JP3184828B2 - ヒト間質型コラゲナーゼに対するモノクローナル抗体およびその利用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は、ヒト間質型コラゲナーゼ（以
下、ヒトMMP-1と記す）に対するモノクローナル抗体に
関するものであり、また、このモノクローナル抗体を用
いて免疫組織化学的手法に基づき、組織中あるいは細胞
中のヒトMMP-1（潜在型または活性型）を検出する方法
に関する。

【０００２】さらに詳しくは、本発明は、特異的な免疫
反応性を有する抗ヒトMMP-1モノクローナル抗体ならび
にこのモノクローナル抗体を用いる免疫組織化学的手法
により、ヒトの組織中のヒトMMP-1を検出する方法に関
するものであり、かかる検出方法は、慢性関節リウマチ
疾患あるいは癌の診断に利用されるものである。

【０００３】

【背景技術】細胞外マトリックスはコラーゲン、プロテ
オグリカン、エラスチン、フィブロネクチンおよびラミ
ニンなどの粘着性糖蛋白質から構成される。これらマト
リックス成分の分解には、マトリックスメタロプロテア
ーゼ（MMP)と総称される、間質型コラゲナーゼ（MMP-
1)、72-kDaゼラチナーゼ（ＩＶ型コラゲナーゼ；MMP-
2)、92-kDaゼラチナーゼ（ＩＶ型コラゲナーゼ；MMP-9)
およびストロムライシン（トランジン；MMP-3)というそ
れぞれの酵素が重要な役割を果たしている。また、炎症
時にコラーゲン分解に関与する多形核白血球由来エラス
ターゼやカテプシンＧに代表されるセリンプロテアーゼ
が注目されるようになってきた。MMPの遺伝子ファミリ
ーの代表的なものとしてヒトMMP-1、ヒトMMP-2、ヒトMM
P-3およびヒトMMP-9があり、それらの一次構造もすでに
決定されている。MMP-1とMMP-3の一次構造において両者
間に55％の相同性が認められており、いずれもＮ−末端
ドメイン、Zn²⁺結合ドメインおよびヘモペキシン凝血酵
素様Ｃ−末端ドメインの３つのドメインより構成されて
いる。MMP-2はさらに上記Ｎ−末端ドメインおよびZn²⁺
結合ドメイン間に58アミノ酸残基からなる構造が３つ繰
り返された構造をもつフィブロネクチン様コラーゲン結
合ドメインが付加されているものである。MMP-9がMMP-2
と大きく異なるところは、Zn²⁺結合ドメインとＣ−末端
ドメインの間に54アミノ酸残基からなり、プロリンに富
むＶ型コラーゲンのα２鎖によく似たドメイン、α２
(V)鎖様ドメインが挿入されている点である。

【０００４】次に、各MMPの基質特異性についてみてみ
ると、MMP-1は基質特異性が高く、間質のＩ型コラーゲ
ン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲンの他、Ｘ型
コラーゲンを分解する。また、弱いながらもゼラチンに
も作用する。MMP-2はゼラチン、ＩＶ型コラーゲンおよ
びＶ型コラーゲン、さらに弱いながらプロテオグリカン
コア蛋白質やフィブロネクチンも分解する。また、活性
は弱いが不溶性エラスチンも分解する。

【０００５】一方、MMP-9は、SV-40形質転換ヒト胎児肺
線維芽細胞、ヒト肺マクロファージ、単球性白血病U937
細胞、線維肉腫HT1080細胞およびヒトケラチノサイトな
どにより産生され、ゼラチンやＩＶ型コラーゲンを分解
するが、その基質特異性については、MMP-2と同様なの
かまだよく分っていない。

【０００６】

【発明の開示】本発明者らは、特異的な免疫反応性を有
するヒト間質型コラゲナーゼ（ヒトMMP-1)に対するモノ
クローナル抗体を製造することに成功した。また、この
モノクローナル抗体を用いてヒト組織中のヒトMMP-1を
免疫組織化学的に検出することに成功し、この検出方法
は、ヒト慢性リウマチ疾患または癌の診断に利用するこ
とができる。

【０００７】したがって、本発明は、ヒトMMP-1に存在
する抗原決定基のうち、いずれか一つの抗原決定基のみ
に免疫反応性を有するモノクローナル抗体であって、潜
在型または活性型ヒトMMP-1と特異的に反応し、ヒトス
トロムライシン、ヒト72kDaゼラチナーゼ及びヒト92kDa
ゼラチナーゼに免疫交差反応性を有しない抗ヒトMMP-1
モノクローナル抗体を提供するものであり、また、この
モノクローナル抗体を使用して、組織検体中のヒトMMP-
1を免疫組織化学的に分析する方法を提供するものであ
る。

【０００８】本発明により提供されるモノクローナル抗
体ならびにその製造方法に関しては、後に詳述する。本
発明に係る上記免疫組織化学的な分析としては、後掲の
実施例として一つの例示方法が示されているが、他に例
えば、標識物が付与された抗ヒトMMP-1抗体と検体とを
反応させ、洗浄後検体中に残った標識物を例えばジアミ
ノベンジジンなどの発色剤を用いて分析する、いわゆる
直接法、または、検体と抗ヒトMMP-1抗体とを反応さ
せ、洗浄後、標識物が付与された抗免疫グロブリンとさ
らに反応させ、洗浄後検体中に残った標識物を上記と同
様に分析する、いわゆる間接法があり、これらは、いず
れも本発明に適用される。これらの場合の標識物の例と
しては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファ
ターゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼなど）、化学
物質、螢光物質あるいは放射性同位元素などがある。一
方、標識物を付与する抗体としては、抗体含有物を硫酸
アンモニウムを加えることにより分画した後、DEAE−セ
ファセルの如き陰イオン交換ゲルによりあるいはProtei
nＡカラムクロマトグラフィーにより精製したIgG画分、
さらには、ペプシン消化後、還元して得られる特異的結
合部分Fab'を用いることもできる。

【０００９】本発明の方法は、被検試料中のヒトMMP-1
の分析を可能とするものであり、その結果はヒト慢性リ
ウマチ疾患あるいは癌の診断において非常に有用なもの
である。以下、実施例により、本発明を具体的に説明す
る。ただし、本発明はこれらに限定されるものではな
い。なお、本発明の方法は、ヒトMMP-2及びヒトMMP-９
に対しても同様に適用されるものであるので、実施例及
び図面には、ヒトMMP-2及びヒトMMP-９についても合わ
せて記載している。

【００１０】

【実施例】実施例１ 抗ヒトMMP-1モノクローナル抗体、抗ヒトMMP-2モノクロ
ーナル抗体および抗ヒトMMP-9モノクローナル抗体の作
製 (a)ヒトMMP-1ポリペプチド、ヒトMMP-2ポリペプチドお
よびヒトMMP-9ポリペプチドの調製 ヒトMMP-1ポリペプチドは、J.Biol.Chem.,261,6600−66
05（1986）に記載のGoldbergらのアミノ酸配列を、ま
た、ヒトMMP-2ポリペプチドおよびヒトMMP-9ポリペプチ
ドはそれぞれ、J.Biol.Chem.,263,6579−6587（1988）
に記載のCollierおよびJ.Biol.Chem.,264,17213−17221
（1989）に記載のWilhelmらのアミノ酸配列を用いた。
第１表に示したヒトMMP-1ポリペプチド（Ｐ−１〜Ｐ−
３）、ヒトMMP-2ポリペプチド（Ｐ−４〜Ｐ−８）およ
びヒトMMP-9ポリペプチド（Ｐ−９〜Ｐ−11）をそれぞ
れペプチドシンセサイザー9600（ミリジエン／バイオサ
ーチ）で合成した。なお、各ペプチドＣ末端にシステイ
ンを導入した。合成ペプチドの純度約70％以下のものは
μBondasphere（５μ、C18-100Å）カラムを用いて高速
液体クロマトグラフィーにより精製した。

【００１１】(b)各ポリペプチドと牛血清アルブミンま
たは各ポリペプチドとキーホールリンペットヘモシアニ
ンの複合体の調製 ２mg牛血清アルブミン（BSA)を１mlの0.1Ｍリン酸緩衝
液（pH7.0）に溶解したもの、あるいは２mgキーホール
リンペットヘモシアニン（KLH)を１mlの0.1Ｍリン酸緩
衝液（pH7.5）に溶解したものと1.85mgＮ−（ε−malei
midocaproyloxy）succinimideを200μlのジメチルホル
ムアミドに溶解したものとを混合し、30℃、30分間イン
キュベーションした。次に上記の混合液を0.1Ｍリン酸
緩衝液（pH7.0）で平衡化したPD-10（ファルマシア）で
ゲル濾過した。マレイミドが結合されたBSAまたはマレ
イミドが結合されたKLHを分取し、1.5ml以下に濃縮し
た。マレイミドが結合されたBSAまたはマレイミドが結
合されたKLHに対し50倍モル量の前記(a)で合成した各ヒ
トMMP-1ポリペプチド、各ヒトMMP-2ポリペプチドあるい
は各ヒトMMP-9ポリペプチドを１mlの0.1Ｍリン酸緩衝液
（pH7.0）に溶解したものと混合した。４℃、20時間イ
ンキュベーションし、MMP-1ポリペプチド−BSA複合体ま
たはMMP-1ポリペプチド−KLH複合体、MMP-2ポリペプチ
ド−BSA複合体、MMP-9ポリペプチド−BSAおよびMMP-9ポ
リペプチド−KLH複合体をそれぞれ調製した。

【００１２】(c)抗体産生細胞の調製 前記(b)の方法により調製した各複合体250μｇを完全フ
ロイントアジュバントと共に８週令Balb/c雌マウスにそ
れぞれ腹腔内投与し、初回免疫した。15日後に0.1Ｍリ
ン酸緩衝液（pH6.0)に溶解した各複合体200μｇを初回
免疫したそれぞれのマウスに腹腔内投与し追加免疫し
た。さらに、38日後に追加免疫時と同様に各複合体70μ
ｇを静脈内および130μｇを腹腔内投与し、最終免疫と
した。その３日後に脾臓を摘出し、脾細胞懸濁液を調製
した。

【００１３】(d)細胞融合 (1)以下の材料および方法を用いた。 RPMI1640培地：RPMI1640(Flow Lab.)に重炭酸ナトリウ
ム（24mM）、ピルビン酸ナトリウム（１mM）、ペニシリ
ンＧカリウム（50Ｕ／ml）、硫酸ストレプトマイシン
（50μｇ／ml）および硫酸アミカシン（100μｇ／ml）
を加え、ドライアイスでpHを7.2にし、0.2μm東洋メン
ブレンフィルターで除菌濾過した。 NS-1培地：上記RPMI1640培地に除菌濾過した仔牛胎児血
清（M.A.Bioproducts)を15％（v/v)の濃度になるように
加えた。PEG4,000溶液：RPMI1640培地にポリエチレング
リコール4,000(PEG4,000、Merck&Co.)を50％（w/w)にな
るように加え、無血清溶液を調製した。８−アザグアニ
ン耐性ミエローマ細胞SP2(SP2/O-Ag14)との融合は、Sel
ectedMethod in Cellular Immunology (ed.B.B.Mishell
and S. M.Shiigi）、W.H.Freeman and Company(198
0)、351−372に記載のOiらの方法を若干改変して行っ
た。

【００１４】(2)前記(c)で調製した有核脾臓細胞（生細
胞率100％）とミエローマ細胞（生細胞率100％）とを
５：１の割合で融合した。脾臓細胞とミエローマ細胞と
を別に前記のRPMI1640培地で洗浄し、次に同じ培地に懸
濁し、融合させるため上記の割合で混合した。容量250m
lのポリプロピレン製遠沈管（岩城硝子）を用い、40ml
のRPMI1640培地中400×ｇ、10分間遠心し、上清を完全
に吸出した。沈殿細胞に37℃加温PEG4,000溶液6.0mlを
穏やかに撹拌しながら１分間で滴下し、さらに１分間撹
拌し細胞を再懸濁、分散させた。次に37℃加温RPMI1640
培地6.0mlを１分間で滴下した。この操作をさらに１回
繰り返した後、同培地42.0mlを２〜３分間で常に撹拌し
ながら滴下し細胞を分散させた。これを400×ｇ、10分
間遠心分離し、上清を完全に吸引除去した。次にこの沈
殿細胞に37℃加温NS-1培地60mlを速やかに加え、細胞の
大きい塊を10mlのピペットを用いて注意深くピペッティ
ングして分散した。さらに同培地120mlを加えて希釈
し、ポリスチレン製96穴マイクロウエル（岩城硝子）に
ウエル当り6.0×10^５個／0.1mlの細胞を加えた。細胞を
加えた上記のマイクロウエルを７％炭酸ガス／93％空気
中で温度37℃、湿度100％下に培養に付した。

【００１５】(e)選択培地によるハイブリドーマの選択
的増殖 (1)使用する培地は以下のとおりである。 HAT培地：前記(d)で述べたNS-1培地にさらにヒポキサン
チン(100μM)、アミノプテリン(0.4μM)およびチミジン
（16μM)を加えた。 HT培地：アミノプテリンを除去した以外は上記HAT培地
と同一組成のものである。

【００１６】(2)前記(d)の培養開始後翌日（１日目）、
細胞にパスツールピペットでHAT培地２滴（約0.1ml）を
加えた。２、３、５、８、11日目に培地の半分（0.1m
l）を新しいHAT培地で置き換え、14日目に培地の半分を
新しいHT培地で置き換えた。以降３〜４日毎に培地の半
分を新しいHT培地で置き換えた。通常約２週間で充分な
ハイブリドーマの生育が観察される。ハイブリドーマ生
育全ウエルについて次項(f)記載の固相−抗体結合テス
ト法（ELISA)により陽性ウエルをチェックした。次にフ
ィーダーとして10⁷個のマウス胸腺細胞を含むHT培地１m
lをポリスチレン製24穴セルウエル（岩城硝子）に加え
たものを用い、上記で検出された各陽性ハイブリドーマ
の全内容物を移した。これを前記(d)におけると同様に
７％炭酸ガス存在下、37℃で約１週間培養に付した。そ
の間１〜２回各ウエルの上清0.5mlを新しいHT培地0.5ml
と交換した。ハイブリドーマの充分生育した時点でELIS
A法により陽性を再確認し、それぞれについて次項(g)記
載の限界希釈法によるクローニングを行った。なお、ク
ローニングに使用後の残液をポリスチレン製25cm ^２組織
培養フラスコ（岩城硝子）に移し、凍結保存用試料を調
製した。

【００１７】(f)ELISA法による抗ヒトMMP-1抗体、抗ヒ
トMMP-2抗体または抗ヒトMMP-9抗体産生ハイブリドーマ
の検索 Anal.Biochem. 104, 205〜214（1980）に記載のRennard
らの方法を若干改変した方法を用いた。この方法は、ハ
イブリドーマ抗体の検出に適している。96穴ミクロタイ
トレーションプレート（Flow Lab.)を100nｇの各ヒトMM
P-1ポリペプチド、各ヒトMMP-2ポリペプチドあるいは各
ヒトMMP-9ポリペプチドでコートし、次に、未コート部
分を１％BSAでブロックした。これに前記(e)で得られた
ハイブリドーマ生育ウエルの上清の一部を加えて室温で
約１時間インキュベートした。２次抗体として西洋わさ
びペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン
（Cappel Lab.)を加え、さらに室温で約１時間インキュ
ベートした。次に基質である過酸化水素とｏ−フェニレ
ンジアミンを加え生成した褐色の程度をマイクロプレー
トリーダー（MRP-A4、東洋ソーダ）を用いて492nmの吸
光度を測定し判定した。

【００１８】(g)クローニング 前記(e)の操作後、各ウエル中には、２種以上のハイブ
リドーマが生育している可能性があるので、限界希釈法
によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマを取得する。NS-1培地１ml当りフィーダー
として10⁷個のマウス胸腺細胞を含むクローニング培地
を調製し、96穴マイクロウエルの36ウエル、36ウエルお
よび24ウエルにウエル当り５個、１個および0.5個のハ
イブリドーマを加えた。５日目、12日目に全ウエルに各
約0.1mlのNS-1培地を追加した。クローニング開始後14
〜15日で充分なハイブリドーマの生育が認められ、コロ
ニー形成陰性ウエルが50％以上である群についてELISA
法を行った。テストした全ウエルが陽性でない場合、抗
体陽性ウエル中のコロニー数を確認し、ウエル中に１コ
ロニーが確認されたウエルを４〜６個選び再クローニン
グする。最終的に第２、３および４表に示したように各
ヒトMMP-1ポリペプチド、ヒトMMP-2ポリペプチドまたは
ヒトMMP-9ポリペプチドに対するモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマを得た。

【００１９】(h)モノクローナル抗体の生体外増殖およ
び生体内増殖 モノクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、得
られた各ハイブリドーマをNS-1培地などの適当な培養液
で培養（生体外増殖）し、その培養上清から10〜100μ
ｇ／mlの濃度のモノクローナル抗体を得ることができ
た。一方、大量に抗体を得るためには脾細胞とミエロー
マ細胞の由来動物と同系の動物（Balb/cマウス）にマウ
ス１匹当り0.5mlの腫瘍形成促進剤プリスタン（2,6,10,
14−テトラメチルペンタデカン、Aldrich Chem.Co.）を
腹腔内投与した。１〜３週間後に、各ハイブリドーマ１
×10⁷個を同じく腹腔内投与し、さらにその１〜２週間
後に生体内で産生された４〜７mg／mlのモノクローナル
抗体を含む腹水を得ることができた。

【００２０】(i)モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖 前述したELISA法に従って、ヒトMMP-1ポリペプチド、ヒ
トMMP-2ポリペプチドあるいはヒトMMP-9ポリペプチドを
コートしたミクロタイトレーションプレートに、前記
(g)で得られた各モノクローンの培養上清を加えた。次
にPBSにより洗浄した後、アイソタイプ特異的ウサギ抗
マウスIg抗体（Zymed Lab.）を加えた。PBSによる洗浄
後、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG
(H＋L)抗体を加え、基質として過酸化水素および2,2'−
アジノ−ジ（３−エチルベンゾチアゾリン硫酸）を用い
てそれぞれの重鎖および軽鎖を判定した。その結果をま
とめて後掲の第２、３および４表に示した。

【００２１】(j)モノクローナル抗体の精製 前記(h)で得られた各腹水を40％飽和硫酸アンモニウム
で分画した後、IgGクラスの抗体について0.5Ｍ塩化ナト
リウム含有1.5Ｍグリシン−NaOH緩衝液（pH8.9）で平衡
化したプロテインＡアフィゲル（Bio-Rad)カラムに吸着
させ、上記洗浄液で洗浄後、0.1Ｍクエン酸緩衝液（pH
5.0）で溶出することにより精製した。

【００２２】

【表１】

【００２３】

【表２】

【００２４】

【表３】

【００２５】

【表４】

【００２６】実施例２ イムノブロッティング (a)材料の調製 DMEM培地：Dulbecco's Modified Eagle Medium“Nissu
i”（日水製薬）に重炭酸ナトリウム（31mM）およびＬ
−グルタミン（５mM）を加え、ドライアイスでpH7.2に
調整し、0.2μm東洋メンブレンで除菌濾過した。ヒト歯
髄から得た線維芽細胞を15％仔牛胎児血清を含むDMEM培
地で、５％CO_２インキュベーター中、37℃、５日間培養
し、500rpm、５分間で遠心して集めた細胞を0.2％ラク
トアルブミン水解物および５units／ml遺伝子組換えヒ
トインターロイキン１αを含むDMEM培地中で６〜７日間
同様に培養した。500rpm、５分間で遠心後の上清を限外
濾過により約140倍に濃縮し、イムノブロッティング用
試料とした。

【００２７】ヒト慢性関節リウマチ（RA）滑膜細胞を、
15％仔牛胎児血清を含むDMEM培地で５％CO_２インキュベ
ーター中、37℃、６〜７日間培養し、遠心後の細胞を0.
2％ラクトアルブミン水解物および20units／ml Tumor N
ecrosis Factorα(TNFα）を含むDMEM培地で懸濁し、同
様に６〜８日間培養した。遠心後上清を限外濾過あるい
は３％トリクロロ酢酸（TCA)により濃縮し、イムノブロ
ッティング用試料とした。American Type Culture Coll
ectionから購入したヒト線維肉腫細胞HT1080を前記NS-1
培地で５％CO_２インキュベーター中、37℃、２〜３日間
培養し、遠心後の細胞を２％ラクトアルブミン水解物お
よび100 units／ml TNFαを含むRPMI1640培地で懸濁
し、同様に７〜10日間培養した。700〜800rpm、３分間
の遠心上清を集め、限外濾過あるいは３％TCAにより濃
縮し、イムノブロッティング用試料とした。

【００２８】(b)免疫染色 実施例２−(a)で調製した試料をドデシル硫酸ナトリウ
ムを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した後、
細胞工学１＆２、1061−1068（1983）に記載の田部の方
法に従ってウエスタンブロッティングを行い、各モノク
ローンの培養上清と反応後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ
抗マウス免疫グロブリン（Cappel Lab.)を用い、間接法
により免疫染色を行った。抗ヒトMMP-1モノクローナル
抗体の免疫反応性：第２表に掲げられたモノクローナル
抗体のうちヒト歯髄線維芽細胞培養液から調製した試料
を用いた場合、41-1E5、41-16E11、49-6H4、49-9D3、49
-10D9、49-14E3、49-16G9、49-19B9および49-20F1の９
つのクローンが陽性として認められた。TNFαで刺激し
たヒトRA滑膜細胞培養液から調製した試料を用いた場
合、41-1E5、41-16E11、49-2C2、49-4H5、49-5D7、49-6
H4、49-8F11、49-9D3、49-10D9、49-11F5、49-14E3、49
-16G9、49-19B9、49-20F1、49-22B1、70-4D9、70-6G8お
よび70-13F1の18のクローンが陽性として認められた。

【００２９】抗ヒトMMP-2モノクローナル抗体の免疫反
応性：第３表に掲げられたモノクローナル抗体のうち、
TNFαで刺激したヒトRA滑膜細胞培養液から調製した試
料を用いた場合、34-2H11、34-27A5、35-3F2、39-1H9、
39-4E4、39-11D11、39-12B7、39-18F3、42-2H2、42-5D1
1、42-14H5、43-3F9、45-2H8、45-6F12、45-14A8、45-1
5F9および45-17D8の17のモノクローナル抗体がヒトMMP-
2と反応した。抗ヒトMMP-9モノクローナル抗体の免疫反
応性：第４表に掲げられたモノクローナル抗体のうち、
TNFαで刺激したHT1080細胞培養液から調製した試料を
用いた場合、56-2A4、56-4F11、56-6D1、57-6G2および5
7-13D8の５つのモノクローナル抗体がヒトMMP-9と反応
した。

【００３０】(c)特異性 前記(b)の免疫染色で陽性となった各抗MMPモノクローナ
ル抗体が他のMMPまたは他の蛋白質と交差反応するかど
うかをみるために、TNFαで刺激したヒトRA滑膜細胞培
養液またはHT1080細胞のそれぞれの培養液から調製した
試料を用いてイムノブロッティングにより各抗MMPモノ
クローナル抗体の特異性を調べた。各ヒトMMPの分子
量：TNFαで刺激されたヒトRA滑膜細胞培養液から調製
した試料中には、イムノブロッティングにより検出でき
る量のヒトMMP-1、ヒトMMP-2およびヒトMMP-3が存在し
ており、各々のヒトMMPの分子量は、潜在型MMP-1が55kD
aおよび52kDa、活性化されたMMP-1が45kDa、42kDa、28k
Daおよび27kDaであり、潜在型MMP-2が72kDa、活性型MMP
-2が67kDa、また潜在型MMP-3が57kDa、活性型MMP-3が50
kDaおよび46kDaであった。同様にTNFαで刺激されたHT1
080細胞培養液から調製した試料中に検出される潜在型M
MP-9は92kDaで、活性型MMP-9は84kDaであった。

【００３１】抗ヒトMMP-1モノクローナル抗体の特異
性：TNFαで刺激したヒトRA滑膜細胞あるいはHT1080細
胞培養液から調製した試料をイムノブロッティングに供
した場合、70-4D9、70-6G8および70-13F1の各モノクロ
ーナル抗体については、それぞれ、分子量55kDaおよび5
2kDaのバンドのみ検出され、41-1E5、49-2C2、49-6H4、
49-9D3、49-10D9、49-14E3、49-16G9、49-19B9、49-20F
1および49-22B1の各モノクローナル抗体については、そ
れぞれ、分子量55kDa、52kDa、45kDa、42kDa、28kDaお
よび27kDaのバンドが検出され、その他のバンドは認め
られなかった。また、49-4H5、49-5D7および49-8F11の
各モノクローナル抗体については、分子量55kDa、52kD
a、45kDaおよび42kDaのバンドが検出され、分子量28kDa
および27kDaのバンドは検出されなかった。一方、ヒト
潜在型MMP-1とヒト潜在型MMP-3の分子量が近似している
ため、ｐ−アミノフェニル酢酸第二水銀を試料中に加え
ることにより、両者を活性型にした後、イムノブロッテ
ィング法により分析した結果、分子量50kDaおよび46kDa
のバンドは認められなかった。従って、これらの各抗ヒ
トMMP-1モノクローナル抗体は、ヒトMMP-2、ヒトMMP-
3、ヒトMMP-9または細胞培養液中の他の蛋白質と交差反
応しないことが示され、ヒトMMP-1分子に特異的に反応
することが示された。

【００３２】抗ヒトMMP-2モノクローナル抗体の特異
性：TNFαで刺激したヒトRA滑膜細胞あるいはHT1080細
胞培養液から調製した試料をイムノブロッティングに供
した場合、前記(b)の陽性モノクローナル抗体のうち、3
4-2H11、39-1H9および42-14H5の各モノクローナル抗体
はヒトMMP-9と交差反応を示し、42-2H2および42-14H5の
各モノクローナル抗体は、ヒトMMP-1およびヒトMMP-3と
交差反応を示した。それ以外のモノクローナル抗体につ
いては、他のヒトMMPまたは細胞培養液中の他の蛋白質
と反応せず、ヒトMMP-2に対して特異的に反応すること
が示された。

【００３３】抗ヒトMMP-9モノクローナル抗体の特異
性：TNFαで刺激したヒトRA滑膜細胞培養液から調製し
た試料をイムノブロッティングに供した場合、56-2A4、
56-4F11、56-6D1、57-6G2および57-13D8の５つのモノク
ローンから得られた各抗体は、他のヒトMMPまたは培養
液中の他の蛋白質と交差反応せず、ヒトMMP-9に特異的
に反応することが示された。以上イムノブロッティング
による結果を第５表にまとめた。

【００３４】

【表５】

【００３５】

【表６】

【００３６】実施例３ 免疫組織染色 ヒトRA滑膜組織および横紋筋肉腫を２μMモネンシン存
在下で３時間培養した。この材料をペリオデイト−リジ
ン−パラホルムアルデヒド固定し、パラフィン切片を作
製した。脱パラフィンしたこれらの切片を、内因性ペル
オキシダーゼを過酸化水素でブロックした後、実施例１
および２でスクリーニングした抗体のうち、41-1E5（抗
ヒトMMP-1)、42-5D11（抗ヒトMMP-2)または56-2A4（抗
ヒトMMP-9)のモノクローナル抗体を用い、上記切片と反
応させた。次に、この切片を0.14Ｍ塩化ナトリウム含有
20mMリン酸緩衝液（pH7.4）で十分洗浄し、ビオチン化
ウマ抗マウスIgG(H＋L)と反応後、さらにアビジン−ビ
オチン−ペルオキシダーゼ複合体（Vector Lab.）と反
応させた。PBSによる洗浄後、基質として過酸化水素お
よびジアミノベンジジンを用いて発色させた。また、La
b-Tekスライドチャンバー（Miles)上で培養したHT1080
細胞をTNFαで刺激後、56-2A4（抗ヒトMMP-9)のモノク
ローナル抗体を用い、上記と同様に免疫染色した。

【００３７】図１a及び図１bに示したように41-1E5（抗
ヒトMMP-1)モノクローナル抗体を用いた場合、ヒトRA滑
膜表層細胞が強く染色された。42-5D11（抗ヒトMMP-2)
モノクローナル抗体を用いた場合、ヒトRA表層細胞下層
の線維芽細胞が陽性像として認められた。一方、図２a
及び図２bに示したように56-2A4（抗ヒトMMP-9)モノク
ローナル抗体を用いた場合、HT1080細胞および横紋筋肉
腫が強く染色された。以上のことから、41-1E5、42-5D1
1または56-2A4のモノクローナル抗体は、パラフィン切
片によるRAあるいは癌患者の免疫組織染色に使用できる
ことが明らかになった。

【図面の簡単な説明】

【図１a】 ヒトRA滑膜組織を抗ヒトMMP-1モノクローナ
ル抗体（クローン41-1E5）で染色した時の染色像（×30
0)を示す写真図である。

【図１b】 ヒトRA滑膜組織を抗ヒトMMP-2モノクローナ
ル抗体（クローン42-5D11)で染色した時の染色像（×15
0)を示す写真図である。

【図２a】 TNFαで刺激したHT1080細胞を抗ヒトMMP-9
モノクローナル抗体（クローン56-2A4）で染色した時の
染色像（×300)を示す写真図である。

【図２b】 横紋筋肉腫を抗ヒトMMP-9モノクローナル
抗体（クローン56-2A4）で染色した時の染色像（×300)
を示す写真図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/573 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 毛利 信子 富山県富山市吉作445番地２ (72)発明者 張 建 富山県高岡市波岡555番地４号 長慶寺 コーポ13号 (72)発明者 香林 優美 石川県河北郡高松町フ−134 (72)発明者 米沢 佳代子 富山県西砺波郡福岡町一歩二歩405番地 (72)発明者 酒井 智恵 富山県射水郡小杉町戸破3799番地６ (72)発明者 新谷 孝 富山県高岡市野村1297番地14号 (56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 261（1986），Ｎｏ．14，ｐ．6600− 6605 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ. 27（1988），Ｎｏ．18，ｐ．6751−6758 Ｃｏｌｌ．Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｓ．，Ｖ ｏｌ．８，Ｎｏ．１，ｐ．１−10 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/06 C07K 16/40 C12N 5/16 C12P 21/08 C12Q 1/37 G01N 33/573 G01N 33/577 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒト間質型コラゲナーゼに存在する抗原決
   定基のうち、いずれか一つの抗原決定基のみに免疫反応
   性を有する各モノクローナル抗体であって、潜在型また
   は活性型ヒト間質型コラゲナーゼと特異的に反応し、ヒ
   トストロムライシン、ヒト72kDaゼラチナーゼ及びヒト9
   2kDaゼラチナーゼに免疫交差反応性を有しない抗ヒト間
   質型コラゲナーゼモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】組織検体中のヒト間質型コラゲナーゼを免
   疫組織化学的に分析することにおいて、請求項１に記載
   のモノクローナル抗体を使用することを特徴とする、ヒ
   ト間質型コラゲナーゼの検出方法。