JP2902129B2 - 塩基性線維芽細胞成長因子の検出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、塩基性線維芽細胞成長
因子に特異的な抗体およびヘパリンを用いる、塩基性線
維芽細胞成長因子の検出又は測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ：ｆｉｂｒ
ｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）は、大脳
や脳下垂体抽出液中に見出されるタンパク質で、塩基性
線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ：ｂａｓｉｃ ＦＧＦ）
および酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ：ａｃｉｄｉ
ｃ ＦＧＦ）が知られている。線維芽細胞成長因子（Ｆ
ＧＦ）類は、培養線維芽細胞の他、血管内皮細胞を含む
多くの中胚葉由来の培養細胞の増殖を低濃度（数ｐｇ〜
数ｎｇ／ｍｌ）で促進する〔Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃ
ｚ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｓｕｐｐｌｅ
ｍｅｎｔ ５，１５−２６（１９８７）〕。塩基性線維
芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）と酸性線維芽細胞成長因子
（ａＦＧＦ）の作用はほとんど類似しているが、ｂＦＧ
Ｆの方が生体内に広く分布していることや、腫瘍細胞に
おいて産生例が多いことが知られている。ｂＦＧＦのイ
ン・ビボにおける作用としては、胚における外胚葉か
ら、中胚葉への分化作用、神経細胞の生存促進や分化作
用等が知られているが、特に血管新生作用が注目されて
いる。腫瘍細胞が産生するｂＦＧＦは、腫瘍血管新生因
子の一つと考えられ、固形腫瘍の形成における役割が考
えられている。従って、ｂＦＧＦは生物活性をもつ腫瘍
マーカーとなる可能性があるが、血中レベルの正確な測
定例はまだない。しかし、尿路系腫瘍患者の尿中に高い
ｂＦＧＦの排出があるという報告はある〔Ｃｈｏｄａｋ
等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４８，２０８３−２０８
８（１９８８）〕。

【０００３】ｂＦＧＦに対するポリクローナル抗体は、
抗原として合成ペプチドまたは天然分子を用いて得られ
ていた〔例えば、Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒｅｒ等，Ｎａｔｕ
ｒｅ，３２５，２５７−２５９（１９８７）〕。しか
し、このｂＦＧＦに対するモノクローナル抗体を生成す
ることは困難であった。ｂＦＧＦに対するモノクローナ
ル抗体の生成を最初に報告したのはＭａｓｓｏｇｌｉａ
等である〔Ｍａｓｓｏｇｌｉａ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ．，１３２，５３１−５３７（１９８
７）〕。もっとも、これら４種のモノクローナル抗体は
いずれもｂＦＧＦの生物活性を阻害するものではない。
続いて、Ｓｅｎｏ等もｂＦＧＦに対する４種のモノクロ
ーナル抗体の生成を報告している〔Ｓｅｎｏ等、Ｈｙｂ
ｒｉｄｏｍａ，８，２０９−２２１（１９８９）〕が、
これらもｂＦＧＦの生物活性を阻害するものではない。

【０００４】本発明者等は、ｂＦＧＦの生物活性（すな
わち、ｂＦＧＦによる毛細血管内皮細胞の増殖）を阻害
し、そしてｂＦＧＦの活性形と不活性形を区別すること
のできるモノクローナル抗体を見出し、これらに関して
は既に特許第２８７１７４３号（特願平１−２３６８８
１号）明細書に開示している。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、前記の
モノクローナル抗体などを用いて、血液や尿中に存在す
る塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の検出または
定量を鋭意研究したところ、前記モノクローナル抗体と
ヘパリンとを併用するサンドイッチ法を用いると効率よ
く検出および定量が可能になることを見出した。本発明
はかかる知見に基づくものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、（１）
ウシ塩基性線維芽細胞成長因子を免疫原として調製さ
れ、塩基性線維芽細胞成長因子による毛細血管内皮細胞
の増殖を阻害し、そして加熱によって不活性化された塩
基性線維芽細胞成長因子との交差反応を示さないモノク
ローナル抗体、又は（２）ウシ塩基性線維芽細胞成長因
子を免疫原として調製され、塩基性線維芽細胞成長因子
による毛細血管内皮細胞の増殖を阻害し、そして加熱に
よって不活性化された塩基性線維芽細胞成長因子との交
差反応を示すモノクローナル抗体（以下、抗ｂＦＧＦ抗
体と称することがある）と、ヘパリンと、水不溶性担体
と、検出可能なマーカーとを含有する検出系であって、
前記の抗体（抗ｂＦＧＦ抗体）またはヘパリンのいずれ
か一方は水不溶性担体に担持されており、そして他方に
は検出可能なマーカーが付いているものとする該検出系
に、被検試料を接触させ、前記のマーカーに由来する信
号を検出することを特徴とする、塩基性線維芽細胞成長
因子（ｂＦＧＦ）の検出又は測定方法に関するものであ
る。

【０００７】本発明方法では、ヘパリンを水不溶性担体
に担持させ、ｂＦＧＦに対する抗体（抗ｂＦＧＦ抗体）
に検出可能なマーカーを付けるか、あるいは、抗ｂＦＧ
Ｆ抗体を水不溶性担体に担持させ、ヘパリンに検出可能
なマーカーを付けることができる。いずれの場合におい
ても、被検試料中のｂＦＧＦがヘパリンと抗ｂＦＧＦ抗
体との間に結合され、ヘパリン−ｂＦＧＦ−抗ｂＦＧＦ
抗体の複合体が形成される。本発明で用いるヘパリン
は、分子量約１万〜２万のムコ多糖類の１種で、タンパ
ク質と結合してムコタンパク質を形成する。

【０００８】本発明方法においては、抗ｂＦＧＦ抗体と
して、（１）ウシｂＦＧＦを免疫原として調製され、ｂ
ＦＧＦによる毛細血管内皮細胞の増殖を阻害し、そして
加熱によって不活性化されたｂＦＧＦとの交差反応を示
さないモノクローナル抗体、又は（２）ウシｂＦＧＦを
免疫原として調製され、ｂＦＧＦによる毛細血管内皮細
胞の増殖を阻害し、そして加熱によって不活性化された
ｂＦＧＦとの交差反応を示すモノクローナル抗体を用い
る。すなわち、前記モノクローナル抗体の作成には、免
疫源としてウシｂＦＧＦを用いる。モノクローナル抗体
は、前記の免疫源で免疫された任意の哺乳動物（例え
ば、ラット、ニワトリまたはマウス）の脾臓細胞とミエ
ローマ細胞とのハイブリドーマから分泌させることがで
きる。本発明方法においては、特には特許第２８７１７
４３号（特願平１−２３６８８１号）明細書に記載のモ
ノクローナル抗体ｂＦＭ−１（ウシｂＦＧＦを免疫原と
して調製され、ｂＦＧＦによる毛細血管内皮細胞の増殖
を阻害し、そして加熱によって不活性化されたｂＦＧＦ
と交差反応を示さないモノクローナル抗体）またはモノ
クローナル抗体ｂＦＭ−２（ウシｂＦＧＦを免疫原とし
て調製され、ｂＦＧＦによる毛細血管内皮細胞の増殖を
阻害し、そして加熱によって不活性化されたｂＦＧＦと
交差反応を示すモノクローナル抗体）を用いるのが好ま
しい。

【０００９】ヘパリンまたは抗ｂＦＧＦ抗体を担持する
水不溶性担体としては、サンドイッチ法で通常用いられ
る担体を用いることができる。それらの担体としては、
例えば、セルロース化合物、ポリスチレン、デキストラ
ン、好ましくはアガロースゲル（商品名：セファロー
ス、バイオゲル−Ａ）を挙げることができる。

【００１０】ヘパリンを水不溶性担体に担持させるに
は、公知の化学結合法を用いることができる。また、ヘ
パリンをセファロースに担持した市販品を用いることも
できる。ヘパリンが吸着しにくい材料（例えば、ポリス
チレン）を用いる場合には、その担体とよく吸着する他
のタンパク質（例えば、フィブロネクチン）を最初に吸
着させ、続いてヘパリンをそのタンパク質に結合させる
ことができる。好適には、例えば、フィブロネクチンの
還元およびそのアルキル化誘導体を不溶性担体に固定化
したものを用いることでヘパリンを容易に吸着固定化す
ることができる（特願平１−２８７５号明細書参照）。
抗ｂＦＧＦ抗体を不水溶性担体に担持させるには、公知
の物理吸着法または化学結合法を用いることができる。

【００１１】抗ｂＦＧＦ抗体につける検出可能なマーカ
ーとしては、サンドイッチ法で通常用いられるマーカー
を用いることができる。それらのマーカーとしては、例
えば、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホス
ファターゼ、ガラクトシターゼまたはグルコースオキシ
ダーゼ）、蛍光物質（例えば、フルオレツセンスイソチ
オシアネートまたはローダミン）、発光物質（例えば、
ルミノール、アクリジニウムまたはルシゲニン）または
放射性物質（例えば、 ¹²⁵Ｉ、 ³Ｈまたは³²Ｐ）を挙げ
ることができる。

【００１２】ヘパリンに検出可能なマーカーを付けるに
は、公知の直接化学結合法、または架橋剤を介する化学
結合法を用いることができる。抗ｂＦＧＦ抗体に検出可
能なマーカーを付けるには、公知の物理吸着法または化
学結合法（例えば、マレイミド導入法またはクロラミン
Ｔ法）を用いることができる。

【００１３】本明細書において被検試料とは、ｂＦＧＦ
を含有する可能性のある任意の試料を意味し、特には生
体試料、例えば、尿、血液、血清、細胞抽出液、細胞培
養上清または臓器抽出物などである。

【００１４】本発明は具体的には以下の２種類の方法で
実施する。第１の方法では、ヘパリンを水不溶性担体に
固定させ、抗ｂＦＧＦ抗体に検出可能なマーカーを付け
た検出系を用いる。即ち、ヘパリン固定水不溶性担体に
被検試料を加え、被検試料中に存在するｂＦＧＦをヘパ
リンに結合させる。全体を洗浄した後、検出可能なマー
カーを付けた抗ｂＦＧＦ抗体を加え、ヘパリンに結合し
ているｂＦＧＦに抗ｂＦＧＦ抗体を結合させてヘパリン
−ｂＦＧＦ−抗ｂＦＧＦ抗体からなる複合体を形成させ
る。全体を洗浄した後、複合体または洗浄液に含まれる
前記のマーカーに由来する信号を検出する。この第１の
方法は、前記の２段階法で行うことができるだけでな
く、１段階法、即ち、ヘパリン固定水不溶性担体と、被
検試料と、検出可能なマーカーを付けた抗ｂＦＧＦ抗体
とを同時に加え、全体を洗浄した後、前記のマーカーに
由来する信号を検出することができる。この１段階法
は、試料中のｂＦＧＦの含量が高く、試料を十分に希釈
して検出操作に用いることができ、しかも、混在物の干
渉がない場合に用いるのが好ましい。また、前記の２段
階法は、試料中のｂＦＧＦ含量が低く、混在物の干渉の
可能性がある場合に用いるのが好ましい。

【００１５】第２の方法では、抗ｂＦＧＦ抗体を水不溶
性担体に固定させ、ヘパリンに検出可能なマーカーを付
けた検出系を用いる。即ち、抗ｂＦＧＦ抗体固定水不溶
性担体に被検試料を加え、被検試料中に存在するｂＦＧ
Ｆを抗ｂＦＧＦ抗体に結合させる。全体を洗浄した後、
検出可能なマーカーを付けたヘパリンを加え、抗ｂＦＧ
Ｆ抗体に結合しているｂＦＧＦにヘパリンを結合させて
抗ｂＦＧＦ抗体−ｂＦＧＦ−ヘパリンからなる複合体を
形成させる。全体を洗浄した後、複合体または洗浄液に
含まれる前記のマーカーに由来する信号を検出する。こ
の第２の方法も、前記の２段階法で行うことができるだ
けでなく、１段階法、即ち、抗ｂＦＧＦ抗体固定水不溶
性担体と、被検試料と、検出可能なマーカーを付けたヘ
パリンとを同時に加え、全体を洗浄した後、前記のマー
カーに由来する信号を検出することができる。

【００１６】前記の第１および第２の方法において、反
応液を洗浄する際には、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ
（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎ
ｅ）を用いることができる。

【００１７】マーカーとして酵素を用いた場合には、酵
素免疫法によりその酵素活性を測定する。蛍光物質また
は発光物質の場合には、蛍光免疫分析法または発光免疫
分析法により、発生する特定波長を測定し、放射性物質
を用いた場合には、放射免疫分析法により放射能活性を
測定する。

【００１８】

【実施例】以下、実施例によって本発明を更に具体的に
説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでは
ない。

【００１９】実施例１： （ａ）モノクローナル抗体の ¹²⁵Ｉによる標識 後記参考例（Ｅ）で調製した精製モノクローナル抗体ｂ
ＦＭ−１を、クロラミン−Ｔ法によって ¹²⁵Ｉでラベル
し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ−２５ゲル濾過クロマトグラ
フィ法によって精製した。即ち、クロラミン−Ｔ２００
μｇ／ｍｌを含有する０．３Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．４）１００μｌ中で、室温にて１分間、前記
の精製モノクローナル抗体ｂＦＭ−１（１０μｇ）と
¹²⁵Ｉ（３６０μＣｉ；１３ＭＢｑ）とをインキュベー
トした。メタビサルファイト水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１
００μｌを加えることにより反応を停止させた。更に１
０ｍＭ−ＮａＩ（１００μｌ）、続いて１％ＢＳＡを含
有するＰＢＳ１００μｌを加えてから、ＰＢＳで平衡化
した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ−２５カラム（０．５×３
０ｃｍ）にかけて遊離の ¹²⁵Ｉから ¹²⁵Ｉラベル付きの
モノクローナル抗体ｂＦＭ−１を分離した。 ¹²⁵Ｉラベ
ル付きのモノクローナル抗体ｂＦＭ−１の放射性比活性
は１．９×１０⁴ ｃｐｍ／ｎｇであった。こうして得ら
れた ¹²⁵Ｉラベル付きのモノクローナル抗体ｂＦＭ−１
を以下の実験に用いた。

【００２０】（ｂ）１段階法 ヘパリンを表面上に固定したセファロース粒子（ヘパリ
ン−セファロース：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）の膨潤物
０．１ｍｌ（ベッド・ボリューム）を４ｍｌ試験管（ミ
ニソープチューブ）に導入した。次に、０．１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１００μｌと ¹²⁵Ｉ標
識モノクローナル抗体ｂＦＭ−１（５０μｌ：モノクロ
ーナル抗体１０ｎｇ；２０，０００ｃｐｍを含む）とサ
ンプル溶液（後記）５０μｌとを前記試験管に加え、よ
く攪拌した後、２０℃で１時間インキュベートした。抗
体および試料溶液は、０．１％ＢＳＡおよび０．０２％
アジ化ナトリウムを含むＰＢＳに溶解したものを用い
た。次に、洗浄用緩衝液（０．１％ＢＳＡおよび０．０
２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）２ｍｌを加えて攪
拌した後、遠心処理した（１，０００ｒｐｍ：３分
間）。更に、沈澱物を前記と同じ洗浄液用緩衝液２ｍｌ
で遠心洗浄した。この遠心洗浄操作を３回繰り返し、沈
澱をγ−カウンターで計数した。結果を図１および図２
に示す。

【００２１】図１において、○でプロットした線１は標
準ｂＦＧＦを０ｎｇ〜１．０ｎｇの量で前記ＰＢＳ中に
含有する１０種類のサンプル溶液に関するものであり、
標準検量曲線を示す。△でプロットした線２はａＦＧＦ
を０．５ｎｇ〜１．０ｎｇの量で前記ＰＢＳ中に含有す
るサンプル溶液に関するものであり、そして▽でプロッ
トした線３は標識していない過剰（１０μｇ／ｍｌ）の
精製モノクローナル抗体ｂＦＭ−１とｂＦＧＦ０ｎｇ〜
１．０ｎｇとを前記ＰＢＳ中に含有するサンプル溶液に
関するものである。この結果から、本発明方法を用いる
ことによって、０．１ｎｇ〜１．０ｎｇのｂＦＧＦを特
異的に検出することができることが分かる。

【００２２】次に、図２において○でプロットした線４
はｂＦＧＦを０ｎｇ〜１．０ｎｇの量で前記ＰＢＳ中に
含有する６種類のサンプル溶液に関するものであり、△
でプロットした線５は、培養ＢＣＥ（ｂｏｖｉｎｅ ｃ
ａｐｉｌｌａｒｙｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ：ウシ毛細血
管内皮）細胞１．５×１０⁷ 個を１０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．２）で抽出して調製した粗抽出物（サン
プル液体）０〜２０μｌに関するものである。この結果
は、本発明方法を用いることによって培養細胞に含まれ
ているｂＦＧＦを定量することができることを示してい
る。

【００２３】実施例２：２段階法 ヘパリンを表面上に固定したセファロース粒子（ヘパリ
ン−セファロース：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）の膨潤物
０．１ｍｌ（ベッド・ボリューム）を４ｍｌ試験管（ミ
ニソープチューブ）に導入した。次に、サンプル溶液
（後記）２００μｌ〔０．１リン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．５）で希釈したもの〕を前記試験管に加え、
よく攪拌した後、４℃で１時間インキュベートしてか
ら、遠心処理した（１，０００ｒｐｍ；３分間）。沈澱
物にＰＢＳ２ｍｌを加えて懸濁させてから、再び遠心処
理した（１，０００ｒｐｍ；３分間）。得られた沈澱物
に０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１０
０μｌと ¹²⁵Ｉで標識したモノクローナル抗体ｂＦＭ−
１（前記実施例１と同じ濃度）５０μｌとＰＢＳ緩衝液
０．１％ＢＳＡおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含
有）５０μｌとを加え、よく攪拌した後、２０℃で１時
間インキュベートした。次に、前記ＰＢＳ緩衝液２ｍｌ
を加えて攪拌した後、遠心処理した（１，０００ｒｐ
ｍ；３分間）。更に、沈澱物を前記と同じＰＢＳ緩衝液
２ｍｌで遠心洗浄した（１，０００ｒｐｍ；３分間）。
更に、この遠心洗浄操作を３階繰り返してから、沈澱を
γ−カウンターで計数した。結果を図３に示す。

【００２４】図３において、○でプロットした線６は標
準ｂＦＧＦを０ｎｇ〜１ｎｇの量で含有する６種の標準
試料に関するものであり、□でプロットした線７はラッ
トの脾臓を１．５Ｍ−ＮａＣｌ／１０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．２）で抽出して調製した粗抽出物（サン
プル液体）０〜１０μｌに関するものであり、そして、
△でプロットした線８はラットの肝臓を１．５Ｍ−Ｎａ
Ｃｌ／１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で抽出
して調製した粗抽出物（サンプル液体）０〜１０μｌに
関するものである。

【００２５】この結果は、本発明方法を用いることによ
って、実施例１と同じように０．１ｎｇ〜１ｎｇのｂＦ
ＧＦを検出することができ、臓器の粗抽出液中のｂＦＧ
Ｆを定量することができることを示している。

【００２６】参考例 （Ａ）免疫原の精製 硫酸アンモニウム沈澱、ＣＭ−セファデックスクロマト
グラフィおよびヘパリン−セファロースクロマトグラフ
ィを含むＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ等の方法〔Ｇｏｓ
ｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１，６９６３−６９６７（１９
８４）〕によってウシの脳からｂＦＧＦを精製した。カ
ラムから溶離され、ＤＮＡ合成刺激活性〔ニシカワ等、
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４６，１１−２２
（１９８７）：ヨシタケ等、Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔ．
Ｆｕｎｃｔ．７，２２９−２４３（１９８２）参照〕を
有する１本のタンパク質ピークを与えるフラクションを
集めた。精製されたｂＦＧＦの還元化試料は１９．５％
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、分子量１８，０００を有する単
独バンドのタンパク質を与えた。

【００２７】（Ｂ）免疫処理 精製したｂＦＧＦ免疫原溶液を等量のフロインド氏完全
アジュバントまたは不完全アジュバントと乳化するまで
混合した。このｂＦＧＦ１０μｇを含む混合液を、６週
令のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に投与することに
より免疫を行った（第１回免疫）。以後、２〜４週間の
間隔で同様の操作を行い、計５回免疫した。マウス血清
の抗体力価の定量は、Ｍａｓｓｏｇｌｉａ等、Ｊ．Ｃｅ
ｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３２，５３１−５３７（１９
８７）に記載のＥＬＩＳＡ法によって行った。最終免疫
から４日経過後、脾臓を無菌的にマウスから取り出し以
下の細胞融合工程に使用した。

【００２８】（Ｃ）ハイブリドーマの作成 ＤＭＥ培地に、上記（Ｂ）の脾臓を入れ、ステンレスメ
ッシュ上で押し漬して脾臓細胞懸濁液を得た。こうして
得た細胞をＤＭＥ培地で遠心法によって洗浄し、生きて
いる脾臓細胞数を測定した。

【００２９】一方、予め培養しておいたマウスミエロー
マ細胞（骨髄種細胞）Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ
３Ｕ１）（Ｄｒ．Ｇｏｒｄｏｎ Ｈ．Ｓａｔｏ，Ｗ．Ａ
ｌｔｏｎ Ｊｏｎｅｓ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃ
ｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．より入手）約５×１０⁷ 個に上記
脾臓細胞１×１０⁸ 個を加え、ＤＭＥ培地中でよく混合
し、遠心分離を行った（５００×ｇ、１０分間）。その
上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐし、５０％（ｗ
／ｖ）ポリエチレングリコール４０００のＤＭＥ溶液
（３７℃に保温）０．５ｍｌを滴下し、遠心チューブを
手で１分間穏やかに回転することによってポリエチレン
グリコール溶液と細胞ペレットとを混合させた。次に、
３７℃に保温しておいたＤＭＥ培地２４ｍｌを少量づつ
加えて、チューブを穏やかに回転させた後、遠心分離
（５００×ｇ、１０分間）を行った。細胞ペレットを、
１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地で遠心洗浄した
後、細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（Ｒ
ＰＭＩ培地にアミノプテリン４×１０^-7Ｍ、チミジン
１．６×１０^-5Ｍ、ヒポキサンチン１×１０^-4Ｍを添加
したもの）４０ｍｌに懸濁した。この細胞懸濁液を９６
ウエル細胞培養プレートの各ウエルに２００μｌずつ分
注し、３７℃で、５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器で
培養を開始した。培養中、２〜３日間隔で各ウエルの培
地を約１００μｌ除き、新たに上記のＨＡＴ培地１００
μｌを加えることによりＨＡＴ培地中で増殖するハイブ
リドーマを選択した。８日目から１０％ウシ胎児血清を
含むＨＴ培地（ＤＭＥ培地にチミジン１．６×１０
^-5Ｍ、ヒポキサンチン１×１０^-4Ｍになるように添加し
たもの）に交換し、ハイブリドーマの増殖を観察すると
ともに、１０日目に、下記のＥＬＩＳＡ法により、ｂＦ
ＧＦ抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした。

【００３０】（Ｄ）ハイブリドーマの樹立 ９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｆａｌｃｏｎ社）の
各ウエルに、前記のｂＦＧＦ免疫原溶液２０μｇ／ｍｌ
ずつを分注し、室温で４時間放置した。上清を除去した
後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを分注してブロッキングした。
次に、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで４回洗浄した
後、各ウエルの培養上清５０μｌを加え、室温で４時間
反応させた。その後、上清を除去し、０．１％Ｔｗｅｅ
ｎ２０−ＰＢＳで４回洗浄した。

【００３１】次に、Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで２，００
０倍に希釈したペルオキシターゼ結合ウサギ抗マウス抗
体（ダコ社、デンマーク）５０μｌを各ウエルに加え
た。反応終了後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで各
ウエルを４回洗浄し、０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液
（ｐＨ５．０）と０．４％ｏ−フェニレンジアミンと
０．００５％過酸化水素とを含む溶液５０μｌを各ウエ
ルに加え、室温で１５分間反応させ、各ウエルの４９２
ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果、１９２ウエ
ル中５ウエルに抗体産生が認められた。その後、再度Ｅ
ＬＩＳＡ法によって抗ｂＦＧＦ抗体の産生の有無を確認
してから限界希釈法により３回クローニングした。これ
らのクローンの中から、増殖のよい、抗体分泌能の高
い、しかも安定なクローンを選び、前記と同様の方法で
再クローン化を行い、抗ｂＦＧＦ特異的抗体産生ハイブ
リドーマ２種を樹立し、各々ｂＦＭ−１およびｂＦＭ−
２と命名した。

【００３２】（Ｅ）モノクローナル抗体の製造：イン・
ビボ法 プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン）０．５ｍｌを７週令のＢＡＬＢ／ｃ系マウスの
腹腔内に投与し、７日経過した後のマウス腹腔内に、イ
ン・ビトロで増殖させたハイブリドーマｂＦＭ−１およ
びｂＦＭ−２をマウス一匹当たり１×１０⁷ 細胞となる
ように接種した。

【００３３】各ハイブリドーマにつき一匹のマウスから
約５〜１０ｍｌの腹水が得られた。その抗体濃度は、１
〜３ｍｇ／ｍｌであった。腹水中のモノクローナル抗体
の精製は、以下のようにして行った。ガーゼで濾過した
腹水を遠心分離（２０，０００×ｇ，１０分間）した
後、固形の硫酸アンモニウムを３０％飽和濃度になるよ
うに加えた。遠心分離（２０，０００×ｇ，１０分間）
した後、上清に更に硫酸アンモニウムを５０％飽和濃度
になるように加え、遠心分離により沈澱を得た。沈澱を
小量の５ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）
に溶解し、１００倍量の前記緩衝液に対して３回透析し
た。得られた透析物を、前記緩衝液で平衡化したＤＥ−
５０セルロースのカラムにかけて、前記緩衝液で洗浄し
た。吸着したモノクローナル抗体は、前記緩衝液とそれ
に０．１５Ｍ−ＮａＣｌを加えた溶液とにより、濃度勾
配法によって溶出させた。得られたモノクローナル抗体
が均一な純度をもつことは、ＳＤＳ−電気泳動法によっ
て確認した。

【００３４】（Ｆ）免疫グロブリンクラスの同定 抗ｂＦＧＦ特異モノクローナル抗体ｂＦＭ−１およびｂ
ＦＭ−２の免疫グロブリンクラスおよびサブクラスの同
定は、マウスモノクローナル抗体アイソダイピングキッ
ト（アマーシャム社製）によって行った。その結果、そ
れぞれ、ＩｇＧ１／κであることが分かった。

【００３５】（Ｇ）モノクローナル抗体の交差反応性 （ａ）ウシ脳下垂体ｂＦＧＦ（１−１４６）〔Ｅｓｃｈ
等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２，６５０７−６５１１（１９８５）〕の天然形のア
ミノ酸１４−１６個および追加のＴｙｒの配列を有する
３種類のペプチドを、全自動Ｂｉｏｌｙｎｘ４１７０
Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，スエ
ーデン）または全自動Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ ４３０ Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｎｐｈｙｓｉｃｓ
Ｉｎｃ．；米国）中で、固相法によって合成した〔マツ
オ等、Ｉｎ ＶｉｔｒｏＣｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．
２４，４７７−４８０（１９８８）〕。その内の２種
は、Ｔｒｙ¹⁶−ｂＦＧＦ（１−１５）およびＴｒｙ¹³²
−ｂＦＧＦ（１３３−１４６）であり、これらはそれぞ
れ天然分子のアミノ末端配列およびカルボキシ末端配列
に相当する。もう１種は、Ｔｒｙ⁵¹−ｂＦＧＦ（３６−
５０）であり、これは全配列の親水性分析によって同定
したｂＦＧＦの親水性配列の主要部分を含んでいた。

【００３６】モノクローナル抗体ｂＦＭ−１およびｂＦ
Ｍ−２に関するｂＦＧＦ上のエピトープを決定するため
に、ｂＦＧＦ分子の３種の線状フラグメントとモノクロ
ーナル抗体ｂＦＭ−１およびｂＦＭ−２との交差反応性
を調べた

【００３７】結果を図４および図５に示す。図４および
図５は、モノクローナル抗体ｂＦＭ−１（図４）および
ｂＦＭ−２（図５）とｂＦＧＦフラグメント、ｂＦＧＦ
（後述）および加熱不活性化ｂＦＧＦ（後述）との交差
反応性を競合結合アッセイ法で調べた結果を示すもので
ある。図４および図５において縦軸のＢ／Ｂｏは、各種
濃度の抗原の存在下における ¹²⁵ＩラベルｂＦＧＦの特
異的結合量（Ｂ）を非ラベル化抗原非存在下での特異的
結合量（Ｂｏ）で割った（除算した）ものである。図４
および図５の実験においては、モノクローナル抗体ｂＦ
Ｍ−１の６ｎｇまたはモノクローナル抗体ｂＦＭ−２の
７５ｎｇを反応混合物（０．５ｍｌ）に加えた。添加し
た総トレーサーの百分率でＢｏを示せば、モノクローナ
ル抗体ｂＦＭ−１とは５６％であり、モノクローナル抗
体ｂＦＭ−２とは３５％であった。図４および図５の実
験においては、◎は活性ｂＦＧＦ、○は加熱不活性化ｂ
ＦＧＦ、□はＴｒｙ¹⁶−ｂＦＧＦ（１−１５）、☆はＴ
ｒｙ⁵¹−ｂＦＧＦ（３６−５０）、◇はＴｒｙ¹³² −ｂ
ＦＧＦ（１３３−１４６）である。図４および図５から
明らかなように、これらのペプチド即ちＴｒｙ¹⁶−ｂＦ
ＧＦ（１−１５）、Ｔｒｙ¹³² −ｂＦＧＦ（１３３−１
４６）およびＴｒｙ⁵¹−ｂＦＧＦ（３６−５０）のいず
れもモノクローナル抗体ｂＦＭ−１またはｂＦＭ−２と
は１００μｇ／ｍｌ（この濃度は、明確な交差反応を示
す天然ｂＦＧＦのモル基準濃度の１００−１０００倍で
ある）においてさえ交差反応を示さなかった。このこと
から、これらの配列、すなわちアミノ末端、カルボキシ
ル末端および主要な親水性領域が連続エピトープとして
モノクローナル抗体ｂＦＭ−１またはｂＦＭ−２によっ
ては認識されないことがわかる。

【００３８】（ｂ）ｂＦＧＦの生物活性は熱不安定性お
よび酸不安定性である。従って、ｂＦＧＦ分子（これは
ジスルフィド結合によって維持されていない）のコンフ
ォーメ−ションは、その生物活性に必須のものと考えら
れる〔Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．
Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２８，４７５−４８４（１９８
６）〕。モノクローナル抗体ｂＦＭ−１またはｂＦＭ−
２がｂＦＧＦ分子のコンフォーメ−ションを認識したか
どうかを決定するために、ｂＦＧＦ溶液を沸騰水浴中で
５分間インキュベイションした。熱不活性化ｂＦＧＦの
生物活性（ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３−３Ｋセル中でのＤＮＡ
合成の刺激によって測定した）は、熱処理前のｂＦＧＦ
の生物活性の０．２％より低かった。モノクローナル抗
体ｂＦＭ−１（図４）は熱不活性化ｂＦＧＦと交差反応
を示さなかったが、モノクローナル抗体ｂＦＭ−２（図
５）は熱不活性化ｂＦＧＦと交差反応を示した。但し、
その反応は非処理ｂＦＧＦとのものよりも幾分低かっ
た。このことは、モノクローナル抗体ｂＦＭ−１が、ｂ
ＦＧＦの生物活性に必要なｂＦＧＦ分子のコンフォーメ
−ションを認識していることを示している。

【００３９】（ｃ）様々な種から誘導されたｂＦＧＦお
よびウシ−ａＦＧＦとこれらのモノクローナル抗体との
反応性を、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）によって
決定した。結果を表１に示す。どちらのモノクローナル
抗体も、マウス−ｂＦＧＦ、ヒト−ｂＦＧＦおよびウシ
−ｂＦＧＦとは交差反応を示したが、ウシ−ａＦＧＦと
は交差反応を示さなかった。

【００４０】

【表１】

【００４１】ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）の実験
条件は、図４および図５に関連して記載してあるとおり
である。数値の計算は、前記したとおり、ラジオイムノ
アッセイ法（ＲＩＡ）によって推定したＦＧＦ濃度を、
ＦＧＦのＤＮＡ合成刺激活性から推定したＦＧＦ濃度で
割って行った。いずれのアッセイにおいても、純粋なウ
シ−ｂＦＧＦを標準として用いた。ウシ−ｂＦＧＦの値
を１００％とした。

【００４２】（Ｈ）ｂＦＧＦのラジオイムノアッセイ法 精製したウシｂＦＧＦを、クロラミン−Ｔ法〔Ｋａｎ
等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１１３０６−１
１３１３（１９８８）に記載〕によって ¹²⁵Ｉでラベル
し、ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティクロマ
トグラフィ〔Ｎｅｕｆｅｌｄ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６０，１３８６０−１３８６８（１９８５）に記
載〕を若干修正した方法で精製した。簡単に説明すれ
ば、クロラミン−Ｔ１８０μｇ／ｍｌを含有する反応混
合物１１０μｌ中で室温下で２分間、ウシｂＦＧＦ２．
８μｇと ¹²⁵Ｉ７００μＣｉ（２５．９ＭＢｑ）とを
０． ０２％ＣＨＡＰＳの存在下でインキュベートした
〔マツオ等、Ｉｎ ＶｉｔｒｏＣｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉ
ｏｌ．２４，４７７−４８０（１９８８）〕。０．０２
Ｍジチオスレイトール１００μｌを加えることにより、
反応を停止した。次に、０．１％ＣＨＡＰＳを含有する
塩溶液を用いて、ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム
上で遊離の ¹²⁵Ｉから ¹²⁵Ｉラベル付きｂＦＧＦを分離
した。 ¹²⁵Ｉラベル付きｂＦＧＦの比活性は５．５×１
０⁴ ｃｐｍ／ｎｇであった。ラベルされたｂＦＧＦとラ
ベルされていないｂＦＧＦは、前記と同様のＤＮＡ合成
刺激から判断して、ほとんど同じ生物活性を示した。Ｒ
ＩＡ用反応混合物（５ｍｌ）は、０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）／０．０２％ＮａＮ₃ ０．３５ｍｌ、Ｐ
ＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０２％ＮａＮ₃ （ＰＢＳ−
Ｂ−Ａ）中の４ｎｇ／ｍｌ ¹²⁵Ｉ−ｂＦＧＦ（８０００
−１５０００ｃｐｍ）０．０５ｍｌ、ＰＢＳ−Ｂ−Ａ中
の適当な濃度のラベルされていないｂＦＧＦ０．０５ｍ
ｌおよびＰＢＳ−Ｂ−Ａ中の各々精製されたモノクロー
ナル抗体（０．１２−１．５μｇ／ｍｌ）０．０５ｍｌ
からなり、これを試験管（栄研）内で４℃で一晩インキ
ュベートした。ＰＢＳ／０．０２％ＮａＮ₃ 中の１％正
常マウス血清０．１ｍｌとＰＢＳ／０．０２％ＮａＮ₃
中の０．７７ｍｇ／ｍｌヤギ−抗−マウス免疫グロブリ
ン（ダコ社）０．１ｍｌとを加えた後で、試験管を更に
４℃で４時間インキュベートた。抗体に結合した放射能
を、０．２％ポリエチレングリコール６０００の１ｍｌ
を加えそして遠心することによって沈澱させ、続いてＡ
ｌｏｋａ自動−ウェルガンマシステム（ＡＲＣ−３０
０）中で計数した。

【００４３】（Ｊ）ウシ毛細血管内皮細胞増殖に対する
阻害効果 （ａ）細胞および培養 Ｇｏｅｔｚ等、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．
Ｂｉｏｌ．２１，１７２−１８０（１９８５）に記載の
条件を若干変更した条件でウシ脳皮質からウシ毛細血管
内皮細胞を単離培養し、維持した。細胞の培養は、タイ
プ−ＩＶコラーゲン（Ｓｉｇｍａ社、米国）でコートし
た皿で、ペニシリン１００単位／ｍｌ、ストレプトマイ
シン１００μｇ／ｍｌ、１５ｍＭ−Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ
７．３）およびｂＦＧＦ１ｎｇ／ｍｌを補充して１０％
熱不活性化ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中
で行った。細胞を５〜９継代での増殖実験に用いた。細
胞を、ＣＯ₂ ５％を含む空気中で、湿潤雰囲気下で３７
℃で培養した。

【００４４】（ｂ）増殖実験 タイプ−ＩＶコラーゲンでコートした６０ｍｍ−Ｆａｌ
ｃｏｎ皿で、維持用の培地と同じ培地５ｍｌ中に２×１
０⁴ の密度で、ウシ毛細血管内皮細胞を平板培養した。
細胞接種の時のみ、ｂＦＧＦおよびモノクローナル抗体
を加えた。５日後、細胞をトリプシンによって採取し、
次いでコールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）計数器内で細胞数
を計数した。ｂＦＧＦを含まない培地に１０⁵個の細胞
を平板培養して４日後に細胞数を計数した以外は、ｂＦ
ＧＦ非存在下での増殖を前記と同様の方法で分析した。
数値は、２枚の皿による実験の平均を取った。

【００４５】（ｃ）結果 図６および図７は、外因的に加えたｂＦＧＦの存在下お
よび非存在下での、ウシ毛細血管内皮細胞の増殖に対す
るモノクローナル抗体の効果を示すものである。なお、
図６および図７において、○は、外因的ｂＦＧＦｌｎｇ
／ｍｌ存在下の結果を示し、●は、外因的ｂＦＧＦ非存
在下での結果を示す。また、太い矢印（Ｉｎｏ）は、接
種細胞数を示す。１０％ウシ胎児血清を含有する培地中
でのウシ毛細血管内皮細胞の増殖は、添加されたｂＦＧ
Ｆによって刺激された。細胞２×１０⁴ 個を接種してか
ら５日後の細胞数は、ｂＦＧＦｌｎｇ／ｍｌ存在下およ
び非存在下で各々６．０×１０⁵ および１．１×１０⁵
であった。一方、これらの細胞をより高密度（細胞１０
⁵ 個）で接種した場合には、これらの細胞は外因的に添
加されたｂＦＧＦの非存在下でも増殖することができ
た。もっとも、その増殖速度は若干遅かった。ｂＦＧＦ
非存在下での高接種濃度での倍加時間およびｂＦＧＦ存
在下での低接種濃度での倍加時間は各々４０時間および
２４時間であった。モノクローナル抗体ｂＦＭ−１（図
６）およびモノクローナル抗体ｂＦＭ−２（図７）はど
ちらも、外因的ｂＦＧＦ存在下だけでなく非存在下でも
ウシ毛細血管内皮細胞の増殖を、供与量（０．１−１０
μｇ／ｍｌの範囲において）に依存する態様で阻害し
た。モノクローナル抗体ｂＦＭ−１の阻害効果は、モノ
クローナル抗体ｂＦＭ−２の阻害効果よりも大きかっ
た。これは、これらのモノクローナル抗体のＫｄ値の差
異と一致する。これらの結果は、これらのモノクローナ
ル抗体が、ｂＦＧＦのイン・ビトロにおける生物活性を
阻害し、更にウシ毛細血管内皮細胞から生成分泌される
ｂＦＧＦの生物活性をも阻害し、ｂＦＧＦのこの細胞に
おけるオートクリン作用を抑制することを示している。

【００４６】

【発明の効果】本発明方法によれば、生体液体中のｂＦ
ＧＦの存在またはその量を、簡易な方法で正確に検出ま
たは定量することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】１段階法で本発明方法を実施した場合の、ｂＦ
ＧＦ濃度と放射能活性との関係を示すグラフである。

【図２】１段階法で本発明方法を実施した場合の、ｂＦ
ＧＦ濃度と放射能活性との関係を示すグラフである。

【図３】２段階法で本発明方法を実施した場合の、ｂＦ
ＧＦ濃度と放射能活性との関係を示すグラフである。

【図４】モノクローナル抗体ｂＦＭ−１と、ｂＦＧＦ、
加熱不活性化ｂＦＧＦおよびｂＦＧＦのフラグメントと
の交差結合性を示すグラフである。

【図５】モノクローナル抗体ｂＦＭ−２と、ｂＦＧＦ、
加熱不活性化ｂＦＧＦおよびｂＦＧＦのフラグメントと
の交差結合性を示すグラフである。

【図６】モノクローナル抗体ｂＦＭ−１がウシ毛細血管
内皮細胞のｂＦＧＦによって促進された増殖に与える効
果を示すグラフである。

【図７】モノクローナル抗体ｂＦＭ−２がウシ毛細血管
内皮細胞のｂＦＧＦによって促進された増殖に与える効
果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平２−156154（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−103189（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/543 G01N 33/577

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （１）ウシ塩基性線維芽細胞成長因子を
   免疫原として調製され、塩基性線維芽細胞成長因子によ
   る毛細血管内皮細胞の増殖を阻害し、そして加熱によっ
   て不活性化された塩基性線維芽細胞成長因子との交差反
   応を示さないモノクローナル抗体、又は（２）ウシ塩基
   性線維芽細胞成長因子を免疫原として調製され、塩基性
   線維芽細胞成長因子による毛細血管内皮細胞の増殖を阻
   害し、そして加熱によって不活性化された塩基性線維芽
   細胞成長因子との交差反応を示すモノクローナル抗体
   と、ヘパリンと、水不溶性担体と、検出可能なマーカー
   とを含有する検出系であって、前記の抗体またはヘパリ
   ンのいずれか一方は水不溶性担体に担持されており、そ
   して他方は検出可能なマーカーが付いているものとする
   該検出系に、被検試料を接触させ、前記のマーカーに由
   来する信号を検出することを特徴とする、塩基性線維芽
   細胞成長因子の検出又は測定方法。