JP3336033B2 - 抗ヒト精液γ−グルタミルトランスペプチダーゼモノクローナル抗体、ハイブリドーマおよび前立腺疾患検出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト精液γ−グルタミ
ルトランスペプチダーゼに特異的なモノクローナル抗
体、そのモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ、および前立腺疾患の検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年増加の著しい前立腺癌や前立腺肥大
症等の前立腺疾患の診断法としては、触診や前立腺組織
で作られるマーカー物質である血清酸性ホスファターゼ
（ＡＣＰ）、前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、
前立腺特異抗原（ＰＡ）、ヒト精漿特異抗原であるγ−
セミノプロテイン（γ−Ｓｍ）等を測定することによっ
て行われている。しかしながら、これらのマーカーは、
例えば早期癌での陽性率の低値、疾患に対する特異性の
面で未だ完全なものとはいえず、診断や治療効果の判定
等においては、異なる複数のマーカーとの併用測定を必
要とすることも生じ、特異性の高いマーカーの開発が望
まれている。

【０００３】先に本発明者らは、ヒト精液中に高活性で
存在するγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（以下、
ヒト精液γ−ＧＴＰと称することがある）について、そ
の分子量が２５０ｋＤａで２つのサブユニット（９５ｋ
Ｄａおよび１５０ｋＤａ）をもつ糖タンパクであること
を解明した(Biochimica Biophysica Acta,1077,259-26
4,1991)。この結果、分子量が８４ｋＤａ（サブユニッ
ト：２２ｋＤａおよび６２ｋＤａ）であるヒト腎の膜結
合型γ−ＧＴＰとヒト精液γ−ＧＴＰとが明らかに異な
るもので、アミノ酸組成においても異なることが確認さ
れた。

【０００４】γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ
−ＧＴＰ、ＥＣ２．３．２．２）は一群のアイソザイム
からなる転移酵素であり、腎の尿細管、腸絨毛、毛細胆
管、膵および肝等に広く分布している。これらγ−ＧＴ
Ｐは、臨床検査の分野において各種疾患の指標として日
常的に測定されている。例えば、血中γ−ＧＴＰの上昇
は肝・胆道系疾患を、尿中γ−ＧＴＰの上昇は腎疾患を
それぞれ反映することが知られている。これらのγ−Ｇ
ＴＰの測定方法としては、発色性基質を用いた比色法が
一般的に用いられている。ヒト精液γ−ＧＴＰの測定方
法でも、一般的な血清中のγ−ＧＴＰ測定方法に従い、
γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド、γ−グルタミル
−β−ナフチルアミド、γ−グルタミル−３−カルボキ
シ−４−ヒドロキシアニリド等を基質とし、γ−ＧＴＰ
活性を比色法により定量する方法等が行われていた。し
かし、これらの方法では精液由来のγ−ＧＴＰや肝由来
のγ−ＧＴＰ等を区別することができないので、前立腺
疾患による精液特異γ−ＧＴＰの血中への流入を検査す
ることができなかった。さらに、法医学分野での物証学
的な応用においても、精液と他の体液との識別は、活性
測定のみでは十分満足のいくものではなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、新規な前立腺疾患のマーカーとして期待できる精液
特異γ−ＧＴＰの分子量およびアミノ酸組成が、肝疾患
等に伴って血中に遊離してくる膜結合型γ−ＧＴＰと異
なることに着目し、両者を明瞭に識別できる方法を開発
することにある。これらの課題を解決するべく鋭意研究
したところ、前記ヒト精液γ−ＧＴＰに特異的なモノク
ローナル抗体ＳＧ１、ＳＧ２およびＳＧ３を見出すこと
に成功し、これらのモノクローナル抗体を用いるとヒト
精液γ−ＧＴＰを免疫学的に迅速かつ特異的に検出でき
ることを見出した。本発明は、こうした知見に基づくも
のである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、ヒト
精液γ−ＧＴＰに特異的に反応し、腎由来γ−グルタミ
ルトランスペプチダーゼ及び肝由来γ−グルタミルトラ
ンスペプチダーゼと反応しないモノクローナル抗体を用
いて、血中のヒト精液γ−グルタミルトランスペプチダ
ーゼを分析することを特徴とする、前立腺疾患の検出方
法に関する。また、本発明は、受託番号がＦＥＲＭ Ｐ
−１２８８５、ＦＥＲＭ Ｐ−１２８８６、又はＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１２８８７であるハイブリドーマから分泌さ
れ、ヒト精液γ−グルタミルトランスペプチダーゼに特
異的に反応し、腎由来γ−グルタミルトランスペプチダ
ーゼ及び肝由来γ−グルタミルトランスペプチダーゼと
反応しないモノクローナル抗体に関する。更に、本発明
は、ヒト精液γ−グルタミルトランスペプチダーゼに特
異的に反応し、腎由来γ−グルタミルトランスペプチダ
ーゼ及び肝由来γ−グルタミルトランスペプチダーゼと
反応しないモノクローナル抗体を産生する、受託番号が
ＦＥＲＭ Ｐ−１２８８５、ＦＥＲＭ Ｐ−１２８８
６、又はＦＥＲＭ Ｐ−１２８８７であるハイブリドー
マにも関する。更にまた、本発明は、ヒト精液γ−グル
タミルトランスペプチダーゼに特異的に反応し、腎由来
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ及び肝由来γ−グ
ルタミルトランスペプチダーゼと反応しないモノクロー
ナル抗体を用いることを特徴とする、血中のヒト精液γ
−グルタミルトランスペプチダーゼの検出方法にも関す
る。

【０００７】以下、本発明をモノクローナル抗体、ハイ
ブリドーマおよび前立腺疾患の検出方法の順に説明す
る。免疫源として用いる精製ヒト精液γ−ＧＴＰは、例
えばBiochimica Biophysica Acta,1077,259-264,1991に
記載の方法に従って調製することができる。次に、精製
したヒト精液γ−ＧＴＰ免疫原溶液を用いて哺乳動物
（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギまたはウマ）
をイン・ビボ免疫法により免疫する。

【０００８】具体的には、例えば、精製したヒト精液γ
−ＧＴＰ免疫原溶液を等量のフロインド氏完全アジュバ
ントまたは不完全アジュバントと乳化するまで混合す
る。この混合液を、例えばマウスの皮下に投与する（第
１回免疫）。以後、２〜４週間の間隔で同様の操作を行
い、数回免疫する。最終免疫から数日後に脾臓を無菌的
に取り出し、ステンレスメッシュなどで押しつぶして脾
臓細胞を調製し、細胞融合工程に用いる。

【０００９】細胞融合に用いるもう一方の親細胞である
ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）としては、各種の公知の
細胞株、例えば、ｐ３（ｐ３／×６３−Ａｇ８）［Ｎａ
ｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）］、ｐ
３−Ｕ１［ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，
８１；１−７（１９７８）］、ＮＳ−１［Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６；５１１−５１９（１９７
６）］、ＭＰＣ−11［Ｃｅｌｌ，８；４０５−４１５
（１９７６）］、ＳＰ２／０［Ｎａｔｕｒｅ，２７６；
２６９−２７０（１９７８）］、ＦＯ［Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈ．，３５；１−２１（１９８０）］、×
６３．６．５５．３［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３；
１５４８−１５５０（１９７９）］、Ｓ１９４［Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．，１４８；３１３−３２３（１９７
８）］、またはラットにおけるＲ２１０［Ｎａｔｕｒ
ｅ，２７７；１３１−１３３（１９７９）］などを使用
することができる。

【００１０】免疫脾臓細胞とミエローマ細胞との細胞融
合は通常の方法で行うことができ、例えば、公知の融合
促進剤（ポリエチレングリコールまたはセンダイウイル
スなど）を用い、場合により補助剤（ジメチルスルホキ
シドなど）を用いることもできる。免疫脾臓細胞とミエ
ローマ細胞との使用比率も常法と同様でよく、例えば、
ミエローマ細胞に対して脾臓細胞を約１〜１０倍程度の
量で用いる。融合用培地としては、例えば、４０％（ｗ
／ｖ）ポリエチレングリコールを含むダルベッコ改変イ
ーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地等を用
いることができる。融合は、前記の培地内で免疫脾臓細
胞とミエローマ細胞とをよく混合することによって行
う。続いて、選別用培地（例えば、ＨＡＴ培地）を用い
てハイブリドーマ以外の細胞を除去し、ハイブリドーマ
培養上清の抗体産生の有無を、例えばＥＬＩＳＡ法によ
って測定し、目的とするハイブリドーマを分離する。

【００１１】こうして、ヒト精液γ−ＧＴＰと特異的に
反応するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ
を分離することができる。本発明者は、具体的には、ヒ
ト精液γ−ＧＴＰと特異的に反応する３種のモノクロー
ナル抗体、即ち、モノクローナル抗体ＳＧ１、ＳＧ２お
よびＳＧ３を分泌するハイブリドーマＳＧ１、ＳＧ２お
よびＳＧ３を分離した。これらのハイブリドーマは、通
常の培地で継代培養することができ、また液体窒素等の
中で容易に長期間保存することができる。

【００１２】また、前記のハイブリドーマを培養する培
地としては、ハイブリドーマの培養に適した任意の培地
を用いることができ、例えばＤＭＥＭにウシ胎児血清、
Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸および抗生物質（ペニ
シリンＧとストレプトマイシン）を含む培地やウシ胎児
血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地等が用いられる。

【００１３】前記のハイブリドーマの培養は、イン・ビ
トロの場合には例えば培地中で５％ＣＯ₂ 濃度および３
７℃で約３日間、またイン・ビボ例えばマウスの腹腔中
で培養する場合には約１４日間程度実施するのが好まし
い。

【００１４】前記のハイブリドーマ（特にはハイブリド
ーマＳＧ１、ＳＧ２およびＳＧ３）を常法によって培養
した培養液から、あるいは前記３種のいずれかのハイブ
リドーマを投与した適当な哺乳動物（例えばマウスまた
はラット）の腹水から、目的とするモノクローナル抗体
（特にはモノクローナル抗体ＳＧ１、ＳＧ２およびＳＧ
３）を分離し、精製することが可能である。

【００１５】このようにして製造された培養液またはマ
ウスの腹水からモノクローナル抗体を分離、精製する場
合にはタンパク質の単離、精製に一般的に用いられる方
法を用いることが可能である。そのような方法としては
硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、分子篩ゲル
を用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテイン
Ａ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィ
ー、透析、凍結乾燥の方法等がある。

【００１６】こうして得られた本発明のモノクローナル
抗体は、ヒト精液γ−ＧＴＰと特異的に反応する。特
に、本発明のモノクローナル抗体ＳＧ１、ＳＧ２および
ＳＧ３について、ＡＢＣ法（ａｂｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉ
ｎ−ｃｏｍｐｌｅｘによる染色法）に従い免疫染色を行
うと、免疫組織学的反応性は以下の通りである。 （１）モノクローナル抗体ＳＧ１は、精巣上体管、精嚢
および前立腺上皮細胞と特異的に反応する。 （２）モノクローナル抗体ＳＧ２は、前立腺と特異的に
反応する。 （３）モノクローナル抗体ＳＧ３は、精嚢上皮細胞の一
部と特異的に反応する。

【００１７】本発明による前立腺疾患の検出方法は、例
えば、上記の本発明によるモノクローナル抗体（即ち、
ヒト精液γ−ＧＴＰに特異性を示すモノクローナル抗
体、特には前記の３種のモノクローナル抗体ＳＧ１、Ｓ
Ｇ２および／またはＳＧ３）を用いて実施するので、精
度良くヒト精液γ−ＧＴＰを検出することができる。

【００１８】本発明の前立腺疾患検出方法に用いる被検
試料は、血中のヒト精液γ−ＧＴＰを分析可能な試料で
あれば特に制限されるものではないが、例えば、生体試
料、特には、血清又は血漿である。本発明の前立腺疾患
検出方法においては、被検試料中に存在するヒト精液γ
−ＧＴＰと由来を異にする各種γ−ＧＴＰの影響を避け
ることができる。

【００１９】本発明方法は、ヒト精液γ−ＧＴＰに特異
性を示すモノクローナル抗体を用いることを除けば、そ
れ以外の点で従来公知の免疫学的検出方法、例えばラジ
オイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ等を広く
利用することができる。

【００２０】より具体的には、固相（例えば、プレー
ト、ラテックス等の不溶性担体）に本発明のモノクロー
ナル抗体を公知の手段により固定し、被検試料と接触
後、標識化した二次抗体を反応させ、その標識物質由来
の信号を検出することで、被検試料中のヒト精液γ−Ｇ
ＴＰを測定する（いわゆるサンドイッチ法）ことができ
る。

【００２１】また、本発明のモノクローナル抗体を免疫
組織染色等に用いることもできる。例えば、組織切片あ
るいは細胞診スメア標本をアルコール固定後、本発明の
モノクローナル抗体を添加して反応させる。洗浄後、標
識化二次抗体を反応させ、その標識物由来の信号を検出
することで、組織中のヒト精液γ−ＧＴＰの存在の有無
を確認することができる。

【００２２】これらの二次抗体としては従来公知の、例
えばウサギ抗マウスＩｇＧ等を用いることができる。あ
るいは、一次抗体とは異なる別の本発明のモノクローナ
ル抗体を用いることもできる。

【００２３】このときの標識物質としては、従来公知の
物質を任意に選択し使用することができる。例えば放射
性同位体（³²Ｐ、³⁵Ｓ、 ³Ｈ等）、酵素（ペルオキシダ
ーゼ、アルカリホスファターゼ等）、蛍光物質（ＦＩＴ
Ｃ等）、発光物質（ルミノール、アクリジニウムエステ
ル等）を用いることができる。

【００２４】

【実施例】次に、本発明を実施例により更に詳細に説明
するが、本発明は以下の実施例によって限定されるもの
ではない。実施例１：抗ヒト精液γ−ＧＴＰ抗体産生ハイブリドー
マの作成 （ａ）ヒト精液γ−ＧＴＰの調製 ヒト精液γ−ＧＴＰは、ヒト精液より、Biochimica Bio
physica Acta,1077,259-264,1991に記載の方法に従って
得た。即ち、ヒト精液を遠心分離（３７０００×ｇ、３
０分間）して精漿を得た。この精漿に硫酸アンモニウム
（４５％飽和）を加え、３０分間攪拌を続けた後、遠心
分離（３７０００×ｇ、３０分間）して沈殿を分取し
た。上清液に硫酸アンモニウム（５０％飽和）を加え、
同様の操作を行った。沈殿を蒸留水に溶解し、２０mMト
リス塩酸緩衝液（pH８．５）に対して透析を行った。透
析した試料を、前もって同緩衝液で平衡化したＤＥ−５
２カラムに充填し、同緩衝液で洗浄した後、塩化ナトリ
ウム（０〜０．５Ｍ）含有２０mMトリス塩酸緩衝液（pH
８．５）による、リニア−グラジェントにより溶出を行
った。溶出液をトヨパールＤＥＡＥ−６５０Ｓ（東ソ
ー）カラムに充填し、上記と同様の操作を行い、溶出液
を凍結乾燥によって濃縮した。濃縮液を、０．１Ｍ塩化
ナトリウムを含む２０mMトリス塩酸緩衝液（pH８．５）
で平衡化したトヨパールＨＷ−６５（東ソー）でゲル濾
過し、同緩衝液で溶出した。同様の操作を行い、分子量
約２５０ｋＤａの精製ヒト精液γ−ＧＴＰを得た。

【００２５】（ｂ）免疫化脾臓細胞の調製 ヒト精液γ−ＧＴＰ免疫原溶液（タンパク質量：２００
μｇ／ml、活性：４Ｕ／ml、比活性：２０Ｕ／mgタンパ
ク質）を等量のフロインド氏完全アジュバントと乳化す
るまで混合し、その混合液３００μｌをＢａｌｂ／ｃ系
マウスの背の数か所に皮下注射した（第１回免疫）。２
週間後に同様の投与を行った（第２回免疫）。第２回免
疫から２６日経過後、免疫原溶液２５０μｌを、前記の
マウスの腹腔内に投与した（最終免疫）。最終免疫から
４日経過後、脾臓を無菌的にマウスから取り出し、次の
細胞融合工程に使用した。

【００２６】（ｃ）細胞融合 冷ＲＰＭＩ１６４０培地４mlを入れたシャーレに、無菌
的に抽出した前記の脾臓を入れた。次に、この脾臓細胞
を細かく刻みステンレスメッシュで濾しとった。細胞懸
濁液を１５ml遠心チューブに集め、５００×ｇで１０分
間遠心した。こうして得たペレットをＲＰＭＩ１６４０
培地で遠心法により２回洗浄し、生きている脾臓細胞数
を測定した。

【００２７】一方、予め培養しておいたマウスミエロー
マ細胞（骨髄腫細胞）ｐ３−Ｕ１約６×１０⁷ 個に前記
脾臓細胞２×１０⁵ 個を加え、ＲＰＭＩ１６４０培地中
でよく混合し、遠心分離を行った（５００×ｇ、１０分
間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐし、
４０％ポリエチレングリコール４０００溶液（３８℃に
保温）０．２mlを滴下し、遠心チューブを手で１分間穏
やかに回転することによってポリエチレングリコール溶
液と細胞ペレットとを混合させた。次に、３８℃に保温
しておいたＲＰＭＩ１６４０培地を１分間毎に１ml、１
ml、２ml、４ml、８mlの順で加えて、チューブを穏やか
に回転させた。この時、最後の８mlは、１０％ＦＣＳを
含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。次に、遠心分離
（５００×ｇ、１０分間）により上清を除去した後、１
５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＲＰＭＩ１６４０
培地にアミノプテリン４×１０^-7Ｍ、チミジン１．６×
１０^-5Ｍ、ヒポキサンチン１×１０^-4Ｍになるように添
加したもの）４５mlに懸濁した（３×１０⁵ 個／ウエ
ル）。この細胞懸濁液を９６ウエル細胞培養プレートの
各ウエルに９０μｌずつ分注し、５％炭酸ガスを含む炭
酸ガス培養器で３７℃にて培養を開始した。５日目に前
記のＨＡＴ培地５０μｌを加え、更にその３日後から
は、培養中、２〜３日間隔で各ウエルの培地を約１００
μｌ除き、新たに前記のＨＡＴ培地１００μｌを加える
ことによりＨＡＴ培地中で増殖するハイブリドーマを選
択した。１０日目に、後記のＥＬＩＳＡ法により、抗ヒ
ト精液γ−ＧＴＰ抗体産生ハイブリドーマをスクリーニ
ングした。

【００２８】（ｄ）ハイブリドーマの樹立 ハイブリドーマ培養液の上清における産生抗体の有無は
ＥＬＩＳＡ法により測定した。９６ウエルＥＬＩＳＡ用
プレート（Ｆａｒｃｏｎ）の各ウエルに粗精製ヒト精液
γ−ＧＴＰ希釈液（タンパク質量：０．１mg／ml、活
性：１．５Ｕ／ml、比活性：１５Ｕ／mgタンパク質、Ｐ
ＢＳで２０倍希釈した）５０μｌずつを分注し、４℃で
１夜放置した。次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢ
Ｓで３回洗浄した後、ブロッキング剤（ブロックエー
ス、大日本製薬）で２時間処理し、各ウエルに培養液上
清２０μｌを加え、２５℃で１時間反応させた。

【００２９】次に、Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで５００倍
に希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体（Ｋｉｒ
ｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂ．，Ｉｎ
ｃ．）５０μｌを各ウエルに加えた。反応終了後、０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで各ウエルを３回洗浄
し、１mM−ＡＢＴＳおよび０．０１５％過酸化水素水を
含む溶液１００μｌを各ウエルに加え、２５℃で３０分
間反応させ、各ウエルの４０５nmにおける吸光度を測定
した。その結果、４８０ウエル中、１４ウエルに抗体産
生が認められた。そのうち５ウエル中のハイブリドーマ
を限界希釈法によりクローニングした。限界希釈法は、
ＨＴ培地でハイブリドーマが５個／mlとなるように希釈
した細胞浮遊液を、予め正常Ｂａｌｂ／ｃ系マウスの腹
腔細胞がウエルあたり２×１０⁴ 個分注してある９６ウ
エルプレートの各ウエルに１００μｌずつ分注した。１
０日後、ＥＬＩＳＡ法によってヒト精液γ−ＧＴＰ特異
的抗体を産生するハイブリドーマのクローンをスクリー
ニングした。その結果、各ハイブリドーマにつき、２０
〜４０個の抗体産生クローンが得られた。これらのクロ
ーンの中から、増殖力が強く、抗体分泌能が高く、しか
も安定なクローンを選び、前記と同様の方法で再クロー
ン化を行い、３種の抗ヒト精液γ−ＧＴＰ抗体産生ハイ
ブリドーマＳＧ１、ＳＧ２およびＳＧ３を樹立した。

【００３０】実施例２：モノクローナル抗体の製造 （ａ）イン・ビトロ法 マウスハイブリドーマＳＧ１、ＳＧ２およびＳＧ３を、
それぞれ１５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＡ１６４０培
地で、３７℃で５％二酸化炭素雰囲気中において７２〜
９６時間培養した。培養物を遠心分離（１００００×
ｇ、１０分間）後、上清に固形の硫酸アンモニウムを５
０％最終濃度となるように徐々に加えた。混合物を氷冷
下で３０分間攪拌した後、６０分間放置してから遠心分
離（１００００×ｇ，１０分間）処理し、得られた沈渣
を少量のＰＢＳ（pH７．６）に溶解後、ＰＢＳに透析し
た。次に、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィ
ー（ＭＡＰＳ−II、バイオラッド社）により処理し、精
製した抗ヒト精液γ−ＧＴＰ特異モノクローナル抗体Ｓ
Ｇ１、同様にモノクローナル抗体ＳＧ２、およびモノク
ローナル抗体ＳＧ３の溶液を得た。

【００３１】（ｂ）イン・ビボ法 プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン）０．５mlを１０〜１２週齢のＣＤＦＩ系マウス
の腹腔内に投与し、それから１４〜２０日目のマウスの
腹腔内にインビトロで増殖されたハイブリドーマＳＧ
１、ＳＧ２およびＳＧ３をマウス一匹あたり５×１０⁶
個となるように接種した。

【００３２】各ハイブリドーマにつき一匹のマウスから
約１０〜１５mlの腹水が得られた。その抗体濃度は、２
〜１０mg／mlであった。腹水中のモノクローナル抗体の
精製は、前記のイン・ビトロ精製と同様の方法で行っ
た。

【００３３】実施例３：モノクローナル抗体の免疫グロ
ブリンクラスおよび特異性の同定 モノクローナル抗体ＳＧ１、ＳＧ２またはＳＧ３の免疫
グロブリンクラスの同定は、オクテロニー免疫拡散法に
より行った。その結果、ＳＧ１はＩｇＧ2a、κ−isotyp
e 、ＳＧ２およびＳＧ３はそれぞれＩｇＧ1 、κ−isot
ype であった。

【００３４】特異性の確認は以下の通りであった。 （１）９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレートの各ウエルに、
抗原としてヒト精液γ−ＧＴＰ（活性値：５０mU／m
l）、ヒト男女血清γ−ＧＴＰ（活性値：２９．４±２
５．２mU／ml、ｎ＝５）、腎由来γ−ＧＴＰ（活性値：
５０mU／ml）および肝由来γ−ＧＴＰ（活性値：５０mU
／ml）を５０μｌ分注し、公知の手段によって固定化し
た。モノクローナル抗体ＳＧ１、モノクローナル抗体Ｓ
Ｇ２およびモノクローナル抗体ＳＧ３を加えて免疫反応
させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで洗浄し
た。次にペルオキシダーゼ抗マウス抗体（濃度１μｇ／
ml）５０μｌを各ウエルに加え、洗浄後、実施例１と同
様の操作によってモノクローナル抗体の特異性を確認し
た。その結果、本発明の各モノクローナル抗体は、いず
れもヒト精液γ−ＧＴＰのみと反応性を示した。 （２）従来公知のイムノブロッティング法により試験を
行った結果、モノクローナル抗体ＳＧ１、ＳＧ２および
ＳＧ３はヒト精液γ−ＧＴＰのみに反応し、その他の腎
由来γ−ＧＴＰ、肝由来γ−ＧＴＰとは反応しなかっ
た。いずれのモノクローナル抗体もヒト精液γ−ＧＴＰ
の２つのサブユニットである１５０ｋＤａと９５ｋＤａ
に反応した。 （３）解剖屍体より摘出した男性生殖器（精巣、精巣上
体、精嚢および前立腺）を１０％ホルマリン固定後、パ
ラフィンに包埋し、それを４μｍの厚さに薄切し、脱パ
ラフィン操作を行った。この組織標本について、ＡＢＣ
法に従い免疫染色を行った。その結果は以下の通りであ
った。 （Ａ）モノクローナル抗体ＳＧ１は、精巣上体管、精嚢
および前立腺上皮細胞と特異的に反応した。 （Ｂ）モノクローナル抗体ＳＧ２は、前立腺と特異的に
反応した。 （Ｃ）モノクローナル抗体ＳＧ３は、精嚢上皮細胞の一
部と特異的に反応した。

【００３５】実施例４：ヒト精液γ−ＧＴＰの測定 モノクローナル抗体ＳＧ１またはＳＧ２を公知の手段に
より固相（９６穴プレート）に固定した。それに種々の
抗原としてヒト精液（γ−ＧＴＰ活性値：１．３±０．
７６〜９．９±０．１０mU／ml）、ヒト唾液（３．２±
０．５１mU／ml、ｎ＝３）、ヒト汗（４．３±０．４５
mU／ml、ｎ＝２）、男性血清（２７．３６±１８．２１
mU／ml、ｎ＝６）、女性血清（９．４２±１．６０mU／
ml、ｎ＝５）、腎由来γ−ＧＴＰ（４．２±０．７４〜
２００mU／ml）、および肝由来γ−ＧＴＰ（４．１±
０．３５〜１００mU／ml）を反応させた後、標識化した
モノクローナル抗体ＳＧ３（プロテインＡアフィニティ
クロマトグラフにより精製したＩｇＧに、ＮＨＳ−ＬＣ
−Ｂｉｏｔｉｎを結合させ、ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ化した
モノクローナル抗体ＳＧ３）を反応させ、常法により、
基質（ＡＢＣ法に従い、ａｂｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ−
ｃｏｍｐｌｅｘを反応させた後、パーオキシダーゼ−ｂ
ｉｏｔｉｎをＡＢＴＳにより発色）を加え、波長４０５
nmにて吸光度を測定した。その結果、ヒト精液のみが陽
性であった。その他の試料のＯ．Ｄ．は０．００５以下
であった。ヒト精液を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢ
Ｓで希釈していきヒト精液γ−ＧＴＰを測定した時、本
発明のモノクローナル抗体を使用した時の測定感度は、
２×１０⁵ 倍希釈精液まで検出可能（Ｏ．Ｄ．として
０．０５）であった。

【００３６】実施例５：前立腺疾患診断への応用 健常者血清１１検体、前立腺疾患々者血清１３検体につ
いて、実施例４に示したサンドイッチＥＬＩＳＡ法によ
り測定を行った結果を表１に示す。表１のように、健常
者に対して前立腺疾患々者血清中の精液γ−ＧＴＰ量は
明らかに有意に高値を示した。

【００３７】

【表１】

【００３８】また、生検あるいは摘出術によって得られ
た前立腺癌組織について、モノクローナル抗体ＳＧ１お
よびＳＧ２を用いてＡＢＣ法により免疫染色を行った結
果、中分化型から低分化型癌細胞が陽性を示した。ま
た、周囲の結合組織内に湿潤した癌細胞が、特に強陽性
に染色された。以上のように、ヒト精液γ−ＧＴＰは前
立腺疾患のマーカーとなることが確認された。

【００３９】なお、本発明によるハイブリドーマＳＧ
１、ＳＧ２およびＳＧ３は、それぞれ１９９２年３月１
８日に工業技術院微生物工業技術研究所に寄託された。
受託番号は、ハイブリドーマＳＧ１が微工研菌寄第１２
８８５号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２８８５）、ハイブリドー
マＳＧ２が微工研菌寄第１２８８６号（ＦＥＲＭ Ｐ−
１２８８６）、およびハイブリドーマＳＧ３が微工研菌
寄第１２８８７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２８８７）であ
る。

【００４０】

【発明の効果】本発明によれば、生体試料中のヒト精液
γ−ＧＴＰを、由来の異なるγ−ＧＴＰの影響を受ける
ことなく、特異的に、簡便かつ迅速に測定することがで
きる。従って、本発明は前立腺疾患等の診断および病理
研究、また法医学的分野に有用な手段を提供するもので
ある。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ // Ａ６１Ｂ 10/00 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｐ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏ ｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，1077 （1991），ｐ．259−264

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト精液γ−グルタミルトランスペプチ
   ダーゼに特異的に反応し、腎由来γ−グルタミルトラン
   スペプチダーゼ及び肝由来γ−グルタミルトランスペプ
   チダーゼと反応しないモノクローナル抗体を用いて、血
   中のヒト精液γ−グルタミルトランスペプチダーゼを分
   析することを特徴とする、前立腺疾患の検出方法。
2. 【請求項２】 受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−１２８８５、
   ＦＥＲＭ Ｐ−１２８８６、又はＦＥＲＭ Ｐ−１２８
   ８７であるハイブリドーマから分泌され、ヒト精液γ−
   グルタミルトランスペプチダーゼに特異的に反応し、腎
   由来γ−グルタミルトランスペプチダーゼ及び肝由来γ
   −グルタミルトランスペプチダーゼと反応しないモノク
   ローナル抗体。
3. 【請求項３】 ヒト精液γ−グルタミルトランスペプチ
   ダーゼに特異的に反応し、腎由来γ−グルタミルトラン
   スペプチダーゼ及び肝由来γ−グルタミルトランスペプ
   チダーゼと反応しないモノクローナル抗体を産生する、
   受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−１２８８５、ＦＥＲＭ Ｐ−
   １２８８６、又はＦＥＲＭ Ｐ−１２８８７であるハイ
   ブリドーマ。
4. 【請求項４】 ヒト精液γ−グルタミルトランスペプチ
   ダーゼに特異的に反応し、腎由来γ−グルタミルトラン
   スペプチダーゼ及び肝由来γ−グルタミルトランスペプ
   チダーゼと反応しないモノクローナル抗体を用いること
   を特徴とする、血中のヒト精液γ−グルタミルトランス
   ペプチダーゼの検出方法。