JP3124008B2 - ヒト92kDaゼラチナーゼに対するモノクローナル抗体およびその利用 - Google Patents
ヒト92kDaゼラチナーゼに対するモノクローナル抗体およびその利用Info
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Description
下、ヒトMMP-9と示す)に対するモノクローナル抗体に
関するものであり、また、このモノクローナル抗体を用
いて免疫組織化学的手法に基づき、組織中あるいは細胞
中のヒトMMP-9(潜在型または活性型)の検出方法に関
する。
反応性を有する抗ヒトMMP-9モノクローナル抗体ならび
にこのモノクローナル抗体を用いる免疫組織化学的手法
により、ヒトの組織中のヒトMMP-9を検出する方法に関
するものであり、かかる検出方法は、慢性関節リウマチ
疾患あるいは癌の診断に利用されるものである。
オグリカン、エラスチン、フィブロネクチンおよびラミ
ニンなどの粘着性糖蛋白質から構成される。これらマト
リックス成分の分解には、マトリックスメタロプロテア
ーゼ(MMP)と総称される、間質型コラゲナーゼ(MMP-
1)、72-kDaゼラチナーゼ(IV型コラゲナーゼ;MMP-
2)、92-kDaゼラチナーゼ(IV型コラゲナーゼ;MMP-9)
およびストロムライシン(トランジン;MMP-3)というそ
れぞれの酵素が重要な役割を果たしている。また、炎症
時にコラーゲン分解に関与する多形核白血球由来エラス
ターゼやカテプシンGに代表されるセリンプロテアーゼ
が注目されるようになってきた。MMPの遺伝子ファミリ
ーの代表的なものとしてヒトMMP-1、ヒトMMP-2、ヒトMM
P-3およびヒトMMP-9があり、それらの一次構造もすでに
決定されている。MMP-1とMMP-3の一次構造において両者
間に55%の相同性が認められており、いずれもN−末端
ドメイン、Zn2+結合ドメインおよびヘモペキシン凝血酵
素様C−末端ドメインの3つのドメインより構成されて
いる。MMP-2はさらに上記N−末端ドメインおよびZn2+
結合ドメイン間に58アミノ酸残基からなる構造が3つ繰
り返された構造をもつフィブロネクチン様コラーゲン結
合ドメインが付加されているものである。MMP-9がMMP-2
と大きく異なるところは、Zn2+結合ドメインとC−末端
ドメインの間に54アミノ酸残基からなり、プロリンに富
むV型コラーゲンのα2鎖によく似たドメイン、α2
(V)鎖様ドメインが挿入されている点である。
ると、MMP-1は基質特異性が高く、間質のI型コラーゲ
ン、II型コラーゲン、III型コラーゲンの他、X型
コラーゲンを分解する。また、弱いながらもゼラチンに
も作用する。MMP-2はゼラチン、IV型コラーゲンおよ
びV型コラーゲン、さらに弱いながらプロテオグリカン
コア蛋白質やフィブロネクチンも分解する。また、活性
は弱いが不溶性エラスチンも分解する。
線維芽細胞、ヒト肺マクロファージ、単球性白血病U937
細胞、線維肉腫HT1080細胞およびヒトケラチノサイトな
どにより産生され、ゼラチンやIV型コラーゲンを分解
するが、その基質特異性については、MMP-2と同様なの
かまだよく分っていない。
するヒト92kDaゼラチナーゼ(ヒトMMP-9)に対するモノ
クローナル抗体を製造することに成功した。また、この
モノクローナル抗体を用いてヒト組織中のヒトMMP-9を
免疫組織化学的に検出することに成功し、この検出方法
は、ヒト慢性リウマチ疾患または癌の診断に利用するこ
とができる。
する抗原決定基のうち、いずれか一つの抗原決定基のみ
に免疫反応性を有するモノクローナル抗体であって、潜
在型または活性型ヒトMMP-9と特異的に反応し、ヒト間
質型コラゲナーゼ、ヒトストロムライシン及びヒト72kD
aゼラチナーゼに免疫交差反応性を有しない抗ヒトMMP-9
モノクローナル抗体を提供するものであり、また、この
モノクローナル抗体を使用して、組織検体中のヒトMMP-
9を免疫組織化学的に分析する方法を提供するものであ
る。
体ならびにその製造方法に関しては、後に詳述する。本
発明に係る上記免疫組織化学的な分析としては、後掲の
実施例として一つの例示方法が示されているが、他に例
えば、標識物が付与された抗ヒトMMP-9抗体と検体とを
反応させ、洗浄後検体中に残った標識物を例えばジアミ
ノベンジジンなどの発色剤を用いて分析する、いわゆる
直接法、または、検体と抗ヒトMMP-9抗体とを反応さ
せ、洗浄後、標識物が付与された抗免疫グロブリンとさ
らに反応させ、洗浄後検体中に残った標識物を上記と同
様に分析する、いわゆる間接法があり、これらは、いず
れも本発明に適用される。これらの場合の標識物の例と
しては、酵素(ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファ
ターゼあるいはβ−D−ガラクトシダーゼなど)、化学
物質、螢光物質あるいは放射性同位元素などがある。一
方、標識物を付与する抗体としては、抗体含有物を硫酸
アンモニウムを加えることにより分画した後、DEAE−セ
ファセルの如き陰イオン交換ゲルによりあるいはProtei
nAカラムクロマトグラフィーにより精製したIgG画分、
さらには、ペプシン消化後、還元して得られる特異的結
合部分Fab'を用いることもできる。
の分析を可能とするものであり、その結果はヒト慢性リ
ウマチ疾患あるいは癌の診断において非常に有用なもの
である。以下、実施例により、本発明を具体的に説明す
る。ただし、本発明はこれらに限定されるものではな
い。なお、本発明の検出方法は、ヒトMMP-1及びヒトMMP
-2に対しても同様に適用されるものであるので、実施例
及び図面には、ヒトMMP-1及びヒトMMP-2についても合わ
せて記載している。
ーナル抗体および抗ヒトMMP-9モノクローナル抗体の作
製 (a)ヒトMMP-1ポリペプチド、ヒトMMP-2ポリペプチドお
よびヒトMMP-9ポリペプチドの調製 ヒトMMP-1ポリペプチドは、J.Biol.Chem.,261,6600−66
05(1986)に記載のGoldbergらのアミノ酸配列を、ま
た、ヒトMMP-2ポリペプチドおよびヒトMMP-9ポリペプチ
ドはそれぞれ、J.Biol.Chem.,263,6579−6587(1988)
に記載のCollierおよびJ.Biol.Chem.,264,17213−17221
(1989)に記載のWilhelmらのアミノ酸配列を用いた。
第1表に示したヒトMMP-1ポリペプチド(P−1〜P−
3)、ヒトMMP-2ポリペプチド(P−4〜P−8)およ
びヒトMMP-9ポリペプチド(P−9〜P−11)をそれぞ
れペプチドシンセサイザー9600(ミリジエン/バイオサ
ーチ)で合成した。なお、各ペプチドC末端にシステイ
ンを導入した。合成ペプチドの純度約70%以下のものは
μBondasphere(5μ、C18-100Å)カラムを用いて高速
液体クロマトグラフィーにより精製した。
たは各ポリペプチドとキーホールリンペットヘモシアニ
ンの複合体の調製 2mg牛血清アルブミン(BSA)を1mlの0.1Mリン酸緩衝
液(pH7.0)に溶解したもの、あるいは2mgキーホール
リンペットヘモシアニン(KLH)を1mlの0.1Mリン酸緩
衝液(pH7.5)に溶解したものと1.85mgN−(ε−malei
midocaproyloxy)succinimideを200μlのジメチルホル
ムアミドに溶解したものとを混合し、30℃、30分間イン
キュベーションした。次に上記の混合液を0.1Mリン酸
緩衝液(pH7.0)で平衡化したPD-10(ファルマシア)で
ゲル濾過した。マレイミドが結合されたBSAまたはマレ
イミドが結合されたKLHを分取し、1.5ml以下に濃縮し
た。マレイミドが結合されたBSAまたはマレイミドが結
合されたKLHに対し50倍モル量の前記(a)で合成した各ヒ
トMMP-1ポリペプチド、各ヒトMMP-2ポリペプチドあるい
は各ヒトMMP-9ポリペプチドを1mlの0.1Mリン酸緩衝液
(pH7.0)に溶解したものと混合した。4℃、20時間イ
ンキュベーションし、MMP-1ポリペプチド−BSA複合体ま
たはMMP-1ポリペプチド−KLH複合体、MMP-2ポリペプチ
ド−BSA複合体、MMP-9ポリペプチド−BSAおよびMMP-9ポ
リペプチド−KLH複合体をそれぞれ調製した。
ロイントアジュバントと共に8週令Balb/c雌マウスにそ
れぞれ腹腔内投与し、初回免疫した。15日後に0.1Mリ
ン酸緩衝液(pH6.0)に溶解した各複合体200μgを初回
免疫したそれぞれのマウスに腹腔内投与し追加免疫し
た。さらに、38日後に追加免疫時と同様に各複合体70μ
gを静脈内および130μgを腹腔内投与し、最終免疫と
した。その3日後に脾臓を摘出し、脾細胞懸濁液を調製
した。
ム(24mM)、ピルビン酸ナトリウム(1mM)、ペニシリ
ンGカリウム(50U/ml)、硫酸ストレプトマイシン
(50μg/ml)および硫酸アミカシン(100μg/ml)
を加え、ドライアイスでpHを7.2にし、0.2μm東洋メン
ブレンフィルターで除菌濾過した。 NS-1培地:上記RPMI1640培地に除菌濾過した仔牛胎児血
清(M.A.Bioproducts)を15%(v/v)の濃度になるように
加えた。 PEG4,000溶液:RPMI1640培地にポリエチレングリコール
4,000(PEG4,000、Merck&Co.)を50%(w/w)になるように
加え、無血清溶液を調製した。 8−アザグアニン耐性ミエローマ細胞SP2(SP2/O-Ag14)
との融合は、SelectedMethod in Cellular Immunology
(ed.B.B.Mishell and S. M.Shiigi)、W.H.Freeman and
Company(1980)、351−372に記載のOiらの方法を若干改
変して行った。
胞率100%)とミエローマ細胞(生細胞率100%)とを
5:1の割合で融合した。脾臓細胞とミエローマ細胞と
を別に前記のRPMI1640培地で洗浄し、次に同じ培地に懸
濁し、融合させるため上記の割合で混合した。容量250m
lのポリプロピレン製遠沈管(岩城硝子)を用い、40ml
のRPMI1640培地中400×g、10分間遠心し、上清を完全
に吸出した。沈殿細胞に37℃加温PEG4,000溶液6.0mlを
穏やかに撹拌しながら1分間で滴下し、さらに1分間撹
拌し細胞を再懸濁、分散させた。次に37℃加温RPMI1640
培地6.0mlを1分間で滴下した。この操作をさらに1回
繰り返した後、同培地42.0mlを2〜3分間で常に撹拌し
ながら滴下し細胞を分散させた。これを400×g、10分
間遠心分離し、上清を完全に吸引除去した。次にこの沈
殿細胞に37℃加温NS-1培地60mlを速やかに加え、細胞の
大きい塊を10mlのピペットを用いて注意深くピペッティ
ングして分散した。さらに同培地120mlを加えて希釈
し、ポリスチレン製96穴マイクロウエル(岩城硝子)に
ウエル当り6.0×105個/0.1mlの細胞を加えた。細胞を
加えた上記のマイクロウエルを7%炭酸ガス/93%空気
中で温度37℃、湿度100%下に培養に付した。
的増殖 (1)使用する培地は以下のとおりである。 HAT培地:前記(d)で述べたNS-1培地にさらにヒポキサン
チン(100μM)、アミノプテリン(0.4μM)およびチミジン
(16μM)を加えた。 HT培地:アミノプテリンを除去した以外は上記HAT培地
と同一組成のものである。
細胞にパスツールピペットでHAT培地2滴(約0.1ml)を
加えた。2、3、5、8、11日目に培地の半分(0.1m
l)を新しいHAT培地で置き換え、14日目に培地の半分を
新しいHT培地で置き換えた。以降3〜4日毎に培地の半
分を新しいHT培地で置き換えた。通常約2週間で充分な
ハイブリドーマの生育が観察される。ハイブリドーマ生
育全ウエルについて次項(f)記載の固相−抗体結合テス
ト法(ELISA)により陽性ウエルをチェックした。次にフ
ィーダーとして107個のマウス胸腺細胞を含むHT培地1m
lをポリスチレン製24穴セルウエル(岩城硝子)に加え
たものを用い、上記で検出された各陽性ハイブリドーマ
の全内容物を移した。これを前記(d)におけると同様に
7%炭酸ガス存在下、37℃で約1週間培養に付した。そ
の間1〜2回各ウエルの上清0.5mlを新しいHT培地0.5ml
と交換した。ハイブリドーマの充分生育した時点でELIS
A法により陽性を再確認し、それぞれについて次項(g)記
載の限界希釈法によるクローニングを行った。なお、ク
ローニングに使用後の残液をポリスチレン製25cm 2組織
培養フラスコ(岩城硝子)に移し、凍結保存用試料を調
製した。
トMMP-2抗体または抗ヒトMMP-9抗体産生ハイブリドーマ
の検索 Anal.Biochem. 104, 205〜214(1980)に記載のRennard
らの方法を若干改変した方法を用いた。この方法は、ハ
イブリドーマ抗体の検出に適している。96穴ミクロタイ
トレーションプレート(Flow Lab.)を100ngの各ヒトMM
P-1ポリペプチド、各ヒトMMP-2ポリペプチドあるいは各
ヒトMMP-9ポリペプチドでコートし、次に、未コート部
分を1%BSAでブロックした。これに前記(e)で得られた
ハイブリドーマ生育ウエルの上清の一部を加えて室温で
約1時間インキュベートした。2次抗体として西洋わさ
びペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン
(Cappel Lab.)を加え、さらに室温で約1時間インキュ
ベートした。次に基質である過酸化水素とo−フェニレ
ンジアミンを加え生成した褐色の程度をマイクロプレー
トリーダー(MRP-A4、東洋ソーダ)を用いて492nmの吸
光度を測定し判定した。
リドーマが生育している可能性があるので、限界希釈法
によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマを取得する。NS-1培地1ml当りフィーダー
として107個のマウス胸腺細胞を含むクローニング培地
を調製し、96穴マイクロウエルの36ウエル、36ウエルお
よび24ウエルにウエル当り5個、1個および0.5個のハ
イブリドーマを加えた。5日目、12日目に全ウエルに各
約0.1mlのNS-1培地を追加した。クローニング開始後14
〜15日で充分なハイブリドーマの生育が認められ、コロ
ニー形成陰性ウエルが50%以上である群についてELISA
法を行った。テストした全ウエルが陽性でない場合、抗
体陽性ウエル中のコロニー数を確認し、ウエル中に1コ
ロニーが確認されたウエルを4〜6個選び再クローニン
グする。最終的に第2、3および4表に示したように各
ヒトMMP-1ポリペプチド、ヒトMMP-2ポリペプチドまたは
ヒトMMP-9ポリペプチドに対するモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマを得た。
び生体内増殖 モノクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、得
られた各ハイブリドーマをNS-1培地などの適当な培養液
で培養(生体外増殖)し、その培養上清から10〜100μ
g/mlの濃度のモノクローナル抗体を得ることができ
た。一方、大量に抗体を得るためには脾細胞とミエロー
マ細胞の由来動物と同系の動物(Balb/cマウス)にマウ
ス1匹当り0.5mlの腫瘍形成促進剤プリスタン(2,6,10,
14−テトラメチルペンタデカン、Aldrich Chem.Co.)を
腹腔内投与した。1〜3週間後に、各ハイブリドーマ1
×107個を同じく腹腔内投与し、さらにその1〜2週間
後に生体内で産生された4〜7mg/mlのモノクローナル
抗体を含む腹水を得ることができた。
トMMP-2ポリペプチドあるいはヒトMMP-9ポリペプチドを
コートしたミクロタイトレーションプレートに、前記
(g)で得られた各モノクローンの培養上清を加えた。次
にPBSにより洗浄した後、アイソタイプ特異的ウサギ抗
マウスIg抗体(Zymed Lab.)を加えた。PBSによる洗浄
後、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG
(H+L)抗体を加え、基質として過酸化水素および2,2'−
アジノ−ジ(3−エチルベンゾチアゾリン硫酸)を用い
てそれぞれの重鎖および軽鎖を判定した。その結果をま
とめて後掲の第2、3および4表に示した。
で分画した後、IgGクラスの抗体について0.5M塩化ナト
リウム含有1.5Mグリシン−NaOH緩衝液(pH8.9)で平衡
化したプロテインAアフィゲル(Bio-Rad)カラムに吸着
させ、上記洗浄液で洗浄後、0.1Mクエン酸緩衝液(pH
5.0)で溶出することにより精製した。
i”(日水製薬)に重炭酸ナトリウム(31mM)およびL
−グルタミン(5mM)を加え、ドライアイスでpH7.2に
調整し、0.2μm東洋メンブレンで除菌濾過した。ヒト歯
髄から得た線維芽細胞を15%仔牛胎児血清を含むDMEM培
地で、5%CO2インキュベーター中、37℃、5日間培養
し、500rpm、5分間で遠心して集めた細胞を0.2%ラク
トアルブミン水解物および5units/ml遺伝子組換えヒ
トインターロイキン1αを含むDMEM培地中で6〜7日間
同様に培養した。500rpm、5分間で遠心後の上清を限外
濾過により約140倍に濃縮し、イムノブロッティング用
試料とした。
15%仔牛胎児血清を含むDMEM培地で5%CO2インキュベ
ーター中、37℃、6〜7日間培養し、遠心後の細胞を0.
2%ラクトアルブミン水解物および20units/ml Tumor N
ecrosis Factorα(TNFα)を含むDMEM培地で懸濁し、同
様に6〜8日間培養した。遠心後上清を限外濾過あるい
は3%トリクロロ酢酸(TCA)により濃縮し、イムノブロ
ッティング用試料とした。American Type Culture Coll
ectionから購入したヒト線維肉腫細胞HT1080を前記NS-1
培地で5%CO2インキュベーター中、37℃、2〜3日間
培養し、遠心後の細胞を2%ラクトアルブミン水解物お
よび100 units/ml TNFαを含むRPMI1640培地で懸濁
し、同様に7〜10日間培養した。700〜800rpm、3分間
の遠心上清を集め、限外濾過あるいは3%TCAにより濃
縮し、イムノブロッティング用試料とした。
ムを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した後、
細胞工学1&2、1061−1068(1983)に記載の田部の方
法に従ってウエスタンブロッティングを行い、各モノク
ローンの培養上清と反応後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ
抗マウス免疫グロブリン(Cappel Lab.)を用い、間接法
により免疫染色を行った。 抗ヒトMMP-1モノクローナル抗体の免疫反応性:第2表
に掲げられたモノクローナル抗体のうちヒト歯髄線維芽
細胞培養液から調製した試料を用いた場合、41-1E5、41
-16E11、49-6H4、49-9D3、49-10D9、49-14E3、49-16G
9、49-19B9および49-20F1の9つのクローンが陽性とし
て認められた。TNFαで刺激したヒトRA滑膜細胞培養液
から調製した試料を用いた場合、41-1E5、41-16E11、49
-2C2、49-4H5、49-5D7、49-6H4、49-8F11、49-9D3、49-
10D9、49-11F5、49-14E3、49-16G9、49-19B9、49-20F
1、49-22B1、70-4D9、70-6G8および70-13F1の18のクロ
ーンが陽性として認められた。
応性:第3表に掲げられたモノクローナル抗体のうち、
TNFαで刺激したヒトRA滑膜細胞培養液から調製した試
料を用いた場合、34-2H11、34-27A5、35-3F2、39-1H9、
39-4E4、39-11D11、39-12B7、39-18F3、42-2H2、42-5D1
1、42-14H5、43-3F9、45-2H8、45-6F12、45-14A8、45-1
5F9および45-17D8の17のモノクローナル抗体がヒトMMP-
2と反応した。 抗ヒトMMP-9モノクローナル抗体の免疫反応性:第4表
に掲げられたモノクローナル抗体のうち、TNFαで刺激
したHT1080細胞培養液から調製した試料を用いた場合、
56-2A4、56-4F11、56-6D1、57-6G2および57-13D8の5つ
のモノクローナル抗体がヒトMMP-9と反応した。
ル抗体が他のMMPまたは他の蛋白質と交差反応するかど
うかをみるために、TNFαで刺激したヒトRA滑膜細胞培
養液またはHT1080細胞のそれぞれの培養液から調製した
試料を用いてイムノブロッティングにより各抗MMPモノ
クローナル抗体の特異性を調べた。 各ヒトMMPの分子量:TNFαで刺激されたヒトRA滑膜細胞
培養液から調製した試料中には、イムノブロッティング
により検出できる量のヒトMMP-1、ヒトMMP-2およびヒト
MMP-3が存在しており、各々のヒトMMPの分子量は、潜在
型MMP-1が55kDaおよび52kDa、活性化されたMMP-1が45kD
a、42kDa、28kDaおよび27kDaであり、潜在型MMP-2が72k
Da、活性型MMP-2が67kDa、また潜在型MMP-3が57kDa、活
性型MMP-3が50kDaおよび46kDaであった。同様にTNFαで
刺激されたHT1080細胞培養液から調製した試料中に検出
される潜在型MMP-9は92kDaで、活性型MMP-9は84kDaであ
った。
性:TNFαで刺激したヒトRA滑膜細胞あるいはHT1080細
胞培養液から調製した試料をイムノブロッティングに供
した場合、70-4D9、70-6G8および70-13F1の各モノクロ
ーナル抗体については、それぞれ、分子量55kDaおよび5
2kDaのバンドのみ検出され、41-1E5、49-2C2、49-6H4、
49-9D3、49-10D9、49-14E3、49-16G9、49-19B9、49-20F
1および49-22B1の各モノクローナル抗体については、そ
れぞれ、分子量55kDa、52kDa、45kDa、42kDa、28kDaお
よび27kDaのバンドが検出され、その他のバンドは認め
られなかった。また、49-4H5、49-5D7および49-8F11の
各モノクローナル抗体については、分子量55kDa、52kD
a、45kDaおよび42kDaのバンドが検出され、分子量28kDa
および27kDaのバンドは検出されなかった。一方、ヒト
潜在型MMP-1とヒト潜在型MMP-3の分子量が近似している
ため、p−アミノフェニル酢酸第二水銀を試料中に加え
ることにより、両者を活性型にした後、イムノブロッテ
ィング法により分析した結果、分子量50kDaおよび46kDa
のバンドは認められなかった。従って、これらの各抗ヒ
トMMP-1モノクローナル抗体は、ヒトMMP-2、ヒトMMP-
3、ヒトMMP-9または細胞培養液中の他の蛋白質と交差反
応しないことが示され、ヒトMMP-1分子に特異的に反応
することが示された。
性:TNFαで刺激したヒトRA滑膜細胞あるいはHT1080細
胞培養液から調製した試料をイムノブロッティングに供
した場合、前記(b)の陽性モノクローナル抗体のうち、3
4-2H11、39-1H9および42-14H5の各モノクローナル抗体
はヒトMMP-9と交差反応を示し、42-2H2および42-14H5の
各モノクローナル抗体は、ヒトMMP-1およびヒトMMP-3と
交差反応を示した。それ以外のモノクローナル抗体につ
いては、他のヒトMMPまたは細胞培養液中の他の蛋白質
と反応せず、ヒトMMP-2に対して特異的に反応すること
が示された。
性:TNFαで刺激したヒトRA滑膜細胞培養液から調製し
た試料をイムノブロッティングに供した場合、56-2A4、
56-4F11、56-6D1、57-6G2および57-13D8の5つのモノク
ローンから得られた各抗体は、他のヒトMMPまたは培養
液中の他の蛋白質と交差反応せず、ヒトMMP-9に特異的
に反応することが示された。以上イムノブロッティング
による結果を第5表にまとめた。
在下で3時間培養した。この材料をペリオデイト−リジ
ン−パラホルムアルデヒド固定し、パラフィン切片を作
製した。脱パラフィンしたこれらの切片を、内因性ペル
オキシダーゼを過酸化水素でブロックした後、実施例1
および2でスクリーニングした抗体のうち、41-1E5(抗
ヒトMMP-1)、42-5D11(抗ヒトMMP-2)または56-2A4(抗
ヒトMMP-9)のモノクローナル抗体を用い、上記切片と反
応させた。次に、この切片を0.14M塩化ナトリウム含有
20mMリン酸緩衝液(pH7.4)で十分洗浄し、ビオチン化
ウマ抗マウスIgG(H+L)と反応後、さらにアビジン−ビ
オチン−ペルオキシダーゼ複合体(Vector Lab.)と反
応させた。PBSによる洗浄後、基質として過酸化水素お
よびジアミノベンジジンを用いて発色させた。また、La
b-Tekスライドチャンバー(Miles)上で培養したHT1080
細胞をTNFαで刺激後、56-2A4(抗ヒトMMP-9)のモノク
ローナル抗体を用い、上記と同様に免疫染色した。
ヒトMMP-1)モノクローナル抗体を用いた場合、ヒトRA滑
膜表層細胞が強く染色された。42-5D11(抗ヒトMMP-2)
モノクローナル抗体を用いた場合、ヒトRA表層細胞下層
の線維芽細胞が陽性像として認められた。一方、図2a
及び図2bに示したように56-2A4(抗ヒトMMP-9)モノク
ローナル抗体を用いた場合、HT1080細胞および横紋筋肉
腫が強く染色された。以上のことから、41-1E5、42-5D1
1または56-2A4のモノクローナル抗体は、パラフィン切
片によるRAあるいは癌患者の免疫組織染色に使用できる
ことが明らかになった。
ル抗体(クローン41-1E5)で染色した時の染色像(×30
0)を示す写真図である。
ル抗体(クローン42-5D11)で染色した時の染色像(×15
0)を示す写真図である。
モノクローナル抗体(クローン56-2A4)で染色した時の
染色像(×300)を示す写真図である。
抗体(クローン56-2A4)で染色した時の染色像(×300)
を示す写真図である。
Claims (2)
- 【請求項1】ヒト92kDaゼラチナーゼに存在する抗原決
定基のうち、いずれか一つの抗原決定基のみに免疫反応
性を有するモノクローナル抗体であって、潜在型または
活性型ヒト92kDaゼラチナーゼと特異的に反応し、ヒト
間質型コラゲナーゼ、ヒトストロムライシン及びヒト72
kDaゼラチナーゼに免疫交差反応性を有しない抗ヒト92k
Daゼラチナーゼモノクローナル抗体。 - 【請求項2】組織検体中のヒト92kDaゼラチナーゼを免
疫組織化学的に分析することにおいて、請求項1に記載
のモノクローナル抗体を使用することを特徴とする、ヒ
ト92kDaゼラチナーゼの検出方法。
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---|---|---|---|
JP11251105A JP3124008B2 (ja) | 1999-09-06 | 1999-09-06 | ヒト92kDaゼラチナーゼに対するモノクローナル抗体およびその利用 |
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-
1999
- 1999-09-06 JP JP11251105A patent/JP3124008B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Biochem.J.,Vol.269,No.1,p.183−187 |
J.Biol.Chem.,Vol.261(1986),No.14,p.6600−6605 |
J.Biol.Chem.,Vol.263(1988),No.14,p.6579−6587 |
J.Biol.Chem.,Vol.264(1989),No.29,p.17213−17221 |
Also Published As
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