KR0140365B1 - 콜레스테롤 에스터라제를 특이적으로 인지하는 단세포군 항체와 이를 분비하는 융합세포주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 콜레스테롤 에스터라제를 특이적으로 인지하여 결합할 수 있는 단세포군 항체 단백질 및 이 항체를 분비하는 융합세포주에 관한 것이며 또한 이 융합세포주를 이용하여 상기 단세포군 항체 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

콜레스테롤 에스터라제를 특이적으로 인지하는 단세포군 항체와 이를 분비하는 융합세포주

제1도는 본 발명의 단세포군 항체를 이용하여 정제된 콜레스텔롤 에스터라제에 대한 면역블롯의 결과를 나타내며,

제2도는 본 발명의 단세포군 항체를 이용한 콜레스테롤 에스터라제의 쥐의 조직별 분포에 대한 면역블롯의 결과를 나타내며,

제3도는 본 발명의 단세포군 항체를 이용한 쥐 췌장에서의 생장단계별 콜레스텔롤 에스터라제의 면역 화학적인 조사를 나타낸다.

본 발명은 콜레스테롤 에스터라제를 특이적으로 인식할수 있는 단세포군 항체와 그 항체를 분비하는 융합 세포주에 관한 것이다. 본 발명의 목적은 콜레스테롤의 흡수에 중요한 역할을 하고 있는 효소인 콜레스테롤 에스터라제를 생체 또는 병리학적 시료로부터 간편하고 예민하게 검출 및 정량할 수 있는 수단으로서의 단세포군 항체, 이를 균질로 대량 생산할 수 있는 융합세포 및 이들 융합세포를 이용한 상기 단세포군 항체의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명에서 얻어진 단세포군 항체(이하 '본 발명의 항체'라 칭함)는 포유동물의 콜레스테롤 에스터라제에만 특이적으로 반응하는 성질을 갖고 있으며, 의학적인 진단, 연구와 기초 생물학 연구의 좋은 수단으로 이용되어 질 수 있다.

콜레스테롤은 보통 음식중에서는 대부분 콜레스테롤 에스터 형태로 존재하며, 섭취되면 십이지장에서 콜레스테롤 에스터라제에 의해 분배되어 나온 콜레스테롤 형태로 흡수된다.

콜레스테롤은 체내에서 여러가지 필수적인 역할을 담당하고 있지만, 혈중의 콜레스테롤 농도의 비 정상적인 증가는 고혈압 등의 각종 혈액 순환기계 질병을 유발하게 된다. 혈중의 콜레스테롤 농도는 주로 음식물로부터의 섭취량(300-500㎎/day)과 체내 생합성량(700-900㎎/day)에 의해 조절되고 있다(Sliskovic White, 1991, Trends Pharmacol. Sci, 12, 194).

콜레스테롤의 흡수는 음식에 존재하는 콜레스테롤의 함량에 따라서도 물론 증감이 있지만, 콜레스테롤 에스터를 콜레스테롤로 변환시키는 정도에 따라서도 영향을 받을 수 있다. 콜레스테롤 에스터라제는 췌장에서 생합성되어 보관되고 있다가 다른 소화 효소들과 함께 십이지장으로 분비되어 담즙산에 섞여 있는 콜레스테롤 에스터를 분해하게 된다. 포유 동물의 경우 체내에서 스테로이드 홀몬 합성등의 콜레스테롤이 많이 소요되는 성숙기에 췌장의 콜레스테롤 에스터라제의 합성과 분비가 증가되는 것이 알려져 있다(Cox, et al., 1990, Biochemistry 29, 3842).

콜레스테롤 에스터라제는 분자량이 72,000 인 폴리펩타이드로서 췌장에만 특이적으로 분포하고 있는 췌장의 아시나(acinar) 세포내의 성숙된 분비 소포체(vesicle)에만 존재하며 소화에 관여하고 있다(Rudd and Brockman, 1984, in Lipase, Elsevier, New York).

췌장의 세포 변화를 초래하는 여러가지 질병(췌장암, 췌장염등)의 초기 진단은 췌장의 해부학적인 위치와 증상의 복합성등으로 어려운 것으로 알려져 있다. 췌장 세포의 파괴를 가져오는 질병으로 인하여 아시나 세포로부터 콜레스테롤 에스터라제가 혈액주으로 혼입될 경우에 이를 감지하는 방법으로 여러가지 소화 효소들의 활성을 측정하는 방법들이 알려져 있다(Gornall, A. G., 1980 in Applied Biochemistry and Clinical Disorders, Harper Row Publishers, Inc., Hagerstown, U.S.A.). 이 경우, 효소 활성의 특이성 및 감도가 높지 않아서 정확한 진단의 어려움이 있다. 췌장에 특이적으로 존재하고 있는 콜레스테롤 에스터라제를 활성 측정이 아닌 효소 자체의 단백질량을 항체를 이용하여 정량하면, 특이성이 높고 예민한 측정 방법을 개발할 수 있는 것으로 판단된다. 현재까지 콜레스테롤 에스터라제에 대한 단세포군 항체의 개발은 없으며, 콜레스테롤 에스터라제 자체에 대한 성질과 생리 및 병리적 의미도 규명 초기 단계에 있어서, 본 항체는 임상진단에 있어서만 아니라, 연구의 중요한 수단으로 활용되어 질 수 있다.

이에 본 발명자들은 췌장의 콜레스테롤 에스터라제만 특이적으로 인지하여 결합할 수 있는 단세포군 항체 개발을 시도하였다. 즉, 본 발명은 소의 췌장으로부터 콜레스테롤 에스터라제를 순수분리 정제하고, 이것으로 생쥐(Balb/c)를 면역시킨 다음, 생쥐의 비장 세포를 분리하여 골수종(myeloma) 세포와 융합시킴으로써, 본 항체를 분비하면서 계속적으로 배야이 가능한 새로운 융합 세포주에 관한 것이며 또한 이 세포주를 배양하여 그 배양액으로부터 균질의 항체를 필요한 만큼 대량으로 생산할 수 있게 하는 방법에 관한 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 항체 제조방법을 구체적으로 설명하면, 본 발명의 항체는 항원으로서의 방법으로 소의 췌장으로부터 정제한 콜레스테롤 에스터라제를 생쥐에 면역시키고, 이 면역된 생쥐의 비장 세포와 마우스 골수종세포를 융합시켜 하이브리도마(hybridoma) 세포를 얻은 다음, 이 세포를 클로닝하여, 단백질을 인식할 수 있는 항체를 생산하는 단일클론을 선발한 후 이 클론을 배양하여 제조할 수 있다.

이러한 생쥐는 통상적인 방법에 따라 면역되어 진다. 곧 정맥내, 피하내, 복강내로 항원을 투여하게 되며, 더욱 상세하게는 14 내지 21 일마다 수차례에 걸쳐 항원을 투여하며, 마지막으로 한달간 쉬게한 후 또 한번 항원을 투여하여 총 투여량이 60내지 200㎍/생투가 되도록 한다. 통상적인 보조제로 프로인트(Freund)의 완전보조제(complete adjuvant)와 불완전 보조제 (incomplete adjuvant)를 필요에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 면역항원의 최종투여 후 3 일째에 비장세포를 제거하여 면역세포로 사용한다. 이와 융합시키기 위해 사용된 마우스 골수종 세포는 생존율 95%이상이며 로그 단계(log phase)중인 것을 사용한다.

면역된 세포들과 고수종 세포 사이의 융합은, 예를 들면 콜러와 밀스타인(Kohler, G and C. Milstein, 1975, Nature 256:495-497)의 방법과 같은 기본적으로 공지된 방법들 또는 이들을 변형한 방법들에 의하여 수행되어 진다.

면역된 세포들과 골수종 세포와 비율은 1:10 내지 1:5의 비율로 사용하며, 융합을 촉진시키기 위해, 50%의 분자량 1500 정도의 폴리에틸렌 글리콜(kodak, Cat. No. 840-4014)을 사용할 수 있고, 배지는 DMEM 배지 (Gibco Cat. No. 430-2800 Ec)등을 사용할 수 있다. 이러한 배지에는 일반적으로 10%(v/v) 소태아 혈정(Fetal bovine serum)이 첨가되어 사용된다. 융합된 세포는 HAT 배지(하이포샨틴, 아미노 프테린, 티미딘 함유)와 같은 통상적인 선별 배지에서 배양하여 융합되지 않은 세포들은 소멸시키고, 융합된 세포들을 선별적으로 자라게하여 분리할 수 있다.

이렇게 하여 얻어진 융합세포는 공지의 제한 희석법(in Current Protocols in Immunology, 1991, Wiley Interscience)으로 처리하여 원하는 항체를 생산하는 개개의 클론을 획득하여, 결국 단일클론 항체를 생산할 수 있게 된다.

원하는 항체를 생산하는 클론은 효소면역측정법(Enzyme Immounoassay, Antibiodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY(1988))에 의해 검색할 수 있으며, 이외에 통상적인 방법, 즉 플라크 방법(plaque method), 스포트 방법(spot method), 응집반응법, 오우터로니법(Ouchterlony Method) 및 방사능표식 면역검정법등이 사용될 수도 있다(Hybridoma methods moncolonal antibodies, Presearch and Debelopment 사 pp 30-53, 1982).

본 발명의 항체는 통상적인 방법으로 콜론을 배양한 상등액 또는 원하는 친화크로마토그라피등의 방법을 사용하여 용이하게 정제할 수 있다. 이렇게 하여 얻어진 본 발명의 단일 클론항체들을 소 뿐만 아니라 포유동물의 콜레스텔롤 에스테라제에 특이하게 반응성을 갖는다.

본 발명의 항체의 특성은 다음과 같다.

1) 본 항체는 표 1의 결과에서 알 수 있듯이 소의 콜레스테롤 에스테라제에 대한 생쥐에서 생성된 면역그로불린 G1의 균질한 단백질이다.

표 1. 콜레스테롤 에스터라제에 대한 단세포 항체의 subtyping

2) 본항체는 췌장으로부터 분리되는 분자량 72,000 과 67,000의 콜레스테롤 에스터라제를 모두 인식할 수 있다. 제1도에서 시료번호는 PL2 은 정체된 콜레스테롤 에스터라제를, SM 은 표준 분자량 표지를 각각 나타낸다.

소의 췌장으로부터 순수분리 정제된 콜레스테롤 에스터라제를 본항체로 면역블롯을 행하여 본 결과 분자량 72,000 과 67,000의 콜레스테롤 에스터라제가 모두 본 항체에 의하여 인식됨을 알 수 있다.

여기에서 얻은 본 항체를 이용하여 포유류의 조직별 콜레스테롤 에스터라제 분포를 측정할 수 있었고, 쥐의 생장단계에 따라 췌장에서 효소의 생합성이 변하는 것도 면역조직 화학적인 방법으로 측정가능하게 한다.

다음의 실시예는 본 발명을 좀더 구체적으로 설명하기 위해 제공되는 것이고 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

실시예1:콜레스텔롤 에스터라제에 대한 단세포군 항체를 분비하는 융합세포주의 제조

단계 1 면역

면역에는 생후 6-8주된 발브씨(Balb/c) 종자의 생쥐(한국화학연구소에서 입수)를 사용하였다. 정제된 콜레스테롤 에스터라제 20㎍ 씩을 같은 양의 완전 프로인트씨 보조제(Complete Freund's adjuvant)를 가하여 현탁액을 만들고 생쥐당 200㎕씩으로 복강내 주사하였다. 같은 방법으로 2주 간격씩 2번 더 주사하고 한달간 쉬게한 후 세포 융합을 하기 3일전에 생리식염수에 항원(25㎍)을 포함하는 100㎕를 복강내로 마지막 주사하였다.

단계 2 세포융합 및 배양

콜레스테롤 에스터라제로 마지막 면역한지 3일후에 면역된 생쥐의 비장을 꺼내어 10㎖의 세척액(10mM 헤피스(HEPES), pH 7.2)이 함유된 디엠이엠(DMEM)배양액(Gibco, Cat No. 430-2800 EC)으로 수회 세척하였다. 이를 60메쉬(mesh) 철망으로 눌러 터뜨리며 10㎖의 세척용 배지로 방울방울 떨어뜨려 비장으로 부터 비장 세포를 추출하였다. 세포융합은 계대 배양하여 유지하고 있는 발브씨 생쥐의 형질전환 세포종 세포인 Sp₂01-Ag를 사용하였다. 이 세포를 8-아자구아닌(8-azaguanine) 배지(20㎍/㎖의 8-아자구아닌, 20% 우태아 혈청 및 50㎍/㎖)로 분열할 때 원심분리하여 수확하고, 이를 10㎖의 세척용 배지에 부유시키고 50 배 희석한 후 혈구계수기(hemocytometer)로 세포수를 측정하였다. 세포 융합은 콜러와 밀스타인(1975, Nature 256:495-497)이 개발한 방법을 다소 변형시킨 방법으로 실시하였다. 1x10⁸개의 비장 세포와 2x10⁷개의 에스피투 형질 변환 세포종 세포를 50㎖ 원심 분리관에 옮기고 이를 세척한 다음 여기에 미리 37℃로 보온한 50% 폴리에틸렌글리콜 1500(PEG 1500)을 가하여 융합시켰다. 원심분리하여 침전된 세포를 해드(HAT) 배지로 증식시켜 융합에 의한 형질변환 세포를 선별하였다. 항체검색은 세포융합후 약 2주일쯤에 실시하였다.

단계 3 항체검색

융합 세포의 검색은 제2차 항체를 이용하여 시행 하였다. 96-웰 폴리스티렌 플레이트에 50㎕의 순수 정체된 콜레스테롤 에스터라제(5㎍/㎖)를 넣어 웰(Well) 벽에 흡착시켰다. 융합된 세포가 자라고 있는 웰로부터 50㎕의 배지를 취하여 콜레스텔롤 에스터라제가 도포된 웰에 넣어 항원-항체 결합을 유도한 다음, 50㎕의 1㎍/㎖ 퍼옥시다제가 결합된 염소 항-생쥐면역글로불린(goat anti-mouse IgG-conjugated peroxidase) 용액을 다시 각각 웰에 가하여 결합시켰다. 각각의 웰에 50㎕의 퍼옥시다제 기질 용역{100mM 인산-구연산 완충액, pH 4.4 에 10㎎/㎖ 2,2' -아지노비스(3-에틸벤즈치아졸린)황산(2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline)sulfonic acid) 및 0.02% 과산화수소를 녹인 액}을 가하여 발색시켜 표 2 에서 볼 수 있듯이 양성반응 결과가 나온 융합세포를 항체를 생성하는 세포로 결정하였다.

표 2. 콜레스테롤 에스터라제에 대한 단세포 항체의 검색

단계 4 융합세포의 클로닝

융합세포 클로닝을 위해서는 우선 세포 융합후 항체를 생성하는 융합세포를 검색하여 양성인 융합세포군을 24-웰 플레이트에 옮기고 해트 배지로 세포의 성장이 미드로그상태에 이르도록 증식시킨 다음, 이것을 단계적으로 희서과 배양을 계속하여 항체 생성 클로닝하였다. 양성 반응 결과가 나온 클론중 하느를 융합 세포주(hybridoma cell line) CE2-7로 명명하여 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국과학기술연구원 부설 유전자은행(KICTC)에 기탁번호 KCTC 0055BP 로 1992년 9월 19일자로 기탁하였다.

실시예 2:콜레스테롤 에스터라제에 특이적인 단세포군 항체의 생산

단계 1 융합세포주의 시험관내 대량 배양을 통한 단세포군 항체의 생산

단세포군 항체를 분비하는 상기 융합세포주를 20%우태아 혈청이 포함된 디엠이엠 배지에서 5%로 탄산가스로 조절하고, 섭씨 37도에서 배양시켰다. 세포가 충분히 자라서 배양액의 색깔이 노란빛을 나타낼 때, 새로운 배지를 10 배량 넣어서 계속 배양하였다. 이와 같은 방법으로 계속 세포수를 늘린 다음, 충분히 자라게 한 후, 1000xg에서 10분간 원심분리하여 세포를 제거하고 그 상층액에 있는 단세포군 항체를 이용하였다.

단계 2융합세포주를 생쥐 복강에 주입하여 복수로부터의 단세포군 항체 생산

제조된 콜레스테롤 에스터라제에 대한 단세포군 하체를 분비하는 융합세포를 상기 단계 1의 방법대로 대량 배양한 후 이를 수확하여 1주 전에 미리 1㎖에 프리스탄{pristane, (2, 6, 10,14-tetramethylpentadecane)}을 주사한 발브씨 생쥐의 복강에 주사하였다. 이로부터 대략 10일 전후하여 복수를 마리당 6-8㎖ 채취하고 이를 5000xg에서 10분간 원심분리하여 그 상층액을 얻었다.

단계 3 생산된 단세포군 항체의 정제

상기 단계 1에서 얻어진 배약 상층액은 그대로 정제에 사용될 수 있다. 단계 2에서 얻어진 복수 상층액은 동량의 결합 완충액(피어스사의 ImmunoPure Binding buffer)를 첨거하여 1000xg에서 10분간 원심분리하고 그 상층액을 취하여 결합 완충액으로 미리 평형을 이룬 단백질 에이-세파로스 4 비 컬럼(Pierce, Illinois, Cat. No 20334)에 부하하였다. 부하후 겔 부피의 5 배의 결합완충액으로 세척시켰다. 컬럼에 결합된 항체의 용출은 겔 부피의 2 배가 되는 용출완충액(피어스사의 ImmunoPure elution buffer)으로 용출한 후, 생리식염수에 대해 투석한 다음 적당한 양으로 분주하여 섭씨 -20도에 보관하였다. 이렇게 얻은 단세포군 항체 요액의 농도는 2㎎/㎖ 었다.

실시예 3: 단세포군 항체를 이용한 쥐의 조직별 콜레스테롤 에스터라제 분포 측정

단계 1 조직의 선별 및 단백질 추출

쥐의 각 조직들을 쥐를 죽인뒤에 바로 떼에내어 추출완충액(20mM 염산 트리스, 폐하 7.6, 1mM 에틸렌글리콜비스(베타-아미노에틸에테르)테트라아세트산, 2mM 페닐메틸설포닐플로라이드, 0.1mM 디치오트레이톨)을 넣어 분쇄한 다음, 100,000xg에서 1시간 원심분리하여 그 상층액을 측정에 사용하였다. 상층액의 총 단백질 농도를 측정하여 100㎍ 씩을 10% 에스디에스 전기영동겔에 넣어 분석하였다.

단계 2전기영동과 면역블롯

30mA의 전류로 전기영동을 한후 겔에 분리된 단백질들을 니트로셀룰로스막으로 전기적으로 이동시켰다. 니트로셀룰로스막의 여백을 소 알부민으로 결합시킨 다음, 발명된 단세포군 1차항체액(콜레스테롤 에스터라제에 대한 단세포군 항체를 5㎍/㎖농도로 2% 소 알부민이 녹아 있는 생리식염수에 녹인액)과 4시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응이 끝나면 1차 항체액을 제거하고 세척액(0.1% 트윈을 생리식염수에 녹인 액)으로 3차 10분씩 세척하였다. 퍼옥시다제가 결합된 염소 항-생쥐면역글로불린 0.25㎍/㎖(KPL, Co. 141807)을 10% 염소 혈청에 1/2000로 희석시킨 용액에서 2시간동안 반응시킨 다음, 1차 항체때와 같은 방법으로 세척하였다. 2%의 과산화수소와 0.02% 4-콜로로-1-나프톨액을 1:1로 섞은액에 블롯막을 넣어 발색 반응시켰다. 2분 반응시킨 다음, 증류수로 희석하여 발색반응을 중지시켰다. 그 결과는 제 2 도와 같으며, 제 2도에서 시료번호는 1, 뇌:2, 심장:3, 간:4, 허파:5, 비장:6, 신장:7, 정낭;8, 고환;9, 췌장;10, 근육;11, 피부;12, 부신;PL2, 정체된 콜레스테롤 에스터라제; S.M, 표준 분자량 표지를 가각 나타낸다. 본 항체를 이용하여 콜레스테롤 에스터라제의 조직별 분포를 조사해본 결과 췌장에서만 본 항체와 반응하는 단백질이 인지되었다. 이러한 결과는 본 항체의 특이성을 확인시켜주는 것이라고 볼 수 있다.

실시예 4:단세포군 항체를 이용한 쥐 췌장의 콜레스테롤 에스터라제 면역 조직화학적 조사

단계 1 쥐 췌장 시편의 제작

생후 40일 및 100일된 스프락돌리 종 쥐(한국화학연구소)를 각각 페노바르비탈로 마취시킨 다음, 고정액(0.1M 인산 완추액(폐하 7.2)에 파라포름알데히트를 4%로 넣은액) 200㎖로퍼퓨젼(perfusion)시켰다. 췌장을 잘라내어 같은 고정액으로 섭씨 4도에서 4시간동안 다시한번 고정시킨 다음, 오씨티(O.C.T)화합물(폴리비닐알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 다이메틸 벤질암모늄 클로라이드의 혼합물, BDH Co.)과 함께 얼렸다. 얼린 췌장을 10㎛두께로 크리오스탈에서 잘라서 젤라틴이 발라져 있는 유리 슬라이드에 접착시킨 다음 면역조직화학적 검사에 사용하였다.

단계 2 면역조직 화학적 염색

조직 박편을 공기중에서 건조시킨 다음, 5분간 2번씩 생리식염수에 담근 후, 비특이적 발색을 방지하기 위해 50㎕의 5% 염소 혈처액으로 2시간동안 배양하였다. 배야액을 따라 버린후, 50㎕의 상기 실시예 2의 단계 3에서 얻은 단세포군 항체액으로 섭씨 4도에서 밤새 반응시켰다. 시편을 생리식염수로 2회 세척한 후, 내재된 퍼옥시다제를 제거하기 위해 0.05% 과요오드산으로 배양시켰다. 생리식염수로 다시 2회 세척한 다음, 바이오틴이 결합된 염소의 항-생쥐면역글로불린 2차 항체액(BRL Co. 0.5㎍/㎖)으로 실온에서 30분간 반응시켰다. 같은 방법으로 세척한 다음, 아비딘-퍼옥시다제액(BRL Co. 10㎍/㎖)을 30분간 처리하여 결합시켰다. 시편에 3,3' -디아미노벤지딘- 염화닉켈을 0.01% 과산화수소수에 0.5%로 녹인액을 5분간 처리하여 발색시켰다. 메틸그린으로 대조 염색을 하여 광학 현미경하에서 관찰하고 사진을 찍었다. 그 결과 제3도에 나타난 바와 같은 결과를 얻었다. 제 3도에서 (a)는 생후 40일된 쥐의 췌장이며 (b)는 생후 100일된 쥐의 췌장으로 실험한 결과를 나타낸다. 이러한 결과를 통해 콜레스테롤 에스터라제의 발현이 발생단계에 따라 변화함을 알 수 있다.

Claims (5)

1. 콜레스테롤 에스터라제를 특이적으로 인지하여 결합할 수 있는 단세포군 항체 단백질.
2. 제1항의 항체를 분비하면서 계속 배양되어질 수 있는 융합세포주.
3. 제2항에 있어서, 융합세포주 CE2-7(기탁번호 KCTC 0055BP).
4. 제2항 또는 제3항의 융합세포주를 세포 배양 또는 복강 배양한 후 상등액 또는 복강액을 크로마토그래피하는 단계를 포함하는, 콜레스테롤 에스터라제를 특이적으로 인지하여 결합할 수 있는 단세포군 항체를 제조하는 방법.
5. 제1항의 항체를 이용함을 특징으로 하는, 콜레스테롤 에스터라제를 검출 및 측정하는 방법.