタ一の構築
フリン、 PC1、 PC6A、 PC 6 B及び PC 8の発現べクタ一は、 実施例 1 (3) (3-2) (ii) の 「哺乳類細胞発現用ヒト PACE 4発現ベクターの作製」 の 欄に記載する方法に従って作製することができる。 ここでは、 フリン、 PC1、 PC6 A及び P C6Bの発現ベクターとして、それぞれ中山和久博士（筑波大学） から供与された Trancatedmouse furin (C末の膜結合領域を欠失） 発現べクタ一 Δ704/ρΑ mouse PCI発現べクタ一 (PCl/pCMV), mousePC6A及び PC6B発現べク 夕一 （PC6A/pRcCMV， PC6B/pRcCMV) を用いた。 また P C 8の発現ベクターは、 Dr. T丄 Martin (メルボルン大学、 オーストラリア）から供与された P C 8 cDN Aを pALTERMAX (Promega社） に組み込んで作製した。
2) 次いで、 調製した各酵素発現べクタ一を、 それぞれ HEK293細胞 （ATCCより 入手） に FuGene (Roche社） を用いてトランスフエクトした。
3) トランスフエクトから 48時間後 培養液をメチォニン、 システィンを含ま ない MEM培養液に交換し、 1時間反応した。
4) 次いで、 100'Ci/mlになるように [35S] -メチォニン溶液及びシスティン溶 液を加え、 一晩 (16時間） 反応し、 [35S] -メチォニンで標識した。
5) 培養液から、 細胞抽出液 （c) と培養上清 （m) をそれぞれ回収し、 それぞ れに 4X免疫沈降バッファー (1.6MKC1, 4¾ TritonX-100, 0.4M Tris-HCl, H 7.5, 2.5 mM EDTA, 5 mg/mlプロテア一ゼインヒビター， leupeptin, E- 64、 pepstatin, c ymostatin ) を培養液容量の 3分の 1加え、 さらにこれらの中に、 上記で得ら れた P A C E 4抗体産生クローンを加えて、 4t:にて一晩反応した。
6) これらに二次抗体として ProteinA-Sepharoseを 1加え、 4°Cにて 1時 間反応させ、上記で生成した抗原-抗体複合体を Protein A-Sepharoseに結合させ た。
7) 遠心 (12,000rpm, 1分) して上清を除き、 残った Protein A- Sepharoseゲル を IX免疫沈降バッファ一でサスペンドして、 上記と同様に遠心して上清を除去 する操作を 9回繰り返した。
8) 最後に得られた Protein A-Sepharoseゲルを 100 1の PBSで遠心洗浄し、 ゲルに SDS試料溶液 （4%SDS、 10%/3-メルカプトエタノール、 0.125M
Tris-HCl,pH6.8, 20%グリセロール、 0.002%ブロモフエノールブル一) を 20 1 添加して 100°Cで 2分間処理した。
9) これを遠心して上清を SDS- PAGEにかけた。電気泳動後、クマシ一ブルーでゲ ルを染色し、 脱色して、 増感剤でゲルを 30分間処理してゲルドライヤーで乾燥 させた。
10) 調製したゲルを X線フィルムに感光させて （― 80°Cで数日）、 現像した。
11) なお、比較試験として、上記べプチド（GIRP YID)に対する抗体産生クローン (PACE4抗体産生クローン：） に代えて、 PACE 4触媒領域に対する抗体 (anti-SCD) を用いて、 同様にして各酵素に対して免疫沈降試験を行った。
上記免疫沈降法の結果、 PACE 4とのみ反応し、 他の S PCファミリー （フ リン、 PC1、 PC6A、 PC6B、 及び： PC8) と全く反応しない抗体を産生する 2つのハイ ブリドーマクローン （1- D-l、 1-D-6) を分離した。 図 6にこれら 2つのハ イブリドーマクロ一ンの酵母細胞発現 PACE 4 (Δ680) に対するウエスタンブ ロットの結果を、また図7に：L-D-6クローンのHEK293細胞発現PACE4に対 するウェスタンプロットの結果を示す。 また、 図 8 (A) 〜（C) に免疫沈降の 結果を示す。
図 8 (A) に示すように、 比較試験で抗 S CD抗体 (anti-SCD) を抗体として 使用した場合は、 PC1， PC6A、 及び PACE4 (いずれも分泌酵素） の発 現細胞はいずれもその細胞抽出物（c)と培養上清の両方に anti-SCDと反応する バンドが確認された。 また、 フリン、 PC6B、 及び PC 8 (いずれも膜結合酵 素） の発現細胞のいずれにもその細胞抽出物 （c) に抗 S CD抗体 (anti-SCD) と反応するバンドが確認された （P C 6 Bは僅かに可溶化された sheddinng form が培養上清 (m)に検出された)。 なお、 分子量約 68kDaのパンドは Mock (外来遺伝 子を挿入しない空の発現ベクター） も含めて全ての細胞抽出液 （c) に認められ ることから、 細胞抽出液に由来する非特異的バンドであると判断された。
以上のことから、 PACE4の触媒領域 (SCD) を抗原として作製された抗 体（抗 S CD抗体 (anti-SCD)) は、全ての S P Cファミリーと反応して、 PAC E 4に対して特異的でないことが確認された。 なお、 PACE4の触媒領域 (S CD)の C末端側に位置するホモ Bドメインを抗原として作製した抗体 (抗 HomoB 抗体） も、 PACE 4 (PACE4-II, PACE4-I) だけでなく、 他の SPCファミリー (フリン、 PC1、 PC2、 PC6A、 PC6B、 及び PC8) とも反応して、 PACE 4に対し て特異的でないことが判明している （図 9)。
—方、 図 8 (B) 及び （C) に示すように、 ハイプリドーマクローン （ID— 1、 ID— 6) の培養上清 （m) を抗体として免疫沈降反応を行うと、 68kDaの 非特異バンド以外に検出されたバンドは、 P A C E 4の発現細胞 (細胞抽出液（ c ) 110kDa、 培養上清 （m) 103kDa) だけであった。 また、 これらのバンドは、 分子 量から、 抗 SCD抗体 (anti-SCD) について得られた PAC E 4のバンドと一致 した。 この結果から、 上記ハイプリドーマ （1D—1、 ID— 6) は、 SPCフ アミリーのうち PACE4とのみ結合する特異性の高いモノク口一ナル抗体を産 生していることが確認できた。 また、 SDS変性条件下で行ったウエスタンプロ ットの結果 （図 6、 7) から考えて、 上記モノクロ一ナル抗体は、 SDS変性状 態及び未変性状態の両方で P AC E と特異的に反応する抗体であることがわか る。
なお、 上記で得られたハイプリドーマ（1- D- 1) を、 「Mou s e Hyb r i doma— PACE4」 と命名し、 2002年 10月 1日付けで、 日本国茨城 県つくば巿東 1丁目 1番 1中央第 6に住所を有する独立行政法人産業技術総合研 究所 特許生物寄託センターに、微生物の表示：（寄託者が付した識別のための表 示） Mou s e Hy b r i doma— PACE4、 （受託番号） FERM P— 19048として国内寄託した。 そして、 それを 2003年 9月 29日にブ夕ぺ スト条約に基づく国際寄託に移管し、 （受託番号） FERM BP— 08498と して受託された。
(4) PACE 4モノクローナル抗体の精製
上記で得られたハイプリドーマクローン （1D— 1、 1D— 6) から、 下記の 方法に従つて PACE4モノクロ一ナル抗体を精製した。
まず八イブリドーマを 4.5g/L グルコース及び 10%ゥシ胎児血清、 及び抗生物 質 （ペニシリン G10万単 硫酸ストレプトマイシン 0.1g/L、 ゲンタマイシ ン 10 mg/L、 アンテホリン B 0.2 mg/L) を含む DMEM培地 （Sigma社） で培養 した。 コンフルェントに達した後、 細胞を PBSで 2回遠心洗浄し、 ゥシ胎児血 清フリーの 4.5g/Lグルコースと抗生物質を含む DMEM培地（Sigma社） に細胞 密度が 2〜3xl06Zmlになるように移し、 生存率が 10%以下であることを確認 した後、 培養上清を回収した。 遠心操作で不溶物を除去後、 P艮外ろ過、 硫安分画 によって濃縮した。 濃縮した培養液を PBSで透析し、 Protein G- Sepharose力 ラム (Aiersham- Pharmacia社) にかけ、 20mM sodium phosphate buffer, pH7.0 で洗浄後、抗体を 0.1 M Glycine- HC1、 pH2.7で溶出した。直ちに 1M Tris-HC 1, pH9.0で中和した後、 PBSで透析し、 限外ろ過法で濃縮した。 産業上の利用可能性
本発明のモノク口一ナル抗体は、 ズブチリシン様プロプロティンコンベルタ一 ゼ' PACE 4を特異的に認識し反応するため、 当該 PACE 4の特異的検出及 び特異的結合に有用である。 かかる本発明のモノクローナル抗体、 その抗体断片 またはこれらの標識物を利用した P A C E 4の特異的検出によれば、 生体組織に おける P A C E 4の発現分布を免疫化学的に調べることができ、 P A C E 4の生 理学的作用並びに意義をより詳細に解明することが可能となる。 また、 本発明の モノク口一ナル抗体、 その抗体断片またはこれらの標識物を利用した P A C E 4 の特異的検出法は、 PACE 4の異常発現 （発現亢進、 発現不全 Z減少） に関連 して生じる種々の疾患の免疫ィヒ学的及び免疫組織学的診断に有用である。
本発明のモノク口一ナル抗体、 特に後述の実施例に具体的に記載するマウス 由来のモノクローナル抗体は、 PACE 4に特異的結合性を有するヒト化抗体、 特にヒト型キメラ抗体ゃヒト型 CDR移植抗体の調製のために好適に使用するこ とができる。 力 るヒト型キメラ抗体やヒト型 CD R移植抗体は、 PACE4の 異常発現に関連して生じる種々の疾患の予防または治療に利用することが可能で ある。

Claims

請求の範囲
1. ズブチリシン様プロプロテインコンペルターゼのうち、 PACE4と反応 し、 フリン、 PC1、 PC2、 PC4、 PC6及び PC8とは反応しないことを 特徴とするモノクローナル抗体。
2. 配列番号 1のアミノ酸配列をェピトープ部として有するぺプチドに対する モノクローナル抗体である、 請求項 1に記載するモノクローナル抗体。
3. 配列番号 1のアミノ酸配列からなるぺプチドとキヤリァタンパクとの結合 物を抗原として調製される抗体である、請求項 1に記載するモノクローナル抗体。
4. 受託番号 FERM BP— 08498のハイブリドーマによって産生され る請求項 1に記載するモノク口一ナル抗体。
5. キメラ抗体である、 請求項 1に記載するモノクローナル抗体。
6. ヒト化抗体である、 請求項 1に記載するモノク口一ナル抗体。
7. ヒト化抗体が、 ヒト型キメラ抗体、 またはヒト型 CDR移植抗体である請 求項 6に記載するモノク口一ナル抗体。
8. ズブチリシン様プロプロテインコンペルターゼのうち、 PACE 4に反応 し、 フリン、 PC1、 PC2、 PC4、 PC 6及び PC 8とは反応しないことを 特徴とするモノク口一ナル抗体を産生するハイプリドーマ。
9. 上記モノクローナル抗体が、 配列番号 1のアミノ酸配列をェピトープ部と して有するペプチドに対する抗体である請求項 8に記載するハイプリド一マ。
1 0. 受託番号 FERM B P— 08498のハイブリドーマ （Mouse Hybridoma-PACE4) である請求項 8に記載するハイプリド一マ。
11. 請求項 8に記載するハイプリドーマを生体内または生体外で培養し、 そ の体液または培養物から P A C E 4に反応し、フリン、 PC1、 PC2、 PC4、 P C 6及び PC 8とは反応しないモノクローナル抗体を採取することを特徴とす る、 請求項 1に記載するモノクローナル抗体の製造方法。
12. 請求項 1に記載のモノクロ一ナル抗体、 PACE 4に対して特異的結合 性を有するその断片、 またはそれらの標識物を、 ズブチリシン様プロプロテイン コンベルタ一ゼ · P AC E 4に対する特異的結合試薬または特異的検出試薬とし て含む、 ズブチリシン様プロプロテインコンベルタ一ゼ' PACE4検出用試薬 十ット。
13. 請求項 1に記載のモノクローナル抗体、 PACE 4に対して特異的結合 性を有するその断片、 またはそれらの標識物を含有する、 ズプチリシン様プロプ ロティンコンベルターゼ · P A C E 4に対する特異的結合剤。
14. 更に薬学的に許容される担体を含有する、 請求項 13に記載する特異的 結合剤。
15. 請求項 1に記載のモノクローナル抗体、 PACE4に対して特異的結合 性を有するその断片、 またはそれらの標識物を、 ズブチリシン様プロプロテイン コンペルターゼ' PACE 4に対する特異的結合試薬または特異的検出試薬とし て用いる工程を有する、 ズプチリシン様プロプロテインコンペルターゼ' PAC E 4の特異的検出方法。
16. 下記の（a)、 （b)および（c)の工程を含む、ズプチリシン様プロプロテ ィンコンベル夕ーゼ - PACE4の異常発現に関連する疾患の治療に有効な物質 のスクリーニング方法：
(a)被験物質をズブチリシン様プロプロティンコンペルターゼ' PACE 4を発 現し得る細胞に接触させる工程、
(b)請求項 1に記載のモノクローナル抗体、 PACE 4に対して特異的結合性を 有するその断片、 またはそれらの標識物を用いて、 上記被験物質を接触させた細 胞におけるズブチリシン様プロプロテインコンベルタ一ゼ， PACE4の発現量 を測定し、 同様にして被験物質を接触させない上記に対応する対照細胞における ズブチリシン様プロプロティンコンベルタ一ゼ' PACE4の発現量を測定して、 両者を比較する工程、
(c) (b)の比較結果に基づいて、 ズブチリシン様プロプロテインコンベルタ一 ゼ* PACE 4の発現量を増加または低下させる被験物質を選択する工程。
17. ズブチリシン様プロプロテインコンペルターゼのうち、 PACE4と反 応し、 フリン、 PC1、 PC 2, PC4、 PC 6及び PC 8とは反応しないキメ ラ抗体の調製のための、 請求項 4に記載するモノクローナル抗体の使用。
18. キメラ抗体がヒト化抗体である請求項 17に記載の使用。
19. ヒト化抗体が、 ヒト型キメラ抗体、 またはヒト型 CDR移植抗体である 請求項 18に記載の使用。
20. 請求項 1に記載するモノクロ一ナル抗体、 PACE4に対して特異的結 合性を有するその断片、 またはその標識物の、 ズブチリシン様プロプロテインコ ンベルタ一ゼ* PACE 4検出用試薬キットまたはズブチリシン様プロプロティ ンコンベル夕ーゼ · P A C E 4に対する特異的結合剤の調製のための使用。
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