JP2949467B2 - 免疫学的測定法によるヒトプロマトリックスメタロプロテアーゼ７の定量 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗ヒトマトリックスメ
タロプロテアーゼ７（ＭＭＰ−７）モノクローナル抗
体、及びそのモノクローナル抗体を用いた免疫学的測定
法、特には免疫組織染色、酵素免疫測定並びに該測定法
に基づき検体中に存在するヒトプロＭＭＰ−７を定量す
る方法に関する。

【０００２】

【背景技術及び解決すべき課題】血管やリンパ管及び関
節軟骨の基底膜や結合組織の構成タンパク、いわゆる細
胞外マトリックスの分解には、マトリックスメタロプロ
テアーゼ類（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅ
ｉｎａｓｅｓ；ＭＭＰｓ）の作用が必須である。近年、
これらのＭＭＰｓについては、遺伝子がクローニングさ
れて遺伝子ファミリーとして存在することが報告されて
いる。一次構造と基質特異性の違いからそれぞれグルー
プ分けされており、その中でプロＭＭＰ−７と称される
マトリライシンは、カルボキシル末端のヘモペキスン様
ドメインを欠失しており、ＭＭＰ遺伝子ファミリーの中
で最も小さい分子種として存在している。Ｑｕａｎｔｉ
ｎｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８，５
３２７−５３３４，１９８９）は、プロＭＭＰ−７の分
子量は２８，０００ダルトン（２８ｋＤａ）であり、４
−アミノフェニル酢酸水銀（ＡＰＭＡ）処理した場合
は、２１ｋＤａの中間体を経て１９ｋＤａ活性化型ＭＭ
Ｐ−７へと変換され、そして活性化されたＭＭＰ−７は
プロテオグリカン、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、フィ
ブロネクチン分解能を有することを報告している。ま
た、Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．（ＦＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔ．，３４５，１４−１６，１９９４）は、ＭＭＰ−７
が７２ｋＤａゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２）を活性化する
ことを報告している。

【０００３】Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ．，５０，７７５８−７７６４，１９９
０）は、ヒト直腸癌細胞の培養液からヒトＭＭＰ−７を
単離しこの酵素が広い基質特異性をもちＩＶ型コラーゲ
ンやフィブロネクチンなどに対して、非常に高い分解活
性を有していることを明らかにしている。ＭＭＰ−７は
直腸癌（Ｍ．Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｉｎ
ｔ．，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５４，６１４−６１８，１９
８３）、結腸癌（Ｈ．Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏ
ｍｍｕｎ．，２０１，６５７−６６４，１９９４）、前
立腺癌（Ｗ．Ｃ．Ｐｏｗｅｌｌｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ．，５３，４１７−４２２，１９９３）、
胃癌（Ｓ．ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ
ｌ，Ｃａｒｃｉｎｏｇ．，４，５２７−５３３，１９９
１）などで、高い頻度で発現している。しかし、未だに
ＭＭＰ−７タンパクを定性的及び定量的に測定すること
に成功していない。

【０００４】

【課題の解決】本発明者らは、ヒトＭＭＰ−７タンパク
を定性的及び定量的に測定するには、それを特異的に認
識しうるモノクローナル抗体、すなわちヒトＭＭＰ−７
に対するモノクローナル抗体を得るべきと考え、鋭意研
究の結果、ヒトＭＭＰ−７に対するモノクローナル抗体
を作製することに成功した。その結果、モノクローナル
抗体を用いて現在増加している直腸癌、前立腺癌を始め
とし各種癌疾患のマーカーもしくは診断法を提供するこ
とが可能となった。本発明は、ヒトＭＭＰ−７と特異的
に免疫反応することのできるモノクローナル抗体、その
モノクローナル抗体を測定試薬として用いたヒトＭＭＰ
−７の免疫学的測定法、さらにその測定法に用いる試薬
を提供する。本発明は、さらにヒトＭＭＰ−７に免疫交
差反応性を有するモノクローナル抗体及びそのモノクロ
ーナル抗体を用いるサンドイッチ法に基づくヒトＭＭＰ
−７の酵素免疫測定法をも提供するものである。本発明
の方法は、固相担体に結合させる抗体あるいは標識物を
付与する抗体として、それぞれヒトＭＭＰ−７の実質的
に異なる抗原決定基に対し特異的に結合するモノクロー
ナル抗体を使用することをも特徴とするものである。特
に本発明に従えばヒトＭＭＰ−７のＧＩＱＫＬＹＧＫＲ
ＳＮＳＲＫＫ（Ｒ２５３−２６７）のアミノ酸配列を含
むＣ末端領域あるいはそれと実質的に同等の領域を特異
的に認識し、プロ、中間体及び活性化型ＭＭＰ−７と免
疫反応するモノクローナル抗体とヒトプロＭＭＰ−７の
ＬＰＬＰＱＥＡＧＧＭＳＥＬＱＷＥＱ（Ｒ１８−３４）
のアミノ酸配列を含むＮ末端領域あるいはそれと実質的
に同等の領域を特異的に認識しプロＭＭＰ−７のみと免
疫反応するモノクローナル抗体とを組合わせて測定試薬
として用い、サンドイッチ法により、酵素免疫学的にヒ
トＭＭＰ−７の測定を行う方法及び試薬が提供される。

【０００５】本発明で使用されるモノクローナル抗体
は、ケラー及びミルシュタイン（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．＆
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４
９５，１９７５）などにより開示されたミエローマ細胞
を用いての細胞融合技術を利用して得られたモノクロー
ナル抗体であってもよいことはいうまでもない。本発明
で使用されるモノクローナル抗体は、次のような工程で
作製できる。 １．免疫原性抗原の調製 ２．免疫原性抗原による動物の免疫 ３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製 ４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合 ５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクロー
ン化 ６．モノクローナル抗体の製造

【０００６】１．免疫原性抗原の調製 抗原としては、例えば培養ヒト直腸癌細胞株（ＣａＲ−
１細胞）から、Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．の方法（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１４２４５−１４２５
５，１９８６及びＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，
２１７１２−２１７１９，１９９２）に従い精製されて
得られたヒトプロＭＭＰ−７を用いることができる。特
に好ましくは精製ヒトプロＭＭＰ−７は、キレート化
剤、例えばＥＤＴＡなどを含有する緩衝液中に保存して
あるものが好ましい。こうして得られたヒトプロＭＭＰ
−７は、さらに免疫原性コンジュゲートなどにしてもよ
いが、そのまま適当なアジュバントと混合して動物を免
疫するのに使用できる。さらにヒトプロＭＭＰ−７は、
それを断片化したものを適当な縮合剤を介して種々の担
体タンパク質類と結合させてハプテン−タンパク質の如
き免疫原性コンジュゲートとし、これを用いて特定の配
列のみを認識できるモノクローナル抗体をデザインする
のに用いることもできる。例えば遺伝子組換え技術を適
用し、天然の細胞から分子クローニングにより得られた
ＤＮＡ配列あるいは既に知られたゲノム配列から、酵素
などを用いたり、化学合成により得られたＤＮＡ配列ま
たは修飾ＤＮＡ配列を、微生物あるいは動物、植物、昆
虫などで発現させて得られたリコビナント抗原や、それ
らの情報を利用し液相法や固相法として知られたペプチ
ド化学合成法により得られたペプチドまたは改変ペプチ
ドを用いることもできる。

【０００７】ペプチドの固相合成法は、一般的には自動
ペプチド合成装置により好適に行うことが出来、例えば
ミリジェン・バイオーチ社製（ＭｉｌｌｉＧｅｎ／Ｂｉ
ｏｓｅａｒｃｈ）モデル９０５０、モデル９５００、あ
るいはエクセル（Ｅｘｃｅｌｌ）、アプライド・バイオ
システムズ社製（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）モデル４３０Ａやモデル４３１Ａ、デュポン社製
（ＤｕＰｏｎｔ）アールエイエムピーエス（ＲａＭＰ
Ｓ）、国産化学株式会社製「コックさん」、アドバンス
ド・ケムテク社製（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃ
ｈ）モデル３５０などを用いて行うことができる。ヒト
ＭＭＰ−７のＧＩＱＫＬＹＧＫＲＳＮＳＲＫＫ（Ｒ２５
３−２６７）のアミノ酸配列を含むＣ末端領域、ヒトプ
ロＭＭＰ−７のＬＰＬＰＱＥＡＧＧＭＳＥＬＱＷＥＱ
（Ｒ１８−３４）のアミノ酸配列を含むＮ末端領域、あ
るいはそれら領域と実質的に同等の活性あるいは構造を
有するペプチドを合成して免疫原性コンジュゲートと
し、これを用いて特定の配列のみを認識できるモノクロ
ーナル抗体を得ることができる。

【０００８】担体タンパク質類と結合させるにあたって
は、担体タンパク質類はまず活性化されることができ
る。こうした活性化にあたり活性化結合基を導入するこ
とが挙げられる。活性化結合基としては、（１）活性化
エステルあるいは活性化カルボキシ基、例えばニトロフ
ェニルエステル基、ペンタフルオロフェニルエステル
基、１−ベンゾトリアゾールエステル基、Ｎ−スクシン
イミドエステル基など、（２）活性化ジチオ基、例えば
２−ピリジルジチオ基などが挙げられる。担体タンパク
質類としては、キーホール・リンペット・ヘモシアニン
（ＫＬＨ），牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブ
ミン、グロブリン、ポリリジンなどのポリペプタイド、
細菌菌体成分、例えばＢＣＧなどが挙げられる。

【０００９】２．免疫原性抗原による動物の免疫 動物を免疫するには、例えば村松繁、他編、実験生物学
講座１４、免疫生物学、丸善株式会社、昭和６０年、日
本生化学会編、続生化学実験講座５、免疫生化学研究
法、東京化学同人、１９８６年、日本生化学会編、新生
化学実験講座１２、分子免疫学 III、抗原・抗体・補
体、東京化学同人、１９９２年などに記載の方法に準じ
て行うことができる。抗原と共に用いられるアジュバン
トとしては、例えばフロイント完全アジュバント、リビ
（Ｒｉｂｉ）アジュバント、百日咳ワクチン、ＢＣＧ、
リピッドＡ、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカ
などが挙げられる。免疫は、例えばＢＡＬＢ／ｃなどの
マウスをはじめとする動物を使用して行われる。抗原の
投与量は、例えばマウスに対して約１〜４００μｇ／動
物で、一般には宿主動物の腹腔内や皮下に注射し、以後
１〜４週間おきに、好ましくは１〜２週間ごとに腹腔
内、皮下、静脈内あるいは筋肉内に追加免疫を２〜１０
回程度反復して行う。免疫用のマウスとしてはＢＡＬＢ
／ｃ系マウスの他、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスと他系マウス
とのＦ１マウスなどを用いることもできる。必要に応
じ、抗体価測定系を調製し、抗体価を測定して動物免疫
の程度を確認できる。

【００１０】３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製 細胞融合に使用される無限増殖可能株（腫瘍細胞株）と
しては免疫グロブリンを産生しない細胞株から選ぶこと
ができ、例えばＰ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１（ＮＳ−
１，Eur. J. Immunol., 6, 511〜519, 1976)、ＳＰ２／
０−Ａｇ１４（ＳＰ２，Nature, 276, 269〜270, 1978
) 、マウスミエローマＭＯＰＣ−２１セルライン由来
のＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１，Current to
pics in Microbiol. and Immunol., 81, 1〜7, 1978
）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３，Nature, 256, 49
5〜497, 1975 ) 、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３ (６
５３，J. Immunol., 123, 1548〜1550, 1979) などを用
いることができる。８−アザグアニン耐性のマウスミエ
ローマ細胞株はダルベッコＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ培
地）、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの細胞培地に、例え
ばペニシリン、アミカシンなどの抗生物質、牛胎児血清
（ＦＣＳ）などを加え、さらに８−アザグアニン（例え
ば５〜４５μｇ／ｍｌ）を加えた培地で継代されるが、
細胞融合の２〜５日前に正常培地で継代して所要数の細
胞株を用意することができる。また使用細胞株は、凍結
保存株を約３７℃で完全に解凍したのちＲＰＭＩ−１６
４０培地などの正常培地で３回以上洗浄後、正常培地で
培養して所要数の細胞株を用意したものであってもよ
い。

【００１１】４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細
胞融合 上記２．の工程に従い免疫された動物、例えばマウスは
最終免疫後、２〜５日後にその脾臓が摘出され、脾細胞
懸濁液を得る。脾細胞の他、生体各所のリンパ節細胞を
得て、それを細胞融合に使用することもできる。こうし
て得られた脾細胞懸濁液と上記４．の工程に従い得られ
たミエローマ細胞株を、例えば最小必須培地（ＭＥＭ培
地）、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの細
胞培地中に置き、細胞融合剤、例えばポリエチレングリ
コールを添加する。細胞融合剤としては、この他各種当
該分野で知られたものを用いることができ、この様なも
のとしては不活性化したセンダイウイルス（ＨＶＪ：Ｈ
ｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｏｆ
Ｊａｐａｎ）などが挙げられる。好ましくは、例えば３
０〜６０％のポリエチレングリコールを０．５〜２ｍｌ
加えることができ、分子量が１，０００〜８，０００の
ポリエチレングリコールを用いることができ、さらに分
子量が１，０００〜４，０００のポリエチレングリコー
ルがより好ましく使用できる。融合培地中でのポリエチ
レングリコールの濃度は、例えば３０〜６０％となるよ
うにすることが好ましい。必要に応じ、例えばジメチル
スルホキシドなどを少量加え、融合を促進することもで
きる。融合に使用する脾細胞（リンパ球）：ミエローマ
細胞株の割合は、例えば１：１〜２０：１とすることが
挙げられるが、より好ましくは４：１〜１０：１とする
ことができる。融合反応を１〜１０分間行い、次にＲＰ
ＭＩ−１６４０培地などの細胞培地を加える。融合反応
処理は複数回行うこともできる。融合反応処理後、遠心
などにより細胞を分離した後選択用培地に移す。

【００１２】５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及
びモノクローン化 選択用培地としては、例えばヒポキサンチン、アミノプ
テリン及びチミジンを含む、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地などの培地、所謂ＨＡＴ培地が挙
げられる。選択培地交換の方法は、一般的には培養プレ
ートに分注した容量と当容量を翌日加え、その後１〜３
日ごとにＨＡＴ培地で半量ずつ交換するというようにす
ることができるが、適宜これに変更を加えて行うことも
できる。また融合後８〜１６日目には、アミノプテリン
を除いた、所謂ＨＴ培地で１〜４日ごとに培地交換をす
ることができる。フィーダーとして、例えばマウス胸腺
細胞を使用することもでき、それが好ましい場合があ
る。ハイブリドーマの増殖のさかんな培養ウェルの培養
上清を、例えば放射免疫分析（ＲＩＡ）、酵素免疫分析
（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫分析（ＦＩＡ）などの測定
系、あるいは蛍光惹起細胞分離装置（ＦＡＣＳ）など
で、ヒトＭＭＰ−７あるいはその断片ペプタイドなどを
抗原として用いたり、あるいは標識抗マウス抗体を用い
て目的抗体を測定するなどして、スクリーニングしたり
分離する。目的抗体を産生しているハイブリドーマをク
ローニングする。クローニングは、寒天培地中でコロニ
ーをピック・アップするか、あるいは限界希釈法により
なされうる。限界希釈法でクローニングがより好ましく
行うことができる。クローニングは複数回行うことが好
ましい。

【００１３】６．モノクローナル抗体の製造 得られたハイブリドーマ株は、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、
ＲＰＭＩ−１６４０培地などの適当な増殖用培地中で培
養し、その培地上清から所望のモノクローナル抗体を得
ることが出来る。大量の抗体を得るためには、ハイブリ
ドーマを腹水化することが挙げられる。この場合ミエロ
ーマ細胞由来の動物と同系の組織適合性動物の腹腔内に
各ハイブリドーマを移植し、増殖させるか、例えばヌー
ド・マウスなどに各ハイブリドーマを移植し、増殖さ
せ、該動物の腹水中に産生されたモノクローナル抗体を
回収して得ることが出来る。ハイブリドーマの移植に先
立ち、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチル
ペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内投与した後、ハイ
ブリドーマを増殖させ、腹水を採取すればよい。腹水液
はそのまま、あるいは従来公知の方法、例えば硫酸アン
モニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによる
ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、電気泳
動法、透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラ
フィー法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精
製してモノクローナル抗体として用いることができる。
好ましくは、モノクローナル抗体を含有する腹水は、硫
安分画した後、ＤＥＡＥ−セファロースの如き、陰イオ
ン交換ゲル及びプロテインＡカラムの如きアフィニティ
ーカラムなどで処理し精製分離処理できる。特に好まし
くは抗原又は抗原断片（例えば合成ペプチド、組換え抗
原タンパク質あるいはペプチド、抗体が特異的に認識す
る部位など）を固定化したアフィニティー・クロマトグ
ラフィー、プロテインＡを固定化したアフィニティー・
クロマトグラフィーなどが挙げられる。

【００１４】こうして得られたモノクローナル抗体は、
市販のアイソタイプ特異的抗マウスＩｇ抗体、例えばア
イソタイプ特異的ウサギ抗マウスＩｇ抗体などを用いて
その抗体構成鎖の重鎖及び軽鎖のタイプについて調べる
ことができる。ヒトプロＭＭＰ−７抗原を特異的に認識
できるモノクローナル抗体としては、重鎖のタイプとし
てγ鎖、特にはγ1 鎖、γ2a鎖、γ2b鎖などを持つも
の、αを持つもの、μ鎖を持つものが挙げられ、軽鎖の
タイプとしてκ鎖を持つものが挙げられる。ヒトＭＭＰ
−７ポリペプチド抗原を特異的に認識できるモノクロー
ナル抗体としては、重鎖のタイプとしてγ鎖、特にはγ
1 鎖、γ2a鎖、γ3 鎖などを持つもの、μ鎖を持つもの
が挙げられ、軽鎖のタイプとしてκ鎖を持つものが挙げ
られる。

【００１５】またこうして大量に得られた抗体の配列を
決定したり、ハイブリドーマ株から得られた抗体をコー
ドする塩基配列を利用して、遺伝子組換え技術により抗
体を作製することも可能である。さらにこれら抗体をト
リプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理し
て、場合により還元して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ
（ａｂ’）₂ といった抗体フラグメントにして使用して
もよい。標識物を付与する抗体としては、ＩｇＧ画分、
例えば抗体含有物を硫安分画した後、ＤＥＡＥ−セファ
ロースの如き、陰イオン交換ゲルで処理して得られるＩ
ｇＧ画分など、更にはペプシン消化後還元して得られる
特異的結合部Ｆａｂ’などを用いることができる。これ
らの場合の標識物の例としては、下記するように酵素
（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼあるいは
β−Ｄ−ガラクトシダーゼなど）、化学物質、蛍光物質
あるいは放射性同位元素などがある。

【００１６】本発明の一つの態様では、ヒトＭＭＰ−７
と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体が提供され
る。より具体的にはこうしたモノクローナル抗体は、ヒ
トＭＭＰ−７のＧＩＱＫＬＹＧＫＲＳＮＳＲＫＫ（Ｒ２
５３−２６７）のアミノ酸配列を含むＣ末端領域を特異
的に認識し、プロＭＭＰ−７、中間体ＭＭＰ−７及び活
性化型ＭＭＰ−７と免疫反応するモノクローナル抗体で
ある。さらにはヒトプロＭＭＰ−７のＬＰＬＰＱＥＡＧ
ＧＭＳＥＬＱＷＥＱ（Ｒ１８−３４）のアミノ酸配列又
はその近傍を含むＮ末端領域を特異的に認識し、プロＭ
ＭＰ−７のみと免疫反応するモノクローナル抗体である
こともできる。またある場合には該モノクローナル抗体
は、ポリペプチドであるＬＰＬＰＱＥＡＧＧＭＳＥＬＱ
ＷＥＱ（Ｒ１８−３４）、ＬＮＭＷＧＫＥＩＰＬＨＦＲ
ＫＶＶＷＧ（Ｒ１３３−１５０）及びＧＩＱＫＬＹＧＫ
ＲＳＮＳＲＫＫ（Ｒ２５３−２６７）には反応せず、プ
ロＭＭＰ−７のみを認識するものである。

【００１７】本発明の更なる一つの態様では、ヒトプロ
ＭＭＰ−７のＲ１８−３４以外のアミノ酸領域（又は配
列）の一部を特異的に認識し、プロＭＭＰ−７のみと免
疫反応するモノクローナル抗体が提供される。本発明に
従えば「アミノ酸配列又はその近傍」の「その近傍」と
は、ヒトプロＭＭＰ−７のＲ１８−３４以外のアミノ酸
領域（又は配列）の一部であってよく、また実質的に表
８及び図３などで記載されたり、クローン１４１−７Ｂ
２で実質的に代表的に例示されるモノクローナル抗体の
認識部位を意味してよく、あるいはポリペプチドである
ヒトプロＭＭＰ−７のＲ１８−３４、同Ｒ１３３−１５
０及び同Ｒ２５３−２６７には反応せず、プロＭＭＰ−
７のみを認識するモノクローナル抗体の実質的な認識部
位を意味するものであることができる。本発明では、こ
うして得られたヒトＭＭＰ−７に対し特異的に結合する
モノクローナル抗体を用いて検体試料中のＭＭＰ−７を
免疫学的に定量する方法が提供される。特にヒトプロＭ
ＭＰ−７のみを特異的に認識するモノクローナル抗体、
ヒトプロＭＭＰ−７のＬＰＬＰＱＥＡＧＧＭＳＥＬＱＷ
ＥＱ（Ｒ１８−３４）のアミノ酸配列を含むＮ末端領域
あるいはそれと実質的に同等なアミノ酸配列を特異的に
認識し、プロＭＭＰ−７のみと免疫反応するモノクロー
ナル抗体及びヒトＭＭＰ−７のＧＩＱＫＬＹＧＫＲＳＮ
ＳＲＫＫ（Ｒ２５３−２６７）のアミノ酸配列を含むＣ
末端領域あるいはそれと実質的に同等なアミノ酸配列を
特異的に認識し、プロ、中間体及び活性化型ＭＭＰ−７
と免疫反応するモノクローナル抗体から成る群から選ば
れたものを使用したＭＭＰ−７を免疫学的に定量する方
法が提供される。さらにそれぞれヒトプロＭＭＰ−７の
うちの異なる領域に特異性を有するモノクローナル抗体
の少なくとも二つを組み合わせ、ＭＭＰ−７を免疫学的
に定量する方法も提供される。

【００１８】本発明の測定は、イムノアッセイ、例えば
競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで
行うことができ、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡなどを用いること
ができ、Ｂ−Ｆ分離を行ってもあるいは行わないでその
測定を行うこともできる。好ましくは酵素免疫測定法
（ＥＩＡ）であり、さらにサンドイッチ型アッセイが挙
げられる。さらにはまた標識モノクローナル抗体試薬を
用いた免疫細胞染色あるいは免疫組織染色を行うことが
できる。測定は直接法でも間接法でもよい。また間接法
の変法、例えばＰＡＰ法（ペルオキシダーゼ・アンチペ
ルオキシダーゼ法）、ＡＢＣ法（アビジン・ビオチン・
コンプレックス法）、プロテインＡ法などを用いること
もできる。例えばサンドイッチ型アッセイでは、ＭＭＰ
−７に対する抗体の一方を検出可能に標識化する。同じ
抗原を認識できる他の抗体を固相に固定化する。検体と
標識化抗体及び固相化抗体を必要に応じ順次反応させる
ためインキュベーション処理し、ここで非結合抗体を分
離後、標識物を測定する。測定された標識の量は抗原、
すなわちＭＭＰ−７の量と比例する。このアッセイで
は、不溶化抗体や、標識化抗体の添加の順序に応じてワ
ンステップサンドイッチ型アッセイ、フォワード（forw
ard)サンドイッチ型アッセイあるいは逆サンドイッチ型
アッセイなどと呼ばれる。例えば洗浄、撹拌、震盪、ろ
過あるいは抗原の予備抽出等は、特定の状況のもとでそ
れら測定工程の中で適宜採用される。特定の試薬、緩衝
液等の濃度、温度あるいはインキュベーション処理時間
などのその他の測定条件は、検体中の抗原の濃度、検体
試料の性質等の要素に従い変えることができる。当業者
は通常の実験法を用いながら各測定に対して有効な最適
の条件を適宜選定して測定を行うことが出来る。

【００１９】抗原あるいは抗体を固相化できる多くの担
体が知られており、本発明ではそれらから適宜選んで用
いることができる。担体としては、抗原抗体反応などに
使用されるものが種々知られており、本発明においても
勿論これらの公知のものの中から選んで使用できる。特
に好適に使用されるものとしては、例えばガラス、例え
ば活性化ガラス、多孔質ガラス、シリカゲル、シリカ−
アルミナ、アルミナ、磁化鉄、磁化合金などの無機材
料、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、
ポリフッ化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリ
レート、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合
体、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ス
チレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタ
クリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタ
クリレート共重合体など、架橋化アルブミン、コラーゲ
ン、ゼラチン、デキストラン、アガロース、架橋アガロ
ース、セルロース、微結晶セルロース、カルボキシメチ
ルセルロース、セルロースアセテートなどの天然または
変成セルロース、架橋デキストラン、ナイロンなどのポ
リアミド、ポリウレタン、ポリエポキシ樹脂などの有機
高分子物質、さらにそれらを乳化重合して得られたも
の、細胞、赤血球などで、必要に応じ、シランカップリ
ング剤などで官能性基を導入してあるものが挙げられ
る。

【００２０】さらに、ろ紙、ビーズ、試験容器の内壁、
例えば試験管、タイタープレート、タイターウェル、ガ
ラスセル、合成樹脂製セルなどの合成材料からなるセ
ル、ガラス棒、合成材料からなる棒、末端を太くしたり
あるいは細くしたりした棒、末端に丸い突起をつけたり
あるいは偏平な突起をつけた棒、薄板状にした棒などの
固体物質（物体）の表面などが挙げられる。これら担体
へは、抗体を結合させることができ、好ましくは本発明
で得られるヒトマトリックスメタロプロテアーゼ７に対
し特異的に結合するモノクローナル抗体を結合させるこ
とができる。担体とこれら抗原抗体反応に関与するもの
との結合は、吸着などの物理的な手法、あるいは縮合剤
などを用いたり、活性化されたものなどを用いたりする
化学的な方法、さらには相互の化学的な結合反応を利用
した手法などにより行うことが出来る。

【００２１】標識としては、酵素、酵素基質、酵素イン
ヒビター、補欠分子類、補酵素、酵素前駆体、アポ酵
素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、
発光物質、発色物質、磁気物質、金属粒子、例えば金コ
ロイドなど、放射性物質などを挙げることができる。酵
素としては、脱水素酵素、還元酵素、酸化酵素などの酸
化還元酵素、例えばアミノ基、カルボキシル基、メチル
基、アシル基、リン酸基などを転移するのを触媒する転
移酵素、例えばエステル結合、グリコシド結合、エーテ
ル結合、ペプチド結合などを加水分解する加水分解酵
素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどを挙げるこ
とができる。酵素は複数の酵素を複合的に用いて検知に
利用することもできる。例えば酵素的サイクリングを利
用することもできる。

【００２２】代表的な酵素標識としては、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ、大腸菌β−Ｄ
−ガラクトシダーゼなどのガラクトシダーゼ、マレエー
ト・デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−フォスフェー
ト・デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グル
コアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、カタラー
ゼ、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、大腸菌アルカリ
ホスファターゼなどのアルカリ・フォスファターゼなど
が挙げられる。アルカリホスファターゼを用いた場合、
４−メチルウンベリフェリルフォスフェートなどのウン
ベリフェロン誘導体、ニトロフェニルホスフェートなど
のリン酸化フェノール誘導体、ＮＡＤＰを利用した酵素
的サイクリング系、ルシフェリン誘導体、ジオキセタン
誘導体などの基質を使用したりして、生ずる蛍光、発光
などにより測定できる。ルシフェリン、ルシフェラーゼ
系を利用したりすることもできる。カタラーゼを用いた
場合、過酸化水素と反応して酸素を生成するので、その
酸素を電極などで検知することもできる。電極としては
ガラス電極、難溶性塩膜を用いるイオン電極、液膜型電
極、高分子膜電極などであることもできる。酵素標識
は、ビオチン標識体と酵素標識アビジン（ストレプトア
ビジン）に置き換えることも可能である。標識は、複数
の異なった種類の標識を使用することもできる。こうし
た場合、複数の測定を連続的に、あるいは非連続的に、
そして同時にあるいは別々に行うことを可能にすること
もできる。

【００２３】本発明においては、信号の形成に４−ヒド
ロキシフェニル酢酸、１，２−フェニレンジアミン、テ
トラメチルベンジジンなどと西洋ワサビ・ペルオキシダ
ーゼ、ウンベリフェリルガラクトシド、ニトロフェニル
ガラクトシドなどとβ−D −ガラクトシダーゼ、グルコ
ース−６−リン酸・デヒドロゲナーゼなどの酵素試薬の
組合わせも利用でき、ヒドロキノン、ヒドロキシベンゾ
キノン、ヒドロキシアントラキノンなどのキノール化合
物、リポ酸、グルタチオンなどのチオール化合物、フェ
ノール誘導体、フェロセン誘導体などを酵素などの作用
により形成しうるものが使用できる。

【００２４】蛍光物質あるいは化学ルミネッセンス化合
物としては、フルオレセインイソチオシアネート、例え
ばローダミンＢイソチオシアネート、テトラメチルロー
ダミンイソチオシアネートなどのローダミン誘導体、ダ
ンシルクロリド、ダンシルフルオリド、フルオレスカミ
ン、フィコビリプロテイン、アクリジニウム塩、ルミフ
ェリン、ルシフェラーゼ、エクォリンなどのルミノー
ル、イミダゾール、シュウ酸エステル、希土類キレート
化合物、クマリン誘導体などが挙げられる。標識するに
は、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスル
フィド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基
の反応などを利用して行うことができ、公知の方法ある
いは当該分野の当業者が容易になしうる方法、さらには
それらを修飾した方法の中から適宜選択して適用でき
る。また上記免疫原性コンジュゲート作製に使用される
ことのできる縮合剤、担体との結合に使用されることの
できる縮合剤などを用いることができる。

【００２５】縮合剤としては、例えばグルタルアルデヒ
ド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレン
ジイソチオシアネート、Ｎ，Ｎ’−ポリメチレンビスヨ
ードアセトアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスマレイミ
ド、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネー
ト、ビスジアゾベンジジン、１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシンイミ
ジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｓ
ＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミ
ドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓ
ＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル ４−（Ｎ−マ
レイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレー
ト、Ｎ−スクシンイミジル （４−ヨードアセチル）ア
ミノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル ４−（１−
マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−（ε−マレイミ
ドカプロイルオキシ）コハク酸イミド（ＥＭＣＳ），イ
ミノチオラン、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水
物、メチル−３−（４’−ジチオピリジル）プロピオン
イミデート、メチル−４−メルカプトブチリルイミデー
ト、メチル−３−メルカプトプロピオンイミデート、Ｎ
−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルメルカプトアセテー
トなどが挙げられる。

【００２６】本発明の測定法によれば、測定すべき物質
を酵素などで標識したモノクローナル抗体試薬と、担体
に結合された抗体とを順次反応させることもできるし、
同時に反応させることもできる。試薬を加える順序は選
ばれた担体系の型により異なる。感作されたプラスチッ
クなどのビーズを用いた場合には、酵素などで標識した
モノクローナル抗体試薬を測定すべき物質を含む検体試
料と共に最初適当な試験管中に一緒に入れ、その後該感
作されたプラスチックなどのビーズを加えることにより
測定を行うことができる。本発明の定量法においては、
免疫学的測定法が用いられるが、その際の固相の担体と
しては抗体等タンパク質を良く吸着するポリスチレン
製、ポリカーボナイト製、ポリプロピレン製あるいはポ
リビニル製のボール、マイクロプレート、スティック、
微粒子あるいは試験管等の種々の材料および形態を任意
に選択し使用することができる。測定にあたっては至適
ｐＨ、例えばｐＨ約４〜９に保つように適当な緩衝液系
中で行うことができる。特に適切な緩衝剤としては、例
えばアセテート緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、フォスフェ
ート緩衝剤、トリス緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝
剤、ボレート緩衝剤、グリシン緩衝剤、炭酸塩緩衝剤、
トリス−塩酸緩衝剤などが挙げられる。緩衝剤は互いに
任意の割合で混合して用いることができる。抗体抗原反
応は約０℃〜６０℃の間の温度で行うことが好ましい。

【００２７】酵素などで標識されたモノクローナル抗体
試薬及び担体に結合せしめられた抗体試薬、さらには測
定すべき物質のインキュベーション処理は、平衡に達す
るまで行うことができるが、抗体抗原反応の平衡が達成
されるよりもずっと早い時点で固相と液相とを分離して
限定されたインキュベーション処理の後に反応を止める
ことができ、液相又は固相のいずれかにおける酵素など
の標識の存在の程度を測ることができる。測定操作は、
自動化された測定装置を用いて行うことが可能であり、
ルミネセンス・ディテクター、ホト・ディテクターなど
を使用して基質が酵素の作用で変換されて生ずる表示シ
グナルを検知して測定することもできる。抗体抗原反応
においては、それぞれ用いられる試薬、測定すべき物
質、さらには酵素などの標識を安定化したり、抗体抗原
反応自体を安定化するように適切な手段を講ずることが
できる。さらに、非特異的な反応を除去し、阻害的に働
く影響を減らしたり、あるいは測定反応を活性化したり
するため、タンパク質、安定化剤、界面活性化剤、キレ
ート化剤などをインキュベーション溶液中に加えること
もできる。当該分野で普通に採用されていたりあるいは
当業者に知られた非特異的結合反応を防ぐためのブロッ
キング処理を施してもよく、例えば、哺乳動物などの正
常血清タンパク質、アルブミン、スキムミルク、乳発酵
物質、コラーゲン、ゼラチンなどで処理することができ
る。非特異的結合反応を防ぐ目的である限り、それらの
方法は特に限定されず用いることが出来る。

【００２８】本発明の測定方法で測定される試料として
は、あらゆる形態の溶液やコロイド溶液などが使用しう
るが、好ましくは生物由来の流体試料、例えば血液、血
漿、、関節液、脳脊髄液、唾液、羊水、尿、その他の体
液、細胞培養液、組織培養液、生検検体、例えば細胞、
組織、臓器、腫瘍組織などが挙げられる。特に好ましく
は血漿、血清などが挙げられる。本発明の標識モノクロ
ーナル抗体試薬を用いた免疫細胞染色あるいは免疫組織
染色では、生検検体、例えば細胞、組織、臓器、腫瘍組
織などが好適に用いられ、それら試料は染色前に必要に
応じ固定化することができる。組織の固定化には当該分
野で広く使用されているものあるいはそれから誘導され
たものを使用できる。例えばペリオデイト−リジン−パ
ラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ブアン、ホ
ルマリン、パラホルムアルデヒド、ザンボニー、アクロ
レインなどが使用できる。またパラフィンなどで固定化
することもできる。

【００２９】

【実施例】以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれら実施例に限定されず、様々な実
施形態が可能であり、本発明は本明細書及び図面に開示
の思想に従ったものであるかぎり、すべての実施形態を
包含することは理解されるべきである。 実施例１ 抗原の作製 （ａ）ヒト直腸癌細胞由来プロＭＭＰ−７の調製 ＣａＲ−１細胞をダルベッコ変法イーグル／Ｆ１２培地
（ライフテックオリエンタル製）で培養した。まず、１
０％ＦＣＳ、ペニシリン及びストレプトマイシンを含む
ダルベッコ変法イーグル／Ｆ１２培地中で、ＣａＲ−１
細胞をコンフルエントまで培養した。次に、０．２％ラ
クトアルブミン水酸化物を含み無血清としたＢＴ５６３
培地（バイオテスト製、ドイツ）で１４日間培養し、そ
の培養液を回収した。得られた培養液から、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１４２４５−１４２５５，１
９８６及びＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２１７
１２−２１７１９，１９９２に記載のＯｋａｄａ ｅｔ
ａｌ．の方法に従いヒトＭＭＰ−７を精製した。培養
液をＹＭ−１０メンブラン（Ａｍｉｃｏｎ製）を用いて
濃縮し、その濃縮液を０．１５Ｍ ＮａＣｌ，５ｍＭ
ＣａＣｌ₂ ，０．０２％ ＮａＮ₃ 含有５０ｍＭ トリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−
セルロースカラムに供し、グリコサアミノグリカンを取
り除いた。次に、非吸着画分を同緩衝液で平衡化したＧ
ｒｅｅｎ Ａ Ｄｙｅｍａｔｒｉｘ ｇｅｌ（Ａｍｉｃ
ｏｎ製）カラムに供した。ＭＭＰ−７の大部分は吸着し
上記緩衝液に０．０５％ Ｂｒｉｊ３５を加え、ＮａＣ
ｌ濃度０．１５Ｍ〜２．０Ｍの濃度勾配で溶出させた。
溶出画分を分取し、５ｍＭ ＣａＣｌ₂ ，０．０５％
Ｂｒｉｊ３５，０．０２％ ＮａＮ₃ 含有１０ｍＭ ト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対し透析後、同緩衝
液にて平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラムに供し
た。

【００３０】非吸着画分にあるＭＭＰ−７を分取し０．
１５Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＣａＣｌ₂ ，０．０５％Ｂ
ｒｉｊ３５，０．０２％ ＮａＮ₃ 含有２５ｍＭ ホウ
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に対し透析し、その
透析液を亜鉛キレートセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ製）カラムに供した。プロＭＭＰ−７と活性化型であ
るＭＭＰ−７を１ｍＭ ＣａＣｌ₂ ，０．０５％ Ｂｒ
ｉｊ３５，０．０２％ＮａＮ₃ 含有２５ｍＭ カコジル
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解したＮａＣｌ
の濃度勾配により分離した。活性化型ＭＭＰ−７は０．
１５Ｍ ＮａＣｌ含有同緩衝液で溶出され、プロＭＭＰ
−７は１Ｍ ＮａＣｌ含有同緩衝液にて溶出された。プ
ロＭＭＰ−７画分をＹＭ−１０メンブランにて濃縮し、
０．４ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ₂ ，０．０
５％ Ｂｒｉｊ３５，０．０２％ ＮａＮ₃含有５０ｍ
Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したウ
ルトロゲルＡｃＡ４４（ＩＢＦ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃ
ｓ製）カラムによりゲルろ過し、高分子側の不純物を除
去した。得られた精製ヒトプロＭＭＰ−７に２０ｍＭ
ＥＤＴＡを加え、室温で３時間静置した後、０℃で保存
した。また精製ヒトプロＭＭＰ−７をデドシル硫酸ナト
リウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）に供したところ、分子量２８ｋＤａの単一バン
ドを示した。

【００３１】（ｂ）ヒトＭＭＰ−７ポリペプチドの調製 ヒトＭＭＰ−７ポリペプチドとして、Ｍｕｌｌｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５３，１８７−
１９２，１９８８に記載のアミノ酸配列を用いた。ヒト
ＭＭＰ−７ Ｃ末端領域ポリペプチド（Ｃ−ＧＩＱＫＬ
ＹＧＫＲＳＮＳＲＫＫ，Ｒ２５３−２６７）をペプチド
シンセサイザー９６００（ミリジエン／バイオサーチ
製）で合成した。なお、ペプチドＮ末端にシステインを
導入した。次に１２．２ｍｇＫＬＨを１．９５ｍｌの
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解したもの
と、１１．６ｍｇ ＥＭＣＳ １７６．１μｌのジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したものとを混合し、
３０℃，３０分間インキュベーションした。次に、上記
の混合液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡
化したＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）でゲ
ルろ過し、マレイミドが結合されたＫＬＨを分取し、
１．５ｍｌに濃縮した。マレイミドが結合されたＫＬＨ
に対し５０倍モル量の合成ヒトＭＭＰ−７ポリペプチド
３．５ｍｇを０．５４７ｍｌ ０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に溶解したものを混合した。４℃、２０
時間インキュベーションし、ＭＭＰ−７ポリペプチド−
ＫＬＨ複合体を調製した。

【００３２】実施例２ 抗ヒトプロＭＭＰ−７モノクロ
ーナル抗体の作製 （ａ）抗体産生細胞の調製 実施例１（ａ）に記載の方法により調製したヒトプロＭ
ＭＰ−７ ２６μｇをフロイント完全アジュバントと共
に６週令 ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス２匹にそれぞれ腹腔内
投与し初回免疫とした。その後１７日目に１０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した２６μｇヒト
プロＭＭＰ−７で追加免疫した。最終免疫として５２日
目に追加免疫時と同様にヒトプロＭＭＰ−７ ２６μｇ
を静脈内投与し、３日後にマウス脾臓を取り出し脾臓細
胞を調製した。

【００３３】（ｂ）細胞融合 （１）以下の材料及び方法を用いる。 ＲＰＭＩ−１６４０培地：ＲＰＭＩ−１６４０（ＪＲＨ
Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ製）に重炭酸ナトリウム（２４
ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリン
Ｇカリウム（５０Ｕ／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシン
（５０μｇ／ｍｌ）及び硫酸アミカシン（１００μｇ／
ｍｌ）を加え、ドライアイスでｐＨを７．２にし、０．
２２μｍミリポアフィルターで除菌ろ過する。 ＮＳ−１培地：上記ＲＰＭＩ−１６４０培地に除菌ろ過
したＦＣＳ（ＪＲＨＢｉｏｓｉｅｎｃｅｓ製）を１５％
（ｖ／ｖ）の濃度に加える。 ＰＥＧ４０００溶液：ＲＰＭＩ−１６４０培地にポリエ
チレングリコール４０００（ＰＥＧ ４０００，Ｍｅｒ
ｃｋ ａｎｄ ＣＯ．，Ｉｎｃ．製）５０％（ｗ／ｗ）
無血清溶液を調製する。８−アザグアニン耐性ミエロー
マ細胞ＳＰ２（ＳＰ２／０−Ａｇ１４）との融合は、Ｓ
ｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａ
ｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．Ｂ．Ｂ．Ｍｉｓｈ
ｅｌｌ ａｎｄ Ｓ．Ｍ．Ｓｈｉｉｇｉ）、Ｗ．Ｈ．Ｆ
ｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０）、
３５１〜３７２に記載のＯｉ ａｎｄ Ｈｅｒｚｅｎｂ
ｅｒｇ法を若干改変して行った。

【００３４】（２）前記（ａ）項で調製した有核脾臓細
胞（生細胞率１００％）とミエローマ細胞（生細胞率１
００％）とを６：１の割合で融合した。脾臓細胞とミエ
ローマ細胞をそれぞれ前記ＲＰＭＩ−１６４０培地で洗
浄した。次に、融合させるためにそれぞれ同じ培地に懸
濁させた有核脾臓細胞６×１０⁸ とミエローマ細胞１×
１０⁸ を混合した。次に、１，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１
０分間の遠心分離により細胞を沈殿させ上清を完全に吸
引除去した。沈殿した細胞に３７℃に加温したＰＥＧ
４，０００溶液３．３ｍｌを穏やかに攪拌しながら１分
間で滴下し、１分間攪拌し細胞を再懸濁、分散させた。
次に３７℃に加温したＲＰＭＩ−１６４０培地３．３ｍ
ｌを１分間で滴下した。この操作をさらに１回繰り返し
た後、同培地２３．１ｍｌを２〜３分間で常に攪拌しな
がら滴下し、細胞を分散させた。これを１，０００ｒ．
ｐ．ｍ．で７分間遠心分離し上清を完全に吸引除去し
た。次にこの沈殿細胞に３７℃に加温したＮＳ−１培地
３３ｍｌを速やかに加え、大きい細胞塊を注意深くピッ
ペティングで分散させた。さらに同培地６６ｍｌを加え
て希釈しポリスチレン製９６穴マイクロウエル（岩城硝
子製）にウエルあたり６×１０⁵ 個／０．１ｍｌの細胞
を加えた。このマイクロウエルを７％炭酸ガス／９３％
空気中で温度３７℃、湿度１００％下で培養した。

【００３５】（ｃ）選択培地によるハイブリドーマの選
択的増殖 （１）使用する培地は以下のとおりである。 ＨＡＴ培地：前記（ｃ）項で述べたＮＳ−１培地にさら
にヒポキサンチン（１００μＭ）、アミノプテリン
（０．４μＭ）及びチミジン（１６μＭ）を加える。 ＨＴ培地：アミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ
培地と同一組成のものである。 （２）前記（ｂ）項の培養開始後翌日（１日目）、細胞
にピペットでＨＡＴ培地２滴（約０．１ｍｌ）を加え
た。２，３，５，８日目に培地の半分（約０．１ｍｌ）
を新しいＨＡＴ培地で置き換えた。１１日目に培地の半
分を新しいＨＴ培地に置き換えた。１５日目にハイブリ
ドーマの充分な生育が観察された全ウエルについて、次
項（ｄ）記載のＥＬＩＳＡにより陽性ウエルを調べた。
次に、フィーダーとして１０⁷ 個のマウス胸腺細胞を含
むＨＴ培地１ｍｌをポリスチレン製２４穴セルウエル
（住友ベークライト製）の各ウエルに加え、上記で検出
された各陽性ハイブリドーマの充分生育した時点でＥＬ
ＩＳＡにより陽性を再確認し、それぞれについて次項
（ｅ）記載の限界希釈法によるクローニングを行った。

【００３６】（ｄ）ＥＬＩＳＡによる抗ヒトプロＭＭＰ
−７抗体産生ハイブリドーマの検索 Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０４，２０５〜２１
４，１９８０に記載のＲｅｎｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．の
方法を若干改変した方法を用いて行った。前記実施例１
（ａ）で精製したヒトプロＭＭＰ−７ ５０ｎｇ／ウエ
ルで９６穴マイクロタイトレーションプレート（Ｆｌｏ
ｗ Ｌａｂ．製）をコートした。これに、前記（ｃ）で
得られたハイブリドーマ生育ウエルの上清の一部を加え
て、室温で約１時間静置した。２次抗体として西洋わさ
びペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウス免疫グ
ロブリン（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂ．製）を加え、さらに
室温で約１時間静置した。次に、基質である過酸化水素
とｏ−フェニレンジアミンを加え発色の程度をマイクロ
プレートリーダー（ＭＲＰ−Ａ４，東ソー製）を用いて
４９２ｎｍの吸光度で測定した。

【００３７】（ｅ）クローニング 前記（ｃ）の操作後、各ウエル中には２種以上のハイブ
リドーマが生育している可能性があるので、限界希釈法
によりクローニングを行いモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマを取得する。ＮＳ−１培地１ｍｌ当たりフイ
ーダーとして１０⁷ 個のマウス胸腺細胞を含むクローニ
ング培地を調製し、９６穴マイクロウエルの３６ウエ
ル、３６ウエル、２４ウエルにウエル当たりそれぞれ５
個、１個及び０．５個のハイブリドーマを加える。５日
目に全ウエルに約０．１ｍｌのＮＳ−１培地を追加し
た。１１日目にハイブリドーマの充分な生育が認めら
れ、それらについてＥＬＩＳＡを行った。テストした全
ウエルが陽性でない場合、抗体陽性ウエル中のコロニー
数を確認し、ウエル中に１コロニーが確認されたウエル
を１個選び、再クローニングする。最終的にヒトプロＭ
ＭＰ−７に対するモノクローナル抗体産生ハイブリドー
マ１７株が得られた。

【００３８】（ｆ）ハイブリドーマによるモノクローナ
ル抗体の大量産生 ハイブリドーマの増殖は常法によって行う。すなわち、
得られた各ハイブリドーマをＮＳ−１培地などの適当な
培養液で培養し、その培養上清から１０〜１００μｇ／
ｍｌの濃度のモノクローナル抗体を得ることができる。
一方、大量に抗体を得るためには脾臓細胞とミエローマ
細胞の由来マウスと同系のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に１
匹当たり０．５ｍｌの腫瘍形成促進剤プリスタン（Ａｌ
ｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ．製）を腹腔内投与する。１〜３
週間後に、各ハイブリドーマ１×１０⁷ 個を同じく腹腔
内投与し、さらに、その１〜２週間後に４〜７ｍｇ／ｍ
ｌのモノクローナル抗体を含む腹水を得ることができ
る。

【００３９】（ｇ）モノクローナル抗体のアイソタイプ 前述したＥＬＩＳＡ法に従って、ヒトＭＭＰ−７をコー
トしたマイクロタイトレーションプレートに各モノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清を加えた。
０．０５％ツイン２０含有ＰＢＳで洗浄した後、アイソ
タイプ特異的ウサギ抗マウスＩｇ抗体（Ｚｙｍｅｄ．Ｌ
ａｂ．製）を加えた。０．０５％ツイン２０含有ＰＢＳ
による洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋
Ｌ）抗体を加え、基質として過酸化水素及び２，２′−
アジノ−ジ（３−エチルベンゾリン硫酸）を用いて検出
した。その結果、得られたプロヒトＭＭＰ−７に対する
モノクローナル抗体のうち、４個が免疫グロブリン鎖γ
1 ／κを、５個がγ2a／κを、１個がγ2b／κを、４個
がα／κを、３個がμ／κをそれぞれ有していた（表
１）。 （ｈ）モノクローナル抗体の精製 前記（ｆ）項で得られたＩｇＧ１抗体含有各腹水を４０
％飽和硫酸アンモニウム分画後、アフィゲル プロテイ
ンＡ ＭＡＰＳ−IIキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を用い
て精製した。プロテインＡ アガロースカラム（φ２．
５×５ｃｍ）を０．５Ｍ ＮａＣｌ含有１．５Ｍグリシ
ン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化し、抗体含
有透析４０％飽和硫酸アンモニウム画分をそのカラムに
供し、０．１Ｍクエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５．０）で溶出した。溶出液４ｍｌ／フラクショ
ンに分画したところ、例えばクローン１４１−１５Ｃ６
（生工研受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４７３３）はフラ
クション２８〜３４に、クローン１４１−７Ｂ２（生工
研受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４７３４）はフラクショ
ン２６〜３３に溶出された。

【００４０】実施例３ 抗ヒトプロＭＭＰ−７ポリペプ
チドモノクローナル抗体の作製 （ａ）免疫方法および脾臓細胞の調製法 実施例１（ｂ）に記載の方法により調製したヒトＭＭＰ
−７ポリペプチド−ＫＬＨ複合体４５３μｇを完全フロ
イントアジュバンドと共に、６週令、ＢＡＬＢ／ｃ雌マ
ウス２匹にそれぞれに腹腔内投与し、初回免疫とした。
その後、１７日目に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）に溶解した２００μｇポリペプチド−ＫＬＨ複合体
を追加免疫した。最終免疫として５０日目に追加免疫時
と同様にポリペプチド−ＫＬＨ複合体６７μｇを静脈内
および１３３μｇを腹腔内投与し、３日後にマウス脾臓
を取り出し脾臓細胞を調製した。 （ｂ）細胞融合 前記（ａ）で調製した有核脾臓細胞（生細胞率１００
％）を用いて前記実施例２（ｂ）と同様に行った。 （ｃ）選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖 前記（ｂ）の培養開始翌日より、前記実施例２（ｃ）に
記載した方法で行った。

【００４１】（ｄ）ＥＬＩＳＡ法による抗ヒトＭＭＰ−
７ポリペプチド抗体産生ハイブリドーマの検索 前記実施例２（ｄ）に記載した方法と同様に行った。こ
の方法においては、９６穴マイクロタイトレーションプ
レートをヒトＭＭＰ−７ポリペプチド １００ｎｇ／ウ
エルでコートした。 （ｅ）クローニング 前記実施例２（ｅ）に記載した方法と同様に行った。最
終的に表２に示したヒトＭＭＰ−７ポリペプチドに対す
るモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ１２株が得ら
れた。 （ｆ）ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の大量
産生 前記実施例２（ｆ）に記載した方法と同様に行った。 （ｇ）モノクローナル抗体のアイソタイプ 前述したＥＬＩＳＡ法に従ってヒトＭＭＰ−７ポリペプ
チド １００ｎｇ／ウエルをコートしたマイクロタイト
レーションプレートに前記（ｅ）で得られた各モノクロ
ーンの培養上清を加えて、前記実施例２（ｇ）に記載し
た方法と同様に行った。得られたモノクローナル抗体の
うち、９個が免疫グロブリン鎖γ1 ／κを、１個がγ2a
／κを、１個がγ3 ／κを、１個が、μ／κをそれぞれ
有していた（表２）。 （ｈ）モノクローナル抗体の精製 前記実施例２（ｈ）に記載した方法と同様に行った。抗
体含有各腹水を４０％飽和硫酸アンモニウム分画後、ア
フィゲル プロテインＡ ＭＡＰＳ−IIキット（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ製）を用いて精製した。

【００４２】実施例４ 抗ヒトプロＭＭＰ−７モノクロ
ーナル抗体および抗ヒトＭＭＰ−７ポリペプチドモノク
ローナル抗体の選択 （ａ）ヒトプロＭＭＰ−７と抗ヒトプロＭＭＰ−７モノ
クローナル抗体との反応性 前記実施例１（ａ）で得られたヒトプロＭＭＰ−７と前
記実施例２（ｈ）で得られた１７株の精製各モノクロー
ナル抗体との反応性を調べた。実施例１（ａ）で調製し
たＭＭＰ−７をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、細胞工学
１＆２，１０６１−１０６８，１９８３に記載の田部の
方法に従ってウエスタンブロッティングを行い、各モノ
クローンの培養上清と反応後、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウス
免疫グロブリン（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂ．製）を用い間
接法によりイムノブロッティングを行った。また、他の
ＭＭＰｓとの交差反応を調べるためにヒト新生児線維芽
細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）から精製したプロＭＭＰ−１
（Ｊ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉ
ｍ．Ａｃｔａ，２１９，１−１４，１９９３）、プロＭ
ＭＰ−２（Ｎ．Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌ
ｉｎ，Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２２１，９１−１０３，１
９９３）、プロＭＭＰ−３（Ｋ．Ｏｂａｔａ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２１１，５９−
７２，１９９２）及びヒト線維肉腫細胞（ＨＴ１０８
０）から精製したプロＭＭＰ−９（Ｎ． Ｆｕｊｉｍｏ
ｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ．Ａｃｔ
ａ，２３１，７９−８８，１９９４）を用い上記のイム
ノブロッティングもしくは前記（ｄ）で記述したＥＬＩ
ＳＡを行った。表３に示したように、これらのプロＭＭ
Ｐ−７モノクローナル抗体は、他のヒトプロＭＭＰｓと
反応せずヒトプロＭＭＰ−７に対して特異的に反応し
た。

【００４３】（ｂ）抗ヒトプロＭＭＰ−７ポリペプチド
モノクローナル抗体の選択 得られた１２個のポリペプチドモノクローナル抗体はす
べてヒトプロＭＭＰ−７を認識したが、抗ヒトプロＭＭ
Ｐ−７モノクローナル抗体よりも反応性は弱かった。し
かし、クローン１２５−２０Ｈ１１（生工研受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１４７３５）は実施例５記載の免疫組織
染色に使用可能であった。また、１２５−２０Ｈ１１と
他のＭＭＰｓとの交差反応を調べるために上記（ａ）項
で記載した培養細胞の培養液を用いてイムノブロッテン
グを行った。培養液中にはプロＭＭＰ−１，プロＭＭＰ
−２，プロＭＭＰ−３，プロＭＭＰ−９が共存するが、
イムノブロッテングではこれらＭＭＰｓに相当するバン
ドは検出されず、交差反応は認められなかった。

【００４４】実施例５ 抗ヒトプロＭＭＰ−７モノクロ
ーナル抗体を用いた免疫組織染色 ヒト胃癌組織をペリオデイト−リジン−パラホルムアル
デヒド固定し、パラフィン切片を作製した。脱パラフィ
ンしたこれら組織切片中の内因性ＨＲＰを過酸化水素で
ブロックした後、実施例２（ｈ）及び３（ｈ）項で得ら
れたそれぞれの抗ヒトＭＭＰ−７モノクローナル抗体と
反応させた。次に、その切片をＰＢＳで充分洗浄しビオ
チン化ウマ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）と反応させた後、
さらにアビジン−ビオチン−ＨＲＰ複合体（Ｖｅｃｔｏ
ｒ Ｌａｂ．製）と反応させた。上記のようにして得ら
れた切片を、ＰＢＳで洗浄した後、基質としてジアミノ
ベンチジン及び過酸化水素を用いて発色させた。抗プロ
ＭＭＰ−７モノクローナル抗体としてＩｇＧ（クローン
１２５−２０Ｈ１１：生工研受託番号 ＦＥＲＭＰ−１
４７３５，クローン１４１−７Ｂ２：生工研受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１４７３４及びクローン１４１−７３Ｃ
７）を用いたときの免疫組織染色では、ヒトＭＭＰ−７
はいずれも腺癌細胞中に染色された。従って、クローン
１２５−２０Ｈ１１，クローン１４１−７Ｂ２及び１４
１−７３Ｃ７はいずれも免疫組織染色に使用できること
が判明し、癌疾患マーカーとして利用できる可能性が示
唆された。

【００４５】実施例６ ヒトＭＭＰ−７の定量法 （ａ）酵素標識抗体（ＩｇＧ−ＨＲＰ複合体）の調製 （１）ＳＨ基標識ＩｇＧの調製 Ｊ．Ｉｍｍｎｏａｓｓａｙ，４，２０９〜３２７，１９
８３に記載のＩｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．の方法に
従って抗ヒトプロＭＭＰ−７ ＩｇＧ−ＨＲＰ複合体を
調製した。実施例２（ｈ）項で得られ、ヒトプロＭＭＰ
−７に対し反応性が認められたモノクローナル抗体（Ｉ
ｇＧ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し透
析し、その溶液に含有されるＩｇＧに対して１００倍モ
ルのＳ−アセチルメルカプト無水コハク酸をＤＭＦ溶液
として加え、３０℃，３０分間インキュベーションし
た。次に、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）
１００μｌ，０．１Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ６．０）１
０μｌ、１Ｍヒドロキシルアミン溶液（ｐＨ７．０）１
００μｌを加え、３０℃、５分間静置後、５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化
したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５でゲルろ過し、ＳＨ基標
識抗ヒトプロＭＭＰ−７ ＩｇＧを得た。

【００４６】（２）マレイミド標識ＨＲＰの調製 ＨＲＰを１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にＤＭＦに溶解したＥＭＣＳ
をＨＲＰ量に対して２５倍モル量加え、３０℃、３０分
間反応させた。この反応液を０．１Ｍ リン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２
５カラムでゲルろ過し、マレイミド標識ＨＲＰ画分を分
取した。 （３）ＩｇＧ−ＨＲＰ複合体の調製 上記（１）で調製したＳＨ基標識ＩｇＧ １モルに上記
（２）で得られたマレイミド標識ＨＲＰ約５モルを加
え、４℃で約２０時間静置した。この混合液を０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したウルトロゲル
ＡｃＡ ４４（ＩＢＦ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ製）カ
ラムでゲルろ過し、抗ヒトプロＭＭＰ−７ＩｇＧ−ＨＲ
Ｐ複合体画分を分取した。

【００４７】（ｂ）酵素標識抗体（Ｆａｂ’−ＨＲＰ）
の調製 （１）Ｆａｂ′画分の調製 実施例３（ｈ）項で得られた各精製モノクローナル抗体
（ＩｇＧ）を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解
し、その溶液を以下述べるようにしてペプシンで消化し
た。すなわち、上記ＩｇＧに対して２％（ｗ／ｗ）のペ
プシンを加え、３７℃、２４時間消化した。さらにその
消化物に、２Ｍトリス溶液を加えてｐＨを７．０に調整
することによって反応を停止させ、０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ４４
カラムを用いたゲルろ過により、Ｆ（ａｂ′）₂ 画分を
分取した。次に、このＦ（ａｂ′）₂ 画分を５ｍＭＥＤ
ＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で透析
し、最終濃度１０ｍＭとなるようにアミノエタンチオー
ルを加え３７℃で９０分間還元した後、５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化し
たウルトロゲルＡｃＡ４４カラムを用いてゲルろ過し、
Ｆａｂ′画分を分取した。

【００４８】（２）マレイミド標識ＨＲＰ画分の調製 上記（１）項の操作とは別に、以下に述べるようにして
ＨＲＰにマレイミドを標識した。すなわち、ＨＲＰを１
０ｍｇ／ｍｌの量で０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に溶解し、そのＨＲＰに対して、２５倍モル量のＥ
ＭＣＳをＤＭＦ溶液として加え、３０分間反応させた。
これを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化し
たＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラムでゲルろ過し、マ
レイミド標識ＨＲＰ画分を分取した。 （３）Ｆａｂ′−ＨＲＰ複合体画分の調製 前記（１）項で調製した画分中のＦａｂ′に対して、上
記（２）項で得られた画分中のマレイミド標識ＨＲＰと
して等モルになるように両画分を混合し、さらにＦａ
ｂ′及びマレイミド標識ＨＲＰの最終濃度が１００μＭ
となるように、５ｍＭ ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ６．０）で希釈した。この混合液を４℃、２
０時間反応後、Ｆａｂ′の１０倍モル量のＮ−エチルマ
レイミドで未反応のチオール基をブロックした。これを
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したウル
トロゲルＡｃＡ４４カラムを用いてゲルろ過し、Ｆａ
ｂ′−ＨＲＰ複合体画分を分取後、０．１％ＢＳＡ及び
０．００１％クロルヘキシジンを添加し、４℃で保存し
た。

【００４９】（ｃ）モノクローナル抗体結合担体の調製 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，４，２０９〜３２７，１
９８３に記載のＩｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．の方法
に従って、実施例２（ｈ）項及び実施例３（ｈ）項で得
られた精製モノクローナル抗体を０．１％アジ化ナトリ
ウム含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解
し、その濃度を１００μｇ／ｍｌに調製した。このモノ
クローナル抗体溶液を９６穴マイクロプレートにウエル
当たり１００μｌずつ加え、４℃、２４時間静置した。
次にモノクローナル抗体溶液を除去し、１％ＢＳＡ，
０．１Ｍ塩化ナトリウム及び１０ｍＭ ＥＤＴＡ含有３
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０，緩衝液Ａ）を各ウエ
ルに３００μｌずつ加え、４℃で保存した。使用時０．
１％ ツイン ２０及び０．１Ｍ塩化ナトリウム含有１
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０，洗浄緩衝液）で３回
洗浄した。

【００５０】（ｄ）２ステップサンドイッチＥＩＡ法 （ヒトプロＭＭＰ−７の定量）緩衝液Ａで、精製ヒトプ
ロＭＭＰ−７（標準試料）あるいはヒトプロＭＭＰ−７
を含む検体を調製し９６穴マイクロプレート（ＩＣＮ
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製）に各々２５μｌ加えた。次
に緩衝液Ａを上記プレートに各々２２５μｌずつ加え混
和した。この混合液を前記（ｃ）で調製した抗体結合プ
レートに１００μｌ加え、室温で１時間反応させ、洗浄
緩衝液で３回洗浄した。次に、実施例６で調製した酵素
標識抗体を１μｇ／ｍｌとなるように緩衝液Ａで希釈
し、上記プレートに１００μｌずつ加え室温で１時間反
応させ、洗浄緩衝液で３回洗浄した。次に、０．０２％
過酸化水素含有０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ
４．９）に溶解した２ｍｇ／ｍｌ ｏ−フェニレンジア
ミンをウエル当たり１００μｌ加え、室温で１５分間反
応後、２Ｎ硫酸１００μｌ添加し反応を停止させた。こ
の反応混液のＡ₄₉₂ をマイクロプレートリーダーを用い
て測定し検量線より、検体中のヒトプロＭＭＰ−７濃度
を求めた。

【００５１】モノクローナル抗体（クローン１２５−２
０Ｈ１１）を固相用抗体とし、モノクローナル抗体（ク
ローン１４１−７Ｂ２）を標識用抗体（ＩｇＧ−ＨＲ
Ｐ）として用いて得られた検量線を図１に示した。ただ
し、上記以外のモノクローナル抗体の組み合わせでもヒ
トＭＭＰ−７の定量は可能である。一方、実施例４
（ａ）及び（ｂ）項に記載したように、固相用抗体及び
標識用抗体はいずれも他のＭＭＰｓと反応しないので、
上記のアッセイ系においてはヒトプロＭＭＰ−７のみを
特異的に定量していると判断される。図１に示されてい
るように、ヒトプロＭＭＰ−７標準試料の濃度の上昇に
伴ってＡ₄₉₂ は直線的に増加しており、定量感度（標準
プロＭＭＰ−７．０ｎｇ／ｍｌ時の平均値＋２ＳＤのＡ
₄₉₂ 値より算出）は５．０ｎｇ／ｍｌ（５０ｐｇ／ａｓ
ｓａｙ）であり、定量範囲は１０〜６４０ｎｇ／ｍｌ
（０．１−６．４ｎｇ／ａｓｓａｙ）であった。

【００５２】（ｅ）１ステップサンドイッチＥＩＡ法 緩衝液Ａで、精製ヒトプロＭＭＰ−７（標準試料）ある
いはヒトプロＭＭＰ−７を含む検体を調製し９６穴マイ
クロプレートに各々２５μｌ加えた。次に、実施例６で
調製した酵素標識抗体を１．１μｇ／ｍｌとなるように
緩衝液Ａで希釈し、上記プレートに２２５μｌずつ加え
混和した。この混合液を前記実施例６（ｃ）で調製した
抗体結合プレートに１００μｌ加え４℃で２４時間反応
させ、洗浄緩衝液で３回洗浄した。次に、０．０２％過
酸化水素含有０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ
４．９）に溶解した２ｍｇ／ｍｌ ｏ−フェニレンジア
ミンをウエル当たり１００μｌ加え、室温で１５分間反
応後、２Ｎ硫酸１００μｌ添加し反応を停止させた。こ
の反応混液のＡ₄₉₂ をマイクロプレートリーダーを用い
て測定し検量線より、検体中のヒトプロＭＭＰ−７濃度
を求めた。モノクローナル抗体（クローン１２５−２０
Ｈ１１）を固相用抗体とし、モノクローナル抗体（クロ
ーン１４１−１５Ｃ６：生工研受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ
−１４７３３）を標識用抗体（ＩｇＧ−ＨＲＰ）とした
場合の検量線を図２に示した。一方、実施例４（ａ）及
び（ｂ）項に記載したように、固相用抗体及び標識用抗
体はいずれも他のＭＭＰｓと交差しないので、上記のア
ッセイ系においてヒトプロＭＭＰ−７のみを特異的に定
量することができると判断された。図２に示したよう
に、ヒトプロＭＭＰ−７標準試料の濃度の上昇に伴って
Ａ₄₉₂ は直線的に増加しており、定量感度（標準プロＭ
ＭＰ−７、０ｎｇ／ｍｌ時の平均値＋２Ｓ．Ｄ．値より
求めた）は０．１７ｎｇ／ｍｌ（１．７ｐｇ／ａｓｓａ
ｙ）であり、定量範囲は０．６２５〜４０ｎｇ／ｍｌ
（６．２５〜４００ｐｇ／ａｓｓａｙ）であった。

【００５３】（ｆ）ＥＩＡ法による他のＭＭＰｓ及び細
胞外分子との交差反応性 実施例４（ａ）に記載した各プロＭＭＰｓ（プロＭＭＰ
−１，プロＭＭＰ−２，プロＭＭＰ−３，プロＭＭＰ−
９）、ヒト白血球から精製したプロＭＭＰ−８（Ｖ．Ｋ
ｎａｕｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈ
ｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，３７１（Ｓｕｐｐ１．），２
９５−３０４，１９９０）及びヒト胎盤から精製したＩ
Ｖ型コラーゲン（Ｒ．Ｍａｙｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｒ
ｔｅｒｙ，７，２６２−２８０，１９８０）、ヒトラミ
ニン及びヒトフィブロネクチン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社
製）を６４０ｎｇ／ｍｌ及び４０ｎｇ／ｍｌに調整し前
記（ｄ）及び（ｅ）に記載した方法で、それぞれのプロ
ＭＭＰ−７抗体との交差反応性を調べた。プロＭＭＰ−
７の６４０ｎｇ／ｍｌ及び４０ｎｇ／ｍｌのＡ₄₉₂ の値
を１００％として各々のＡ₄₉₂ 値を示した場合、これら
のＭＭＰｓ及び細胞外分子とは交差反応は２ステップ及
び１ステップＥＩＡ法において認められなかった（表４
及び表５）。

【００５４】（ｇ）添加回収試験 前記（ｄ）に記載した方法において以下のように添加回
収試験を行った。健常者血清Ａ（プロＭＭＰ−７、４６
ｎｇ／ｍｌ）、Ｂ（プロＭＭＰ−７、４８．５ｎｇ／ｍ
ｌ）各々２５μｌに標準試料液（０、４０、８０、１６
０及び３２０ｎｇ／ｍｌ）各２５μｌを添加したものを
検体とし、２００μｌの緩衝液Ａを加えた。この混合液
を抗体結合プレートに１００μｌ加え、前記（ｄ）に記
載した方法と同様にしてプロＭＭＰ−７濃度を測定し回
収率を算出した。標準プロＭＭＰ−７の平均回収率は健
常者血清Ａを用いた場合９３．９±２．９（Ｓ．Ｄ．）
％であり、健常者血清Ｂを用いた場合９３．３±３．２
（Ｓ．Ｄ．）％であった（表６）。次に、前記（ｅ）に
記載した方法において添加回収試験を行った。健常者血
清Ｃ（プロＭＭＰ−７、２．１ｎｇ／ｍｌ）２５μｌに
標準試料液（０、１．２５、２．５、５．０及び１０．
０ｎｇ／ｍｌ）各２５μｌを添加したものを検体とし、
２００μｌの酵素標識抗体（ＩｇＧ−ＨＲＰ）液を加え
た。この混合液を抗体結合プレートに１００μｌ加え、
前記（ｅ）に記載した方法と同様にしてプロＭＭＰ−７
量を測定し回収率を算出した。標準プロＭＭＰ−７の健
常者血清Ｃ中での回収率は１１４±４．３（Ｓ．Ｄ．）
％であった（表７）。これらのことより本測定系は、特
異的にプロＭＭＰ−７を認識していることが示唆され
る。

【００５５】実施例７ ヒトプロＭＭＰ−７モノクロー
ナル抗体の特異性 （ａ）ヒト活性化型ＭＭＰ−７と抗ヒトプロＭＭＰ−７
モノクローナル抗体との反応性 前記実施例１（ａ）で得られたヒトプロＭＭＰ−７を１
ｍＭ ＡＰＭＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で２３℃、１０
分間反応させることにより、プロＭＭＰ−７は中間型Ｍ
ＭＰ−７（２１ｋＤａ）及び活性化型ＭＭＰ−７（１９
ｋＤａ）に変換されることがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより認
められた。そこでこの反応液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し
た後、ウエスタンブロッティングを行いヒトプロＭＭＰ
−７モノクローナル抗体（クローン１２５−２０Ｈ１
１、１４１−７Ｂ２及び１４１−１５Ｃ６）を用いてイ
ムノブロッティングを行った。モノクローナル抗体（ク
ローン１２５−２０Ｈ１１）はプロＭＭＰ−７（２８ｋ
Ｄａ）、中間型ＭＭＰ−７（２１ｋＤａ）及び活性化型
ＭＭＰ−７（１９ｋＤａ）を認識したが、モノクローナ
ル抗体（クローン１４１−７Ｂ２及び１４１−１５Ｃ
６）はプロＭＭＰ−７（２８ｋＤａ）のみを認識した
（図３）。

【００５６】（ｂ）ヒトＭＭＰ−７ポリペプチドと抗ヒ
トプロＭＭＰ−７モノクローナル抗体との反応性 前記実施例１（ｂ）で調製したヒトＭＭＰ−７のＣ末端
領域ポリペプチド（ＧＩＱＫＬＹＧＫＲＳＮＳＲＫＫ，
Ｒ２５３−２６７，ｐｅｐｔｉｄｅ＃３）と同様に中間
領域ポリペプチド（ＬＮＭＷＧＫＥＩＰＬＨＦＲＫＶＶ
ＷＧ，Ｒ１３３−１５０，ｐｅｐｔｉｄｅ＃２）及びＮ
末端領域ポリペプチド（ＬＰＬＰＱＥＡＧＧＭＳＥＬＱ
ＷＥＱ，Ｒ１８−３４，ｐｅｐｔｉｄｅ＃１）をペプチ
ドシンセサイザー９６００で合成した。これら３種のポ
リペプチドを各々１００ｎｇ／ウエルで９６穴マイクロ
タイトレーションプレートをコートした。これに、抗ヒ
トＭＭＰ−７抗体（クローン１４１−１５Ｃ６、１４１
−７Ｂ２及び１２５−２０Ｈ１１）を加えて前記実施例
２（ｄ）に記載したＥＬＩＳＡを行った。４９２ｎｍの
吸光度よりクローン１４１−１５Ｃ６はｐｅｐｔｉｄｅ
＃１をクローン１２５−２０Ｈ１１はｐｅｐｔｉｄｅ＃
３を確認した（表８）。上記（ａ）で記載したイムノブ
ロッティング及びポリペプチドとのＥＬＩＳＡの結果よ
りクローン１４１−１５Ｃ６はヒトプロＭＭＰ−７のＬ
ＰＬＰＱＥＡＧＧＭＳＥＬＱＷＥＱ（＃１）のアミノ酸
配列を含むＮ末端領域を特異的に認識し、プロＭＭＰ−
７のみと免疫反応するモノクローナル抗体であり、クロ
ーン１２５−２０Ｈ１１はヒトＭＭＰ−７のＧＩＱＫＬ
ＹＧＫＲＳＮＳＲＫＫ（＃３）のアミノ酸配列を含むＣ
末端領域を特異的に認識し、プロ、中間体及び活性化型
ＭＭＰ−７と免疫反応するモノクローナル抗体であるこ
とが判明した。なお、クローン１４１−７Ｂ２は、ｐｅ
ｐｔｉｄｅ＃１，２，３のいずれとも反応しなかった。
しかし、実施例７（ａ）の結果から判断してｐｅｐｔｉ
ｄｅ＃１近傍のアミノ酸配列を含むＮ末端領域を特異的
に認識するモノクローナル抗体と推定された。

【００５７】実施例８ サンドイッチＥＩＡ法による血
清中ヒトプロＭＭＰ−７量の測定 前記実施例６（ｄ）項に記載した２ステップサンドイッ
チＥＩＡ法により検体として各種疾患の血清プロＭＭＰ
−７を測定した（図４）。健常者血清（ｎ＝２２）の平
均プロＭＭＰ−７値は７１．２±３５．４（Ｓ．Ｄ．）
ｎｇ／ｍｌであり、結腸癌患者血清（ｎ＝２０）の平均
プロＭＭＰ−７値は３１．５±１５．３（Ｓ．Ｄ．）ｎ
ｇ／ｍｌでありこの値は健常者血清に比較して有意に低
かった（ｐ＜０．００１）。また、前記実施例６（ｅ）
項に記載した１ステップサンドイッチＥＩＡ法により結
腸癌患者の血清プロＭＭＰ−７濃度を測定した（表
９）。健常者血清（ｎ＝１６）の平均プロＭＭＰ−７濃
度は２．７５±１．６９（Ｓ．Ｄ．）ｎｇ／ｍｌであっ
た。一方、結腸癌患者血清（ｎ＝１１）の平均プロＭＭ
Ｐ−７濃度は１．１５±１．２２（Ｓ．Ｄ．）ｎｇ／ｍ
ｌであり、この値は健常者血清プロＭＭＰ−７濃度に比
較して有意に低かった（ｐ＜０．０５）。こうして本発
明のモノクローナル抗体は、腫瘍などの診断剤としても
有用であると考えられる。

【００５８】

【発明の効果】本発明では、ヒト直腸癌細胞株（ＣａＲ
−１細胞）由来プロＭＭＰ−７抗原を用いて動物を免疫
後細胞融合法を適用してヒトＭＭＰ−７と特異的に免疫
反応するモノクローナル抗体が得られる。さらに、例え
ばヒトＭＭＰ−７ Ｃ末端領域ポリペプチド（ＧＩＱＫ
ＬＹＧＫＲＳＮＳＲＫＫ，Ｒ２５３−２６７）を用いて
ヒトＭＭＰ−７と特異的に免疫反応するモノクローナル
抗体が得られる。特にヒトＭＭＰ−７のＧＩＱＫＬＹＧ
ＫＲＳＮＳＲＫＫ（Ｒ２５３−２６７）のアミノ酸配列
を含むＣ末端領域あるいはそれと実質的に同等の領域を
特異的に認識しうるモノクローナル抗体、プロ、中間体
及び活性化型ＭＭＰ−７と免疫反応することのできるモ
ノクローナル抗体と、ヒトプロＭＭＰ−７のＬＰＬＰＱ
ＥＡＧＧＭＳＥＬＱＷＥＱ（Ｒ１８−３４）のアミノ酸
配列を含むＮ末端領域あるいはそれと実質的に同等の領
域を特異的に認識しうるモノクローナル抗体、プロＭＭ
Ｐ−７のみと免疫反応することのできるモノクローナル
抗体とを、それぞれ組合わせて測定試薬として用い、特
にはサンドイッチ酵素免疫学的にヒトＭＭＰ−７の測定
を行う方法及び試薬が提供され、それらはヒトプロＭＭ
Ｐ−７の測定及び検知、さらには定量に、より有効なも
のであることが期待できる。これらモノクローナル抗体
を用いることにより現在増加している直腸癌、前立腺癌
を始めとし各種癌疾患に見いだされるＭＭＰ−７を検
出、測定でき、さらに定量できる。これらモノクローナ
ル抗体はさらに組織や細胞の免疫学的染色のための試薬
としても有用で、直腸癌、前立腺癌を始めとし各種癌疾
患のためのマーカー診断剤として有用である。したがっ
てＭＭＰ−７と関連性を有する各種疾患、疾病、症状、
病気の診断薬として有用である。

【００５９】

【表１】

【００６０】

【表２】

【００６１】

【表３】

【００６２】

【表４】

【００６３】

【表５】

【００６４】

【表６】

【００６５】

【表７】

【００６６】

【表８】

【００６７】

【表９】

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトプロＭＭＰ−７の２ステップサンドイッチ
ＥＩＡ法による標準曲線を示すグラフである。

【図２】ヒトプロＭＭＰ−７の１ステップサンドイッチ
ＥＩＡ法による標準曲線を示すグラフである。

【図３】ヒトプロＭＭＰ−７をＡＰＭＡで活性化させた
時のイムノブロッティングの結果を示す図である。

【図４】健常者と結腸癌血清のプロＭＭＰ−７測定結果
を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 吉田 真一 富山県高岡市長慶寺530番地 富士薬品 工業株式会社内 (72)発明者 岩田 和士 富山県高岡市長慶寺530番地 富士薬品 工業株式会社内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 16/40 C12P 21/08 C12Q 1/37 C12N 15/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 (i) ヒトマトリックスメタロプロテアー
   ゼ７（ヒトＭＭＰ−７）のうち、ヒトプロＭＭＰ−７の
   Ｎ末端領域又はヒトプロＭＭＰ−７のＲ１８−３４以外
   のアミノ酸領域の一部を特異的に認識し、ヒトプロＭＭ
   Ｐ−７のみと免疫反応するモノクローナル抗体、及び (ii) ヒトプロＭＭＰ−７のＣ末端領域を特異的に認識
   し、ヒトプロＭＭＰ−７、ヒト中間体ＭＭＰ−７及びヒ
   ト活性化型ＭＭＰ−７と免疫反応するモノクローナル抗
   体からなる群から選ばれたものであることを特徴とする
   モノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 (イ) ヒトプロＭＭＰ−７のみと免疫
   反応するモノクローナル抗体(i) が、(a) ヒトプロＭＭ
   Ｐ−７のＬＰＬＰＱＥＡＧＧＭＳＥＬＱＷＥＱ（Ｒ１８
   −３４）のアミノ酸配列又はその近傍を含むＮ末端領域
   を特異的に認識するもの、あるいは (b) ヒトプロＭＭ
   Ｐ−７のＲ１８−３４及びＲ９３−１０８以外のアミノ
   酸領域の一部を特異的に認識するものであり、 (ロ) ヒトプロＭＭＰ−７、ヒト中間体ＭＭＰ−７及
   びヒト活性化型ＭＭＰ−７と免疫反応するモノクローナ
   ル抗体(ii)が、ヒトＭＭＰ−７のＧＩＱＫＬＹＧＫＲＳ
   ＮＳＲＫＫ（Ｒ２５３−２６７）のアミノ酸配列を含む
   Ｃ末端領域を特異的に認識するものであることを特徴と
   する請求項１記載のモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】 ヒトプロＭＭＰ−７を免疫学的に測定す
   る方法であって、 ヒトＭＭＰ−７と特異的に免疫反応するモノクローナル
   抗体を測定試薬として用い、 (i) ヒトＭＭＰ−７のうち、ヒトプロＭＭＰ−７のＮ
   末端領域又はヒトプロＭＭＰ−７のＲ１８−３４以外の
   アミノ酸領域の一部を特異的に認識し、ヒトプロＭＭＰ
   −７のみと免疫反応するモノクローナル抗体、及び (ii) ヒトプロＭＭＰ−７のＣ末端領域を特異的に認識
   し、ヒトプロＭＭＰ−７、ヒト中間体ＭＭＰ−７及びヒ
   ト活性化型ＭＭＰ−７と免疫反応するモノクローナル抗
   体からなる群から選ばれたモノクローナル抗体を使用す
   ることを特徴とする方法。
4. 【請求項４】 測定試薬としてヒトプロＭＭＰ−７の実
   質的に異なる２つの抗原決定基に対し、それぞれ特異的
   に結合するモノクローナル抗体の少なくとも二種を組合
   わせて用い、且つ (i) ヒトＭＭＰ−７のうち、ヒトプロＭＭＰ−７のＮ
   末端領域又はヒトプロＭＭＰ−７のＲ１８−３４以外の
   アミノ酸領域の一部を特異的に認識し、ヒトプロＭＭＰ
   −７のみと免疫反応するモノクローナル抗体、及び (ii) ヒトプロＭＭＰ−７のＣ末端領域を特異的に認識
   し、ヒトプロＭＭＰ−７、ヒト中間体ＭＭＰ−７及びヒ
   ト活性化型ＭＭＰ−７と免疫反応するモノクローナル抗
   体からなる群から選ばれたモノクローナル抗体を使用
   し、 ヒトプロＭＭＰ−７を免疫学的に定量することを特徴と
   する方法。
5. 【請求項５】 測定試薬として、 A. (i) ヒトプロＭＭＰ−７のＬＰＬＰＱＥＡＧＧＭＳ
   ＥＬＱＷＥＱ（Ｒ１８−３４）のアミノ酸配列又はその
   近傍を含むＮ末端領域を特異的に認識し、プロＭＭＰ−
   ７のみと免疫反応するモノクローナル抗体、及び (ii) ヒトＭＭＰ−７のＧＩＱＫＬＹＧＫＲＳＮＳＲＫ
   Ｋ（Ｒ２５３−２６７）のアミノ酸配列を含むＣ末端領
   域を特異的に認識し、プロ、中間体及び活性化型ＭＭＰ
   −７と免疫反応するモノクローナル抗体とを少なくとも
   用いるか、あるいは B. (i) ヒトプロＭＭＰ−７のＲ１８−３４以外のアミ
   ノ酸領域の一部を特異的に認識し、プロＭＭＰ−７のみ
   と免疫反応するモノクローナル抗体、及び (ii) ヒトＭＭＰ−７のＲ２５３−２６７のアミノ酸配
   列を含むＣ末端領域を特異的に認識し、プロ、中間体及
   び活性化型ＭＭＰ−７と免疫反応するモノクローナル抗
   体とを少なくとも用いることを特徴とする請求項３又は
   ４記載の方法。
6. 【請求項６】 検体中のヒトＭＭＰ−７をサンドイッチ
   型アッセイにより測定するにあたり、 ヒトプロＭＭＰ−７の実質的に異なる２つの抗原決定基
   に対し、それぞれ特異的に結合するモノクローナル抗体
   の少なくとも二種を組合わせて用い、且つ (i) ヒトＭＭＰ−７のうち、ヒトプロＭＭＰ−７のＮ末
   端領域又はヒトプロＭＭＰ−７のＲ１８−３４以外のア
   ミノ酸領域の一部を特異的に認識し、ヒトプロＭＭＰ−
   ７のみと免疫反応するモノクローナル抗体、及び (ii) ヒトプロＭＭＰ−７のＣ末端領域を特異的に認識
   し、ヒトプロＭＭＰ−７、ヒト中間体ＭＭＰ−７及びヒ
   ト活性化型ＭＭＰ−７と免疫反応するモノクローナル抗
   体からなる群から選ばれたモノクローナル抗体を使用
   し、 (A) 検体を(a) 担体に結合された上記モノクローナル抗
   体と反応させ、 (B) 次に、(b) 標識された上記モノクローナル抗体と反
   応させ、 (C) 標識により生ずる信号を検知することによりヒトＭ
   ＭＰ−７の指標として測定を行うことを特徴とするヒト
   ＭＭＰ−７の測定方法。
7. 【請求項７】 測定をサンドイッチ法により、酵素免疫
   学的に行うものであることを特徴とする請求項３〜６の
   いずれか一記載の方法。
8. 【請求項８】 検体中のヒトＭＭＰ−７をサンドイッチ
   型アッセイにより測定するにあたり用いる試薬であっ
   て、 (i) ヒトＭＭＰ−７のうち、ヒトプロＭＭＰ−７のＮ末
   端領域又はヒトプロＭＭＰ−７のＲ１８−３４以外のア
   ミノ酸領域の一部を特異的に認識し、ヒトプロＭＭＰ−
   ７のみと免疫反応するモノクローナル抗体、及び (ii) ヒトプロＭＭＰ−７のＣ末端領域を特異的に認識
   し、ヒトプロＭＭＰ−７、ヒト中間体ＭＭＰ−７及びヒ
   ト活性化型ＭＭＰ−７と免疫反応するモノクローナル抗
   体からなる群から選ばれたモノクローナル抗体を含有し
   ていることを特徴とするヒトＭＭＰ−７を免疫学的に測
   定するための試薬。
9. 【請求項９】 該試薬が、少なくとも二種の請求項１ま
   たは２記載のモノクローナル抗体を組合わせて含有して
   いるもので、該モノクローナル抗体の一方は、(a) 担体
   に結合されたモノクローナル抗体であり、他方は、(b)
   標識されたモノクローナル抗体であることを特徴とする
   請求項８記載の試薬。
10. 【請求項１０】 検体中のヒトＭＭＰ−７をサンドイッ
    チ型アッセイにより測定するにあたり用いる試薬であっ
    て、ヒトプロＭＭＰ−７の実質的に異なる２つの抗原決
    定基に対し、それぞれ特異的に結合するモノクローナル
    抗体の少なくとも二種を組合わせて用い、且つ (i) ヒトＭＭＰ−７のうち、ヒトプロＭＭＰ−７のＮ
    末端領域又はヒトプロＭＭＰ−７のＲ１８−３４以外の
    アミノ酸領域の一部を特異的に認識し、ヒトプロＭＭＰ
    −７のみと免疫反応するモノクローナル抗体、及び (ii) ヒトプロＭＭＰ−７のＣ末端領域を特異的に認識
    し、ヒトプロＭＭＰ−７、ヒト中間体ＭＭＰ−７及びヒ
    ト活性化型ＭＭＰ−７と免疫反応するモノクローナル抗
    体からなる群から選ばれたモノクローナル抗体を使用
    し、 該少なくとも二種のモノクローナル抗体を含有している
    ことを特徴とするヒトＭＭＰ−７を免疫学的に測定する
    ための試薬。