JP3081638B2 - ヒト７２ｋＤａゼラチナーゼに対するモノクローナル抗体およびその利用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［技術分野］ 本発明は、ヒト72kDaゼラチナーゼ（以下、ヒトMMP−
２と記す）に対するモノクローナル抗体に関するもので
あり、また、このモノクローナル抗体を用いて免疫組織
化学的手法に基づき、組織中あるいは細胞中のヒトMMP
−２（潜在型または活性型）を検出する方法に関する。
さらに詳しくは、本発明は、抗ヒトMMP−２モノクロー
ナル抗体及びその製造方法および上記モノクローナル抗
体を用いる免疫組織化学的手法により、慢性関節リウマ
チ患者あるいは癌患者の組織中のヒトMMP−２の染色像
と健常人の組織のそれとを対比することにより、慢性関
節リウマチ疾患あるいは癌の診断に利用することができ
る方法に関するものである。

［背景技術］ 細胞外マトリックスはコラーゲン、プロテオグリカ
ン、エラスチン、フィブロネクチンおよびラミニンなど
の粘着性糖蛋白質から構成される。これらマトリックス
成分の分解には、マトリックスメタロプロテアーゼ（MM
P）と総称される、間質型コラゲナーゼ（MMP−１）、72
kDaゼラチナーゼ（IV型コラゲナーゼ;MMP−２）、92kDa
ゼラチナーゼ（IV型コラゲナーゼ;MMP−９）およびスト
ロムライシン（トランジン;MMP−３）というそれぞれの
酵素が重要な役割を果たしている。また、炎症時にコラ
ーゲン分解に関与する多形核白血球由来エラスターゼや
カテプシンＧに代表されるセリンプロテアーゼが注目さ
れるようになってきた。

MMPの遺伝子ファミリーの代表的なものとしてヒトMMP
−１、ヒトMMP−２、ヒトMMP−３およびヒトMMP−９が
あり、それらの一次構造もすでに決定されている。MMP
−１とMMP−３の一次構造において両者間に55％の相同
性が認められており、いずれもＮ−末端ドメイン、Zn²⁺
結合ドメインおよび、ヘモペキシン凝結酵素様Ｃ−末端
ドメインの３つのドメインより構成されている。MMP−
２はさらに上記Ｎ−末端ドメインおよびZn²⁺結合ドメイ
ン間に58アミノ酸残基からなる構造が３つ繰り返された
構造をもつフィブロネクチン様コラーゲン結合ドメイン
が付加されているものである。MMP−９がMMP−２と大き
く異なるところは、Zn²⁺結合ドメインとＣ−末端ドメイ
ンの間に54アミノ酸残基からなり、プロリンに富むＶ型
コラーゲンのα２鎖によく似たドメイン、α２（Ｖ）鎖
様ドメイン、が挿入されている点である。

次に、各MMPの基質特異性についてみてみると、MMP−
１は基質特異性が高く、間質のＩ型コラーゲン、II型コ
ラーゲン、III型コラーゲンの他、Ｘ型コラーゲンを分
解する。また、弱いながらもゼラチンにも作用する。MM
P−２はゼラチン、IV型コラーゲンおよびＶ型コラーゲ
ン、さらに弱いながらプロテオグリカンコア蛋白質やフ
ィブロネクチンも分解する。また、活性は弱いが、不溶
性エラスチンも分解する。

一方、MMP−９は、SV−40形質転換ヒト胎児肺線維芽
細胞、ヒト肺マクロファージ、単球性白血病U937細胞、
線維肉腫HT1080細胞およびヒトケラチノサイトなどによ
り産生され、ゼラチンやIV型コラーゲンを分解するが、
その基質特異性については、MMP−２と同様なのかまだ
よく分っていない。

［発明の開示］ 本発明者らは、ヒト72kDaゼラチナーゼ（ヒトMMP−
２）に対し、特異的に反応するモノクローナル抗体を製
造することに成功した。また、このモノクローナル抗体
を用いて組織検体中のヒトMMP−２を免疫組織化学的手
法により検出することに成功し、この検出法は、ヒト慢
性リウマチ疾患または癌の診断に利用することができ
る。

したがって、本発明は、ヒト72kDaゼラチナーゼに存
在する抗原決定基のうち、いずれか一つの抗原決定基の
みに免疫反応性を有するモノクローナル抗体であって、
潜在型または活性型72kDaゼラチナーゼに免疫反応性を
有し、ヒト間質型コラゲナーゼ、ヒトストロメライシン
及びヒト92kDaゼラチナーゼに免疫交差反応性を有しな
い抗ヒト72kDaゼラチナーゼモノクローナル抗体を提供
するものであり、また、このモノクローナル抗体を使用
して、組織検体中のヒト72kDaゼラチナーゼを免疫組織
化学的手法により検出する方法を提供するものである。

本発明により提供されるモノクローナル抗体ならびに
それらの製造方法に関しては、後に詳述する。本発明に
係る上記免疫組織化学的な分析としては、後掲の実施例
として一つの例示方法が示されているが、他に例えば、
標識物が付与された抗ヒトMMP−２抗体と検体とを反応
させ、洗浄後検体中に残った標識物を例えばジアミノベ
ンジジンなどの発色剤を用いて分析する、いわゆる直接
法、または、検体と抗ヒトMMP−２抗体とを反応させ、
洗浄後、標識物が付与された抗免疫グロブリンとさらに
反応させ、洗浄後検体中に残った標識物を上記と同様に
分析する、いわゆる間接法があり、これらは、いずれも
本発明に適用される。これらの場合の標識物の例として
は、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファダー
ゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼなど）、化学物
質、螢光物質あるいは放射性同位元素などがある。一
方、標識物を付与する抗体としては、抗体含有物を硫酸
アンモニウムを加えることにより分画した後、DEAE−セ
ファセルの如き陰イオン交換ゲルによりあるいはProtei
n Aカラムクロマトグラフィーにより精製したIgG画分、
さらには、ペプシン消化後、還元して得られる特異的結
合部分Fab′を用いることもできる。

本発明の方法は、被検試料中のヒトMMP−２の検出を
可能とするものであり、その検出結果は、ヒト慢性リウ
マチ疾患あるいは癌の診断において非常に有用なもので
ある。

以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。た
だし、本発明はこれらに限定されるものではない。

なお、本発明の検出方法は、ヒトMMP−１及びヒトMMP
−９に対しても同様に適用されるものであるので、実施
例及び図面には、ヒトMMP−１及びヒトMMP−９について
も合わせて記載している。

実施例１ 抗ヒトMMP−１モノクローナル抗体、抗ヒトMMP−２モノ
クローナル抗体および抗ヒトMMP−９モノクローナル抗
体の作製 （ａ）ヒトMMP−１ポリペプチド、ヒトMMP−２ポリペプ
チドおよびヒトMMP−９ポリペプチドの調製 ヒトMMP−１ポリペプチドは、J.Biol.Chem.,261,6600
−6605（1986）に記載のGoldbergらのアミノ酸配列を、
また、ヒトMMP−２ポリペプチドおよびヒトMMP−９ポリ
ペプチドはそれぞれ、J.Biol.Chem.,263,6579−6587（1
988）に記載のCollierおよびJ.Biol.Chem.,264,17213−
17221（1989）に記載のWilhelmらのアミノ酸配列を用い
た。

第１表に示したヒトMMP−１ポリペプチド（Ｐ−１〜
Ｐ−３）、ヒトMMP−２ポリペプチド（Ｐ−４〜Ｐ−
８）およびヒトMMP−９ポリペプチド（Ｐ−９〜Ｐ−1
1）をそれぞれペプチドシンセサイザー9600（ミリジエ
ン／バイオサーチ）で合成した。なお、各ペプチドＣ末
端にシステインを導入した。合成ペプチドの純度約70％
以下のものはμBondasphere（５μ、C18−100Å）カラ
ムを用いて高速液体クロマトグラフィーにより精製し
た。

（ｂ）各ポリペプチドと牛血清アルブミンまたは各ポリ
ペプチドとキーホールリンペットへモシアニンの複合体
の調製 2mg牛血清アルブミン（BSA）を1mlの0.1Mリン酸緩衝
液（pH7.0）に溶解したもの、あるいは2mgキーホールリ
ンペットヘモシアニン（KLH）を1mlの0.1Mリン酸緩衝液
（pH7.5）に溶解したものと1.85mgN−（ε−maleimido
−caproyloxy）succinimideを200μのジメチルホルム
アミドに溶解したものとを混合し、30℃、30分間インキ
ュベーションした。次に上記の混合液を0.1Mリン酸緩衝
液（pH7.0）で平衡化したPD−10（ファルマシア）でゲ
ル過した。

マレイミドが結合されたBSAまたはマレイミドが結合
されたKLHを分取し、1.5ml以下に濃縮した。マレイミド
が結合されたBSAまたはマレイミドが結合されたKLHに対
し50倍モル量の前記（ａ）で合成した各ヒトMMP−１ポ
リペプチド、各ヒトMMP−２ポリペプチドあるいは各ヒ
トMMP−９ポリペプチドを1mlの0.1Mリン酸緩衝液（pH7.
0）に溶解したものと混合した。４℃、20時間インキュ
ベーションし、MMP−１ポリペプチド−BSA複合体または
MMP−１ポリペプチド−KLH複合体、MMP−２ポリペプチ
ドBSA複合体、MMP−９ポリペプチド−BSAおよびMMP−９
ポリペプチド−KLH複合体をそれぞれ調製した。

（ｃ）抗体産生細胞の調製 前記（ｂ）の方法により調製した各複合体250μｇを
完全フロイントアジュバントと共に８週令Balb/c雌マウ
スにそれぞれ腹腔内投与し、初回免疫した。15日後に0.
1Mリン酸緩衝液（pH6.0）に溶解した各複合体200μｇを
初回免疫したそれぞれのマウスに腹腔内投与し追加免疫
した。さらに、38日後に追加免疫時と同様に各複合体70
μｇを静脈内および130μｇを腹腔内投与し、最終免疫
とした。その３日後に脾臓を摘出し、脾細胞懸濁液を調
製した。

（ｄ）細胞融合 （１）以下の材料および方法を用いた。

RPMI 1640培地:RPMI 1640（Flow Lab.）に重炭酸ナト
リウム（24mM）、ピルビン酸ナトリウム（1mM）、ペニ
シリンＧカリウム（50U/ml）、硫酸ストレプトマイシン
（50μg/ml）および硫酸アミカシン（100μg/ml）を加
え、ドライアイスでpHを7.2にし、0.2μｍ東洋メンブレ
ンフィルターで除菌過した。

NS−１培地：上記RPMI 1640培地に除菌過した仔牛
胎児血清（M.A.Bioproducts）を15％（v/v）の濃度にな
るように加えた。

PEG 4,000溶液:RPMI 1640培地にポリエチレングリコ
ール4,000（PEG 4,000、Merck ＆Co.）を50％（w/w）に
なるように加え、無血清溶液を調製した。

８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞SP2（SP2/0−Ag
14）との融合は、Selected Method in Cellular Immuno
logy（ed.B.B.Mishell and S.M.Shiigi）、W.H.Freeman
and Company（1980）、351−372に記載のOiらの方法を
若干改変して行った。

（２）前記（ｃ）で調製した有核脾臓細胞（生細胞10
0％）とミエローマ細胞（生細胞率100％）とを5:1の割
合で融合した。脾臓細胞とミエローマ細胞とを別に前記
のRPMI 1640培地で洗浄し、次に同じ培地に懸濁し、融
合させるため上記の割合で混合した。容量250mlのポリ
プロピレン製遠沈管（岩城硝子）を用い、400mlのRPMI
1640培地中400×ｇ、10分間遠心し、上清を完全に吸出
した。沈殿細胞に37℃加温PEG 4,000溶液6.0mlを穏やか
に撹拌しながら１分間で滴下し、さらに１分間撹拌し細
胞を再懸濁、分散させた。次に37℃加温RPMI 1640培地
6.0mlを１分間で滴下した。この操作をさらに１回繰り
返した後、同培地42.0mlを２〜３分間で常に撹拌しなが
ら滴下し細胞を分散させた。これを400×ｇ、10分間遠
心分離し、上清を完全に吸引除去した。次にこの沈殿細
胞に37℃加温NS−１培地60mlを速やかに加え、細胞の大
きい塊を10mlのピペットを用いて注意深くピペッティン
グして分散した。さらに同培地120mlを加えて希釈し、
ポリスチレン製96穴マイクロウエル（岩城硝子）にウエ
ル当り6.0×10⁵個/0.1mlの細胞を加えた。細胞を加えた
上記のマイクロウエルを７％炭酸ガス/93％空気中で温
度37℃、湿度100％下に培養に付した。

（ｅ）選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖 （１）使用する培地は以下のとおりである。

HAT培地：前記（ｄ）で述べたNS−１培地にさらにヒ
ポキサンチン（100μＭ）、アミノプテリン（0.4μＭ）
およびチミジン（16μＭ）を加えた。

HT培地：アミノプテリンを除去した以外は上記HAT
培地と同一組成のものである。

（２）前記（ｄ）の培養開始後翌日（１日目）、細胞
にパスツールピペットでHAT培地２滴（約0.1ml）を加え
た。２、３、５、８、11日目に培地の半分（0.1ml）を
新しいHAT培地で置き換え、14日目に培地の半分を新し
いHT培地で置き換えた。以降３〜４日毎に培地の半分を
新しいHT培地で置き換えた。通常約２週間で充分なハイ
ブリドーマの生育が観察される。ハイブリドーマ生育全
ウエルについて次項（ｆ）記載の固相−抗体結合テスト
法（ELISA）により陽性ウエルをチェックした。次にフ
ィーダーとして10⁷個のマウス胸腺細胞を含むHT培地1ml
をポリスチレン製24穴セルウエル（岩城硝子）に加えた
ものを用い、上記で検出された各陽性ハイブリドーマの
全内容物を移した。これを前記（ｄ）におけると同様に
７％炭酸ガス存在下、37℃で約１週間培養に付した。そ
の間１〜２回各ウエルの上清0.5mlを新しいHT培地0.5ml
と交換した。ハイブリドーマの充分生育した時点でELIS
A法により陽性を再確認し、それぞれについて次項
（ｇ）記載の限界希釈法によるクローニングを行った。
なお、クローニングに使用後の残液をポリスチレン製25
cm²組織培養フラスコ（岩城硝子）に移し、凍結保存用
試料を調製した。

（ｆ）ELISA法による抗ヒトMMP−１抗体、抗ヒトMMP−
２抗体または抗ヒトMMP−９抗体産生ハイブリドーマの
検索 Anal.Biochem.104,205〜214（1980）に記載のRennard
らの方法を若干改変した方法を用いた。この方法は、ハ
イブリドーマ抗体の検出に適している。96穴ミクロタイ
トレーションプレート（Flow Lab.）を100ngの各ヒトMM
P−１ポリペプチド、各ヒトMMP−２ポリペプチドあるい
は各ヒトMMP−９ポリペプチドでコートし、次に、未コ
ート部分を１％BSAでブロックした。これに前記（ｅ）
で得られたハイブリドーマ生育ウエルの上清の一部を加
えて室温で約１時間インキュベートした。２次抗体とし
て西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グ
ロブリン（Cappel Lab.）を加え、さらに室温で約１時
間インキュベートした。次に基質である過酸化水素とｏ
−フェニレンジアミンを加え生成した褐色の程度をマイ
クロプレートリーダー（MRP−A4、東洋ソーダ）を用い
て492nmの吸光度を測定し判定した。

（ｇ）クローニング 前記（ｅ）の操作後、各ウエル中には、２種以上のハ
イブリドーマが生育している可能性があるので、限界希
釈法によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産
生ハイブリドーマを取得する。NS−１培地1ml当りフィ
ーダーとして10⁷個のマウス胸腺細胞を含むクローニン
グ培地を調製し、96穴マイクロウエルの36ウエル、36ウ
エルおよび24ウエルにウエル当り５個、１個および0.5
個のハイブリドーマを加えた。５日目、12日目に全ウエ
ルに各約0.1mlのNS−１培地を追加した。クローニング
開始後14〜15日で充分なハイブリドーマの生育が認めら
れ、コロニー形成陰性ウエルが50％以上である群につい
てELISA法を行った。テストした全ウエルが陽性でない
場合、抗体陽性ウエル中のコロニー数を確認し、ウエル
中に１コロニーが確認されたウエルを４〜６個選び再ク
ローニングする。最終的に第２、３および４表に示した
ように各ヒトMMP−１ポリペプチド、ヒトMMP−２ポリペ
プチドまたはヒトMMP−９ポリペプチドに対するモノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。

（ｈ）モノクローナル抗体に生体外増殖および生体内増
殖 モノクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、
得られた各ハイブリドーマをNS−１培地などの適当な培
養液で培養（生体外増殖）し、その培養上清から10〜10
0μg/mlの濃度のモノクローナル抗体を得ることができ
た。一方、大量に抗体を得るためには脾細胞とミエロー
マ細胞の由来動物と同系の動物（Balb/cマウス）にマウ
ス１匹当り0.5mlの腫瘍形成促進剤プリスタン（2,6,10,
14−テトラメチルペンタデカン、Aldrich Chem.Co.）を
腹腔内投与した。１〜３週間後に、各ハイブリドーマ１
×10⁷個を同じく腹腔内投与し、さらにその１〜２週間
後に生体内で産生された４〜7mg/mlのモノクローナル抗
体を含む腹水を得ることができた。

（ｉ）モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖 前述したELISA法に従って、ヒトMMP−１ポリペプチ
ド、ヒトMMP−２ポリペプチドあるいはヒトMMP−９ポリ
ペプチドをコートしたミクロタイトレーションプレート
に、前記（ｇ）で得られた各モノクローンの培養上清を
加えた。次にPBSにより洗浄した後、アイソタイプ特異
的ウサギ抗マウスIg抗体（Zymed Lab.）を加えた。PBS
による洗浄後、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
ウサギIgG（Ｈ＋Ｌ）抗体を加え、基質として過酸化水
素および2,2′−アジノ−ジ（３−エチルベンゾチアゾ
リン硫酸）を用いてそれぞれの重鎖および軽鎖を判定し
た。その結果をまとめて後、掲の第２、３および４表に
示した。

（ｊ）モノクローナル抗体の精製 前記（ｈ）で得られた各腹水を40％飽和硫酸アンモニ
ウムで分画した後、IgGクラスの抗体について0.5M塩化
ナトリウム含有1.5Mグリシン−NaOH緩衝液（pH8.9）で
平衡化したプロテインＡアファゲル（Bio−Rad）カラム
に吸着させ、上記洗浄液で洗浄後0.1Mクエン酸緩衝液
（pH5.0）で溶出することにより精製した。

実施例２ イムノブロッティング （ａ）材料の調製 DMEM培地:Dulbecco's Modified Eagle Me−dium“Nis
sui"（日水製薬）に重炭酸ナトリウム（31mM）およびＬ
−グルタミン（5mM）を加え、ドライアイスでpH7.2に調
整し、0.2μｍ東洋メンブレンで除菌過した。

ヒト歯髄から得た線維芽細胞を15％仔牛胎児血清を含
むDMEM培地で、５％CO₂インキュベーター中、37℃、５
日間培養し、500rpm、５分間で遠心して集めた細胞を0.
2％ラクトアルブミン水解物および5units/ml遺伝子組換
えヒトインターロインキ１αを含むDMEM培地中で６〜７
日間同様に培養した。500rpm、５分間で遠心後の上清を
限外過により約140倍に濃縮し、イムノブロッティン
グ用試料とした。

ヒト慢性関節リウマチ（RA）滑膜細胞を、15％仔牛胎
児血清を含むDMEM培地で５％CO₂インキュベーター中、3
7℃、６〜７日間培養し、遠心後の細胞を0.2％ラクトア
ルブミン水解物および20units/ml Tumor Necrosis Fact
orα（TNFα）を含むDMEM培地で懸濁し、同様に６〜８
日間培養した。遠心後上清を限外過あるいは３％トリ
クロロ酢酸（TCA）により濃縮し、イムノブロッティン
グ用試料とした American Type Culture Collectionから購入したヒト
線維肉腫細胞HT1080を前記NS−１培地で５％CO₂インキ
ュベーター中、37℃、２〜３日間培養し、遠心後の細胞
を２％ラクトアルブミン水解物および100units/ml TNF
αを含むRPMI 1640培地で懸濁し、同様に７〜10日間培
養した。700〜800rpm、３分間の遠心上清を集め、限外
過あるいは３％TCAにより濃縮し、イムノブロッティ
ング用試料とした。

（ｂ）免疫染色 実施例２−（ａ）で調製した試料をドデシル硫酸ナト
リウムを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した
後、細胞工学１＆２、1061−1068（1983）に記載の田部
の方法に従ってウエスタンブロッティングを行い、各モ
ノクローンの培養上清と反応後、ペルオキシダーゼ標識
ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Cappel Lab.）を用い、
間接法により免疫染色を行った。

抗ヒトMMP−１モノクローナル抗体の免疫反応性：第
２表に掲げられたモノクローナル抗体のうちヒト歯髄線
維芽細胞培養液から調製した試料を用いた場合、41−1E
5、41−16E11、49−6H4、49−9D3、49−10D9、49−14E
3、49−16G9、49−19B9および49−20F1の９つのクロー
ンが陽性として認められた。TNFαで刺激したヒトRA滑
膜細胞培養液から調製した試料を用いた場合、41−1E
5、41−16E11、49−2C2、49−4H5、49−5D7、49−6H4、
49−8F11、49−9D3、49−10D9、49−11F5、49−14E3、4
9−16G9、49−19B9、49−20F1、49−22B1、70−4D9、70
−6G8および70−13F1の18のクローンが陽性として認め
られた。

抗ヒトMMP−２モノクローナル抗体の免疫反応性：第
３表に掲げられたモノクローナル抗体のうち、TNFαで
刺激したヒトRA滑膜細胞培養液から調製した試料を用い
た場合、34−2H11、34−27A5、35−3F2、39−1H9、39−
4E4、39−11D11、39−12B7、39−18F3、42−2H2、42−5
D11、42−14H5、43−3F9、45−2H8、45−6F12、45−14A
8、45−15F9および45−17D8の17モノクローナル抗体が
ヒトMMP−２と反応した。

抗ヒトMMP−９モノクローナル抗体の免疫反応性：第
４表に掲げられたモノクローナル抗体のうち、TNFαで
刺激したHT1080細胞培養液から調製した試料を用いた場
合、56−2A4、56−4F11、56−6D1、57−6G2および57−1
3D8の５つのモノクローナル抗体がヒトMMP−９と反応し
た。

（ｃ）特異性 前記（ｂ）の免疫染色で陽性となった各抗MMPモノク
ローナル抗体が他のMMPまたは他の蛋白質と交差反応す
るかどうかをみるために、TNFαで刺激したヒトRA滑膜
細胞培養液またはHT1080細胞のそれぞれの培養液から調
製した試料を用いてイムノブロッティングにより各抗MM
Pモノクローナル抗体の特異性を調べた。

各ヒトMMPの分子量:TNFαで刺激されたヒトRA滑膜細
胞培養液から調製した試料中には、イムノブロッティン
グにより検出できる量のヒトMMP−１、ヒトMMP−２、お
よびヒトMMP−３が存在しており、各々のヒトMMPの分子
量は、潜在型MMP−１が55kDaおよび52kDa、活性化され
たMMP−１が45kDa、42kDa、28kDaおよび27kDaであり、
潜在型MMP−２が72kDa、活性型MMP−２が67kDa、また潜
在型MMP−３が57kDa、活性型MMP−３が5kDaおよび46kDa
であった。同様にTNFαで刺激されたHT1080細胞培養液
から調製した試料中に検出される潜在型MMP−９は92kDa
で活性型MMP−９は84kDaであった。

抗ヒトMMP−１モノクローナル抗体の特異性:TNFαで
刺激したヒトRA滑膜細胞あるいはHT1080細胞培養液から
調製した試料をイムノブロッティングに供した場合、70
−4D9、70−6G8および70−13F1の各モノクローナル抗体
については、それぞれ、分子量55kDaおよび52kDaのバン
ドのみ検出され、41−1E5、49−2C2、49−6H4、49−9D
3、49−10D9、49−14E3、49−16G9、49−19B9、49−20F
1および49−22B1の各モノクローナル抗体については、
それぞれ、分子量55kDa、52kDa、45kDa、42kDa、28kDa
および27kDaのバンドが検出され、その他のバンドは認
められなかった。また、49−4H5、49−5D7および49−8F
11の各モノクローナル抗体については、分子量55kDa、5
2kDa、45kDaおよび42kDaのバンドが検出され、分子量28
kDaおよび27kDaのバンドは検出されなかった。一方、ヒ
ト潜在型MMP−１とヒト潜在型MMP−３の分子量が近似し
ているため、ｐ−アミノフェニル酢酸第二水銀を試料中
に加えることにより、両者を活性型にした後、イムノブ
ロッティング法により分析した結果、分子量50kDaおよ
び46kDaのバンドは認められなかった。従って、これら
の各抗ヒトMMP−１モノクローナル抗体は、ヒトMMP−
２、ヒトMMP−３、ヒトMMP−９または細胞培養液中の他
の蛋白質と交差反応しないことが示され、ヒトMMP−１
分子に特異的に反応することが示された。

抗ヒトMMP−２モノクローナル抗体の特異性:TNFαで
刺激したヒトRA滑膜細胞あるいはHT1080細胞培養液から
調製した試料をイムノブロッティングに供した場合、前
記（ｂ）の陽性モノクローナル抗体のうち、34−2H11、
39−1H9および42−14H5の各モノクローナル抗体はヒトM
MP−９と交差反応を示し、42−2H2および42−14H5の各
モノクローナル抗体は、ヒトMMP−１およびヒトMMP−３
と交差反応を示した。それ以外のモノクローナル抗体に
ついては、他のヒトMMPまたは細胞培養液中の蛋白質と
反応せず、ヒトMMP−２に対し特異的に反応することが
示された。

抗ヒトMMP−９モノクローナル抗体の特異性:TNFαで
刺激したヒトRA滑膜細胞培養液から調製した試料をイム
ノブロッティングに供した場合、56−2A4、56−4F11、5
6−6D1、57−6G2および57−13D8の５つのモノクローン
から得られた各抗体は、他のヒトMMPまたは培養液中の
他の蛋白質と交差反応せず、ヒトMMP−９に特異的に反
応することが示された。

以上イムノブロッティングによる結果を第５表にまと
めた。

実施例３ 免疫組織染色 ヒトRA滑膜組織および横紋筋肉腫を２μＭモネンシン
存在下で３時間培養した。この材料をペリオデイト−リ
ジン−パラホルムアルデヒド固定し、パラフィン切片を
作製した。脱パラフィンしたこれらの切片を、内因性ペ
ルオキシダーゼを過酸化水素でブロックした後、実施例
１および２でスクリーニングした抗体のうち、41−1E5
（抗ヒトMMP−１）、42−5D11（抗ヒトMMP−２）または
56−2A4（抗ヒトMMP−９）のモノクローナル抗体を用
い、上記切片と反応させた。次に、この切片を0.14M塩
化ナトリウム含有20mMリン酸緩衝液（pH7.4）で十分洗
浄し、ビオチン化ウマ抗マウスIgG（Ｈ＋Ｌ）と反応
後、さらにアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合
体（Vector Lab.）と反応させた。PBSによる洗浄後、基
質として過酸化水素およびジアミノベンジジンを用いて
発色させた。また、Lab−Tekスライドチャンバー（Mile
s）上で培養したHT1080細胞をTNFαで刺激後、56−2A4
（抗ヒトMMP−９）のモノクローナル抗体を用い、上記
と同様に免疫染色した。

第１図に示したように41−1E5（抗ヒトMMP−１）モノ
クローナル抗体を用いた場合、ヒトRA滑膜表層細胞が強
く染色された。42−5D11（抗ヒトMMP−２）モノクロー
ナル抗体を用いた場合、ヒトRA表層細胞下層の線維芽細
胞が陽性像として認められた。一方、第２図に示したよ
うに56−2A4（抗ヒトMMP−９）モノクローナル抗体を用
いた場合、HT1080細胞および横紋筋肉腫が強く染色され
た。以上のことから、41−1E5、42−5D11または56−2A4
のモノクローナル抗体は、パラフィン切片によるRAある
いは癌患者の免疫組織染色に使用できることが明らかに
なった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、（ａ）ヒトRA滑膜組織を抗ヒトMMP−１モノ
クローナル抗体（クローン41−1E5）で染色した時の染
色像（×300）、（ｂ）ヒトRA滑膜組織を抗ヒトMMP−２
モノクローナル抗体（クローン42−5D11）で染色した時
の染色像（×150）を示す図面に代る写真であり、第２
図は、（ａ）TNFαで刺激したHT1080細胞を抗ヒトMMP−
９モノクローナル抗体（クローン56−2A4）で染色した
時の染色像（×300）、（ｂ）横紋筋肉腫を抗ヒトMMP−
９モノクローナル抗体（クローン56−2A4）で染色した
時の染色像（×300）を示す図面に代る写真である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｐ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ (72)発明者 毛利 信子 富山県富山市吉作445番地２ (72)発明者 張 建 富山県高岡市波岡555番地４号 長慶寺 コーポ13号 (72)発明者 香林 優美 石川県河北郡高松町フ―134 (72)発明者 米沢 佳代子 富山県西砺波郡福岡町一歩二歩405番地 (72)発明者 酒井 智恵 富山県射水郡小杉町戸破3799番地６ (72)発明者 新谷 孝 富山県高岡市野村1297番地14号 (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，261, （14），ｐ．6600−6605 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，263, （14），ｐ．6579−6587 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，264, （29），ｐ．17213−17221 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＤＤＢＪ／ｐｉｒ ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒト72kDaゼラチナーゼに存在する抗原決
   定基のうち、いずれか一つの抗原決定基のみに免疫反応
   性を有するモノクローナル抗体であって、潜在型または
   活性型72kDaゼラチナーゼに免疫反応性を有し、ヒト間
   質型コラゲナーゼ、ヒトストロメライシン及びヒト92kD
   aゼラチナーゼに免疫交差反応性を有しない抗ヒト72kDa
   ゼラチナーゼモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】組織検体中の、72kDaゼラチナーゼを免疫
   組織化学的に分析することにおいて、請求項１記載のモ
   ノクローナル抗体を使用することを特徴とする、ヒト72
   kDaゼラチナーゼの検出方法。
3. 【請求項３】組織検体が、ヒト慢性関節リウマチ疾患ま
   たは癌から摘出した組織であることを特徴とする請求項
   ２記載の検出方法。