JPH04262257A - 塩基性線維芽細胞成長因子の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、塩基性線維芽細胞成長
因子に特異的な抗体およびヘパリンを用いる、塩基性線
維芽細胞成長因子の検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ：ｆｉｂｒ
ｏｂｌａｓｔ　　ｇｒｏｗｔｈ　　ｆａｃｔｏｒ）は、
大脳や脳下垂体抽出液中に見出されるタンパク質で、塩
基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ：ｂａｓｉｃ　　Ｆ
ＧＦ）および酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ：ａｃ
ｉｄｉｃ　　ＦＧＦ）が知られている。線維芽細胞成長
因子（ＦＧＦ）類は、培養線維芽細胞の他、血管内皮細
胞を含む多くの中胚葉由来の培養細胞の増殖を低濃度（
数ｐｇ〜数ｎｇ／ｍｌ）で促進する〔Ｇｏｓｐｏｄａｒ
ｏｗｉｃｚ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｓｕ
ｐｐｌｅｍｅｎｔ　　５，１５−２６（１９８７）〕。 塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）と酸性線維芽細
胞成長因子（ａＦＧＦ）の作用はほとんど類似している
が、ｂＦＧＦの方が生体内に広く分布していることや、
腫瘍細胞において産生例が多いことが知られている。ｂ
ＦＧＦのイン・ビボにおける作用としては、胚における
外胚葉から、中胚葉への分化作用、神経細胞の生存促進
や分化作用等が知られているが、特に血管新生作用が注
目されている。腫瘍細胞が産生するｂＦＧＦは、腫瘍血
管新生因子の一つと考えられ、固形腫瘍の形成における
役割が考えられている。従って、ｂＦＧＦは生物活性を
もつ腫瘍マーカーとなる可能性があるが、血中レベルの
正確な測定例はまだない。しかし、尿路系腫瘍患者の尿
中に高いｂＦＧＦの排出があるという報告はある〔Ｃｈ
ｏｄａｋ等、Ｃａｎｃｅｒ　　Ｒｅｓ．，４８，２０８
３−２０８８（１９８８）〕。

【０００３】ｂＦＧＦに対するポリクローナル抗体は、
抗原として合成ペプチドまたは天然分子を用いて得られ
ていた〔例えば、Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒｅｒ等，Ｎａｔｕ
ｒｅ，３２５，２５７−２５９（１９８７）〕。しかし
、このｂＦＧＦに対するモノクローナル抗体を生成する
ことは困難であった。ｂＦＧＦに対するモノクローナル
抗体の生成を最初に報告したのはＭａｓｓｏｇｌｉａ等
である〔Ｍａｓｓｏｇｌｉａ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ．，１３２，５３１−５３７（１９８７）〕。 もっとも、これら４種のモノクローナル抗体はいずれも
ｂＦＧＦの生物活性を阻害するものではない。 続いて、Ｓｅｎｏ等もｂＦＧＦに対する４種のモノクロ
ーナル抗体の生成を報告している〔Ｓｅｎｏ等、Ｈｙｂ
ｒｉｄｏｍａ，８，２０９−２２１（１９８９）〕が、
これらもｂＦＧＦの生物活性を阻害するものではない。

【０００４】本発明者等は、ｂＦＧＦの生物活性を阻害
し、そしてｂＦＧＦの活性形と不活性形を区別すること
のできるモノクローナル抗体を見出し、これらに関して
は既に特願平１−２３６８８号に開示している。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、前記の
モノクローナル抗体などを用いて、血液や尿中に存在す
る塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の検出または
定量を鋭意研究したところ、ヘパリンを併用するサンド
イッチ法を用いると効率よく検出および定量が可能にな
ることを見出した。本発明はかかる知見に基づくもので
ある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、塩基性
線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）に対する抗体（以下、
抗ｂＦＧＦ抗体と称することがある）と、ヘパリンと、
水不溶性担体と、検出可能なマーカーとを含有する検出
系であって、前記の抗体（抗ｂＦＧＦ抗体）またはヘパ
リンのいずれか一方は水不溶性担体に担持されており、
そして他方には検出可能なマーカーが付いているものと
する該検出系に、被検試料を接触させ、前記のマーカー
に由来する信号を検出することを特徴とする、塩基性線
維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の検出方法に関するもの
である。

【０００７】本発明方法では、ヘパリンを水不溶性担体
に担持させ、ｂＦＧＦに対する抗体（抗ｂＦＧＦ抗体）
に検出可能なマーカーを付けるか、あるいは、抗ｂＦＧ
Ｆ抗体を水不溶性担体に担持させ、ヘパリンに検出可能
なマーカーを付けることができる。いずれの場合におい
ても、被検試料中のｂＦＧＦがヘパリンと抗ｂＦＧＦ抗
体との間に結合され、ヘパリン−ｂＦＧＦ−抗ｂＦＧＦ
抗体の複合体が形成される。本発明で用いるヘパリンは
、分子量約１万〜２万のムコ多糖類の１種で、タンパク
質と結合してムコタンパク質を形成する。

【０００８】抗ｂＦＧＦ抗体としては、ｂＦＧＦに対す
る任意のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体
を用いることができる。抗体の作成には、免疫源として
ヒトｂＦＧＦやウシｂＦＧＦを用いることができる。ポ
リクローナル抗体は、前記の免疫源で免疫された任意の
哺乳動物（例えば、ウサギ、ヤギまたはニワトリ）の血
清から調製される。モノクローナル抗体は、前記の免疫
源で免疫された任意の哺乳動物（例えば、ラット、ニワ
トリまたはマウス）の脾臓細胞とミエローマ細胞とのハ
イブリドーマから分泌させることができる。本発明では
モノクローナル抗体を用いるのが好ましく、特には特願
平１−２３６８８号に記載のモノクローナル抗体ｂＦＭ
−１（ｂＦＧＦの生物活性を阻害し、そして熱不活性ｂ
ＦＧＦと交差反応を示さないモノクローナル抗体）また
はモノクローナル抗体ｂＦＭ−２（ｂＦＧＦの生物活性
を阻害し、そして熱不活性ｂＦＧＦと交差反応を示すモ
ノクローナル抗体）を用いるのが好ましい。

【０００９】ヘパリンまたは抗ｂＦＧＦ抗体を担持する
水不溶性担体としては、サンドイッチ法で通常用いられ
る担体を用いることができる。それらの担体としては、
例えば、セルロース化合物、ポリスチレン、デキストラ
ン、好ましくはアガロースゲル（商品名：セファロース
、バイオゲル−Ａ）を挙げることができる。

【００１０】ヘパリンを水不溶性担体に担持させるには
、公知の化学結合法を用いることができる。また、ヘパ
リンをセファロースに担持した市販品を用いることもで
きる。ヘパリンが吸着しにくい材料（例えば、ポリスチ
レン）を用いる場合には、その担体とよく吸着する他の
タンパク質（例えば、フィブロネクチン）を最初に吸着
させ、続いてヘパリンをそのタンパク質に結合させるこ
とができる。好適には、例えば、フィブロネクチンの還
元およびそのアルキル化誘導体を不溶性担体に固定化し
たものを用いることでヘパリンを容易に吸着固定化する
ことができる（特願平１−２８７５号明細書参照）。 抗ｂＦＧＦ抗体を不水溶性担体に担持させるには、公知
の物理吸着法または化学結合法を用いることができる。

【００１１】抗ｂＦＧＦ抗体につける検出可能なマーカ
ーとしては、サンドイッチ法で通常用いられるマーカー
を用いることができる。それらのマーカーとしては、例
えば、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホス
ファターゼ、ガラクトシターゼまたはグルコースオキシ
ダーゼ）、蛍光物質（例えば、フルオレツセンスイソチ
オシアネートまたはローダミン）、発光物質（例えば、
ルミノール、アクリジニウムまたはルシゲニン）または
放射性物質（例えば、　１２５Ｉ、　３Ｈまたは３２Ｐ
）を挙げることができる。

【００１２】ヘパリンに検出可能なマーカーを付けるに
は、公知の直接化学結合法、または架橋剤を介する化学
結合法を用いることができる。抗ｂＦＧＦ抗体に検出可
能なマーカーを付けるには、公知の物理吸着法または化
学結合法（例えば、マレイミド導入法またはクロラミン
Ｔ法）を用いることができる。

【００１３】本明細書において被検試料とは、ｂＦＧＦ
を含有する可能性のある任意の試料を意味し、特には生
体試料、例えば、尿、血液、血清、細胞抽出液、細胞培
養上清または臓器抽出物などである。

【００１４】本発明は具体的には以下の２種類の方法で
実施する。第１の方法では、ヘパリンを水不溶性担体に
固定させ、抗ｂＦＧＦ抗体に検出可能なマーカーを付け
た検出系を用いる。即ち、ヘパリン固定水不溶性担体に
被検試料を加え、被検試料中に存在するｂＦＧＦをヘパ
リンに結合させる。全体を洗浄した後、検出可能なマー
カーを付けた抗ｂＦＧＦ抗体を加え、ヘパリンに結合し
ているｂＦＧＦに抗ｂＦＧＦ抗体を結合させてヘパリン
−ｂＦＧＦ−抗ｂＦＧＦ抗体からなる複合体を形成させ
る。全体を洗浄した後、複合体または洗浄液に含まれる
前記のマーカーに由来する信号を検出する。この第１の
方法は、前記の２段階法で行うことができるだけでなく
、１段階法、即ち、ヘパリン固定水不溶性担体と、被検
試料と、検出可能なマーカーを付けた抗ｂＦＧＦ抗体と
を同時に加え、全体を洗浄した後、前記のマーカーに由
来する信号を検出することができる。この１段階法は、
試料中のｂＦＧＦの含量が高く、試料を十分に希釈して
検出操作に用いることができ、しかも、混在物の干渉が
ない場合に用いるのが好ましい。また、前記の２段階法
は、試料中のｂＦＧＦ含量が低く、混在物の干渉の可能
性がある場合に用いるのが好ましい。

【００１５】第２の方法では、抗ｂＦＧＦ抗体を水不溶
性担体に固定させ、ヘパリンに検出可能なマーカーを付
けた検出系を用いる。即ち、抗ｂＦＧＦ抗体固定水不溶
性担体に被検試料を加え、被検試料中に存在するｂＦＧ
Ｆを抗ｂＦＧＦ抗体に結合させる。全体を洗浄した後、
検出可能なマーカーを付けたヘパリンを加え、抗ｂＦＧ
Ｆ抗体に結合しているｂＦＧＦにヘパリンを結合させて
抗ｂＦＧＦ抗体−ｂＦＧＦ−ヘパリンからなる複合体を
形成させる。全体を洗浄した後、複合体または洗浄液に
含まれる前記のマーカーに由来する信号を検出する。こ
の第２の方法も、前記の２段階法で行うことができるだ
けでなく、１段階法、即ち、抗ｂＦＧＦ抗体固定水不溶
性担体と、被検試料と、検出可能なマーカーを付けたヘ
パリンとを同時に加え、全体を洗浄した後、前記のマー
カーに由来する信号を検出することができる。

【００１６】前記の第１および第２の方法において、反
応液を洗浄する際には、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（
Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　　Ｓａｌｉｎ
ｅ）を用いることができる。

【００１７】マーカーとして酵素を用いた場合には、酵
素免疫法によりその酵素活性を測定する。蛍光物質また
は発光物質の場合には、蛍光免疫分析法または発光免疫
分析法により、発生する特定波長を測定し、放射性物質
を用いた場合には、放射免疫分析法により放射能活性を
測定する。

【００１８】

【実施例】以下、実施例によって本発明を更に具体的に
説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでは
ない。

【００１９】実施例１： （ａ）モノクローナル抗体の　１２５Ｉによる標識後記
参考例（Ｅ）で調製した精製モノクローナル抗体ｂＦＭ
−１を、クロラミン−Ｔ法によって　１２５Ｉでラベル
し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ−２５ゲル濾過クロマトグラ
フィ法によって精製した。即ち、クロラミン−Ｔ２００
μｇ／ｍｌを含有する０．３Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．４）１００μｌ中で、室温にて１分間、前記
の精製モノクローナル抗体ｂＦＭ−１（１０μｇ）と　
１２５Ｉ（３６０μＣｉ；１３ＭＢｑ）とをインキュベ
ートした。メタビサルファイト水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）
１００μｌを加えることにより反応を停止させた。更に
１０ｍＭ−ＮａＩ（１００μｌ）、続いて１％ＢＳＡを
含有するＰＢＳ１００μｌを加えてから、ＰＢＳで平衡
化した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ−２５カラム（０．５×
３０ｃｍ）にかけて遊離の　１２５Ｉから　１２５Ｉラ
ベル付きのモノクローナル抗体ｂＦＭ−１を分離した。 　１２５Ｉラベル付きのモノクローナル抗体ｂＦＭ−１
の放射性比活性は１．９×１０４　ｃｐｍ／ｎｇであっ
た。こうして得られた　１２５Ｉラベル付きのモノクロ
ーナル抗体ｂＦＭ−１を以下の実験に用いた。

【００２０】（ｂ）１段階法 ヘパリンを表面上に固定したセファロース粒子（ヘパリ
ン−セファロース：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）の膨潤物
０．１ｍｌ（ベッド・ボリューム）を４ｍｌ試験管（ミ
ニソープチューブ）に導入した。次に、０．１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１００μｌと　１２５
Ｉ標識モノクローナル抗体ｂＦＭ−１（５０μｌ：モノ
クローナル抗体１０ｎｇ；２０，０００ｃｐｍを含む）
とサンプル溶液（後記）５０μｌとを前記試験管に加え
、よく攪拌した後、２０℃で１時間インキュベートした
。抗体および試料溶液は、０．１％ＢＳＡおよび０．０
２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳに溶解したものを用
いた。次に、洗浄用緩衝液（０．１％ＢＳＡおよび０．
０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）２ｍｌを加えて
攪拌した後、遠心処理した（１，０００ｒｐｍ：３分間
）。更に、沈澱物を前記と同じ洗浄液用緩衝液２ｍｌで
遠心洗浄した。この遠心洗浄操作を３回繰り返し、沈澱
をγ−カウンターで計数した。結果を図１および図２に
示す。

【００２１】図１において、○でプロットした線１は標
準ｂＦＧＦを０ｎｇ〜１．０ｎｇの量で前記ＰＢＳ中に
含有する１０種類のサンプル溶液に関するものであり、
標準検量曲線を示す。△でプロットした線２はａＦＧＦ
を０．５ｎｇ〜１．０ｎｇの量で前記ＰＢＳ中に含有す
るサンプル溶液に関するものであり、そして▽でプロッ
トした線３は標識していない過剰（１０μｇ／ｍｌ）の
精製モノクローナル抗体ｂＦＭ−１とｂＦＧＦ０ｎｇ〜
１．０ｎｇとを前記ＰＢＳ中に含有するサンプル溶液に
関するものである。この結果から、本発明方法を用いる
ことによって、０．１ｎｇ〜１．０ｎｇのｂＦＧＦを特
異的に検出することができることが分かる。

【００２２】次に、図２において○でプロットした線４
はｂＦＧＦを０ｎｇ〜１．０ｎｇの量で前記ＰＢＳ中に
含有する６種類のサンプル溶液に関するものであり、△
でプロットした線５は、培養ＢＣＥ（ｂｏｖｉｎｅ　　
ｃａｐｉｌｌａｒｙｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ：ウシ毛細
血管内皮）細胞１．５×１０７　個を１０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．２）で抽出して調製した粗抽出物（
サンプル液体）０〜２０μｌに関するものである。この
結果は、本発明方法を用いることによって培養細胞に含
まれているｂＦＧＦを定量することができることを示し
ている。

【００２３】実施例２：２段階法 ヘパリンを表面上に固定したセファロース粒子（ヘパリ
ン−セファロース：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）の膨潤物
０．１ｍｌ（ベッド・ボリューム）を４ｍｌ試験管（ミ
ニソープチューブ）に導入した。次に、サンプル溶液（
後記）２００μｌ〔０．１リン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）で希釈したもの〕を前記試験管に加え、よく
攪拌した後、４℃で１時間インキュベートしてから、遠
心処理した（１，０００ｒｐｍ；３分間）。沈澱物にＰ
ＢＳ２ｍｌを加えて懸濁させてから、再び遠心処理した
（１，０００ｒｐｍ；３分間）。得られた沈澱物に０．
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１００μｌ
と　１２５Ｉで標識したモノクローナル抗体ｂＦＭ−１
（前記実施例１と同じ濃度）５０μｌとＰＢＳ緩衝液０
．１％ＢＳＡおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含有
）５０μｌとを加え、よく攪拌した後、２０℃で１時間
インキュベートした。次に、前記ＰＢＳ緩衝液２ｍｌを
加えて攪拌した後、遠心処理した（１，０００ｒｐｍ；
３分間）。更に、沈澱物を前記と同じＰＢＳ緩衝液２ｍ
ｌで遠心洗浄した（１，０００ｒｐｍ；３分間）。 更に、この遠心洗浄操作を３階繰り返してから、沈澱を
γ−カウンターで計数した。結果を図３に示す。

【００２４】図３において、○でプロットした線６は標
準ｂＦＧＦを０ｎｇ〜１ｎｇの量で含有する６種の標準
試料に関するものであり、□でプロットした線７はラッ
トの脾臓を１．５Ｍ−ＮａＣｌ／１０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．２）で抽出して調製した粗抽出物（サン
プル液体）０〜１０μｌに関するものであり、そして、
△でプロットした線８はラットの肝臓を１．５Ｍ−Ｎａ
Ｃｌ／１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で抽出
して調製した粗抽出物（サンプル液体）０〜１０μｌに
関するものである。

【００２５】この結果は、本発明方法を用いることによ
って、実施例１と同じように０．１ｎｇ〜１ｎｇのｂＦ
ＧＦを検出することができ、臓器の粗抽出液中のｂＦＧ
Ｆを定量することができることを示している。

【００２６】参考例 （Ａ）免疫原の精製 硫酸アンモニウム沈澱、ＣＭ−セファデックスクロマト
グラフィおよびヘパリン−セファロースクロマトグラフ
ィを含むＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ等の方法〔Ｇｏｓ
ｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　　８１，６９６３−６９６７（１
９８４）〕によってウシの脳からｂＦＧＦを精製した。 カラムから溶離され、ＤＮＡ合成刺激活性〔ニシカワ等
、Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４６，１１−
２２（１９８７）：ヨシタケ等、Ｃｅｌｌ　　Ｓｔｒｕ
ｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．７，２２９−２４３（１９８２）参
照〕を有する１本のタンパク質ピークを与えるフラクシ
ョンを集めた。精製されたｂＦＧＦの還元化試料は１９
．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、分子量１８，０００を有
する単独バンドのタンパク質を与えた。

【００２７】（Ｂ）免疫処理 精製したｂＦＧＦ免疫原溶液を等量のフロインド氏完全
アジュバントまたは不完全アジュバントと乳化するまで
混合した。このｂＦＧＦ１０μｇを含む混合液を、６週
令のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に投与することに
より免疫を行った（第１回免疫）。以後、２〜４週間の
間隔で同様の操作を行い、計５回免疫した。マウス血清
の抗体力価の定量は、Ｍａｓｓｏｇｌｉａ等、Ｊ．Ｃｅ
ｌｌ　　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３２，５３１−５３７（１
９８７）に記載のＥＬＩＳＡ法によって行った。最終免
疫から４日経過後、脾臓を無菌的にマウスから取り出し
以下の細胞融合工程に使用した。

【００２８】（Ｃ）ハイブリドーマの作成ＤＭＥ培地に
、上記（Ｂ）の脾臓を入れ、ステンレスメッシュ上で押
し漬して脾臓細胞懸濁液を得た。こうして得た細胞をＤ
ＭＥ培地で遠心法によって洗浄し、生きている脾臓細胞
数を測定した。

【００２９】一方、予め培養しておいたマウスミエロー
マ細胞（骨髄種細胞）Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ
３Ｕ１）（Ｄｒ．Ｇｏｒｄｏｎ　　Ｈ．Ｓａｔｏ，Ｗ．
Ａｌｔｏｎ　　Ｊｏｎｅｓ　　Ｃｅｌｌ　　Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ　　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．より入手）約５×１０
７　個に上記脾臓細胞１×１０８　個を加え、ＤＭＥ培
地中でよく混合し、遠心分離を行った（５００×ｇ、１
０分間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐ
し、５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール４０００
のＤＭＥ溶液（３７℃に保温）０．５ｍｌを滴下し、遠
心チューブを手で１分間穏やかに回転することによって
ポリエチレングリコール溶液と細胞ペレットとを混合さ
せた。次に、３７℃に保温しておいたＤＭＥ培地２４ｍ
ｌを少量づつ加えて、チューブを穏やかに回転させた後
、遠心分離（５００×ｇ、１０分間）を行った。細胞ペ
レットを、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地で遠
心洗浄した後、細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＨＡ
Ｔ培地（ＲＰＭＩ培地にアミノプテリン４×１０−７Ｍ
、チミジン１．６×１０−５Ｍ、ヒポキサンチン１×１
０−４Ｍを添加したもの）４０ｍｌに懸濁した。この細
胞懸濁液を９６ウエル細胞培養プレートの各ウエルに２
００μｌずつ分注し、３７℃で、５％炭酸ガスを含む炭
酸ガス培養器で培養を開始した。培養中、２〜３日間隔
で各ウエルの培地を約１００μｌ除き、新たに上記のＨ
ＡＴ培地１００μｌを加えることによりＨＡＴ培地中で
増殖するハイブリドーマを選択した。８日目から１０％
ウシ胎児血清を含むＨＴ培地（ＤＭＥ培地にチミジン１
．６×１０−５Ｍ、ヒポキサンチン１×１０−４Ｍにな
るように添加したもの）に交換し、ハイブリドーマの増
殖を観察するとともに、１０日目に、下記のＥＬＩＳＡ
法により、ｂＦＧＦ抗体産生ハイブリドーマをスクリー
ニングした。

【００３０】（Ｄ）ハイブリドーマの樹立９６ウエルＥ
ＬＩＳＡ用プレート（Ｆａｌｃｏｎ社）の各ウエルに、
前記のｂＦＧＦ免疫原溶液２０μｇ／ｍｌずつを分注し
、室温で４時間放置した。上清を除去した後、１％ＢＳ
Ａ−ＰＢＳを分注してブロッキングした。 次に、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで４回洗浄した
後、各ウエルの培養上清５０μｌを加え、室温で４時間
反応させた。その後、上清を除去し、０．１％Ｔｗｅｅ
ｎ２０−ＰＢＳで４回洗浄した。

【００３１】次に、Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで２，００
０倍に希釈したペルオキシターゼ結合ウサギ抗マウス抗
体（ダコ社、デンマーク）５０μｌを各ウエルに加えた
。反応終了後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで各ウ
エルを４回洗浄し、０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（
ｐＨ５．０）と０．４％ｏ−フェニレンジアミンと０．
００５％過酸化水素とを含む溶液５０μｌを各ウエルに
加え、室温で１５分間反応させ、各ウエルの４９２ｎｍ
における吸光度を測定した。その結果、１９２ウエル中
５ウエルに抗体産生が認められた。その後、再度ＥＬＩ
ＳＡ法によって抗ｂＦＧＦ抗体の産生の有無を確認して
から限界希釈法により３回クローニングした。これらの
クローンの中から、増殖のよい、抗体分泌能の高い、し
かも安定なクローンを選び、前記と同様の方法で再クロ
ーン化を行い、抗ｂＦＧＦ特異的抗体産生ハイブリドー
マ２種を樹立し、各々ｂＦＭ−１およびｂＦＭ−２と命
名した。

【００３２】（Ｅ）モノクローナル抗体の製造：イン・
ビボ法 プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン）０．５ｍｌを７週令のＢＡＬＢ／ｃ系マウスの
腹腔内に投与し、７日経過した後のマウス腹腔内に、イ
ン・ビトロで増殖させたハイブリドーマｂＦＭ−１およ
びｂＦＭ−２をマウス一匹当たり１×１０７　細胞とな
るように接種した。

【００３３】各ハイブリドーマにつき一匹のマウスから
約５〜１０ｍｌの腹水が得られた。その抗体濃度は、１
〜３ｍｇ／ｍｌであった。腹水中のモノクローナル抗体
の精製は、以下のようにして行った。ガーゼで濾過した
腹水を遠心分離（２０，０００×ｇ，１０分間）した後
、固形の硫酸アンモニウムを３０％飽和濃度になるよう
に加えた。遠心分離（２０，０００×ｇ，１０分間）し
た後、上清に更に硫酸アンモニウムを５０％飽和濃度に
なるように加え、遠心分離により沈澱を得た。沈澱を小
量の５ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に
溶解し、１００倍量の前記緩衝液に対して３回透析した
。得られた透析物を、前記緩衝液で平衡化したＤＥ−５
０セルロースのカラムにかけて、前記緩衝液で洗浄した
。吸着したモノクローナル抗体は、前記緩衝液とそれに
０．１５Ｍ−ＮａＣｌを加えた溶液とにより、濃度勾配
法によって溶出させた。得られたモノクローナル抗体が
均一な純度をもつことは、ＳＤＳ−電気泳動法によって
確認した。

【００３４】（Ｆ）免疫グロブリンクラスの同定抗ｂＦ
ＧＦ特異モノクローナル抗体ｂＦＭ−１およびｂＦＭ−
２の免疫グロブリンクラスおよびサブクラスの同定は、
マウスモノクローナル抗体アイソダイピングキット（ア
マーシャム社製）によって行った。その結果、それぞれ
、ＩｇＧ１／κであることが分かった。

【００３５】（Ｇ）モノクローナル抗体の交差反応性（
ａ）ウシ脳下垂体ｂＦＧＦ（１−１４６）〔Ｅｓｃｈ等
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　　
８２，６５０７−６５１１（１９８５）〕の天然形のア
ミノ酸１４−１６個および追加のＴｙｒの配列を有する
３種類のペプチドを、全自動Ｂｉｏｌｙｎｘ４１７０　
　Ｐｅｐｔｉｄｅ　　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ　　ＬＫＢ　　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ，スエーデン）または全自動Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ　　４３０　　Ａ　　Ｐｅｐｔｉｄｅ
　　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉ
ｏｎｐｈｙｓｉｃｓ　　Ｉｎｃ．；米国）中で、固相法
によって合成した〔マツオ等、Ｉｎ　　ＶｉｔｒｏＣｅ
ｌｌ　　Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２４，４７７−４８０（１
９８８）〕。その内の２種は、Ｔｒｙ１６−ｂＦＧＦ（
１−１５）およびＴｒｙ１３２　−ｂＦＧＦ（１３３−
１４６）であり、これらはそれぞれ天然分子のアミノ末
端配列およびカルボキシ末端配列に相当する。もう１種
は、Ｔｒｙ５１−ｂＦＧＦ（３６−５０）であり、これ
は全配列の親水性分析によって同定したｂＦＧＦの親水
性配列の主要部分を含んでいた。

【００３６】モノクローナル抗体ｂＦＭ−１およびｂＦ
Ｍ−２に関するｂＦＧＦ上のエピトープを決定するため
に、ｂＦＧＦ分子の３種の線状フラグメントとモノクロ
ーナル抗体ｂＦＭ−１およびｂＦＭ−２との交差反応性
を調べた

【００３７】結果を図４および図５に示す。図４および
図５は、モノクローナル抗体ｂＦＭ−１（図４）および
ｂＦＭ−２（図５）とｂＦＧＦフラグメント、ｂＦＧＦ
（後述）および加熱不活性化ｂＦＧＦ（後述）との交差
反応性を競合結合アッセイ法で調べた結果を示すもので
ある。図４および図５において縦軸のＢ／Ｂｏは、各種
濃度の抗原の存在下における　１２５ＩラベルｂＦＧＦ
の特異的結合量（Ｂ）を非ラベル化抗原非存在下での特
異的結合量（Ｂｏ）で割った（除算した）ものである。 図４および図５の実験においては、モノクローナル抗体
ｂＦＭ−１の６ｎｇまたはモノクローナル抗体ｂＦＭ−
２の７５ｎｇを反応混合物（０．５ｍｌ）に加えた。添
加した総トレーサーの百分率でＢｏを示せば、モノクロ
ーナル抗体ｂＦＭ−１とは５６％であり、モノクローナ
ル抗体ｂＦＭ−２とは３５％であった。図４および図５
の実験においては、◎は活性ｂＦＧＦ、○は加熱不活性
化ｂＦＧＦ、□はＴｒｙ１６−ｂＦＧＦ（１−１５）、
☆はＴｒｙ５１−ｂＦＧＦ（３６−５０）、◇はＴｒｙ
１３２　−ｂＦＧＦ（１３３−１４６）である。図４お
よび図５から明らかなように、これらのペプチド即ちＴ
ｒｙ１６−ｂＦＧＦ（１−１５）、Ｔｒｙ１３２　−ｂ
ＦＧＦ（１３３−１４６）およびＴｒｙ５１−ｂＦＧＦ
（３６−５０）のいずれもモノクローナル抗体ｂＦＭ−
１またはｂＦＭ−２とは１００μｇ／ｍｌ（この濃度は
、明確な交差反応を示す天然ｂＦＧＦのモル基準濃度の
１００−１０００倍である）においてさえ交差反応を示
さなかった。このことから、これらの配列、すなわちア
ミノ末端、カルボキシル末端および主要な親水性領域が
連続エピトープとしてモノクローナル抗体ｂＦＭ−１ま
たはｂＦＭ−２によっては認識されないことがわかる。

【００３８】（ｂ）ｂＦＧＦの生物活性は熱不安定性お
よび酸不安定性である。従って、ｂＦＧＦ分子（これは
ジスルフィド結合によって維持されていない）のコンフ
ォーメ−ションは、その生物活性に必須のものと考えら
れる〔Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．
Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２８，４７５−４８４（１９８６）
〕。モノクローナル抗体ｂＦＭ−１またはｂＦＭ−２が
ｂＦＧＦ分子のコンフォーメ−ションを認識したかどう
かを決定するために、ｂＦＧＦ溶液を沸騰水浴中で５分
間インキュベイションした。熱不活性化ｂＦＧＦの生物
活性（ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３−３Ｋセル中でのＤＮＡ合成
の刺激によって測定した）は、熱処理前のｂＦＧＦの生
物活性の０．２％より低かった。モノクローナル抗体ｂ
ＦＭ−１（図４）は熱不活性化ｂＦＧＦと交差反応を示
さなかったが、モノクローナル抗体ｂＦＭ−２（図５）
は熱不活性化ｂＦＧＦと交差反応を示した。但し、その
反応は非処理ｂＦＧＦとのものよりも幾分低かった。こ
のことは、モノクローナル抗体ｂＦＭ−１が、ｂＦＧＦ
の生物活性に必要なｂＦＧＦ分子のコンフォーメ−ショ
ンを認識していることを示している。

【００３９】（ｃ）様々な種から誘導されたｂＦＧＦお
よびウシ−ａＦＧＦとこれらのモノクローナル抗体との
反応性を、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）によって
決定した。結果を表１に示す。どちらのモノクローナル
抗体も、マウス−ｂＦＧＦ、ヒト−ｂＦＧＦおよびウシ
−ｂＦＧＦとは交差反応を示したが、ウシ−ａＦＧＦと
は交差反応を示さなかった。

【００４０】

【表１】

【００４１】ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）の実験
条件は、図４および図５に関連して記載してあるとおり
である。数値の計算は、前記したとおり、ラジオイムノ
アッセイ法（ＲＩＡ）によって推定したＦＧＦ濃度を、
ＦＧＦのＤＮＡ合成刺激活性から推定したＦＧＦ濃度で
割って行った。いずれのアッセイにおいても、純粋なウ
シ−ｂＦＧＦを標準として用いた。ウシ−ｂＦＧＦの値
を１００％とした。

【００４２】（Ｈ）ｂＦＧＦのラジオイムノアッセイ法
精製したウシｂＦＧＦを、クロラミン−Ｔ法〔Ｋａｎ等
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１１３０６−１１
３１３（１９８８）に記載〕によって　１２５Ｉでラベ
ルし、ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティクロ
マトグラフィ〔Ｎｅｕｆｅｌｄ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６０，１３８６０−１３８６８（１９８５）に
記載〕を若干修正した方法で精製した。簡単に説明すれ
ば、クロラミン−Ｔ１８０μｇ／ｍｌを含有する反応混
合物１１０μｌ中で室温下で２分間、ウシｂＦＧＦ２．
８μｇと　１２５Ｉ７００μＣｉ（２５．９ＭＢｑ）と
を０．　　０２％ＣＨＡＰＳの存在下でインキュベート
した〔マツオ等、Ｉｎ　　ＶｉｔｒｏＣｅｌｌ．Ｄｅｖ
．Ｂｉｏｌ．２４，４７７−４８０（１９８８）〕。０
．０２Ｍジチオスレイトール１００μｌを加えることに
より、反応を停止した。次に、０．１％ＣＨＡＰＳを含
有する塩溶液を用いて、ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
カラム上で遊離の　１２５Ｉから　１２５Ｉラベル付き
ｂＦＧＦを分離した。　１２５Ｉラベル付きｂＦＧＦの
比活性は５．５×１０４　ｃｐｍ／ｎｇであった。ラベ
ルされたｂＦＧＦとラベルされていないｂＦＧＦは、前
記と同様のＤＮＡ合成刺激から判断して、ほとんど同じ
生物活性を示した。ＲＩＡ用反応混合物（５ｍｌ）は、
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）／０．０２％Ｎａ
Ｎ３　０．３５ｍｌ、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０
２％ＮａＮ３　（ＰＢＳ−Ｂ−Ａ）中の４ｎｇ／ｍｌ　
１２５Ｉ−ｂＦＧＦ（８０００−１５０００ｃｐｍ）０
．０５ｍｌ、ＰＢＳ−Ｂ−Ａ中の適当な濃度のラベルさ
れていないｂＦＧＦ０．０５ｍｌおよびＰＢＳ−Ｂ−Ａ
中の各々精製されたモノクローナル抗体（０．１２−１
．５μｇ／ｍｌ）０．０５ｍｌからなり、これを試験管
（栄研）内で４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ／
０．０２％ＮａＮ３　中の１％正常マウス血清０．１ｍ
ｌとＰＢＳ／０．０２％ＮａＮ３　中の０．７７ｍｇ／
ｍｌヤギ−抗−マウス免疫グロブリン（ダコ社）０．１
ｍｌとを加えた後で、試験管を更に４℃で４時間インキ
ュベートた。抗体に結合した放射能を、０．２％ポリエ
チレングリコール６０００の１ｍｌを加えそして遠心す
ることによって沈澱させ、続いてＡｌｏｋａ自動−ウェ
ルガンマシステム（ＡＲＣ−３００）中で計数した。

【００４３】（Ｊ）ウシ毛細血管内皮細胞増殖に対する
阻害効果 （ａ）細胞および培養 Ｇｏｅｔｚ等、Ｉｎ　　Ｖｉｔｒｏ　　Ｃｅｌｌ　　Ｄ
ｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１，１７２−１８０（１９８５）に
記載の条件を若干変更した条件でウシ脳皮質からウシ毛
細血管内皮細胞を単離培養し、維持した。細胞の培養は
、タイプ−ＩＶコラーゲン（Ｓｉｇｍａ社、米国）でコ
ートした皿で、ペニシリン１００単位／ｍｌ、ストレプ
トマイシン１００μｇ／ｍｌ、１５ｍＭ−Ｈｅｐｅｓ（
ｐＨ７．３）およびｂＦＧＦ１ｎｇ／ｍｌを補充して１
０％熱不活性化ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培
地中で行った。細胞を５〜９継代での増殖実験に用いた
。細胞を、ＣＯ２　５％を含む空気中で、湿潤雰囲気下
で３７℃で培養した。

【００４４】（ｂ）増殖実験 タイプ−ＩＶコラーゲンでコートした６０ｍｍ−Ｆａｌ
ｃｏｎ皿で、維持用の培地と同じ培地５ｍｌ中に２×１
０４　の密度で、ウシ毛細血管内皮細胞を平板培養した
。 細胞接種の時のみ、ｂＦＧＦおよびモノクローナル抗体
を加えた。５日後、細胞をトリプシンによって採取し、
次いでコールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）計数器内で細胞数
を計数した。ｂＦＧＦを含まない培地に１０５個の細胞
を平板培養して４日後に細胞数を計数した以外は、ｂＦ
ＧＦ非存在下での増殖を前記と同様の方法で分析した。 数値は、２枚の皿による実験の平均を取った。

【００４５】（ｃ）結果 図６および図７は、外因的に加えたｂＦＧＦの存在下お
よび非存在下での、ウシ毛細血管内皮細胞の増殖に対す
るモノクローナル抗体の効果を示すものである。なお、
図６および図７において、○は、外因的ｂＦＧＦｌｎｇ
／ｍｌ存在下の結果を示し、●は、外因的ｂＦＧＦ非存
在下での結果を示す。また、太い矢印（Ｉｎｏ）は、接
種細胞数を示す。１０％ウシ胎児血清を含有する培地中
でのウシ毛細血管内皮細胞の増殖は、添加されたｂＦＧ
Ｆによって刺激された。細胞２×１０４　個を接種して
から５日後の細胞数は、ｂＦＧＦｌｎｇ／ｍｌ存在下お
よび非存在下で各々６．０×１０５　および１．１×１
０５　であった。一方、これらの細胞をより高密度（細
胞１０５　個）で接種した場合には、これらの細胞は外
因的に添加されたｂＦＧＦの非存在下でも増殖すること
ができた。もっとも、その増殖速度は若干遅かった。ｂ
ＦＧＦ非存在下での高接種濃度での倍加時間およびｂＦ
ＧＦ存在下での低接種濃度での倍加時間は各々４０時間
および２４時間であった。モノクローナル抗体ｂＦＭ−
１（図６）およびモノクローナル抗体ｂＦＭ−２（図７
）はどちらも、外因的ｂＦＧＦ存在下だけでなく非存在
下でもウシ毛細血管内皮細胞の増殖を、供与量（０．１
−１０μｇ／ｍｌの範囲において）に依存する態様で阻
害した。モノクローナル抗体ｂＦＭ−１の阻害効果は、
モノクローナル抗体ｂＦＭ−２の阻害効果よりも大きか
った。これは、これらのモノクローナル抗体のＫｄ値の
差異と一致する。これらの結果は、これらのモノクロー
ナル抗体が、ｂＦＧＦのイン・ビトロにおける生物活性
を阻害し、更にウシ毛細血管内皮細胞から生成分泌され
るｂＦＧＦの生物活性をも阻害し、ｂＦＧＦのこの細胞
におけるオートクリン作用を抑制することを示している
。

【００４６】

【発明の効果】本発明方法によれば、生体液体中のｂＦ
ＧＦの存在またはその量を、簡易な方法で正確に検出ま
たは定量することができる。４．図面の簡単な説明

【図
１】１段階法で本発明方法を実施した場合の、ｂＦＧＦ
濃度と放射能活性との関係を示すグラフである。

【図２】１段階法で本発明方法を実施した場合の、ｂＦ
ＧＦ濃度と放射能活性との関係を示すグラフである。

【図３】２段階法で本発明方法を実施した場合の、ｂＦ
ＧＦ濃度と放射能活性との関係を示すグラフである。

【図４】モノクローナル抗体ｂＦＭ−１と、ｂＦＧＦ、
加熱不活性化ｂＦＧＦおよびｂＦＧＦのフラグメントと
の交差結合性を示すグラフである。

【図５】モノクローナル抗体ｂＦＭ−２と、ｂＦＧＦ、
加熱不活性化ｂＦＧＦおよびｂＦＧＦのフラグメントと
の交差結合性を示すグラフである。

【図６】モノクローナル抗体ｂＦＭ−１がウシ毛細血管
内皮細胞のｂＦＧＦによって促進された増殖に与える効
果を示すグラフである。

【図７】モノクローナル抗体ｂＦＭ−２がウシ毛細血管
内皮細胞のｂＦＧＦによって促進された増殖に与える効
果を示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　塩基性線維芽細胞成長因子に対する抗
   体と、ヘパリンと、水不溶性担体と、検出可能なマーカ
   ーとを含有する検出系であって、前記の抗体またはヘパ
   リンのいずれか一方は水不溶性担体に担持されており、
   そして他方は検出可能なマーカーが付いているものとす
   る該検出系に、被検試料を接触させ、前記のマーカーに
   由来する信号を検出することを特徴とする、塩基性線維
   芽細胞成長因子の検出方法。