JPH025893A - 新規抗体 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の分野〕 本発明は、ヒトのガン胎児抗原（ＣＣＡ）に対し高い特
異性および親和性を有する新規モノクローナル抗体、そ
の誘導体、該抗体およびその誘導体の調製方法、該抗体
を分泌するハイブリドーマ細胞系、前記細胞系の調製方
法、ガンの診断および療法への該抗−ＣＥＡ抗体の利用
９、該モノクローナル抗体を含有するテストキラＩ・、
並びに前記抗体を含有する医薬調製物に関する。

〔従来の技術〕

ハイブリドーマ技法の発達は、望ましい特異性のモノク
ローナル抗体（ＭＡｂ）を産生ずる細胞系を生み出すこ
とを可能にし、この抗体は生物学的に重要な分子を同定
し、単離しそして特徴づけるのに利用され得る。

本発明の主題であるＭＡｂは、ガン胎児抗原（ＣＣＡ）
に対して向けられる。ＣＥＡは１８０，０００の分子量
を有し内胚葉由来の消化系上皮および胎児の結腸の腺ガ
ンにおいて見出される。再発性の病気または療法への反
応についてガン患者を診断および連続的にモニターする
ためのＣＥＡイムノアッセイの役割（Ｍａｃｂら、Ｉｍ
ｍｕｎ、Ｔｏｄａｙ　２，２３９，１９８１　；Ｂｅｒ
ｃｌ＋ｅら、［３ｒ、Ｍｅｄ、Ｊ、２８５．１４４７．
１９８２）並びにヒト結腸ガン異種移植片を有するヌー
ドマウスの実験的モデルにおけるそれらの使用（ｌｌｉ
ｄｉｎら、Ｉｎｔ、ＪＣａｎｃｅｒ　　３０，５４７，
１９８２　　；　　１３ｕｃｌ＋ｅｇｇｅｒら、　ｌ＋
ｔＪ、ｃａｎｃｅｒ３３．６４３．１９８４）は、広く
評価されそして文献に示されている。

臨床目的での抗−ＣＥＡ抗体の利用の主要な欠点の１つ
は、幾つかの明らかに正常な成人組織に対するこれら抗
体の交差反応性であった。これまでの研究は、ＣＥＡの
異なる免疫原型に対して誘発される最も伝統的な高免疫
性（ｂｙｐｅｒ　ｉ＋ｏｍｕｎｅ）抗血清が多くの異な
るタイプのガンと同様、正常の結腸粘膜、牌臓、肝臓、
肺、汗腺、多形核白鼠球および明らかに正常な個体の単
球中に見い出されるＣＥＡ−関連抗原と交差反応するこ
とを示した。

ＣＥＡと交差反応する同定された抗原の第一のシリーズ
は、ＭａｃｈおよびＰｕｓｚｔａｓｚｅｒｉ（Ｉｍｍｕ
ｎｏｃｌ＋ｅｍｉｓｔｒｙ９．１０３１．１９７２）に
よりそしてｖｏｎ　Ｋｌｅｉｓｔら　（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Δｃａｄ、ｓｃｉ、６９，２４９２．１９７
２）により、それぞれ正常糖タンパク質（ＮＧＰ）また
は非特異的交差反応性抗原（ＮＣＡ）と名づけられな。

それが約５５ｋＤの分子量を有することが両研究グルー
プの報告により示されたので、本明細書ではこれをＮＣ
Ａ５．と称することにする。この抗原は、幾つかの他の
研究グループによって様々な名称で記載されており、Ｃ
ＣＥＡ−２（Ｔｕｂｅｒｖｉｌｌｅら、Ｉｍｍｕｎｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ　１０，８４１゜１９７３）、ＣＣＡ
　−ｍ　（Ｐｒｉｍｕｓら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１
８，５５゜１９７７）およびＴＥＸ　（Ｋ’ｅｓｓ　Ｉ
ｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、３８，１０４１゜１９
７８）を包含する。ＢｕｃｈｅｇＨｅｒら（Ｉｎｔ、Ｊ
、Ｃａｎｃｅｒ　３３゜６４３．１９８４）は、９５ｋ
ＤのＣＥＡ交差反応性抗原（ＮＣ八へＳ）を同定した。

交差反応性および分子量（１６０ｋＤ）の点からＣＥＡ
と密接に関連する他の抗体がｌ１ｕｒｔｉｎら（Ｆｉｓ
ｈｍａｎ　　＆　　５ｅｌｌ、”Ｏｎｃｏｄｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔａｌｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”、Ｎ
、Ｙ、１９７８．ｐｐ、６０９−６１１中）により記載
され、そしてＮＣＡ−ＩＩ　　と命名された。この抗原
は、Ｍａｔｓｕｏｋａら（Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　
２１，６０４．１９７８）により記載された正常糞便抗
原−２（ＮＦＡ−２＞と非常に類似しているように思わ
れる。同グループは、正常の成人の糞便においてＮＦＡ
−１と呼ばれる２０３０ｋＤのＣＥＡ−関連語タンパク
質を同定した（Ｋｕｒｏｋｉら、Ｍｏ１．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、１９，３９９．１９８２）。ｉｆ＆に、胆汁糖タン
パク質−１（ＢＧＰ−１）は、正常の胆汁に存在する、
Ｓｖｅｎｂｅｒｇ（Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　１７，
５８８．１９７６）により同定されたＣＥＡと交差反応
する抗原である。これらの結果は、その抗血清がＣＥＡ
に特異的なエピトープだけでなくＣＥＡとＣＥＡ−関連
抗原との両方に存在するエピトープをも認識するという
ことを証明している。これらはさらに、ＣＥＡとＣＥＡ
−関連抗原との遺伝子間の密接な関連性並びにそれらの
いくつかの間のプレカーサー生成物の関係を示唆する。

Ｉｌａｍｍａｒｓｔｏｒｍら（Ｐｒｏｃ　。

Ｎａｔ　Ｉ　、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ　、７２　、１５２
８　、１９７５）および１ｌｅｄｉｎら（Ｍｏｌｒｎｕ
ｎｕｎｏｌ　、２３，１０５３．１９８６）によれば、
該エピトープはＣＥＡのペプチドの部分に位置し、そし
て強度にコンホメーション依存性であるらしい。

モノクローナル抗−ＣＥＡ抗体の生産は、幾つかの研究
グループにより開示されている。Ａｃｃｏｌｌａら（Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、７７．５６３．
１９８０）は、２つのハイブリドーマのクローンから得
られた抗体がＣＥＡと強く反応するがＮＧＰとは弱く反
応するということを報告した。これら２抗体とＣＥＡと
の反応は、お互いによって競合的に阻害されず、それら
がＣＥＡ分子上の異なる抗原決定基と反応するというこ
とを示している。Ｋｕｐｃｈｉｋら（ＣａｎｃｅｒＲｅ
ｓ、　４１，３３０６．１９８１）およびＰｒｉｍｕｓ
ら（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ。

４３．６８６，６９３．１９８３）により記載された抗
体は、正常な多形核白血球（ＰＭＮ）との反応性を少な
くとも多少有するということが示されている。Ｋｕｒｏ
ｋｉら（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　、３０．２０９０　、
１９８４）は、ＣＥＡに対する２つのＭＡｂを記載した
が、これは免疫１ヒに用いられるもの以外の精製ＣＥＡ
とは反応しない。これらＭＡ、ｂは、腫瘍対正常組織と
の反応性の比についてはまだ特徴づけられていない。

〔発明の目的〕

本発明の目的は、ＣＥＡに対して高い親和性を有し、Ｃ
ＥＡを担持しているガン細胞への高い比率の結合性を示
し、そして腫瘍対正常組１ａ　（Ｔ／Ｎ）の高い結合比
を有する、抗−ＣＥＡ　ＭＡｂである。

〔具体的な説明〕

本発明は、非特異的交差反応性抗原ＮＣ＾５．もしくは
ＮＣＡ５５もしくはＮＣＡ９９上、胆汁の糖タンパク質
上または顆粒球上に存在しないＣＥＡのエビｉ・−プを
認識し、そして少なくとも（１，６±０．３）　Ｘ　１
０１０リツトル１モルの親和力でヒトＣＥ　Ａに結合す
ることを特徴とする、ヒトのガン胎児抗原（ＣＥＡ）に
特異的なモノクローナル抗体およびその誘導体に関する
。特に、本発明はＭＡｂ　ＣＥ２５の呼称を有するモノ
クローナル抗体、およびその誘導体に関する。

本発明に係るモノクローナル抗体、特にＭＡｂＣＥ２５
の誘導体は、例えば、ＣＥＡの抗原決定基に対するそれ
らの特異性を保有している断片、例えば−価のＦａｂま
たはＦａｂ　’断片および二価のＦ（ａｌ＋’＞２断片
（Ｆａｂ　＝抗原結合性断片）、ＨＡ　抗体）ニー酵素
、蛍光マーカー、金属キレート、細胞増殖抑制性または
細胞毒性物質、アビジン、ビオチン等との接合体、並び
に放射能ラベル化抗体である。

本発明の抗体接合体に使われる酵素は、例えば、西洋ワ
サビのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グ
ルコアミラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチ
ルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレイン酸デヒド
ロ゛ゲナーゼ、またはグルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼである。ＭＡｂ　ＣＥ２５と接合される蛍光マ
ーカーは、フルオレセイン、フルオロクロム、ローダミ
ン等である。そのような接合体においては、該抗体は直
接的にまたはスペーサーもしくはリンカ−基を介して、
酵素または蛍光マーカーと結合されている。

金属キレートについての例は、エチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴ＾）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＰ
Ｔ＾）、１，４．８．１１−テ１へラアザテトラデカン
、１，４，８．１１−テトラアザテトラデカン−１，４
，８’、１１−テトラ酢酸、１−オキサ−４゜７．１２
．１５−テトラアザヘプタデカン−４，７゜１２　、１
５−テトラ酢酸等である。本発明の抗体との接合におい
て適用できる細胞増殖抑制物質は、例えは、アルキル化
する物質、例えばメクロルエタミン、トリエチレンホス
ホラミド、シクロホスファミド、イフォスファミド、ク
ロラムブシル、ブスルファン、メルフアランまたはトリ
アジクオン、さらにニトロソウレア化合物、例えばカル
ムスチン、ロムスチンまたはセムスチンである。使用さ
れる代謝拮抗物質は、例えばメト）〜レキセード、メル
カプ）・プリン、シタラビン、フルオロウラシル、フロ
クスウリジン、またはフトラフルである。

細胞増殖抑制物質のさらなる群は、ビンブラスチンおよ
びビンクリスチン、並びに成る種の抗生物置、例えばア
クチノマイシンＤ、ダウノルビシン（ダウノマイシン）
、ドキソルビシン、ミトラマイシン、ストレプトニグリ
ン プレオマイシンを包含する。さらに適切な細胞増殖抑制
物質は、例えば、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、
Ｌ−アスパラギナーゼ、ダカルバジン、ミドタン、エス
トラムスチン、またはポドフィロｉ・キシンである。さ
らなる細胞増殖抑制剤は、ホルモン類またはホルモン拮
抗物置、例えば、コルチコステロイド類、例えばプレド
ニゾン、プロゲスチン類、例えばヒドロキシプロゲステ
ロンまたはメトロプロゲステロン、エストロゲン類、例
えばジエチルスチルベストロール、抗エストロゲン類、
例えばタモキシフェン、アンドロゲン類、例えばテスト
ステロン、およびアロマターゼ阻害物置、例えばアミノ
グルテチミドである。

細胞毒性物質と接合された本発明のモノクローナル抗体
の誘導体は、毒素そのまま又はそれから誘導されるＡ鎖
のどちらかを含む。抗体−縮合に適する毒素は、特に、
幾つかのレクチン類、例えばリシンまたはアブリン、ま
たはジフテリア毒素Ａ、等である。

放射能ラベル１ヒモツクローナル抗体は、例えば、放射
性のヨウ素（１２３１　、　’２５１　、　”’Ｉ）、
イツトリウム（９０Ｙ）、テ３ネチウム（９ｇ’Ｔｃ）
、等である。

本発明に係るモノクローナル抗体およびその誘導体は、
それ自体既知である方法により調製され、その方法は、
そのようなキ奔季モノクローナル抗体を産生する下記に
定義されるようなハイブリドーマ細胞を、既知の方法に
従って生体外または生体内で増殖せしめることを特徴と
する。所望てあれば、生じたモノクローナル抗体はその
誘導体に変換される。

生体外での増殖は、適当な培地、常用の標準的な培地、
例えばＤｕｌｂｅｃｃｏ改良ｈｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）
またはＲＰＭ１１６４０培地中で行われ、これは所望に
より１１ｎ乳類の血清、例えばウシ胎児血清、またはｆ
ｄ量要素および増殖維持補足要素、例えば支持細胞、例
えば正常のマウス腹腔滲出細胞、牌臓細胞、骨髄マクロ
ファージ等により補充されている。

生体外における生産は、比較的純粋な抗体調製物を提供
し、且つ大量の所望の抗体を与えるためにスケールアッ
プすることが可能である。組織培養条件下での大スケー
ルでのハイブリドーマの培養のための技術は当業界にお
いて既知であり、そして例えばエアーリフト反応器また
は連続撹拌反応器中での均一懸濁培養、または例えば中
空ファイバー中、ミクロカプセル中、アガロースミクロ
ビーズ上もしくはセラミックカートリッジ上に固定化も
しくは封入された細胞培養を包含する。

該キ≠雫モノクローナル抗体の単離のためには、まず培
養物上清中の免疫グロブリンを、例えば硫酸アンモニウ
ムによる沈澱、ＰＥＧのような吸湿性物質に対する透析
、選択膜を通す濾過等により、濃縮する。必要および／
または所望であれば、濃縮された該抗体を常用のクロマ
トグラフィー法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマト
グラフィーＤＥＡＥ−セルロース上でのクロマトグラフ
ィー、プロティンＡまたはイムノアフィニティークロマ
トグラフィーにより精製する。

ハイブリドーマ細胞を生体内で増殖せしめることにより
、大量の所望するキ≠ラモノクローナル抗体を得ること
ができる。細胞クローンを、親の細胞と組織適合性であ
る哺乳類、例えば同系のマウスに注射し、抗体を生産す
る腫瘍の発達を引き起こす。所望により、注射前にその
哺乳類に炭化水素、特にブリスタン（テトラメチルペン
タデカン）のような鉱油を与える。１−３週間後、前記
哺乳類の体液から所望のモノクローナル抗体を回収する
。例えば、ｌ１ａｌｂ／ｃマウス由来のハイブリドーマ
細胞を、所望によりブリスタンのような炭化水素で前処
理されているＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔的注射し、そし
て１〜２週間後、これらマウスから腹水を回収する。そ
の体液から、上記に記載したような常法により所望のモ
ノクローナル抗体を単離する。

ヒトのＣＥＡに対する特異性を保持しているモノクロー
ナル抗体の断片、例えばｔａｂ　、　Ｆｉｂ’またはＦ
（ａｌ〕’）２断片は、前述のようにして調製された抗
体から、それ自体既知の方法により、例えばパパインも
しくはペプシンのような酵素での消ｆヒにより、そして
／またはｆヒ学的還元によるジスルフィド結合の開裂に
より得ることができる。

本発明のモノクローナル抗体の接合体は、当業界におい
て既知の方法により、例えば前述のようにして調製され
たモノクローナル抗体を縮合剤、例えばグルタルアルデ
ヒド、過ヨウ素酸塩、Ｎ。

Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−（ｍ−マレイ
ミドベンゾイルオキシ）スクシンイミド、Ｎ−［３−（
２’−ピリジルジチオ）プロピオンオキシラスクシンイ
ミド、Ｎ−エチル−Ｎ’　−（３ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミドまたはその種の他のものと反応せし
めることにより調製される。アビジンとの接合体も同様
にして調製される。ビオチンとの接合体は、例えばモノ
クローナル抗体をビオチンの活性エステル、例えばビオ
チンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応せ
しめることにより調製される。蛍光マーカーとの接合体
は、縮合剤、例えば上に挙げたものの存在下で、または
イソチオシアネート、好ましくはフルオレセイン−イソ
チオシアネートと反応せしめることにより調製される。

金属キレートとの抗体−接合体も同様にして調製される
。

ヨウ素Ｃ２３１、”’Ｉ　、　”’ｒ）で放射能ラベル
化されたモノクローナル抗体は、それ自体既知のヨウ素
化法により、例えば放射性のヨウ化すＩ・リウムもしく
はヨウ化カリウムおよび化学的酸化剤、例えば次亜塩素
酸ナトリウム、クロラミンＴもしくはその他、または酵
素的酸化剤、例えばラクトペルオキシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼおよびクルコースを用いて、本発明に係
るモノクローナル抗体から得られる。本発明に係るモノ
クローナル抗体は、例えばジエチレントリアミンペンタ
酢酸（ＤＴＰ＾）−キレート化により、イブ１〜リウム
（”Ｙ）と結合される。テクネチウム−９９１１１ラベ
ル化抗体は、リガンド交換法により、例えば過テクネチ
ウム酸塩（ＴｃＯ，−）を第一スズ溶液で還元し、還元
されたテクネチウムをセファデックスカラム上にキレ−
１・化し、そしてこのカラムに該抗体を適用することに
より；または、直接ラベル化技術により、例えば過テク
ネチウム酸塩、Ｓ＋ｔＣＬのような還元剤、フタル酸ナ
トリウム−カリウム溶液のようなｔｌｄＲ溶液および該
抗体をインキュベ−１・することにより調製される。

本発明は、本発明に係るモノクローナル抗−ＣＥＡ抗体
を分泌するハイブリドーマ細胞系、好ましくは称号ＣＥ
２５を有するハイブリドーマ細胞系に関し、このＣＨ３
Ｓは１９８７年１２月１５日、パリのインスティテユー
ト・パスツールの″“Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏ
ｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏ
ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ”に第１−７１９号のもとに寄託
された。

本発明のハイブリドーマ細胞系は、遺伝的に安定であり
、一定な特異性の本発明のモノクローナル抗体を分泌し
、そして解凍および再クローニングにより冷凍保存され
た培養物から活性化され得る。

本発明は、そのようなハイブリドーマ細胞系の調製方法
にも関し、この方法は、精製ヒトＣＥＡによりまたは精
製ヒトＣＥＡを含む抗原の担体によりｒｌａｌｂ／ｃマ
ウスを免疫化し、免疫化された［１ａｌｂ／ｃマウスの
抗体産生細胞をミエローマＰ３Ｎ５２／　１＾ｇ４の細
胞と融合し、その融合において得られたハイブリッド細
胞をクローンｆヒし、そして所望の抗体を分泌する細胞
クローンを選択することを特徴とする。

次の方法により調製される高純度ＣＥＡによる免疫化が
好ましい。ＣＥＡは、ＣＥＡ−担持細胞、例えば結腸直
腸または肺の腺カンの転移＃’ｍまたは最初の肺の腺ガ
ンから、過塩素酸による沈澱または塩類溶液−抽出によ
り抽出される。生じるＣＥＡがほとんど変性しないので
、後者の方法の方がより有利である。塩類溶液−抽出法
については、ＣＥＡ−担持組織を７．０−７．６のｐＨ
範囲の緩衝液、例えばリン酸を波街液、トリス緩衝液、
ＴＡＰＳＯ緩街渣（：３−［Ｎｌ・リス（ヒドロキシメ
チル）メチルアミン〕−２−ヒドロキシプロパンスルホ
ン酸）、ｐｏｐｓｏ緩衝液（ピペラジン−Ｎ、Ｎ′−ビ
ス〔２ヒドロキシプロパンスルポン酸）　、ＥＰＰＳｇ
街液（Ｎ−（２−ヒドロキシエチルツーピペラジンＮ′
〜３−プロパンスルポン酸）等、中でホモジナイズする
。ホモジナイズは、それ自体既知の方法により、例えば
、機械的な装置、例えばミキサ、ブレンダーまたはウル
ｌ−ラタラックスの使用により、超音波により、’ｒｕ
＋ｅｅｎ　、　ＴｒｉｔｏｎまたはＴｅｒｇｉｔｏｌの
ような界面活性化合物の添加等により、達成される。抽
出されたＣＥＡは常用のクロマトグラフィー法、例えば
イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニテ
ィークロマトグラフィー等により、そして／または所望
により臭化シアン、ニトロフェニルクロロホルメ−１・
、ポリアクリルアミドヒドラシトまたはその他で活性化
されたセファロースもしくはアガロースといったマトリ
ックスに接合された既知の抗−ＣＥＡ抗体により、精製
される。

特に好ましいのは、塩類溶液で抽出され精製されたＣＥ
Ａ　　１５μｇを腹腔内に注射することにより［１ａｌ
ｂ／ｃマウスを免疫化し、塩類溶液で抽出され精製され
たＣＥＡ１５，５０および１５０μｇを有するーシリー
ズのブースター注射液を４ケ月後に腹腔内に注射し、最
後の注射の３日後に、免疫化マウスから牌臓細胞を取り
出し、そして融合促進剤の存在下でミエローマＰ３−Ｎ
Ｓ２／１＾ｇ４の細胞と融合することを特徴とする、本
発明のハイブリドーマ細胞系およびその誘導体の調製方
法である。検討された融合促進剤は、例えば、所望によ
りＵＶ不活性化された形のセンダイウィルスもしくは他
のパラミクソウィルス、カルシウムイオン、界面活性脂
質、例えばリゾレシチン、またはポリエチレングリコー
ルである。細胞融合は、既に記載・された方法（Ｋｏｈ
ｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ　、　Ｎａｔｕｒｅ　２
５６４９５．１９７５）に従って行われる。好ましくは
、該ミエローマ細胞は、分子量１０００〜４０００のポ
リエチレングリコールを約３０％〜約６０％含む溶液中
で、免疫化された吐乳類からの３〜２０倍過剰のＩ！１
１！臓細胞と融合される。

融合の後、過剰増殖する該ハイブリドーマ細胞から正常
のミエローマ細胞を保護するために規則的な間隔で、選
択培地、例えば）（Ａ　Ｔ培地を補充した前記のような
適当な培地中に該細胞を再懸濁しそして増殖させる。

該ハイブリドーマ細胞の培養物の上清を、イムノアッセ
イにより、好ましくはエンザイムイムノアッセイまたは
ラジオイムノアッセイにより、ＣＥ　Ａ’に対するモノ
クローナル抗体についてスクリーニングする。前記のよ
うなモノクローナル抗ＣＥＡＭＡｌｔを分泌するハイブ
リドーマ細胞、例えばＭＡｂ　ＣＨ３Ｓを分泌する細胞
系ＣＥ２５を、限定消化によりまたは軟寒天中で、好ま
しくは２回またはそれより多数回、クローン化する。所
望により、腹腔的注射および腹水の回収により動物、例
えばマウスにハイブリドーマ細胞を通過せしめる。これ
はハイブリドーマを安定化しそして増殖特性を改善する
。クローン化された該細胞は常法において凍結すること
ができる。

本発明に係るモノクローナル抗木およびその誘導体は、
ガンの診断および療法において有用である。

診断利用の一例は、特に生物学的流体中のヒトガン胎児
抗原の定性および定量である。本発明のモノクローナル
抗体およびその誘導体は、抗原とモノクローナル抗体と
の間の結合相互作用を利用するそれ自体既知のイムノア
ッセイのいずれか、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）　、エンザイムリンクドイムノアッセイ、免疫蛍光
試験、ラテックス凝集反応または血球凝集反応において
利用することかできる。

本発明に係るモノクローナル抗体は、それ自体でまたは
放射能ラベル化誘導体の形でラジオイムノアッセイ（Ｒ
ＩＡ）において利用され得る。ＲＩ　Ａの既知の変法の
いずれかを利用することもでき、例えば均一相における
Ｒ　Ｉ　Ａ、固相ＲＩＡもしくは不均一相ＲＩＡ、ＣＥ
Ａの直接もしくは間接（競合的）測定を伴う単一ＲＩＡ
または二重（サンドイッチ）ＲＩＡを利用できる。適当
な担体、例えばミクロタイタープレートまたは試験管の
プラスチック表面、例えばポリスチレン、ポリプロピレ
ンもしくはポリ塩化ビニルの表面、ガラスもしくはプラ
スチックビーズ、濾紙、またはデキストラン、酢酸セル
ロースもしくは二ｌ・ロセルロース紙等を、単純吸着に
よりまたは所望により該担体を例えばグルタルアルデヒ
ドもしくは臭化シアンで活性化した後に、ＣＥＡに対す
るモノクローナル抗体でコートし、そして１２５Ｉで放
射能ラベル化されたモノクローナル抗体の溶液およびテ
スト溶液と共にインキュベートシくただし溶解された該
モノクローナル抗体は担体に結合した抗体よりもＣＥＡ
の別の、エピトープを認識する）、そして担体に結合し
た放射能を測定することによりＣＥＡの量を決定する、
サンドイッチＲＩＡが好ましい。

該サンドイッチＲＩＡにおいて使われる抗体のうちの１
つが本発明のモノクローナル抗体である。

特に好ましいのは、本発明のモノクローナル抗体をビー
ズ、例えばポリスチレンピースに結合せしめ、このコー
トされたビーズを、ＣＥＡを含むテスト溶液または標準
液とインキュベートしそして最後に別のエピトープを認
識する放射能ラベル化モノクローナル抗体により展開す
るという、前記のサンドイッチラジオイムノアッセイで
ある。

本発明に係るモノクローナル抗体は、それ自体で又は酵
素−接合誘導体の形で、エンザイムイムノアッセイにお
いて使用され得る。そのようなイムノアッセイは、本発
明に係る酵素ラベル化モノクローナル抗体誘導体または
本発明の抗体のエピト−プを認識および結合するそれ自
体既知の酵素ラベル化抗体を使う試験法を含む。

好ましいのは、ＲＩ　Ａについて上述したごとき担体を
本発明に係るモノクローナル抗体でコートしそしてＣＥ
Ａを含むテスト溶液と、次いでＣＥＡに対するポリクロ
ーナル血清、例えばヒツジの血清とインキュベ−１−Ｌ
、そして最後に、該ポリクローナル血清の結合抗体を、
それらを認識し且つ結合する酵素ラベル化抗体により顕
現し、そして酵素基質反応によりタンパク質結合の量を
決定する、ＥＬＩＳ＾（エンザイムリンクドイムノソル
ベントアッセイ）である。・そのような酵素ラベル化抗
体は、例えば、ホスファターゼでラベル化されたヤギの
抗−ヒツジ免疫グロブリンである。

本発明に係るモノクローナル抗体でコーＩ・された担体
をテスト溶液および酵素と接合したモノクローナル抗体
の溶液とインキュベートシ、ただし溶解された該モノク
ローナル抗体が担体に結合したモノクローナル抗体より
もＣＥＡの別のエピ１−−プを認識する、ＥＬＩＳ＾も
また好ましい。例えば色の変化をもたらしそして肉眼に
よりまたは光学測定装置を用いて観察することのできる
酵素基質反応によって、結合した酵素の量（これはテス
ト溶液中のＣ’　Ｅ　Ａの量に比例する）が測定される
。

本発明に係る酵素ラベル化モノクローナル抗体を使用し
そして本発明に係る該モノクローナル抗体よりも別のエ
ピトープを認識するモノクローナル抗−ＣＥＡ抗体で担
体をコートするＥＬＩＳ＾もまた好ましい。

特に好ましいのは、イムノドツト分析と呼ばれるエンザ
イムイムノアッセイであり、この場合は、ＣＥＡを含有
するテスト溶液または標準液を、ポリペプチドに対し高
い本質的親和性を有する微孔質担体、例えばニトロセル
ロース上にスポットシ、前記試料の１または幾つかのド
ツトを有する該担体を、本発明のモノクローナル抗体の
溶液中で、次に前記本発明のモノクローナル抗体を認識
し且つ結合する酵素ラベル化第二抗体の溶液中で、そし
て最後に検出可能なシグナルを導く酵素基質、例えば発
色性物質の溶液中でインキュベーＩ・する。

そのような酵素ラベル化第二抗体は、例えば、西洋ワサ
ビのペルオキシダーゼと接合したウサギの抗−マウス免
疫グロブリンであり、これは適当な酵素基質、例えば４
−クロロ−１−ナフト−ル等で発色する。

本発明に係るモノクローナル抗体は、それ自体でまたは
蛍光マーカーと接合された本発明に係る誘導体の形で、
免疫蛍光試験において利用され得る。そのような免疫蛍
光試験は、本発明に係るモノクローナル抗体誘導体、例
えばフルオレセインと接合した誘導体、または本発明の
モノクローナル抗体を認識し且つ結合するそれ自体既知
の蛍光マーカー−ラベル化抗体を使用する方法を包含す
る。

ＲＩＡについて前述したような担体を、標準法に従って
、Ｃ［ＥＡの存在についてテスト・するべき細胞てコー
■・シ（該細胞は固定されそして透過性にされており、
′適用される溶液と細胞の内側のタンパク様鞠哲との相
互作用が可能になっている）、次いで蛍光マーカーと接
斤されたモノクローナル抗体誘導体の溶液とインキュベ
−１・するか、または本発明のモノクローナル抗体の溶
液とのインキュベートに続いて本発明の該モノクローナ
ル抗体を認識し且つ結合する蛍光マーカーラベルｆヒ第
二抗体、例えばフルオレセインでラベル化されたウサギ
の抗−マウス免疫グロブリンの溶液とインキュベートす
る、免疫蛍光試験が好ましい。次いで、ＣＥＡの存在を
標準的な蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーにより
位置決定する。

ヒ）−ＣＥ　Ａの定性および定量への上記のモノクロー
ナル抗体およびその誘導体の本発明に係る利用は、それ
自体既知の他のイムノアッセイ、例えば抗体でもしくは
抗原でコートされたラテックス粒子を用いるラテックス
凝集反応、または抗体でもしくは抗原でコートされた赤
血球を用いる血球凝集反応を包含する。

本発明はまた、本発明のモノクローナル抗体および／ま
たはその誘導体並びに所望により池のモノクローナルも
しくはポリクローナル抗体および／または添加剤を含有
する、ヒトＣＥＡの定性および定量用テストキッ１〜に
関する。

本発明に１系るラジオイムイムノアッセイ用テストキッ
トは、例えば、本発明のモノクローナル抗体でコートさ
れているかまたはコー１〜されていない適当な担体、凍
結乾燥または濃縮されていることがある、ＣＥＡに対す
るモノクローナルもしくはポリクロ−リール抗体および
／またはその放射能ラベル１ヒ誘導体の溶液、ヒトＣＥ
　Ａの標準液、緩衝液、並びに所望により、非特異的吸
着および凝集形成を防止するための界面活性剤およびペ
プチド、ピペット、反応容器、検量線およびその池を含
む。

本発明にｆ系るエンザイムノアッセイ用テス）〜キット
は、例えば、適当な担体、例えばミクロタイタープレー
トまたはニトロセルロース紙、凍結乾燥または濃縮され
ていることがある、本発明のモノクローナル抗体の溶液
およびＣＥＡに対するまたはＣＥＡを認識する第−抗体
に対する酵素ラベル化モノクローナルもしくはポリクロ
ーナル抗体の溶液、固体のまたは溶解された形態の酵素
基質、ヒトＣＥ　Ａの標準液、並びに所望により、ｔ１
！街液、ポリペプチドおよび界面活性剤、ピペット、反
応容器、検量線、カラー目盛板、手引書等を含む。

本発明に係る免疫蛍光試験用デスｊ・キットは、例えば
、適当な担体、ρ１えばプラスチックのカバーガラスま
たはスライドガラス、凍結乾燥または濃縮されているこ
とがある、本発明のモノクローナル抗体の溶液および該
モノクローナル抗体を認識するフルオレセイン−ラベル
化ポリクローナル抗体の溶液、緩衝液、並びに所望によ
り、標準ＣＥＡ溶液、ポリペプチドおよび界面活性剤、
ピペット、反応容器、手引書等を包含する。

加えて、本発明のモノクローナル抗体およびその誘導体
は、腫瘍の局在定位および生体内イメージングのために
も利用される。生体内イメージングのためには、本発明
の抗体は放射能ラベル化されるか、または放射性核種、
例えばヨウ素、テクネチウム、レニウム等との金属キレ
ート錯体と接合され、そして最初のおよび転移の腫瘍を
検出するために放射線スキャン技法が使用される。この
ためには、放射性抗体を例えば腹腔内に注射し、そして
患者を規則的間隔にてガンマイメージヤ−でスキャンす
る。ＣＥＡを発現している腫瘍は、池の組織よりも多く
の放射性抗体を収り込み、そしてガンマイメージングカ
メラによりはっきりと認識されるであろう。卓越的には
、Ｉ３１■または２３Ｉでラベル化されたモノクローナ
ル抗体が、体重１ｋｇあたり１５〜３０μＣｉを示すよ
うに３〜５０μ８の量において放射線スキャン用に使わ
れる。ガンの処置における生物致死活性のためには、本
発明の抗体が前述したような４．ＩＩＩ胞増殖抑制性ま
たは細胞毒性の物質、例えばリジンＡと接合された誘導
体として、放射能ラベルｆヒ誘導体として、でなければ
生物致死性試薬をかむリボン−１１中に供給されて、使
用される。１■乳類に対する治療量は、モノクローナル
抗体それ自体については体重１ｋｇあたり約１＋ｎｇ〜
５ｔｎｇであり、そして細胞毒性薬物との接合体につい
ては体重１ｋｇあたりＯ，Ｌ＋Ｈ〜’ｚｎｇであり、こ
れは患者の状態および投与方式に散穿する。

本発明は、ＣＥＡに対し高い親和性を有する上述のよう
な本発明のモノクローナル抗体またはその誘導体を含有
する医薬調製物にも関する。該医薬調製物は１例えば、
有効量の本発明のモノクローナル抗体またはその誘導体
と一緒にまたは混合して無機または有機の、固体または
液体の医薬上許容される担体を含む。

好ましいのは、非経口投与用の医薬調製物である。筋肉
、皮下または静脈内投与用の調製物は、例えば、等張の
水溶液または懸濁液であり、所望により凍結乾燥または
濃縮された調製物から使用直前に調製される。該医薬調
製物は、滅菌されてもよくそして、例えば、該成分を保
存、安定化、湿潤（ヒ、乳化もしくは可溶化するための
添加剤、浸透圧の調節のための塩類、緩衝液および／ま
たは、粘度を調節する化合物、例えばカルボキシセルロ
ースナトリウム、デキストラン、ポリビニルピロリドン
またはゼラチンを含有してもよい。それらは当業界にお
いて既知の方法により、例えば常用の混合、溶解または
凍結乾燥法により調製され、そして約０．０１％〜約５
０％の活性成分を３む。

注射用の調製物は、当業界において既知の方法に従って
、処理され、アンプルまたはバイアル中に詰められ、そ
して無菌条件下で密封される。

下記の例は本発明を説明するものであるが、決してそれ
を限定するものではない。

吐−−１ ＢＳＡ　　　　ウシ血清アルブミン １？　ＣＳ　　　　ウシ胎児血清 ＥＬＩＳＡ　　エンザイムリンクドイムノソルベントア
ッセイ ＨＡＴ培地　ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジ
ン培地 ＮＣＡ　　　非特巽的交差反応性抗原 ＰＢＳ　　　　リン酸緩衝化塩類溶液 死体解剖から得た結腸ガン肝転移物を塩類溶液で抽出す
る。まず、１容の組織を３容の０．０２Ｍリン酸Ｍ衝液
ｐＨ７，４中４℃で５ｏｒｖａｌｌ抛ｎ１ｍ１ｘｅｒに
おいて８．００Ｏｒｐｍで１０分間ホモジナイズする。

粗いポモジネ−１・を４℃にて１５分間８，０００ｇで
遠心する。透明な−り清を、ＣＮＢｒ−活性化セファロ
ースに結合された、既知の抗−ＣＥＡモノクローナル抗
体ＭＡｂ　３５およびＭＡｂｌ１５（Ｉｌａｓｋｅｌ　
ｌら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ。

４３．３８５７，１９８７　；　ｌ）ｕｃｈｅｇＦｌｅ
ｒら、Ｊ、ＩＥｘｐ、Ｍｅｄ、１５８，４１３゜１９８
３）並びにＭＡｂ　７３（Ｉｌｕｃｈｅｇｇｅｒら、１
ｍｍｕｎｏｌ　、１．ｅｔｔｅｒｓ５．８５．１９８２
）のプールから成る免疫吸着体に適用する。２Ｍアンモ
ニウムチオシアネートでＣＥＡを溶出する。最後のセフ
ァロース６Ｂクロマトグラフイーの後、ＣＥＡが９０％
の純度で得られる。

１．２　　Ｂａｌｂｃマ　スの 生ｔＩｉ２ケ月のＤａｌｂ／ｃマウスを、塩類溶液で抽
出され精製されたＣＥＡ１５μｇを完全フロインドアジ
ュバントと共に腹腔内に注射することにより免疫化する
。４゛ケ月後、フロインドアジュバントなしの同温類溶
液ＣＥＡ調製物、１５　、５０および１５０ｇｇを含ん
で成る一連のブースター注射液を融合の５，４および３
日前にそれぞれ腹腔内に与える。

１．３　　綴１隨丸 以前に記載された常法（Ｋｏｅｈｌｅｒ　＆　Ｍｉｌｓ
ｔｅｉｎ。

Ｎａｔｕｒｅ　２５６，４９５．１９７５）に従って、
免疫マウスの牌臓細胞１．５Ｘ１０’個およびマウスの
ミエローマＰ３−ＮＳ２／１八ｇ４からの細胞１．５Ｘ
１０’個を使って細胞融合を行う。洗浄後、細胞を標準
のＤｕｌｂｅｃｃｏ最少必須培地（Ｇｉｂｃｏ　Ｎｕ０
４２２５０１）　４８ｍｌ中に懸濁する。

１融合あたり３×１０６個の正常のマウス腹腔滲出細胞
を支持細胞として添加する。細胞は、９６Ｘ０．５ｍｌ
のＣｏｓ　を訂ウェル中に分配され、標準のＩ−ｔ　Ａ
　Ｔ選択培地と共に３〜６週間の間、１週間ごとに３回
供給される。ハイブリドーマ細胞の増殖が目で見えるよ
うになった時、その上清を例１．４に記載のようにして
スクリーニングする。陽性のハイブリドーマを再りロー
ンｆヒし、そして保存する。

■、４　　近代挾■１ユよイー 増殖しているハイブリドーマの培養液を、以前に記載さ
れたくＡｃｃｏｌｌａら、Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、＾ｃａ
ｄ、ｓｃｉ。

７７．５６３．１９８０）　Ｆａｒｒの分析法（Ｊ、Ｉ
ｎｆｅｃＬ、Ｄｉｓ、１０３−。

２３９．１９５８）の変法により、抗−ＣＩ？、Ａ抗体
の存在についてテス１〜する。細胞培養物の上清の１：
１０（ｖ／ｖ）希釈液を０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１Ｃ
ＩＦ！Ｕｆｌｉｒ液（ｐ（１７，４）中＋２５１−ラベ
ル化ＣＥＡと共に二重反復試験においてインキュベーＩ
・する。冷却した硫酸アンモニウム飽和溶液を正常なヒ
ト血清の存在下で加えることにより、抗体と結合したＣ
ＥＡを４℃で沈澱させる。

非特異的交差反応性抗原ＮＣ＾５５もしくはＮＣ＾、Ｓ
上、胆汁糖タンパク買上または顆粒球上に存在しないＣ
ＥＡ−エピトープを認識し且つ少なくとも（１，６±０
．３）ｘｌＯ”　リットル１モルの親和力でヒトのＣＥ
Ａに結合するような抗−ＣＥＡ抗体を分泌するハイブリ
ドーマ細胞系、例えばＭＡｂ　Ｃｎ２Ｓを分泌するＣｎ
２Ｓ、ＩＩ胞系を、さらなる研究のために選択する。

１５　ハイブリドーマの　　および 選択された該ハイブリドーマ細胞は、−８０℃にてまた
は液体窒素中で凍結された培養液中で保存されそして再
活性化され得る。該Ｒ・■胞は限定希釈法によりクロー
ン［ヒされ、そしてブリスタンを与えられたＢａｌｂ／
ｃマウス中に腹水を形成せしめることにより増殖される
。細胞系ＣＥ２５はパリのＩｎ５ｔｉｔｕｔ　Ｐａ５Ｌ
ｅｕｒの「微生物国際寄託機関（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅ
　Ｍｉｃｒ。

０「・ビａｎｉｓｍｓ）　４に１９８７年１２月１５日
第１−７１９号のもとに寄託された。

２．１　　生−本性イ冒心 生後８−１０週間のＢａｌｂ／ｃマウスを０．５ｍｌの
プリスタン（ΔＩｃ１ｒｉｃｌ＋）で腹腔内的に前処理
する。

１−３　’！Ｍ間ｔ＆、２　５Ｘ１０’　１１７Ｊ（７
）りｌ’：７−ン化ハイフリドーマ細胞を腹腔内に接種
する。８−１０日後、腹水を回収し、８００　Ｘ　Ｉ？
で遠心し、そして−２０℃または一８０°Ｃで１呆存す
る。

解凍された腹水を５０．ＯＯＯＸｇで６０分間遠心する
。表面上に浮いている脂肪層を注意深く収り除き、そし
てタンパク買濃縮物を１０−１２ｍｇ／　＋ｎ１の；農
度に調整する。０．９体績等量の０℃の硫酸アンモニウ
ム飽和溶液の滴加によりｉＩｌ免疫グロブリンを沈澱さ
せ、次いで０．０４Ｍリン酸枕衡’ｔｌ　（ｐＨ８）中
に溶解せしめ、そして同緩衝液に対して透析する。

ＭＡｂ　Ｃｎ２ＳがｉＪＦ除体積において溶出するよう
なりＩＥ八へＥ０５２セルロース（ＷｂａＬ＋ｎａｕ）
クロマ１′・グラフィーにより、免疫学的に活性な免疫
グロブリン画分が得られる。腹水１ｍ１当り５〜１５ｍ
ｇの抗体を与えるそのような調製物が直接得られ、また
は抗体の断片が生体外および生体内適用のために調製さ
れ得る（例２．３）。

２．２　　髪氷水創露 １０％ＦＣ３を含むＲＰＭ１１６４０培地中生理学的温
度（３７°Ｃ叶近）にてハイブリドーマ細胞を１ｍＮあ
たり５Ｘ１０５〜１０６の最終細胞密度まで培養するこ
とにより、細胞系ＣＥ２５のプレ培ａＩｔを得る。プレ
培養物全部をＢｅ１ｌｃｏ培養容器中に入れ、そして新
たなＲＰＭ１１６４０培地で全体積を１５００ｍＮに調
整する。

該培養物を５％Ｃ○２下３７℃付近にて３Ｑｒｐｍで２
〜３日間撹拌し、次いでＲＰＭ１１６４０／　１０％Ｆ
Ｃ３で全体積３０００ｍｔ’に希釈する。この後では９
５％の該細胞は死んでいる。該培養ブロスを４°Ｃにお
いて１０００Ｘ［？で２０分間遠心する。上清を無菌条
件下において、炉孔０．２μＩＩＩのフィルターを通し
て枦遇する。０℃の０．９体績等量の飽和硫酸アンモニ
ウム溶液をゆっくり滴加することにより、■免疫グロブ
リンを沈澱させる。この沈澱物を例２．１に記載したよ
うにして精製する。

２．３　　阪左Δ鳳設 ０．２Ｍ＃酸緩衝液（ｐＨ４）中３７℃にて２２時間の
ペプシン（２−４％、ｗ　／−ｕｒ　）消化を使って、
Ｆ（ａｂ’）２断片を調製する（ＬａｍｙｏｉおよびＮ
１５ｏｎｏｆｆ、Ｊ、ｌｎｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｂｏｄｓ　５６，２３５．１９８３）。１００ｋ
ＤのＦ　（ａｂ　’）　２断片が車−のピークとして溶
出しそして小さい消化生成物がよく分離されるようなセ
ファデックスＧ１５０クロマトグラフイーにより、Ｆ（
ａｂ’）２断片を精製する。同じ方法により、対照のマ
ウスＩｇＧ、およびＦ（ａｂ’）２［ｉ７ｉ片を、Ｐ３
ｘ６３ミエローマ細胞（ＫｏｅｂｌｅｒおよびＭｉｌｓ
ｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ　２５６，４９５．１９７５）
で注射されたマウスの腹水から調製する。Ｌａｃｍｍｌ
ｉ（Ｎａｔｕｒｅ２２７　、６８０　、１９７０　）に
従った５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、９
５％より高い純度のＩｇＧおよびＦ　（ａｂ　’）　２
両分を示す。

２．４ＭＭＡｂＣＥ２５および　の　　の　　　ラベル
クロラミンＴ法によりＭＡｂ　ＣＨ３Ｓまたはその断片
を１３１■でラベル化して、８−９μＣｉ／μｇタンパ
ク質の比放射能を与える。断片に比鮫して完全なＭＡｂ
の優先的ラベル化は全く観察されない。ヨウ素と結合し
たタンパク質をセファデックスクロマトグラフィーによ
り遊離のヨウ素と分離し、これは集合タンパク質と結合
した＋１１■の存在が１％より少ないことを示す。免疫
反応性は、ＣＮＢｒ−活性化セファロース（Ｐｌ＋ａｒ
ｍａｃ　ｉａ）に結合したＣＥＡのインキュベーション
により調整される。

モノクローナル抗体層＾ｂ　Ｃ［Ｅ２５のクラスおよび
サブクラスは、クラスおよびサブクラス特異的ウサギ抗
体（ＢｉｏｎｅＬｉｃｓ）を使ったＯｕｃＭｃｒｌｏｎ
ｙの既知の寒天ゲル免疫拡散法により決定される。その
結果は、次のようにしてエンザイムイムノアッセイ（Ｅ
ＬＩＳＡ）により確認される・ミクロタイタープレート
を、５０μｌのＰ［３Ｓ中の１Ｍｇ／ウェルのクラスお
よびサブクラス特異的血清のウサギの免疫グロブリン調
製物（Ｄｉｏｎｅｔｉｃｓ）でコーティングする。その
プレートの遊離の結合能力を、０．２％ＮａＮ、（ｕ＋
／ｖ）を含むＰＢＳ巾の１％ウシ血清アルブミンの緩衝
液（ｐＨ７，４）で飽和する。モノクローナル抗体を含
む１００μｌのプローブを、該ウェル中３７℃で１時間
インキュベートする。そのプレートをＰＢＳで洗浄し、
次いで該プレートをコーティングするのに使；ｂれたも
のと同じ特異性の、ホスファターゼを接合したウサギの
免疫グロブリン調製物と共に３７℃で１時間インキュベ
ートする。

固定化された該酵素を酵素基質ｐ−ニトロフェニルホス
フェート溶液（０，５１１■ＭＭｇＣ１１および０．０
２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ、を含む１０％ジェタノールアミ
ン緩衝液（ｐｌｌ　９．８）中ｌｌ１１８／ｍ１）とイ
ンキュベート（３７℃、３０分間）することにより発色
せしめ、そして４０５ｎｍでの光学濃度を測定する。モ
ノクローナル抗体８Δｂ　ＣＨ３Ｓは、ＩｇＧ１クラス
である。

３．２　　　　　　　の　　　　の ハイブリドーマ細胞系ＣＥ２５の上清は、間接免疫ペル
オキシダーゼ染色により、正常な牌臓、膵臓、肺および
肝臓の凍結切片中に存在する顆粒球との交差反応性につ
いてテストされる。加えて、胆汁の糖タンパク質との交
差反応の有無は、ヒトの正常な肝臓組織片において決定
される。抗−ＣＥＡ　ＭＡｂを用いる抗原の染色には、
三層のビオチン−アビジン−ペルオキシダーゼ法（Ｇｕ
ｅｓｄｏｎら、Ｊ、１ｌｉ３Ｌｃｂｅ＋。

Ｃｙｔｏｃｂｅｍ、２７，１１３１．１９７９）が使わ
れる。要約すると、１０μＩｎのクリオスタット切片を
アセトン中室温で１０分間固定し、５ｘｌＯ−５Ｍのチ
メロザールを含む冷ＰＢＳ中で洗浄し、そして内因性の
ペルオキシダーゼ活性をなくすために７％１１２０２で
処理する。次にその切片を各々、前記抗−ＣＥＡハイブ
リドーマからまたは対照として使われるミエローマ細胞
系Ｐ３ｘ６３＾ｇ８からの未希釈の培養液２５μｌと６
０分間インキュベートする。第二の１５分間のインキュ
ベーションは、ビオチニル化されたウマの抗−マウスＩ
８Ｇ抗体とであ・す、続く第三の１５分間のインキュベ
ーションは、アビジン−ペルオキシダーゼ接合体（Ｖｅ
ｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｂｕｒｌｉｎｇａ＋ａｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）とである。全
てのインキュベーションは室温で行われそして続いてＰ
ＢＳで洗浄する。最後に、０．４％の３−アミノ−９−
エチルーカルバゾールおよび０．０１５％の１１□０２
を含む新しく調製した溶液を添加することによりペルオ
キシダーゼ活性を明らかにし、そして該Ｓ１■織をヘマ
トキシリンでカウンター染色する（Ｓｃｌ＋ｒｃｙｅｒ
ら：５ｏｒｄａｔ、実験的リサーチにおける免疫不全動
物に関する第１１回インターナショナル・ワークショッ
プ、１９８４、バーセル）。

その結果は下表において要約される： ＭＡｂ　ＣＨ３Ｓの特異性は、精製され放射能ラベル化
された非特異的交差反応性抗体ＮＣ＾５５およびＮＣＡ
ｓ５を使ったラジオイムノアッセイによりさらに分析さ
れる。この研究はＦａｒｒの分析法について例１．４に
記載したように行われるが、ただし＋２５１−ラベル化
ＮＣＡが１２５Ｉ−ラベル化ＣＥＡに置き換えられる。

ＮＣＡは、正常な肺の過塩素酸抽出物から、セファデッ
クスＧ−２００上でのゲル濾過に続いて、ＮＣＡと既知
の交差反応性を有するヤギの抗−ＣＥＡ抗血清からのＩ
ｇＧを含むＣＮＢｒ−セファロース４Ｂカラム上での免
疫吸着により精製される（ｌｌｅｕｍａｎｎら、Ｌｅｈ
ｍａｎｎの”Ｃａｒｃｉｎｏ−ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ”、Ｖｏｌ、１１．＾ｍｓＬｅｒｄａｍ　
１９７９中）。ＮＣＡｓ５　およびＮＣ八へｓは、これ
ら２つのＮＣＡのうちの一方記号二上十　強いポジティ
ブ染色、 （ト）肺胞の上皮細胞の偶因的染色、 非染色 Ｃａｎｃｅｒ　３３，６４３．１９８４）　、　ＮＣＡ
、５はクロラミンＴ法により＋２５■でラベル化され、
ＮＣ式５５はＢａ１ｔｏｎおよび１ｌｕｎｔｅｒの試薬
（＾ｍｅｒｓｈａｍＪ）ｕｃｋｓ５５もしくはＮＣＡ９
９Ｅｎｇｌａｎｄ）で２５１−ラベル化される。

その結果は下表において与えられる： さらに、１２５１−ラベル化阿＾ｈ　ＣＨ３Ｓの、２５
℃にて一晩のインキュベーション後の、ＣＮＢｒ−活性
化セファロースに結合したＣＥＡへの結合およびグルタ
ルアルデヒドで固定された結腸腫瘍細胞Ｃｏ　１１２へ
の結合、並びに４°Ｃにて４時間インキュベーション後
の、パックされ新しく調製されたヒト白血球への結合を
測定する。ヒト白血球への結合を測定する。

その結果は、下表に与えられる； 上に与えられた結果は、ＭＡｂ　ＣＨ３Ｓが骨髄および
肝臓における最少の非特異的な蓄積を伴う最適な腫瘍の
局在定位のための優れた候補者であることを示している
。

３．３　　アフィニーイー　　の−− 限定された量のＭＡｂ　ＣＨ３Ｓに、増加する量の１２
５１＝ラベル化ＣＥＡをＰＢＳ中にて八ｃｃｏｌｌａら
（Ｐｒｏｃ　。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、７７．５６３．１９８０
）に記載されたようにして添加する。１６時間後、正常
なヒト血清を、次に冷却した飽和硫酸アンモニウムを加
えて抗体に結合しなＣＥＡを沈澱させる。試料全体の放
射能および該沈澱物の放射能をγ−カウンティングによ
り測定する。

アフィニティ一定数を計算するために、平衡で得られる
飽和曲線を変形し、そして５ｃａｔｃｌ＋ａｒｄプロツ
ト（＾ｎｎ、Ｎ、Ｙ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、’２１，６０
０．１９４９）により分析する。

ＭＡｔ）ＣＥ２５は、少なくとも（１，６±０．３）　
ｘ　１０ＩＧリットル１モルの親和力でヒトＣＥＡに結
合する。

３．４Ｍ＾ｂ　ＣＥ２５によ　切　　れるエピト−プの
夾２ 阿＾ｂ　ＣＥ２５により認識されるＣＥＡの抗原決定基
（エピトープ）は、交差−阻害法により評価される。

この方法では、Ａｃｃｏｌ　ｌａら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

７７．５８３．１９８０）および１ｌａｓｋｅｌｌ　ら
（Ｃａｎｃｅｒ　ｌ１ｅｓ、　４３゜３８５７　、１９
８３）により以前記載されたようにして、２５１−ラベ
ル化ＨＡ）＋　ＣＥ２５が１００倍過剰の別の抗ＣＥＡ
　ＭＡｂとのインキュベーションの後に非ラベル化ＣＥ
Ａへのそれの結合能について試験される。

その結果は、ＭＡｂ　ＣＥ２５が以前公表された抗−Ｃ
ＥＡＭＡｂのいずれによっても認識されないＣＥＡエピ
ト−プに対しユニークな特異性を有することを示す。

以前Ｂｕｃｌ＋ｅｇｇｅｒら（ｌｔｔ、Ｊ、ｃａｎｃｅ
ｒ　３３，８４３．１９８４）により記載されたＭＡｂ
のエピトープ特異性に比べると、ＭＡｂ　ＣＥ２５によ
り認識されるエピト−プは、既知のＭＡｂ２０２により
認識されるエピトープと立体的に密接な関係にある。Ｍ
Ａｂ　ＣＥ２５の結合はＭＡｂ２０２により強く阻害さ
れる。しかしながら、ＭＡｂ２０２はＭＡｂ　ＣＥ２５
には完全に欠けている顆粒球との強い交差反応性を示す
ので、２者のエピトープは明らかに異なる。

これらの結果は、増加する量のＭＡｂ　ＣＥ２５および
よく特徴づけられた高特異性のＭＡｂ　３５を、ＣＮＢ
ｒ　−活性化セファロースに結合した精製ＣＥＡとまた
は生存している結腸ガン細胞のどちらがとインキュベー
トする、さらなる結合アッセイにより次に記載のように
して確認される。

ＣＥＡ−セファロースへの結合アッセイでは、増加する
濃度の前記の２つの放射性ラベル化モノクローナル抗体
（０，１５−４０μｇ）をセファロース−ＣＮＩ）ｒに
結合した３μｇのＣＥＡと２５℃で１６時間インキュベ
ー１・する。無関係のタンパク質を含有するセファロー
ス−ＣＮＢｒとのインキュベーションにより非特異的結
合を測定しそしてこれを差し引く。その結果から、８＾
ｂ　３５より４倍多くのＭＡｂＣＥ２５がセファロース
結合ＣＥＡに結合することが証明される。

生存している結腸ガン細胞を使ったアッセイにおいても
全く同様な結果が得られる。結腸ガン細胞を９６ウエル
の組織培養プレート上で増殖せしめる。洗浄後、増加す
る量の放射能ラベル化合＾ｂ（２−４５０ｎｇ＞を粘着
細胞と培地中３７℃で４時間インキュベートする。特異
的結合を阻害する多量の非ラベル化ＭＡｂを使うことに
より非特異的結合を測定し、そしてこれを差し引く。前
記のＣＥＡセファロースへのＭＡｂ　ＣＥ２５の結きア
ッセイと同じく、ＭＡｂ　３５に比べて４倍高い結腸ガ
ン細胞へのＭＡＩ）ＣＥ２５の結合が得られる。

従って、ＣＥＡ発現細胞へのＭＡｂ　ＣＥ２５の優れた
結合性により該抗体が診断および療法適用への有望な候
補者になる。

匠生立　　ヌードマウスにおけるイムノシン　グラフィ ４．１　　ヌードマウス腫瘍モデル ヌードマウス（Ｉｆｆａ　Ｃｒｅｄｏ、＾ｒｂｅｓｌｅ
、Ｆｒａｎｃｅ）の腹腔内に連続的に移植されたヒトの
結腸ガンＴ３８０（Ｍａｒｔｉｎおよび１ｌａｌｐｅｒ
ｎ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４４．５４）５，１９８４
；Ｍａｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ　２４８，７０４．１９７
４）を、放射能ラベル北枕−ＣＥＡ　ＭＡｂおよびその
断片のための標的として使用する。Ｔ３８０腫瘍は、高
度な血管新生のためにＩｇより大きいサイズに及ぶ比較
的少ない壊死性の領域を示す。該腫瘍は、適度に分化し
ており、そしてより低度の組織化（ｏｒｇａｎｉｚａｔ
ｉｏｎ）を有する上皮細胞に囲まれた、ＣＥＡに富む多
数の偽管腔を含む。ＣＥＡの生産および血流への放出は
既に記載されている。腫瘍１グラム当り１５〜４５μｓ
のＣＥＡが抽出され得、そして１ｇの腫瘍がち１時間当
り１０〜１８ｎｇのＣＥＡが生産されそして血液中に放
出される（Ｍａｒｔｉｎおよびｌ１ａｌｐｅｒｎ、Ｃａ
ｎｃｅｒ　Ｒｃｓ。

仏、５４７５．１９８４）。

４．２　　　　を　　るヌードマウスのそれぞれＣＥＡ
分子の異なるエピトープを認識する８＾ｂ　ＣＥ２５　
、　ＭＡｂ　３５およびＨ＾Ｉ３　Ｂ１７　、並びにそ
れらのＦ　（ａｂ　’）　２断片をクロラミンＴ法によ
りｌ：ｌｌ［で放射能ラベル化して８−９μＣｉ／μｇ
タンパク質の最終比放射能を与え、そしてこれを０．２
〜１．５グラムの結腸腫瘍を有するヌードマウスに静脈
注射する。抗体とそれらの断片の混合物は、腫瘍小節の
良好な且つ迅速な貫入並びに長期間にわたる多量の抗体
の供給を達成するのに使われる。断片および完全なＭｌ
）−ラベル化抗体は、腫瘍小節の異なる領域を放射線で
照射することもてきる。

３１■でのラベル化はまた、良好な腫瘍貫入のために有
利である。完全抗体の注射後３日日またはＦ（ａｌ）′
）２の注射後２日日にマウスを解剖する。正常組織に対
する腫瘍の比（Ｔ／Ｎ）は全身体に対する腫瘍の比（Ｔ
／Ｎ平均）と同様に計算される。

′「／Ｎ平均″゛は、全生体および解剖された死体を包
含する全身体の放射能／ｇに対する腫瘍の放射能／ｇの
比を表わす。

結果は下表に要約される。

４．３　　　　　Ｔａ２Ｏを　　るヌードマウスの゛１
：１Ｉｌ−ラベル化抗−ＣＥＡ　Ｍ＾ｂの注射によりヒ
ト結腸ガンの腫瘍後退を得る可能性を証明するために、
次の実験を行う。

治療用に、完全抗体を１：２の比においてそれらのＦ（
ａｂ’）２断片と混合する。この混合物のＩＩＩＩＦｌ
を１０＋ｎＣｉの１３１（を有するクロラミンＴにより
８μＣ１／μｇタンパク質の比放射能にラベル化する。

生ｆ＆７週間の雄のヌードマウスに結腸腫Ｔ３８０を移
植し、そして３−４匹のマウスをでたらめに各カゴに分
配する。放射能ラベルの注射の３日前および当日、即ち
移植の１０日後腫瘍がよく発達し且つ器質化しそして指
数増殖期にある時、腫瘍を測量する。種々の大きさに成
長している腫瘍を有する４グループのマウスを選択する
。第１グループは６００μＣｉの−３１１−ラベル化抗
体で、第２グループは６００μＣｉの１３１■−ラベル
化標準的ＩｇＧ（同じく完全体およびＦ（ａｂ’）ｚが
混合されている）を静脈内に注射される。第３グループ
は相当する量の７５μｇの非ラベル化抗体を注射され、
そして第４グループは何も注射されない。＋３１１−ラ
ベルｆヒタンパク買を注射されるマウスの甲状腺は、注
射の３日前から始めその６週間後に至るまで、飲料水中
へ５％ルゴール溶液を添加する（３００ｍｌの水あたり
０．５ｍ１）ことにより保護される。マウスはＰ紙で頂
部を覆われたカゴを使って無菌条件下に保たれ、そして
出入りは２人の人間に限られる。

初めは、３〜４日間毎日、そしてそれ以降は一週間に一
度、三次元において腫瘍の直径を測定する。

次の式、 体積＝ｒｌＸｒ２Ｘｒ３Ｘ４／３π（ｒ＝半径）を用い
ることにより腫瘍の体積を計算する。他の人々による測
定値から見積ると、個々の腫瘍の大きさの測定値の精度
は約±１０％である。ＲＡＤＸ＾５ｓａｙｅｒｌ（ＲＡ
ＤＸ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、１ｌｏｕｓｔｏｎ、Ｔ
ｅｘａｓ）を使った全身体めカウンティングで２つの半
減期の測定が可能になる。次いで全身体の放射線量を次
の式により計算する。

Ｄｐ　＝　２．１３ＸＴ、ｅｒｆＸｌ、４４ＸＣＸＥ４
ラジアンおよび（Ｔ、ｅｆＴは時間、Ｃはμｃｉ／ｇ、
Ｅｘは１３１１については０．１９） Ｄ　７　＝　　２．１３ｘ　Ｔ、ｅｆｆ　Ｘ　１．４４
Ｘ　ＣＸＥ　ｆＸＥ、φ（Ｌ１６ｎｒ）ｉ ラジアン 〔ｆはγ線の周波数、Ｅはγ線のエネルギー、φは線吸
収係数（ｕａ。）掛ける半径（ｒ）、Ｊｏｌｉｎｓおよ
びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ　：　Ｆｒ１ｅｄ＋ａａｎ、”
Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ　　ｉｎ　　ｔｈｅｎａｎｎｅｒｓ
ｔａｎｅ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ
　１ｅｃｔｕｒｅｓ　ｏｎＲａｄｉａｔｉｏｎ　Ｔｈｅ
ｒａｐｙ”、　Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ　１９７Ｂ中、
を参照のこと。〕 マウスのための全身体の放射線量は、９０％がβ−線に
より１０％がγ線によるものである。療法的用量におけ
る放射能ラベル化ＭＡｂの注射から２４時間目、７２時
間目および７日目に解剖されたマウスをＴ／Ｎ比につい
て分析する。全平均Ｔ／Ｎ比は、推定上の腫瘍放射能の
増加期および減少期を考慮して、これら動物中の腫瘍対
全身体の比から計算される。β−線だけによる腫瘍の線
量は、全身体の線量と比べて計算される。腫瘍を１．３
および７日目に組織学的に検査し、そして注射後２４時
間目および７２時間目に切り出された腫瘍からオートラ
ジオグラフィーを得る。ブタの抗−ＣＥＡ　Ｍ＾ｂおよ
び抗−ブタＩｇＧ−ペルオキシダーゼ接合体を使った免
疫ペルオキシダーゼ染色は、放射能ラベル化抗体の注射
後遅く発達する３つの腫瘍並びにヌードマウス中の未処
置のＴ３８０腫瘍において行われる。放射能ラベル化Ｍ
Ａｂを注射されな４−５体のマウスの血液および腫瘍を
有する未処置のマウスの血液を抗体の注射後毎週得、そ
して白血球細胞を計測する。最後に、予備的治療のプロ
トコールの後１／２年間生き残った５体のマウスを組織
学的におよび免疫ペルオキシダーゼ染色により、残存し
ている生存可能なｌ１ｊｌ　１１ｇ細胞およびそれらの
ＣＥＡ発現について検査する。

それらの甲状腺、肝臓、腎臓、肺および牌臓を放射線損
傷について形態学的に分析する。

よく定着された腫瘍移植片のサイズは、放射能ラベル化
抗体の注射後６日目まで増加するが、次いで４−１２週
間腫瘍の後退が始まる６これは、９０％より多くの腫瘍
細胞の破壊または低い割きであるが細胞増殖のｍ著な阻
害を伴う破壊のどちらかに相当するに違いない。

１３体のマウスの主な対照グループは、同量の１ｌｌ−
ラベル化された完全な正常１ｇＧ１およびそのＦ（ａｂ
′）２断片を注射される。腫瘍の進行は、未処置の対照
物に比軸して１〜３週間遅れるが、腫瘍の後退は全く観
察されない。

結果（処置されたマウスおよび対照マウスにおける腫瘍
の大きさの評価）は、下表に要約される。

注射後の日数に応じて、平均腫瘍サイズが下表に示され
た４グループのマウスにおいて４７−５０＋ｎ…３から
変化している。速い増加が（Ｃ）および（ｄ）グループ
において次の２８日間観察される。放射能ラベル１ヒ抗
体を注射されたマウスにおいては、平均腫瘍サイズは１
２２＋ｎ＋ｎ３まての最初の増加の後、２８０目には４
４１１１１１１３の最小値に減少する（ａグループ）。

放射能ラベル化正常１ｇＧを注射された（ｂ）グループ
においては、ゆっくりであるが一定な腫瘍の進行か観察
され、２８日日日は４４９ｍｍ３の平均腫瘍サイズを有
する。

新たな結果は、３種のＭＡｔ＋の１ｊ１７−ラベル化Ｆ
（ａｂ’）２回片を使用することにより、腫瘍を移植さ
れたヌードマウスが完全にそれらの腫瘍から回復すると
いうことを示している。１０体のマウスのうち８体が腫
瘍の再発なしに一年生存している。

療法的用量の１３′１−ラベル化抗体／断片の注射後２
４時間目および７２時間目に切り出された腫瘍は、光学
顕微鏡により検出可能な組織学的変化を全く示さない。

対して、注射後７日目に切り出された腫瘍においては、
不規則な壊死領域および多数の緻密細胞が観察される。

放射線免疫療法後６ケ月間生存した動物において、光学
顕１紋鏡により種々の器官を分析する。甲状腺、腎臓、
肺および牌臓は正常に見える。

処置されたマウスの中で死亡がないことは、造血に対す
る放射線免疫療法の作用が無視できるということを示ず
。

Ｌｕ　　エンザイムリンクドイムノソルベントア５．１
　　分１〕す１ ポリプロピレンのミクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔ
ｅｃｈ）を、Ｍ街液ａｌｌ　８．６　（０，０２％アジ
化すトリウムを含む炭酸塩緩衝化０．９％塩類溶液）中
のモノクローナル抗体ＭＡｂ　ＣＨ３Ｓ（１０μ！？／
ｌｌ１１）の溶液１５０μｌで３７℃にて２時間に渡っ
て、そして４℃にて一晩コートする。そのプレートをＰ
ＢＳで５回洗い、そしてまだ残存しているタンパク質反
応性の部位を緩衝液ｌ３１１７．４　（Ｐ　［３Ｓ中の
０．２％ゼラヂンおよび０．２％ＮａＮａ）　２５０ｔ
ｔｌとの３７℃における１　ｂ時間のインギーしベーシ
ョンにより飽和する。

このようにしてコー１〜されたプレートは、この緩衝液
中４℃にて数日間１に存できる。

テスト溶液または精製しｌ−ＣＥ　Ａを含有する標？（
＋！液の希釈シリーズ５０）１１、Ｍ街液μｍ１７．４
５０μ！、およびＷｌ街液ｐＨ７，４で１　：　１００
に希釈）れな、別のＣＥＡ−エピトープを認識するアル
カリホスファターゼラベル化モノクローナル抗−ＣＥＡ
抗体ＭＡｂ　３５の溶液５０μｌを混合し、そしてミク
ロタイタープレートのウェル中で３７℃において２ニト
ロフェニルホスフェ−ｔ・溶Ｈ（１０％ジェタノールア
ミン緩衝液中１　ｍｇ１社、０．５ｍＭ　ＨｇＣ１ｚ、
１＋ｌｌ　９．８）　１５０μｌと３７℃にて３０分間
インキュベートする。４０５ｎｍにおける光学濃度を測
定することにより、放出されたｐ−ニトロフェノールの
量を決定し、これは結合した酵素ホスファターゼの量に
比例し、そしてテスト溶液中のヒトＣＥＡの亀に逆比例
する。

ＥＬＩＳＡは、酵素ラベル化ＭＡｂ　ＣＩＥ２５を用い
、そして別のＣＥＡ−エピトープを認識するモノクロー
ナル抗−ＣＥＡ抗体阿＾ｂ　３５でミクロタイタープレ
ートをコーティングすることによっても行われ得る。

５．２　　ＥＬ［ＳＡ　　−スト　７１〜例５．１に記
載の分析用のテストキットは次のものを含む。

ポリプロピレンミクロタイタープレート・２０　ｍｌ・
−炭酸塩緩衝化塩溶液（０，９％ＮａＣ１，０，４２％
Ｎａ１１ＣＯ＝、０．００７２％ＮａｚＣＯ−１０．０
２％ＮａＮａ）中の、モノクローナル抗体ＭＡｂ　ＣＨ
３Ｓ（１０μｍ１／ｒｏ１）、 １　ｍｌ・−Ｉ”リスＩＪＪｆｆｌ液（０，０５Ｍ、１
　ｍＭ　ＭｇＣＮ２．１％ＢＳＡ、０．０２％ＮｕＮ５
５もしくはＮＣＡ９９ｐＨ８，ｏ）中の、別のＣＥＡ−
エピト−プを認識するアルカリホスファターゼ−結合モ
ノクローナル抗体ＭＡｂ　３５（０，０３ｎ＋Ｈ抗体／
　ｔｏ　１　）、３００ｍ１・・・ＰＢＳ、 ３ｏｏｖｎ１−１ｌｆｌｒ液１１１１７．４（Ｐ　Ｂ　
Ｓ中０．２％ゼラチンＪ３よび０．２％ＮａＮ＝）、 ５０ｍ１・・・ジェタノールアミン緩衝液（１０％、０
．５＋ｎＨＨｇＣｌ２．０．０２％ＮａＮ５５もしくは
ＮＣＡ９９１１Ｃ１でｐｔ１８．９に調整）中のｐ−二
トロフェニルホスフェート（ＩＩＩ１ｇ／１１１１）、 検量線、 カラー目盛板、 手引書。

匠しニ　ン、Ｆ、口１　　二、＝巳、′例２に従って調
製されたモノクローナル抗体８八ｂ　ＣＥ２５１２０Ｂ
を生理的食塩水５１ｏ１中に溶かず。

その溶液を細菌フィルターに通し、そしてそのｒ液を無
菌条件下でアンプルに詰める。そのアンプルは好ましく
は冷凍庫中、例えば−２０℃で筺存される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、非特異的交差反応性抗原ＮＣＡ＿５＿５もしくはＮ
   ＣＡ＿９＿９上、胆汁の糖タンパク質上または顆粒球上
   に存在しないＣＥＡのエピトープを認識し、そして少な
   くとも（１．６±０．３）×１０＾１＾０リットル／モ
   ルの親和力でヒトＣＥＡに結合することを特徴とする、
   ヒトのガン胎児抗原（ＣＥＡ）に特異的なモノクローナ
   ル抗体およびその誘導体。 ２、呼称ＭＡｂ　ＣＥ２５を有する請求項１に記載のモ
   ノクローナル抗体、およびその誘導体。 ３、酵素、蛍光マーカー、金属キレート、細胞増殖抑制
   性もしくは細胞毒性の物質、アビジン、ビオチンまたは
   その他との接合体である、請求項１に記載のモノクロー
   ナル抗体の誘導体。 ４、放射能ラベル化されている、請求項１に記載のモノ
   クローナル抗体の誘導体。 ５、断片である、請求項１に記載のモノクローナル抗体
   の誘導体。 ６、前記抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を生体外ま
   たは生体内で増殖し、そして所望であれば、生じた該抗
   体をその誘導体に変換することを特徴とする、請求項１
   に記載のモノクローナル抗体およびその誘導体の調製方
   法。 ７、前記抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を、所望に
   より炭化水素で前処理されているＢａｌｂ／ｃマウスに
   腹腔内注射し、そして８−１０日後、これら動物から腹
   水を取り出すことを特徴とする、請求項６に記載の方法
   。 ８、請求項１に記載のモノクローナル抗体分泌をするハ
   イブリドーマ細胞系。 ９、呼称ＣＥ２５を有する、請求項８に記載のハイブリ
   ドーマ細胞系。 １０、精製ヒトＣＥＡによりまたは精製ヒトＣＥＡを含
   有する抗原キャリヤーによりＢａｌｂ／ｃマウスを免疫
   化し、Ｂａｌｂ／ｃマウスの抗体産生細胞をミエローマ
   Ｐ３−ＮＳ２／１Ａｇ４の細胞と融合せしめ、その融合
   で得られたハイブリッド細胞をクローン化し、そして所
   望の抗体を分泌する細胞クローンを選択することを特徴
   とする、請求項８または９に記載のハイブリドーマ細胞
   系の調製方法。 １１、塩類溶液で抽出され精製されたヒトＣＥＡにより
   Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫化することを特徴とする、請
   求項１０に記載の方法。 １２、請求項１に記載のモノクローナル抗体および／ま
   たはその誘導体の、ガンの診断および治療への利用方法
   。 １３、請求項１に記載のモノクローナル抗体および／ま
   たはその誘導体の、ヒトＣＥＡの定性的および定量的測
   定への利用方法。 １４、請求項１に記載のモノクローナル抗体および／ま
   たはその誘導体、並びに所望により、他のモノクローナ
   ルもしくはポリクローナル抗体および／または添加剤を
   含有する、ヒトＣＥＡの定性的および定量的測定用のテ
   ストキット。 １５、請求項１に記載のモノクローナル抗体および／ま
   たはその誘導体を含有する医薬組成物。