JPH04183397A - ヒト７２ｋＤａゼラチナーゼに対するモノクローナル抗体およびその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［技術分野１ 本発明は、ヒト間質型コラゲナーゼ（以下、ヒトＨＭＰ
−１と記す）、ヒト７２ｋＤａセラチナーセ（以下、ヒ
ト１４ＮＰ−２と記す）またはヒト９２ｋＤａゼラチナ
ーゼ（以下、ヒトＨＨＰ−９と示す）のそれぞれに対す
る各モノクローナル抗体に関するものであり、また、こ
れら各モノクローナル抗体を用いて免疫組織化学的手法
に基づき、組織中あるいは細胞中のヒトＨＨＰ−１、ヒ
トＨＨＰ−２またはヒト１４）４Ｐ−９（いずれＩ：Ｊ
潜在型または活性型）を分析することにより、慢性関節
リウマチあるいは癌を診断することに間する。さらに詳
しくは、本発明は、抗ヒトＨＭＰ−１モノクローナル抗
体、抗ヒトＭＭＰ−２モノクローナル抗体または抗ヒト
１４ＨＰ−９モノクロ一ナル抗体ならびにそれらの各製
造方法および上記モノクローナル抗体を用いる免疫組織
化学的手法により、慢性関節リウマチ患者あるいは癌患
者の組織中ヒトＭＮＰ−１、ヒトＭ１４Ｐ−２またはヒ
トＨＭＰ−９の染色像と健常人の組織のそれとを対比す
ることにより、慢性関節リウマチ疾患あるいは癌の診断
をする方法を提供するものである。

［背景技術〕 細胞外マトリックスはコラーゲン、プロテオグリカン、
エラスチン、フィブロネクチンおよびラミニンなどの粘
着性糖蛋白質から構成される。これらマトリックス成分
の分解には、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＨＨＰ
）と総称される、間質型コラゲナーゼ（ＭＨＰ−１）、
７２ｋＤａゼラチナーゼ（■型コラゲナーゼ、　Ｎ）４
Ｐ−２）、９２ｋＤａゼラチナーゼ（■型コラゲナーゼ
；　１４ＭＰ−９）およびストロムライシン（トランジ
ン、　ＨＨＰ−３）というそれぞれの酵素が重要な役割
を果たしている。

また、炎症時にコラーゲン分解に関与する多形核白血球
由来エラスターゼやカテプシンＧに代表されるセリンプ
ロテアーゼか注目されるようになってきた。

ＮＮＰの遺伝子ファミリー力代表的なものとしてヒトＨ
ＨＰ−１、ヒト１４８Ｐ−２、ヒトＨＨＰ−３およびヒ
トＭＭＰ−９があり、それらの−次構造もすでに決定さ
れている。ＭＨＰ−１とＭＭＰ−３の一次楕遺において
両者間に５５％の相同性が認められており、いずれもＮ
−末端ドメイン、２ｎ２＋結合ドメインおよび、ヘモベ
キン凝血酵素様Ｃ−末端ドメインの３つのドメインより
構成されている。

ＭＨＰ−２はさらに上記Ｎ−末端ドメインおよびＩｎＨ
結合ドメイン間に５８アミノ酸残基からなる構造が３つ
繰り返された構造をもつフィブロネクチン様コラーゲン
結合ドメインが付加されているものである。ＨＭＰ−９
がＭＨＰ−２と大きく興なるところは、Ｉｎ”＋結合ド
メインとＣ−末端ドメインの間に５４アミノ酸残基から
なり、プロリンに富む■型コラーゲンのα２鎖によく似
たドメイン、α２（ｖ）鋼機ドメイン、が挿入されてい
る点である。

次に、各ＭＨＰの基質詩興性についてみてみると、ＨＨ
Ｐ−１は基質特異性が高く、間質の■型コラーゲン、■
型コラーゲン、■型コラーゲンの他、Ｘ型コラーゲンを
分解する。また、弱いながらもゼラチンにも作用する。

　ＭＨＰ−２はゼラチン、■型コラーゲンおよびＶ型コ
ラーゲン、さらに弱いながらプロテオグリカンコア蛋白
質やフィブロネクチンも分解する。また、活性は弱いが
、不溶性エラスチンも分解する。

一方、ＭＭＰ−９は、５Ｖ−４０形質転換ヒト胎児肺線
維芽細胞、辷ト肺マクロファージ、単球性白血病ｕ９３
７細胞、線維肉腫ＨＴ１０８０４［胞およびヒトケラチ
ノサイトなどにより産生きれ、ゼラチンや■型コラーゲ
ンを分解するが、その基質特異性については、１４８Ｐ
−２と同様なのかまだよく分っていない。

［発明の開示］ 本発明者らは、ヒト間質型コラゲナーゼ（ヒトＭＨＰ−
１）、ヒト７２ｋＤａゼラチナーゼ（ヒトＨＨＰ−２）
あるいはヒト９２ｋＤａゼラチナーゼ（ヒトＨＭＰ−９
）に対する各モノクローナル抗体を製造することに成功
した。これらの各モノクローナル抗体を用いてヒト組織
中のヒトＭＮＰＩ　、ヒトＨＨＰ−２あるいはヒトＨＭ
Ｐ−９を免疫組織化学的に分析することにより、ヒト慢
性リウマチ疾患または癌を診断することができる。

したがって、本発明は、ヒト１４ＭＰ−１、ヒト）４Ｈ
Ｐ−２またはヒトＨＮＰ−９に対する各モノクローナル
抗体ならびにそれらの製造法を提供するものであり、ま
た、これらのモノクローナル抗体を使用して、ヒト組織
中のヒトＨＨＰ−１、ヒトＨ１４Ｐ−２またはヒトＨＭ
Ｐ−９を免疫組織化学的に分析することによりヒト慢性
リウマチ疾患あるいは癌を診断する方法を提供するもの
である。

本発明により提供される各モノクローナル抗体ならびに
それらの製造方法に関しては、後に詳述する１本発明に
係る上記免疫組織化学的な分析としては、後掲の実施例
としては一つの例示方法が示されているが、他に例えば
、標識物が付与された抗ヒト１４ＭＰ−１抗体、抗ヒト
ＭＭＰ−２抗体または抗ヒトＨ１４Ｐ−９抗体と検体と
を反応させ、洗浄後検体中に残った標識物を例えばジア
ミノベンジジンなどの発色剤を用いて分析する、いわゆ
る直接法、または、検体と抗ヒトＨ１４Ｐ−１抗体、抗
ヒトＭＨＰ−２抗体または抗ヒトＨ１４Ｐ−９抗体とを
反応させ、洗浄後、標識物か付与された一抗免疫グロブ
リンとさらに反応させ、洗浄後検体中に残った標識物を
上記と同様に分析する、いわゆる間接法があり、これら
は、いずれも本発明に適用される。これらの場合の標Ｔ
ｉＡ物の例としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカ
リフォスファターゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
など）、化学物質、螢光物質あるいは放射性同位元素な
どがある。一方、標識物を付与する抗体としては、抗体
含有物を硫酸アンモニウムを加えることにより分画した
後、ＤＥＡＥ−セファセルの如き陰イオン交換ゲルによ
りあるいはＰｒｏｔｅｉｎ　Ａカラムクロマトグラフィ
ーにより精製したＩｇＧ画分、さらには、べ１シン消化
後、還元して得られる特異的結合部分Ｆａｂ“を用いる
こともできる。

本発明の方法は、被検試料中のヒトＨＮＰ−１、ヒトＨ
ＨＰ−２あるいはヒトＨＭＰ−９の分析を可能とするも
のであり、ヒト慢性リウマチ疾患あるいは癌の診断にお
いて非常に有用なものである。

以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。ただ
し、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ 抗ヒト１４ＨＰ−１モノクロ一ナル抗体、抗ヒトＨＭＰ
−２モノクローナル抗体および抗ヒトＭ１４ρ−９モノ
クローナル抗体の作製 ｆａ）ヒトＨＨＰ−１ポリペプチド、ヒトＨＨＰ−２ポ
リペプチドおよびヒトＨＨＰ〜９ポリペプチドの調製 ヒトＨＨＰ−１ポリペプチドは、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｓ、。

２６１．６６００−６６０５　（１９８６）に記載のＧ
ｏｌｄｂｅｒｇらのアミノ酸配列を、また、ヒトＨＨＰ
−２ポリベグチドおよびヒトＭ１４Ｐ−９ポリペプチド
はそれぞれ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６３．６５
７９−６５８７　（１９８８）に記載のＣｏ１１ｉｅｒ
およびＪ、Ｂｉｏｌ、ＣｈｅＩｌ、、２６４．１７２１
３−１７２２１　　（１９８９）に記載の一１ｌｈｅｌ
ｎらのアミノ酸配列を用いた。

第１表に示したヒトＨＭＰ−１ポリペプチド（Ｐ−１〜
Ｐ−３＞、ヒトＭＭＰ−２ポリペプチド（Ｐ−４〜Ｐ−
８）およびヒトＨＨＰ−９ポリペプチド（Ｐ−９〜Ｐ−
１１）をそれぞれペプチドシンセサイザー９６００　（
ミリジエン／バイオサーチ）で合成した。なお、各べ１
チドＣ末端にシスティンを導入した。合成ベグチドの純
度約７０％以下のものはμＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ　　
（５μ、Ｃ１８−１００人）カラムを用いて高速液体ク
ロマトグラフィーにより精製した。

（ｂ）各ポリペプチドと牛血清アルブミンまたは各ポリ
ペプチドとキーホールリンベットヘモシアニンの複合体
の調製 ２Ｍ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を１−の０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解したもの、あるいは２Ｎ
キーホールリンベツトヘモシアニン（にＬＨ）を１−の
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解したものと
１．８５ｗＮ　　（Ｅ　　１ａｌｅｉｌｉｄＯ−ｃａｐ
ｒｏｙｌｏｘｙ）　ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅを２００μ
Ｊｌのジメチルホルムアミドに溶解したものとを混合し
、３０℃、３０分間シンキュベーションしな０次に上記
の混合液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ＤＨ７，０）で平衡
化したＰＤ−１０＜ファルマシア）でゲル沢過しな。

マレイミドが結合されたＢＳＡまたはマレイミドが結合
されたに［Ｈを分取し、Ｌ５ｍＮ以下に濃縮しな、マレ
イミドが結合されたＢＳＡまなはマレイミドが結合され
なＫＬＨに対し５０倍モル量の前記（ａ）で合成した各
ヒト＋Ｈｐ−ｉポリペプチド、各ヒトＨＨＰ−２ポリペ
プチドあるいは各ヒトＨＨＰ−９ポリペプチドを１−の
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解したものと
混合した。４℃、２０時間インキュベーションし、Ｈ１
４Ｐ−１ポリペプチド−ＢＳＡ複合＃またはＨＨＰ−１
ポリベプチドニに［Ｈ複合体、ＨＨＰ−２ポリペプチド
−８３＾複合体、ＭＨＰ−９ポリペプチド−ＢＳ＾およ
びＭＨＰ−９ポリペプチド−に【Ｈ複合体をそれぞれ調
製した。

（ｃ）抗体産生細胞の調製 前記（ｂ）の方法により調製した各複合体２５０μｇを
完全７０インドアジユバントと共に８退会Ｂａ１ｂ／ｃ
雌マウスにそれぞれ腹腔内投与し、初回免疫した。１５
日後に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）に溶解した
各複合体２００μｇを初回免疫したそれぞれのマウスに
腹腔内投与し追加免疫した。さらに、３８日後に追加免
疫時と同様に各複合体７０μｇを静脈内および１３０μ
ｇを腹腔内投与し、最終免疫とした。その３日後に肺臓
を摘出し、肺細胞懸濁液を調製した。

ｔ（１）細胞融合 （１）以下の材料および方法を用いた。

ＲＰＨＩ　１６４０培地：　ＲＰＨＩ　１６４０（Ｆｌ
ｏｗ　Ｌａｂ、）に重炭酸ナトリウム（２４％Ｍ）　、
ピルビン酸ナトリウム（１１１８）、ペニシリンＧカリ
ウム（５０Ｕ／ｗｅｉｇ酸ストレフトマイシン（５０μ
ｇ／１１ｅ）および硫酸アミカシン（１００μｇ／−）
を加え、ドライアイスでｐＨを７．２にし、０．２μｍ
東洋メンブレンフィルターで除菌と過した。

ＭＳ−１培地：上記ＲＰＨＩ　１６４０培地に除菌濾過
しな仔牛脂児血清（１４，＾、Ｂ１０ＤｒＯｄｕＣｔＳ
）を１５％（Ｖ／Ｖ）の濃度になるように加えた。

ＰＥＧ　４，０００溶液：ＲＰ旧１６４０培地にポリエ
チレングリコール４，０００　ｆＰＥＧ　４，０００−
　Ｍｅｒｃｋ　ｇＣＯ暑を５０％（Ｗ／Ｗ）になるよう
に加え、無血清溶液を調製した。

８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞５Ｐ２（ＳＰ２１
０−ＡＧ１４）との融合は、５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔ
ｈｏｄ　１ｎＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｉｉｕｎｏｌｏｇｙ
　（ｅｄ、Ｂ、Ｂ、Ｈｉｓｈｅｌｌ　ａｎｄ　Ｓ。

Ｍ、Ｓｈｉｉｇｉ）　、Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｉａｎ　ａｎ
ｄ　ＣｏＢａｎｙ　ｆ１９８０）、３５１−３７２に記
載のＯｌらの方法を若干改変して行った。

（２）前記（Ｃ）で調製した有核肺臓細胞（生細胞率１
００％）とミエローマ細Ｊｕｌ＜生細胞率１００％）と
を５＝１の割合で融合しな、肺臓細胞とミエローマ細胞
とを別に前記のＲＰＨＩ　１６４（ｌ培地で洗浄し、次
に同じ培地に懸濁し、融合させるため上記の割合で混合
した。容量２５０ＩＩＪのポリプロピレン製遠沈管（居
城硝子）を用い、４０　ｔｓｔノＲＰ１１６４０培地中
４００Ｘｇ、１０分蘭遠心し、上清を完全に吸出した。

沈殿細胞に３７°Ｃ加温ＰＥＧ　４，０００溶液６□Ｏ
ｎｊを穏やかに撹拌しながら１分間で滴下し、さらに１
分間撹拌し細胞を再懸濁、分散させた０次に３７℃加温
ＲＰＨＩ　１６４０培地６．０ＩＩＪを１分間で滴下し
た。この操作をさらに１回繰り返した後、同培地４２．
Ｏｍｅを２〜３分間で常に撹拌しながら滴下し細胞を分
散させた。

これを４００Ｘｇ、１０分間遠心分離し、上清を完全に
吸引除去しな０次にこの沈殿細胞に３７℃加温ＭＳ−１
培地６０−ｅを速やかに加え、細胞の大きい塊を１０ｄ
のピペットを用いて注意深くピペッティングして分散し
た。さらに同培地１２０Ｉｌｊを加えて希釈し、ポリス
チレン製９６六マイクロウエル（居城硝子）にウェル当
り６．０ｘ１０ｓ個１０．１＋１１の細胞を加えた。細
胞を加えた上記のマイクロウェルを７％炭酸ガス／９３
％空気中で温度３７°Ｃ，湿度１００％下に培養に付し
た。

（ｅ）選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖 （１）使用する培地は以下のとおりである。

Ｈ＾■培地、前記（（１）で述べたＭＳ−１培地にさら
にヒボキサンチン（１００μＨ）アミノプテリン（０，
４μＨ）およびチミジン（１６μＭ）を加えた。

ＩＴ培地ニアミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ
培地と同一組成のものである。

（２）前記（ｄ）の培養開始後翌日（１８目）、細胞に
パスツールピペットで）ＩＡＴ培地２滴（約０．１ｎｊ
！　）をカロえた。２．３．５．８．１１日９に培地の
半分＜０．１ｍ、Ｑ　）を新しいＨＡＴ培地で置き換え
、１４日ロー培地の半分を新しいｌ（Ｔ培地で置き換え
た。以降３〜４日毎に培地の半分を新しいＨＴ培地で置
き換えた０通常約２週面で充分なハイブリドーマの生育
が観察される。ハイブリドーマ生育全ウェルについて次
項（ｆ）記載の固相−抗体結合テスト法（ＥＬＩＳ＾）
により陽性ウェルをチエツクした１次にフィーダーとし
て１０７個のマウス胸腺細胞を含むＨＴ培地１−をポリ
スチレン製２４穴セルウエル（居城硝子）に加えたもの
を用い、上記で検出された各陽性ハイブリドーマの全内
容物を移した。これを前記（ｄ）におけると同機に７％
炭酸カス存在下、３７℃で約１週間培養に付した。その
間１〜２回各回正ウェル滑０．５１Ｎを新しい肘培地Ｃ
２５ｉＪと交換した。

ハイブリドーマの充分生育した時点でＥＬＩＳＡ法によ
り陽性を再確認し、それぞれについて次項（ｇ）記載の
限界希釈法によるクローニングを行った。なお、クロー
ニングに使用後の残液をポリスチレン製２５ｃｍ２Ｍ１
ｆ培養フラスコ（居城硝子）に移し、凍結保存用試料を
調製しな。

（ｆ）　ＥＬＩＳＡ法による抗ヒトＭ）４Ｐ−１抗体、
抗ヒトＨＨＰ−２抗体または抗ヒトＨＭＰ−９抗体産生
ハイブリドーマの検索 Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｎ、　１０４．２０５〜２１４
　（１９８０）に記載のＲｅｎｎａｒｄらの方法を若干
改変した方法を用いた。この方法は、ハイブリドーマ抗
体の検出に遺している。９６穴ミクロタイトレージヨン
プレート（Ｆｌｏｗ　ｔａｂ、）を１１００ｎの各ヒト
ＨＨＰ−１ポリペプチド、各ヒトＭＨＰ−２ポリペプチ
ドあるいは各ヒトＨＭＰ−９ポリペプチドでコートし、
次に、未コート部分を１％ＢＳ＾でブロックした。これ
に前記（ｅ）で得られたハイブリドーマ生育ウェルの上
滑の一部を加えて室温で約１時開インキュベートした。

２次抗体として西洋わさびペルオキシダーゼＷＡ識ヤギ
抗マウス免疫グロブリン（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂ、）を
加え、さら４：［［テ約１時ｆｆｌインキュベートした
。次に基質である過酸化水素と０−フェニレンジアミン
を加え生成した褐色の程度をマイクロプレートリーダー
＜　１４ＲＰ−＾４、東洋ソーダ）を用いて４９２ｎ１
の吸光度を測定し判定した。

（ｇ）クローニング 前記（ｅ）の操作後、各ウェル中には、２種以上のハイ
ブリドーマが生育している可能性があるので、限界希釈
法によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを取得する。　ＭＳ−１培地１−当りフ
ィーダーとして１０７個のマウス胸腺細胞を含むクロー
ニング培地を調製し、９６六マイクロウエルの３６ウエ
ル、３６ウエルおよび２４ウエルにウェル当り５個、１
個および０．５個のハイブリドーマを方口えた。５日目
、１２日目に全ウェルに各約０．１１のＭＳ−１培地を
追加しな。クローニング開始後１４〜１５日で充分なハ
イブリドーマの生育が認められ、コロニー形成陰性ウェ
ルか５０％以上である群についてＥＬＩＳＡ法を行った
。テストした全ウェルが陽性でない場合、抗体陽性ウェ
ル中のコロニー数を確認し、ウェル中に１コロニーが確
認されたウェルを４〜６個選び再クローニングする。最
終的に第２．３および４表に示したように各ヒトＨＭＰ
−１ポリペプチド、ヒトＨＨＰ−２ポリペプチドまたは
ヒトＨＨＰ−９ポリペプチドに対するモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマを得た。

（ｈ）モノクローナル抗体に生体外増殖および生体内増
殖 モノクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、得
られた各ハイブリドーマをＭＳ−１培地などの適当な培
養液で培養（生体外増殖）し、その培養上清から１０〜
１１００ＡＬ／−の濃度のモノクローナル抗体を得るこ
とができた。一方、大量に抗体を得るためには牌細胞と
ミエローマ細胞の由来動物と同系の動″”ｆ＠　（Ｂａ
ｌｂ／ｃマウス）にマウス１匹当り０．５１ｊのＭｌ＠
形成促進剤ブリスタン（２，６，１０，１４−テトラメ
チルペンタデカン、＾１ｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｌｌ、Ｃｏ
、　）を腹腔内投与しな。１〜３週間後に、各ハイブリ
ドーマ１ｘｌＯ７＆を同じく腹腔内投与し、さらにその
１〜２週間後に生体内で産生された４〜７■／ｍ？７）
モノクローナル抗体を含む腹水を得ることができた。

（１）モノクローナル抗体のｔｓおよび軽鎖前述したＥ
ＬＩＳＡ法に従って、ヒトＨＭＰ−１ポリペプチド、ヒ
トＨＭＰ−２ポリベグチドあるいはヒ）　ＭＭＰ−９ポ
リペプチドをコートしたミクロタイトレージョンプレー
トに、前記（ａ）で得られた各モノクローンの培養上清
を加えた９次にＰＢＳにより洗浄した後、アイソタイプ
特異的ウサギ抗マウスＩｇ抗体（２ｙｎｅｄ　ｊａｂ、
　）を加えた。　ＰＢＳによる洗浄後、西洋わさびペル
オキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ　（）ｌ÷［）抗
体を加え、基質として過酸化水素および２．２゛−アジ
ノージ（３−エチルベンゾチアゾリン硫酸）を用いてそ
れぞれのＩｒ［および軽鎖を判定した。その結果をまと
めて後掲の第２．３および４表に示した。

ｔｊ）モノクローナル抗体の精製 前記（ｈ）で得られた各腹水を４０％飽和硫酸アンモニ
ウムで分画した後、１ｇＣクラスの抗体について０．５
Ｍ塩化ナトリウム含有１．５Ｍグリシン−ＮａＯＨ４ｉ
ｌ衝液（ｐＨ８，９）で平衡化したプロティンＡアフィ
ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラムに吸着させ、上記洗浄液
で洗浄後、０．１ＭクエンＦｉ緩衝液（ｐＨ５，０）で
溶出することにより精製した。

実施例２ イムノブロッティング （ａ）材料の調製 ＯＭＥＮ培地：　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍａｃｌｉｆ
ｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｈｅ−ｄｉｕｉ“Ｎ１５ｓｕｉ”
　（日永製薬）に重炭酸ナトリウム（３１ｍＭ）および
Ｌ−グルタミン＜５１１Ｍ）を加え、ドライアイスでｐ
Ｈ７，２に調整し、０．２μｍ東洋メンブレンで除！Ｉ
Ｐ遇しな。

ヒト歯髄かち得た繊維芽細胞を１５％仔牛脂児血清を含
むＯＭＥＮ培地で、５％Ｃ０２インキユベーター中、３
７℃、５日間培養し、５００ｒｐｉ、５分間で遠心して
集めた細胞を０．２％ラクトアルブミ′　ン水解物およ
び５ＵｎｉｔＳ／ｍｌ！遺伝子組換えヒトインターロイ
キン１αを含むＯＭＥＮ培地中培地−７日間同様に培養
した。　５００ｒρｍ、５分間で遠心後の上清を限外濾
過により約１４０倍に濃縮し、イムノブロッティング用
試料とした。

ヒト慢性関節リウマチ（ＲＡ）溝膜細胞を、１５％仔牛
脂児血清を含むＤ１４Ｅ１４培地で５％ＣＯ□インキュ
ベーター中、３７℃、６〜７日間培養し、遠心後の細胞
を　０．２％ラクトアルブミン水解物および２０ｕｎｉ
ｔＳ／＋ｄ　Ｔｕｎｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔ
ｏｒα（ＴＮＦα）を含む［１Ｉ４Ｅ１４培地で懸濁し
、同様に６〜８日間培養しな。遠心後上清を限外濾過あ
るいは３％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）により濃縮し、イ
ムノブロッティング用試料とした。

Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎから購入したヒト線鱈肉Ｍ＃胞ＨＴ７０
８０を前記Ｎ５−７培地で５％ＣＯ。インキュベーター
中、３７℃、２〜３日間培養し、遠心後の細胞を２％ラ
クトアルブミン水解物および１００　ｕ　ｎ　ｉ　ｔ　
ｓ／　ｒｓｅ　ＴＮＦ（２を含むＲＰＨｌ　１６４０培
地で懸濁し、同様に７〜１０日間培養した。７００〜８
００ｒｐｉ、３分間の遠心上清を集め、限外−過あるい
は３％ＴＣ＾により濃縮し、イムノブロッティング用試
料とした。

（ｂ）免疫染色 実施例２−　（ａ）で調製した試料をドデシル硫酸ナト
リウムを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した
後、＃ｌ胞工学１＆２．１０６１−１０６８　（１９８
３）に記載の圧部の方法に従ってつ工スタンプロッテイ
ンクを行い、各モノクローンの培養上清と反応後、ベル
オキシダーセミ識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｃａｔ
）Ｄｅｌ　Ｌａｂ、）を用い、間接法により免疫染色を
行った。

抗ヒトＭＭＰ−１モノクローナル抗体の免疫反応性、第
２表に掲げられたモノクローナル抗体のうちヒト歯＠線
維芽細胞培養液から調製した試料を用いた場合、４ｌ−
１Ｅ５．１１１−１６Ｅ１１．４９−６Ｈ４、ａ９−９
０３．４９−１００９　、４９−１４Ｅ３−４９−１６
０９．４９−１９８９および４９−２０Ｆ１の９つのク
ローンが陽性として認められた。１ＮＦαで刺激したヒ
トＲＡ滑膜細胞培養液から調製した試料を用いた場合、
４ｌ−１Ｅ５．４ｌ−１６Ｅ１１．４９−２Ｃ２，４９
−４Ｈ５，４９−５Ｄ７．４９−６Ｈ４，４９−８Ｆ１
１．４９−９０３．４９−１０［］９．４９−１１Ｆ５
．４９−１４Ｅ３．４９−１６Ｇ９．４９−１９８９．
４９−２０Ｆ１．４９−２２８１．７０−４０９．７０
−６０８および７Ｏ−１３Ｆ１の１８のクローンか陽性
として認められた。

抗ヒトＨＭＰ−２モノクローナル抗体の免疫反応性：第
３表に掲げられたモノクローナル抗体のうち−ＴＮＦα
で刺激したヒトＲＡ滑膜細胞培責液から調製した試料を
用いた場合、３４−２）１１１　、３４−２７Ａ５．３
５−３Ｆ２．３９−ＩＨ９，３９−４Ｅ４．３９−１１
０１１．３９−１２３７　＝　３９−１８Ｆ３　、ａ２
−２Ｈ２，４２−５０１１，４２−１４Ｈ５，ａ３−３
Ｆ９、４５−２Ｈ８、４５−６Ｆ１２　　、４５−１４
八８．４５−１５Ｆ９および４５−１７Ｄ８め１７力モ
ノクローナル抗体がヒトＨＨＰ−２と反応した。

抗ヒト１４ＭＰ−９モノクローナル抗体の免疫反応性：
第４表に掲げられたモノクローナル抗体のうち、ＴｉＦ
６で刺激したＨＴ１０８０細胞培ｌＩ液から調製した試
料を用いた場合、５６−２＾４．５６−４Ｆ１１．５６
−６０１．５７−６Ｇ２および５７−１３Ｄ８の５つの
モノクローナル抗体かヒトＭＨＰ−９と反応しな。

ｆｃ）特異性 前記（ｂ）の免疫染色で陽性となった各抗ＭＨＰモノク
ローナル抗体か他のＭ１４Ｐまたは他の蛋白質と交差反
応するかどうかをみるために、ＴｉＦ６で刺激したヒト
Ｒ＾滑膜細胞培養液または）ＩＴ１０８０細胞のそれぞ
れの培養液から調製した試料を用いてイムノブロッテイ
ンクにより各抗ＭＨＰモノクローナル抗体の特異性を調
べた。

各ヒトＭＨＰの分子量：　ＴｉＦ６で刺激されたヒトＲ
Ａ滑膜細胞培養液から調製した試料中には、イムノブロ
ッテインクにより検出できる量のヒトＨＭＰ−１、ヒト
１４ＭＰ−２およびヒｌ−８１４ρ−３か存在しており
、各々のヒトＭＨＰの分子量は、潜在型ＨＭＩ”　１が
５５ｋＤａおよび５２ｋＤａ　、活性化されたＭＭＰ−
１が４５ｋＤａ　、４２ｋＤａ　、２８ｋＤａおよび２
７ｋＤａテアリ、潜在型ＭＭＰ−２か７２ｋＤａ　、活
性型ＭＭＰ−２か６７ｋＤａ　、また潜在型ＮＭＰ−３
か５７ｋＤａ　、活性型ＭＭＰ−３が５０ｋＤａおよび
４６ｋＤａであった。同様にＴｉＦ６で刺激されたＨＴ
１０８０細胞培養液から調製した試料中に検出される潜
在型ＨＭＰ−９は９２ｋＤａで、活性型ＨＨＰ−９は８
４ｋＤａであった。

抗ヒトＭＭＰ−１モノクローナル抗体の特異性：ＴｉＦ
６で刺激したヒトＲＡ滑膜細胞あるいはＨＴ１０８（Ｌ
４８１１胞培養液から調製した試料をイムノブロンテイ
ンクに供した場合、７０−４０９．７０−６０８および
７Ｏ−１３Ｆ１の各モノクローナル抗体については、そ
れぞれ、分子量５５ｋＤａおよび５２ｋＤａのバンドの
み検出され、４ｌ−ＩＦ５．４９−２Ｃ２，４９−６Ｈ
４，４９−９０３，４９−１００９，４９−４４Ｅ３　
．４９−１６０９　．４９−１９８９．４９−２０Ｆ１
および４９−２２８１の各モノクローナル抗体について
は、それぞれ、分子量５５ｋＤａ、５２ｋＤａ　、　４
５ｋＤａ　、４２ｋＤａ　、２８ｋＤａおよび２７ｋＤ
ａのパンＫが検出され、その他のバンドは認められなか
った。また、４９−４８５．４９−５［）７および４９
−８［１１の各モノクローナル抗体については、分子量
５５ｋＤａ　、５２ｋＤａ　、４５ｋＤａおよび４２ｋ
Ｄａのｉ＜ンドが検出され、分子量２８ｋＤａおよび２
７ｋＤａのバンドは検出されなかった。一方、ヒト潜在
型ＭＮＰ−１とヒト潜在型ＮＭＰ−３の分子量か近似し
ているため、ｐ−アミノフェニル酢酸第二水銀を試料中
に加えることにより、両者を活性型にした後、イムノブ
ロッテインク法により分析した結果、分子量５０ｋＤａ
および４６ｋＤａのバンドは認められなかった。従って
、これらの各抗ヒトＮＨＰ−１モノクローナル抗体は、
ヒトＭＭＰ−２、ヒ）ＭＭＰ−３、ヒトＭＭＰ−９また
は細胞培養液中の他の蛋白質と交差反応しないことか示
され、ヒトＭＭＰ−１分子に特異的に反応することが示
された。

抗ヒトＮｔ４Ｐ−２モノクローナル抗体の詩興性：ＴＮ
Ｆαで刺激したヒトＲＡ滑ａｍ胞あるいはＨＴ１０８０
細胞培養液から調製した試料をイムノプロ・ｙティング
に供した場合、前記（ｂ）の陽性モノクローナル抗体の
うち、３４−２８１１．３９−ＩＨ９および４２−１４
Ｈ５の各モノクローナル抗体はヒトＭＨＰ−９と交差反
応を示し、４２−２Ｈ２および４２−１４Ｈ５の各モノ
クローナル抗体は、ヒトＭＨＰ−１およびヒトＮＭＰ−
３と交差反応を示した。それ以外のモノクローナル抗体
については、他のヒトＭ１４Ｐまなは細胞培養液中の他
の蛋白質と反応せず、ヒトＮＭＰ−２に対して特異的に
反応することが示された。

抗ヒト１４８Ｐ−９モノクロ一ナル抗体の時宜性：ＴＮ
Ｆαで刺激したヒト１１Ａ滑膜細胞培ＬＭから調製した
試料をイムノブロッティングに供した場合、５６−２＾
４．５６−４Ｆ１１．５６−６０１．５７−６Ｇ２およ
び５７−１３０８の５つのモノクローンから得られた各
抗体は、他のヒトＭＮＰまたは培養液中の他の蛋白質と
交差反応せず、ヒトＭＨＰ−９に特異的に反応すること
か示された。

以上イムノプロ・Ｖティングによる結果を第５表にまと
めた。

第　　　５　　　表 第　　５　　表（続き） 実施例３ 免疫組織染色 ヒトＲＡ滑膜組織および横絞筋肉腫を２μＨモネンシン
存在下で３時間培養した。この材料をベリオテイトーリ
ジンーパラホルムアルテヒド固定し、パラフィン切片を
作製した。脱パラフィンしたこれらの切片を、内因性ベ
ルオキシターゼを過酸化水素でブロックした後、実施例
１および２でスクリーニングした抗体のうち、４ｌ−Ｉ
Ｆ５　（抗ヒトＭ１４Ｐ−１）、４２−５０１１　　（
抗ヒトＭ１４Ｐ−２）または５６−２＾４（抗ヒトＭＨ
Ｐ−９）のモノクローナル抗体を用い、上記切片と反応
させた。次に、この切片を０．１４Ｍ塩化ナトリウム含
有２０ｎＭリン酸榎衡液（ｐＨ７，４）で十分洗浄し、
ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ　（Ｈ＋ｌ）と反応後、
さらにアビジンービオチンーベルオキシターゼ複合体（
Ｖｅｃ−ｔｏｒ　ｊａｂ、）と反応させた。ＰＢＳによ
る洗浄後、基質として過酸化水素およびジアミノベンジ
ジンを用いて発色させた。また、Ｌａｂ−Ｔｅｋスライ
ドチャンバー（Ｍｉ　１ｅｓ）上で培養したＨＴ１０８
０細胞をＴＮＦαで刺激後、５６−２１Ｍ　（抗ヒトＭ
ＮＰ−９）のモノクローナル抗体を用い、上記と同様に
免疫染色した。

第１図に示したように４ｌ−ＩＦ５　（抗ヒト１４ＭＰ
−１）モノクローナル抗体を用いた場合、巳トＲＡ滑膜
表層細胞か強く染色された。４２−５０１１　　Ｃ抗ヒ
トＨ）４Ｐ−２）モノクローナル抗体を用いた場合、ヒ
１〜ＲＡ表層細胞下層の線維芽細胞が陽性像として認め
られた。一方、第２図に示したように５６−２Ａ４（抗
ヒトＮＭＰ−９）モノクローナル抗体を用いた場合、Ｈ
Ｔ１０８Ｑ４１［１胞および横絞筋肉腫が強く染色され
た。以上のことから、４ｌ−ＩＦ５．４２−５Ｄ１１ま
なは５６−２Ａ４のモノクローナル抗体は、パラフィン
切片によるＲＡあるいは癌患者の免疫組織染色に使用で
きることが明らかになった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、（ａ）ヒトＲＡ滑膜組織を抗ヒトＭＭＰ−１
モノクローナル抗体（クローン４ｌ−１Ｅ５）で染色し
た時の染色像（ｘ　３００）、（ｂ）ヒトＲＡ滑膜組織
を抗ヒトＨＨＰ−２モノクローナル抗体（クローン４２
−５［）１１）で染色した時の染色像（ｘ　１５０）を
示す図面に代る写真であり、第２図は、（ａ）ＴＮＦα
で刺激したＨＴ１０８０細胞を抗ヒトＭ１４Ｐ−９モノ
クローナル抗体（クローン５６−２＾４）で染色した時
の染色像（Ｘ　３００）、（ｂ）横絞筋肉腫を抗し）−
ＮＨＰ−９モノクロ一ナル抗体（クローン５６−２＾４
）で染色した時の染色＠（ｘ３００）を示す図面に代る
写真である。 特許出願人　　富士薬品工業株式会社 、−ｍ− 第　　　１　　　図　　　（ａ） 第　　　１　　　図　　　（ｂ） 第　　　２　　　図　　　（ａ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ヒト間質型コラゲナーゼ、ヒト７２ｋＤａゼラチナ
   ーゼおよびヒト９２ｋＤａゼラチナーゼについて、それ
   ぞれに存在する抗原決定基のうち、それぞれのいずれか
   一つの抗原決定基のみに免疫反応性を有する各モノクロ
   ーナル抗体であって、潜在型または活性型のヒト間質型
   コラゲナーゼ、ヒト７２ｋＤａゼラチナーゼまたはヒト
   ９２ｋＤａゼラチナーゼと特異的に反応する各モノクロ
   ーナル抗体。 ２）診断対象組織を検体とし、ヒト間質型コラゲナーゼ
   、ヒト７２ｋＤａゼラチナーゼあるいはヒト９２ｋＤａ
   ゼラチナーゼに対する各モノクローナル抗体を使用し、
   検体中のヒト間質型コラゲナーゼ、ヒト７２ｋＤａゼラ
   チナーゼあるいはヒト９２ｋＤａゼラチナーゼを免疫組
   織化学的に分析することにより、ヒト慢性リウマチ疾患
   または癌を診断する方法。