MX2011003618A

MX2011003618A - Peliculas de seda modificadas que contienen glicerol.

Info

Publication number: MX2011003618A
Application number: MX2011003618A
Authority: MX
Inventors: David L Kaplan; Xiaoqin Wang; Shenzhou Lu; Fiorenzo Omenetto
Original assignee: Tufts College
Priority date: 2008-10-09
Filing date: 2009-10-09
Publication date: 2011-06-16
Also published as: AU2009302192A1; CN105268020A; JP2012505297A; CA2739487A1; CN102271724B; US20160038637A1; JP5896743B2; US20110223153A1; BRPI0920453A2; CN102271724A; KR20110094277A; WO2010042798A2; IL212143A0; US10493179B2; EP2349367A4; HK1161142A1; EP2349367A2; HK1220645A1; WO2010042798A3; AU2009302192B2

Abstract

La presente invención proporciona composiciones y métodos para preparar películas de fibroína de seda insolubles, dúctiles, flexibles acuosas. Las películas de seda comprenden fibroína de seda y aproximadamente 10% a aproximadamente 50% (p/p) de glicerol, y se preparan mediante procesos completamente acuosos. La película de seda dúctil además se puede tratar al extraer el glicerol de y al re-secar la película de seda. Los agentes activos se pueden incrustar en o depositar sobre la película de seda modificada con glicerol para una variedad de aplicaciones médicas. Las películas se pueden conformar en estructuras tridimensionales, o colocar sobre superficies de soporte como etiquetas o recubrimientos. Las películas de seda modificadas con glicerol de la presente invención son útiles en una variedad de aplicaciones tales como diseño de tejido, dispositivos o implantes médicos, suministro de fármaco y etiquetas farmacéuticas o de alimentos comestibles.

Description

PELÍCULAS DE SEDA MODIFICADAS QUE CONTIENEN GLICEROL CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones y métodos para preparar películas de fibroina de seda que contienen glicerol y que tienen propiedades mecánicas mejoradas .

ANTECEDENTES La fibroina de seda tiene excelentes capacidades formadoras de película y también es compatible parea el uso en el cuerpo humano. Las películas de fibroina de seda, sin manipulación o tratamiento adicional, son solubles en agua debido a la dominación de las estructuras de proteína de espiral aleatoria. Las características estructurales de la proteína se pueden transformar de la espiral aleatoria a la estructura de ß-lámina mediante varios tratamientos, incluyendo el estiramiento mecánico, inmersión en solventes orgánicos polares, o curado en vapor de agua. Esta transición estructural da por resultado la insolubilidad acuosa, proporcionando de esta manera opciones para el uso del material en una gama de aplicaciones biomédicas y otras aplicaciones. Algunas películas de fibroina de seda puras tienden, a través del tiempo, a llegar a ser rígidas y quebradizas en el estado seco, sin embargo, exhibiendo resistencia a la tensión impresiva pero baja ductilidad. Aun permanece una necesidad para modificar las propiedades físicas y mecánicas de las películas de fibroina de seda para mejorar las propiedades mecánicas y proporcionar sistemas basados en fibroina de seda más flexibles para aplicaciones biomédicas y otras aplicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona películas que comprenden fibroina de seda y glicerol, que tienen propiedades distintas comparadas con las películas de fibroina de seda que carecen de glicerol. Más específicamente, la solubilidad acuosa y biocompatibilidad se mejoran con el uso o la inclusión y uso de glicerol como un plastificante . El procesamiento de la fibroina de seda en agua también mejora tanto la biocompatibilidad como el potencial para cargar compuestos bioactivos sin la pérdida de función, y adiciona valor de "química verde" a estos biomateriales . Por ejemplo, las mezclas de fibroina de seda y glicerol con concentraciones de glicerol arriba de 30% (p/p) vaciadas en películas da por resultado la conversión de la estructura secundaria de seda de la espiral aleatoria a ot-hélice, previno a la seda de la disolución en la hidratación, proporcionó morfología de nanoestructura de película distinta, mejoró la flexibilidad de la película en ya sea ambiente seco (como película vaciada) o húmeda (después de la lixiviación del glicerol) y preservó la biocompatibilidad de la célula. Mecanísticamente, el glicerol puede reemplazar el agua en la hidratación de la cadena de fibroina de seda, dando por resultado la estabilización inicial de estructuras helicoidales como es opuesto a la espiral aleatoria o estructuras de ß-lámina. El impacto del glicerol en estabilizar la estructura de película, la insolubilidad acuosa y función aparentemente ocurre arriba de una concentración de glicerol de aproximadamente 20% en peso de glicerol. El uso de glicerol en combinación con la fibroina de seda en el procesamiento de materiales expande las características funcionales alcanzables con esta proteína fibrosa, y la formación de películas más flexibles con utilidad potencial en aplicaciones de biomateriales y de dispositivos .

La presente invención proporciona una película de seda que comprende fibroina de seda y de aproximadamente 10% (p/p) a aproximadamente 50% (p/p) de glicerol, en el cual la película se prepara mediante procesos completamente acuosos, y la película de seda es dúctil y sustancialmente insoluble en agua. Muchas modalidades de las películas mezcladas de seda/glicerol de la presente invención exhiben ductilidad más alta que las películas de seda que carecen de glicerol, opcionalmente siguiendo el tratamiento con metanol o recocido en agua. El glicerol en la película de fibroina de seda, sin que sea limitado por la teoría, parece que estabiliza la estructura a-helicoidal de la fibroina de seda. Así, en una modalidad, la película de fibroína de seda dúctil se puede convertir de una estructura -helicoidal a la estructura ß-lámina al extraer el glicerol de la película de seda y al rehidratar la película.

En una modalidad, una composición que comprende película de seda modificada con glicerol se puede utilizar como una construcción bidimensional o tridimensional para el diseño de tejido, y además puede comprender por lo menos un agente activo. Tal construcción diseñada de tejido se puede utilizar para reparación de órgano, reemplazo de órgano, u otros materiales de tejido regenerados tal como músculo cardiaco o tejido de la córnea. Una modalidad de diseño de tejido tridimensional se puede hacer al envolver o conformar una película de seda/glicerol dúctil alrededor de un dispositivo de implante, tal como un implante dental, y al permitir que la película seque. Las mezclas de seda/glicerol se pueden formar, o las películas plegar o conformar, en esponjas o bloques u otras estructuras tridimensionales. Opcionalmente, el glicerol luego se puede lixiviar de la seda. Así, la película de seda también se puede utilizar como recubrimiento sobre materiales biomédicos tales como dispositivos médicos, materiales o implantes diseñados de tejido, al recubrir la superficie de tales estructuras una película dúctil de seda/glicerol. El recubrimiento de tal película de seda modificada proporciona compatibilidad mejorada y se conforma bien a los contornos del sustrato.

En otra modalidad, la película de fibroína de seda que contiene glicerol es un material compuesto que comprende la estructura basada en seda, tales como nanoesferas o microesferas de fibroína de seda, que contienen opcionalmente agentes activos. Adicionalmente, el material compuesto de seda puede incluir una superficie de soporte compuesta basada en seda, tal como una estructura tridimensional de un implante médico o dispositivo, en el cual se conforma la película de glicerol/seda dúctil.

Las modalidades de la presente invención también proporcionan métodos para preparar una película de seda que es sustancialmente insoluble en agua, al mezclar una solución de fibroína de seda con glicerol, en donde la concentración de glicerol es la solución de mezcla de fibroína de seda/glicerol varía de aproximadamente 10% a 50% (p/p) ; vaciar la solución de mezcla de fibroína de seda/glicerol sobre una superficie de soporte de película; y secar la película. Las películas de seda preparadas por este proceso exhiben ductilidad incrementada comparada con las películas de seda que carecen de glicerol.

Por lo menos un agente activo se puede incrustar en la película de seda dúctil al mezclar una solución de fibroína de seda con por lo menos un agente activo y glicerol antes del vaciado y el secado de la película. De manera similar, las células o tejidos se pueden incrustar en las películas de mezcla de seda/glicerol .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra datos de la disolución de seda y glicerol de las películas de mezcla. *Diferencias significantes entre los grupos (P<0.01). Los datos representan el promedio ± SD (n = 4).

Las Figuras 2A-2C muestran la determinación de FTIR de estructuras secundarias de seda en películas de mezcla con diferente contenido de glicerol. La Figura 2A: películas de mezcla directamente después del vaciado de la película. Figura 2B: películas de mezcla después del tratamiento de metanol al 90% (v/v) durante 1 hora. Figura 2C, película de glicerol de 20% (p/p) con y sin tratamiento con agua durante 1 hora. *diferencias significantes entre los grupos (P<0.01). Los datos representan el promedio ± SD (n = 4).

Las Figuras 3A-3D presentan propiedades mecánicas de las películas de mezcla con diferente contenido de glicerol. Figura 3A, resistentes a la tensión. Figura 3B, alargamiento en el rompimiento. Figura 3C, módulo de tensión de películas de mezclas secas. Figura 3D, módulo de tensión de películas de mezcla húmedas después del tratamiento con agua durante 1 hora. *diferencias significantes entre los grupos (P<0.01). Los datos representan el promedio ± SD (n = Las Figuras 4A-4D muestran imágenes en SEM de películas de mezcla. Figura 4A, contenido de glicerol al 10% (p/p) . Figura 4B, contenido de glicerol de 20% (p/p) . Figura 4C, contenido de glicerol de 30% (p/p) , tratado con agua durante 1 hora. Figura 4D, contenido de glicerol al 0%, tratado con metanol durante 1 hora. Barra de escala = 200 nm.

Las Figuras 5A-5D son micrografías que muestran estructuras de nanofilamento en películas de seda tratadas con agua que contienen 30% (p/p) de glicerol. Las Figuras 5A y 5D muestran regiones diferentes en la película. Figura 5B, alto aumento de 5A. Figura 5C, vista lateral de 5A. Figura 5E, alto aumento de 5D. Barra de escala = 200 nm en 5A, 5C, 5D; 100 nm en 5B, 5E.

Las Figuras 6A y 6B demuestran la unión y proliferación de fibroblastos sobre diferentes superficies. La Figura 6A muestra imágenes microscópicas de fibroblastos cultivados en 30% (p/p) de glicerol/película de seda, película de seda pura, y plástico de cultivo de tejido (TCP) . La Figura 6B representa la unión de fibroblastos sobre diferentes películas. La Figura 6C muestra la proliferación de fibroblastos sobre diferentes películas. Los datos representan el promedio ± SD (n = 6) . Barra = 50 µp?.

La Figura 7 es una ilustración esquemática de las transiciones estructurales de seda en películas de seda mezclas con glicerol.

DESCRIPCIÓN DETALLADA Se debe entender que esta invención no está limitada a la metodología particular, protocolos y reactivos, etc., descritos en la presente y que tales pueden variar. La terminología utilizada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares solamente, y no se proponen para limitar el alcance de la presente invención, que es definido solamente por las reivindicaciones.

Como se utiliza en la presente y en las reivindicaciones, las formas singulares incluyen la referencia plural y viceversa a menos que el contexto claramente lo dicte de otra manera. Diferente a los ejemplos de operación, o donde es indicado de otra manera, todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción utilizadas en la presente se deben entender como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente" .

Todas las patentes y otras publicaciones identificadas se incorporan expresamente en la presente por referencia para el propósito de descripción y divulgación, por ejemplo, las metodologías descritas en tales publicaciones que podrían ser utilizadas en relación con la presente invención. Estas publicaciones se proporcionan solamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada a este respecto se debe considerar como una admisión de que los inventores no están intitulados a la antefecha de tal descripción en virtud de la invención previa o por cualquier otra razón. Todas las declaraciones en cuanto a la fecha o representación en cuanto a los contenidos de estos documentos está basado en información disponible de los solicitantes y no constituye cualquier admisión en cuanto a la corregibilidad de las fechas o contenidos de estos documentos.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como aquellos comúnmente entendidos de uno de habilidad ordinaria en la técnica a la cual esta invención pertenece. Aunque cualquiera de los métodos, dispositivos y materiales conocidos se pueden utilizar en la práctica de la prueba de la invención, los métodos, dispositivos y materiales a este respecto se describen en la presente.

La fibroína de seda tiene diferentes capacidades formadoras de película y también es compatible para el uso en el cuerpo humano. Altman y colaboradores, 24 Biomats. 401 - 16 ( 2003 ) ; Vepari & Kaplan, 32 Prog. Polym. Sci. 991 - 1007 ( 2007 ) . Las películas de fibroína de seda tienen buena permeabilidad de oxígeno disuelto en el estado húmedo, similar a aquel de la piel humana, lo cual sugiere aplicaciones potenciales para estas películas en apositos de heridas y sistemas de piel artificial. Minoura y colaboradores, 11 Biomats., 430-34 (1990); Minoura y colaboradores, 31 Polymer, 265-69 (1990a). Las películas formadas de fibroína de seda, sin manipulación adicional, son solubles en agua, sin embargo, debido a la dominación de las estructuras de proteína de espiral aleatoria. Las características estructurales de la proteína se pueden transformar de la espiral aleatoria a la forma de ß-lámina mediante el tratamiento con calentamiento (Hu y colaboradores, 41 Macromolecules 3939-48 (2008)), estiramiento mecánico (Jin & Kaplan, 424 Nature 1057-61 (2003) ) , inmersión en solventes orgánicos polares (Canetti y colaboradores, 28 Biopolymers - Peptide Sci. § 1613-24 (1989)), y el curado en vapor de agua (Jin y colaboradores, 15 Adv. Funct. Mat . 1241-47 (2005)). Esta transición estructural da por resultado insolubilidad acuosa, proporcionando de esta manera opciones para el uso del material en una gama de aplicaciones biomédicas y otras aplicaciones tales como plataformas de sensor Zhang, 16 Biotechnol. Adv. 961-71 (1998) . Algunas películas de fibroína de seda pura tienden, a través del tiempo llegar a ser rígidas y quebradizas en estado seco, sin embargo, exhibiendo resistencia a la tensión impresiva pero bajo alargamiento. Jin y colaboradores, 2005. Por lo tanto, aun permanece una necesidad para modificar las propiedades y mecánicas de las películas de seda para controlar las propiedades, principalmente hacia sistemas más flexibles.

El mezclado de polímeros con plastificantes es un procedimiento tradicional para dirigirse a la ductilidad y resistencia a la tensión como es resumido en lo anterior. Por ejemplo, algunos estudios han sugerido que las propiedades de la película de seda se pueden modificar al mezclar la seda con otros polímeros sintéticos o naturales, tal como alginato, polialilamina, quitosan, celulosa, poli (caprolactona-co-D, L-lacturo) , S-carboximetil queratina, poli (alcohol vinílico) (PVA), poli (etilenglicol) y poli (óxido de etileno) . Ver Liang & Hirabayashi, 45 J. Appl . Polimer Sci. 1937-43 (1992); Arai y colaboradores, 84 J. Appl. Polymer Sci. 1963-70 (2002); Kitagawa & Yabuki, 80 J. Appl. Polymer Sci. 928-34 (2001); Noishiki y colaboradores, 86 J. Appl. Polymer Sci. 3425-29 (2002); Kesenci y colaboradores, 12 J. Biomats. Sci. Polymer Ed. 337-51 (2001); Lee y colaboradores, 9 J. Biomats. Sci. Polymer Ed. 905-14 (1998); Tsukada y colaboradores, 32 J. Polymer Sci. B, 243-48 (1994); Gotoh y colaboradores, 38 Polymer 487-90 (1997); Jin y colaboradores, 5 Biomacromols . 711-17 (2004). Por ejemplo, las mezclas de fibroína de seda y PEO muestran estabilización de los materiales (Jin y colaboradores, 2004; Jin y colaboradores, 3 Biomacromol. 1233-39 (2002)), y el uso de agua como un plastificante puede mejorar las propiedades de la película (Jin y colaboradores, 2005) .

En muchos casos, sin embargo, la mejora de las mezcla para afectar las propiedades mecánicas permanece como un reto. En particular, evitar adiciones de otros polímeros mientras que se generan sistemas que mantienen estabilidad durante cuadros de tiempo prolongados permanece como un objetivo. Así, la presente invención proporciona opciones de plastificantes alternativos: en particular glicerol. Previamente, las películas de fibroína de seda se sumergen en 10% de glicerina (10 minutos a 95°C) y se acondiciona en un secador rico en humedad para efectuar la transformación de cristal de la seda I a II. Kawahara y colaboradores, 291 Macromol. Mater. Eng . 458-62 (2006). También, la adición de 3%-8% de glicerina redujo la separación de fase de las mezclas de fibroína se seda/PVA. Dai y colaboradores, 86 J. Appl. Polymer Sci. 2342-47 (2002). En ambos de estos procedimientos, la solución de fibroína de seda se generó al disolver la seda desgomada en el sistema de solvente ternario de CaCl2/CH3CH20H/H20.

En los métodos de la presente invención, el glicerol se mezcló con una solución de fibroína de seda disuelta en agua y luego se vació en películas. Estas películas se estimaron para las propiedades mecánicas y características estructurales para entender mejor las interacciones entre la fibroína de seda y glicerol. Las interacciones especificas entre la fibroina de seda y glicerol fue proporcionar beneficios a las propiedades de la película, que sean llevadas al efectuar el comportamiento de cristalización de la fibroina de seda en la formación de las ß-láminas como las reticulaciones físicas estabilizantes en las películas, sin la adición necesaria de otros polímeros.

La presente invención también proporciona películas de seda con distintas propiedades de disolución acuosa, y métodos para ajustar las propiedades de disolución de las películas de seda al mezclar la solución de fibroina de seda con la cantidad adecuada de glicerol. En particular, la disolución en agua de la fibroina de seda de las películas de mezcla de seda/glicerol se midieron mediante la absorbencia de UV, debido a que la fibroina de seda tiene contiene contenido de tirosina significante (>5% en mol) que, distinto del glicerol, se absorbe en longitud de onda de 280 nm. Después de una pérdida de peso inicial rápida en la primera hora, no se encontró diferencia significante adicional para la masa residual y el contenido de seda disuelto a través del tiempo (Figura 1) . Cuando el contenido de glicerol en las películas de mezcla de seda/glicerol fue 2% y 5% (p/p) , las películas completamente se disolvieron en agua, similar a las películas de seda de control que no contuvieron glicerol (Figura 1) . Por lo tanto, el glicerol en concentraciones menores que aproximadamente 5% (p/p) no aparecen tener las propiedades de la película de seda significativamente cambiadas .

Cuando el contenido de glicerol en las películas se incrementó de aproximadamente 10% a 20% (p/p) , la masa residual de las películas que permanecieron solubles se incrementó de aproximadamente 10% a aproximadamente 75%, respectivamente (p<0.01, Figura 1). Incrementos adicionales en glicerol a aproximadamente 30% (p/p) redujo la solubilidad adicionalmente, aunque los resultados no fueron estadísticamente significantes cuando se compararon con los datos de glicerol de 20%. Estos resultados indicaron que 20% (p/p) de glicerol es una concentración que induce cambios significantes en las propiedades de la película de seda, dando por resultado la sin solubilidad sustancial del material en agua (es decir, aproximadamente 75% de masas residual retenida después del empapamiento de solución acuosa. Cuando el contenido de glicerol fue significativamente por debajo de 20% (p/p) , La cantidad de seda que se disolvió en agua disminuyó a medida que se incrementó el contenido de glicerol. En 20% (p/p) de glicerol, menos de 5% de la masa de seda total fue soluble en agua, mucho menor que aquella de las películas de glicerol de 10% (p/p) (p<0.01, Figura 1). De las determinaciones de masa residual, la película de glicerol de 20% (p/p) de glicerol perdió aproximadamente 25% de la masa total en agua. Así, en la comparación de las masas, los contenidos de glicerol iniciales y la absorbencia de UV del material solubilizado, las películas de mezcla qúe contienen más de aproximadamente 30% (p/p) de glicerol pierde casi todo el glicerol en agua mientras que la proteína de fibroína de seda permaneció estable en las películas, probablemente debido al cambio inducido por glicerol en la estructura de seda. Este resultado no se observó en los contenidos de glicerol inferiores .

Los cambios en la solubilidad de la película debido al contenido de glicerol indican que el glicerol induce cambios estructurales en la fibroína de seda. El proceso de autoensamble de la proteína de fibroína de seda en fibras insolubles en agua está acompañado por el contenido de estructura de ß-lámina incrementado, o "seda II, o estructuras cristalinas. Kaplan y colaboradores, in PROTEIN BASED MATS . , 103-31 (McGrath, ed., Birkhauser, Boston, MA, 1998); Motta y colaboradores, 203 Macromol. Chem. Phys . 1658-65 (2002); Chen y colaboradores, 89 Biophys. Chem. 25-34 (2001). In vitro, la estructura de seda II se puede obtener mediante el tratamiento con solvente, tal como con metanol y etanol. Las películas de seda vaciados después del recocido con agua (exposición de las películas vaciadas en vapor de agua durante 24 horas), exhiben estructura de seda I estable con ß-vueltas de tipo II incrementadas. Jin y colaboradores, 2005. Una vez formada, la estructura se seda I en las películas recocidas con agua no transicionan a la estructura de seda II, aun con el tratamiento de metanol. En las películas de fibroína de seda/glicerol de la presente invención, el contenido de estructura -helicoidal es aparentemente incrementada hasta aproximadamente 50%, mientras que el contenido de ß-vuelta disminuyó en las películas de mezcla que tienen un contenido de glicerol más alto que 10% (p/p) (p<0.01, Figura 2A) . Estos cambios estructurales se distinguieron de los cambios observados en las películas de seda tratadas con metanol recocidas con agua preparadas en la ausencia de glicerol.

El contenido de estructura secundaria permaneció relativamente sin cambio cuando el contenido de glicerol en las películas se incrementó de aproximadamente 10% a 20% (p/p) . Así, las estructuras a-helicoidales estables aparentemente dominan el material mezclado con glicerol. Una estructura de cristal helicoidal de3 tres pliegues (seda III) se ha reportado previamente para la seda en interfases de aire-agua utilizando la técnica de Langmuir-Blodgett , que refleja las características de anfilicidad de la seda (Valluzzi y colaboradores, 24 Int'l J. Biol. acromol. 237-42 (1999) ) , pero no los materiales de seda modificados con glicerol. La estructura de seda III se puede transformar en la seda II más estables en la fuerza de compresión fue más de 35 mNm"1. Las distribuciones de cadena lateral de aminoácido a lo largo de la hélice y la orientación del eje de cadena han sido bien caracterizados en estos estudios. Valluzzi y colaboradores, 1999. Para las películas de seda de mezcla de glicerol/fibroína, después del tratamiento con metanol, el contenido de estructura de ß-lámina se incrementó aproximadamente 50%-60%, mientras que el contenido de estructura -helicoidal disminuyó aproximadamente 20%, sin considerar el contenido de glicerol en las películas (Figura 2B) . Esta respuesta, en términos de transiciones estructurales inducidas por metanol, es diferente de aquellas observadas con las películas de seda recocidas con agua donde ninguna transición conformacional de la a-hélice a la ß-lámina ocurre en el tratamiento con metanol. Jin y colaboradores, 2005. Además, en las películas de seda mezcladas con 20% (p/p) de glicerol se enjuagaron con agua y se volvieron a secar en al aire, el contenido de estructura a-helicoidal disminuyó mientras que la estructura de ß-lámina y ß-vuelta y se incrementó a aproximadamente 45% y 20%, respectivamente (p<0.01, Figura 2C) . Por lo tanto, para las películas de seda de mezcla con glicerol, las estructuras de seda II estables (cristalinas, ß-láminas) se pueden obtener al lixiviar el glicerol y al volver a secar la película.

Mecanísticamente, el glicerol parece que altera las interacciones intramoleculares de intermolecular de la fibroína de seda y da por resultado la transición conformacional de la espiral aleatoria a la a-hélice, típicamente considerado como un estado intermediario inestable hacia la formación de la estructura de ß-lámina estable. La presencia de glicerol parece que estabiliza la estructura a-helicoidal, sin embargo, previniendo la transición adicional hacia las estructuras de ß-lámina. Parece que la concentración de glicerol puede alcanzar un nivel eclíptico para lograr este grado de control estructural. Para películas de mezcla de 20% y 50% (p/p) de glicerol/fibroína, las relaciones molares entre el glicerol y la fibroína de seda son aproximadamente 1000:1 y 4000:1, respectivamente. Después de la inmersión en una solución acuosa donde el glicerol se lixivia, la película de mezcla todavía puede contener algo de estructura a-helicoidal, más probablemente debido al efecto estabilizante de las moléculas de glicerol unidas residuales. Esto podría ser la razón de que las películas húmedas (sumergidas en agua) permanecieron flexibles cuando se compararon con las películas que no contienen glicerol después el tratamiento con metanol. La transición estructural de seda de a-hélice a ß-lámina puede ocurrir durante el proceso de re-secado de la película, debido a la concentración de seda incrementada y las interacciones intramoleculares entre las moléculas de fibroína de seda. Como resultado, las películas re-secadas llegar a ser un poco quebradizas, similar a las películas de fibroína de seda tratadas con metanol.

Como se define en la presente, 'películas de mezcla seca' se refiere a películas de seda preparadas al vaciar directamente las soluciones de mezcla de fibroína de seda/glicerol para formar películas y luego secar las películas durante la noche. 'Películas de mezcla húmeda' se refiere a las mismas películas vaciadas y secadas que son subsecuentemente sumergidas y extraídas en agua ultrapura a 37 °C durante 1 hora, que disuelve el glicerol, y se seca nuevamente en el aire. Por consiguiente, el ambiente seco se refiere al ambiente que conduce a la película de mezcla de fibroína de seda/glicerol 'como es vaciado' , y el ambiente húmedo se refiere a las etapas que comprenden un tratamiento adicional de la película de mezcla de fibroína de seda/glicerol 'como es vaciada' para retirar el glicerol de la película.

Las propiedades mecánicas de las películas de fibroína de seda/glicerina de la presente invención también se examinaron. La resistencia a la tensión de las películas de mezcla secas cambió con un cambio en el contenido de glicerol en las películas. Cuando el contenido de glicerol se incrementó de 0% a aproximadamente 20% (p/p) , la resistencia a la tensión significativamente se incrementó de aproximadamente 8 MPa a 13 MPa (p<0.01, Figura 3A) . Cuando el contenido de glicerol se incrementó arriba de 20%, la Resistencia a la tensión significativamente disminuyó. El 40% de glicerol, Resistencia a la tensión fue de aproximadamente 4 MPa, significativamente menor que aquel de las películas de 0% y 20% (p/p) de glicerol (p<0.01, Figura 3A) . La resistencia a la tensión de las películas agotadas de glicerol (películas después de que el glicerol se ha lixiviado) no cambió significativamente con el cambio en el contenido de glicerol, con menos de 2 MPa determinado para todas las muestras (p>0.05, Figura 3A) . Para las películas de muestra secas, el alargamiento del rompimiento permaneció bajo (debajo de 3%) cuando el contenido de glicerol estuvo abajo de 20% (p/p) . Estos valores significativamente se incrementaron aproximadamente 150% cuando el contenido de glicerol se incrementó a 30% y 40% (p/p) . En 50% (p/p) de glicerol, los valores de alargamiento en el rompimiento disminuyeron no menor que 20%. La tendencia fue similar para aquella de la resistencia a la tensión excepto que el alargamiento del rompimiento más alto se obtuvo al 30%-40% (p/p) de glicerol antes que 20% (p/p) de glicerol con la resistencia a la tensión más alta. Para las películas de mezcla húmedas, el alargamiento en el rompimiento de las películas de 20% 20% (p/p) de glicerol fue aproximadamente 27%, significativamente más alto que aquel de las películas de 0% y 40% de glicerol (14% y 8%, respectivamente) (p<0.01, Figura 3B) . Por lo tanto, comparado con las películas de seda tratadas con metanol sin glicerol, las películas de mezcla de glicerol tuvieron ductilidad más alta en los estados tanto seco como húmedo, una propiedad útil para muchas aplicaciones.

La ductilidad de las películas de glicerol-seda también fue más grande que aquella de las películas de seda recocidas con agua, ya que las películas recocidas con agua exhibieron alargamiento de rompimiento de aproximadamente 6% (Jin y colaboradores, 2005), que es 25 veces menor que aquella de las películas de seda con 30% de glicerol presentadas en la presente. El contenido de agua libre también puede influenciar la flexibilidad de las películas de seda. Ka ahara y colaboradores, 2006. Las mezclas con glicerol pueden preservar el contenido de agua libre en las películas de seda y, por lo tanto, la flexibilidad de película mejorada. La función de glicerol en el contenido helicoidal de la fibroína de seda también puede desempeñar una función en el comportamiento mecánico de las películas. Cuando el contenido de glicerol se incrementó de 0% a 40% (p/p) , el módulo de tensión disminuyó aproximadamente 17 veces en las películas de mezcla secas, y aproximadamente 2.5 veces par alas películas de mezcla húmedas (Figuras 3C y 3D) . Aparentemente, con más glicerol en las mezclas las películas llegan a ser mecánicamente más débiles, y este efecto fue más pronunciado para las películas de mezcla secas. El módulo de tensión de películas de mezcla de fibroína de seda/glicerol secas fue más de 100 veces más alta que las películas agotadas de glicerol, de mezcla húmeda correspondientes de las cuales el glicerol se ha lixiviado.

Las nanoestructuras de la fibroína de seda en las películas de mezcla de seda se analizaron por la caracterización morfológica para estimar adicionalmente el impacto del glicerol sobre las propiedades de la película. Las películas se seda se fracturaron en el nitrógeno líquido y las secciones cruzadas de las películas se examinaron por SEM. La proteína de fibroína de seda formó nanoestructuras globulares con diámetros de 100 nm - 200 nm cuando el contenido de glicerol fue de 10% (p/p) (Figura 4A) . Los glóbulos, sin embargo, no se observaron cuando 20% (p/p) de glicerol se mezcló en la película: las películas de mezcla tienen morfologías relativamente lisas cuando se visualizan por SEM (Figura 4B) . Estos resultados indican que un alto contenido de glicerol (>20% p/p) influye en el autoensamble de la fibroína de seda y las características de nanoestructura . De manera interesante, cuando las películas de seda con 20% (p/p) de glicerol se trataron con agua para lixiviar el glicerol y luego se re-secaron en el aire, la fibroína de seda autoensamblada en nanofilamentos , similar a aquellos observados en las películas de seda pura tratados con metanol (Figura 4C y 4D) . Esta observación es consistente con las transiciones de estructura secundaria con la formación de estructura de ß-lámina en ambas de las películas de seda de glicerol tratadas con agua y tratadas con etanol (Figura 2B y 2C) . Por lo tanto, la formación de nanoestructuras en películas mezcladas con glicerol se correlacionó con las características estructurales en las películas, y fue probablemente influenciada por los cambios estructurales secundarios de la seda.

Las estructuras de nanofilamento de la seda que se han formado en las películas de 30% (p/p) de glicerol después del tratamiento con agua además se estudiaron por SEM (Figuras 5A, 5D) . Las estructuras de nanofilamento fueron más claramente visibles en más alto aumento (Figuras 5B y 5E) y e la vista lateral (Figura 5C) . En diferentes regiones de la película, se distinguieron morfologías y la organización de nanofilamentos se observó (comparar las Figuras 5A, 5B y 5D, 5E) , probablemente debido a las velocidades de secado no homogéneas durante el vaciado de la película de seda. El tamaño de los nanofilamentos, sin embargo, fue de manera consistente aproximadamente 10 nm - 20 nm por toda la película .

El contenido de glicerol en las películas de seda puede ser importante para controlar las transiciones estructurales secundarias de la seda e influenciar las propiedades mecánicas de las películas. Las moléculas de glicerol pueden interactuar con las cadenas de fibroína de seda por la via de fuerzas intermoleculares, mucho más probablemente enlaces de hidrógeno entre los grupos hidroxilo de glicerol y los grupos amida de la seda. Dai y colaboradores, 86 J. Appl. Polymer Sci. 2342-47 (2002). Esta interacción puede alterar el estado de hidratación hidrofóbico de las cadenas de la proteína, ya que estas son proteínas hidrofóbicas debido al alto contenido de repeticiones de glicina-alanina (Bini y colaboradores, 335 J. Mol. Biol. 27-40 (2004)), y por lo tanto induce el cambio estructural secundario de seda de las espirales aleatorias predominantes (estado de solución de seda o como película vaciada) a a-hélices (Figura 7) . Esta interacción puede estabilizar el estado helicoidal de la seda a menos que la película se haya tratado por solventes, tal como agua y metanol. El tratamiento con solvente, algunas moléculas de glicerol solubilizan de las películas y se difunden en el medio circundante, aunque las moléculas de glicerol herméticamente enlazadas probablemente permanecen asociadas con las cadenas de fibroína de seda, estabilizando las estructuras a-helicoidal de seda y preservando la flexibilidad de la película. Las moléculas de agua que reemplazan el glicerol lixiviado y forman uniones de hidrógeno más débiles con las moléculas de fibroína también podrían contribuir a mantener la estructura de la seda y las propiedades mecánicas. Cuando estas películas agotadas de glicerol se vuelven a secar, las interacciones intramoleculares fuertes entre las moléculas de seda pueden dominar, promoviendo una transición estructural de las a-hélices a las ß-láminas más termodinámicamente estables (Figura 7) . Tal proceso es similar al mecanismo previamente reportado de las transiciones estructurales de seda basado en el cambio del estado de hidratación hidrofóbico de las cadenas de proteína. Matsumoto y colaboradores, 110 J. Phys. Chem. B 21630-38 (2006) .

Aunque algunas de las interacciones del glicerol en la mecánica de la película de seda se han explorado (Kawahara y colaboradores, 291 Macromol. Mater. Eng. 458-62 (2006); Dai y colaboradores, 86 J. Appl. Polymer Sci. 2342-47 (2002)), la formulación particular e, importantemente, la función del glicerol en la presente invención es distinto de aquellas reportadas previamente. Por ejemplo, las propiedades de tensión de las películas de mezcla de seda/PVA se modificaron mediante la inclusión de hasta 8% de glicerol en la mezcla de seda/PVA. La resistencia a la tensión del alargamiento del rompimiento de las películas de seda/PVA son de aproximadamente 350 kg/cm3 y 10%, respectivamente. Cuando 5% de glicerol se mezcló con la película de PVA/seda para reducir la separación de fases, la resistencia a la tensión de la película resultante y el alargamiento en el rompimiento fueron 426 kg/cm2 y 53%, respectivamente. El incremento de las concentraciones de glicerol a >5%, sin embargo, redujo significativamente la Resistencia a la tensión de las películas de mezcla de seda/PVA. Dai y colaboradores, 2002. En contraste, en una modalidad de la presente invención, la incorporación de 30% de glicerol en la película de seda de fibroína significativamente mejoró tanto la resistencia a la tensión (a aproximadamente 12 MPa) y el alargamiento del rompimiento (150%), sin la incorporación de PVA.

En otro estudio, la solución de glicerol se utilizó como un post-tratamiento de la película de seda pura para convertir la estructura de seda de la seda I a seda II (estructura de ß-lámina) . Más específicamente, la película de seda de sumergió en solución de glicerol al 10% se calentó a 95°C, y se secó en 50% de humedad relativa. Aunque la película empapada con glicerol se sometió a la autoexpansión después del tratamiento de empapamiento, su ductibilidad no se estimó. Kawahara y colaboradores, 2006. En contraste, en algunas modalidades de la presente invención, la solución de fibroína de seda se mezcla con glicerol y se vacía en películas altamente dúctiles, como es demostrado por la resistencia a la tensión mejorada y el alargamiento del rompimiento de las películas de seda que contienen aproximadamente 10% a 50% de glicerol.

Las películas de seda mezcladas de glicerol presentadas en la presente muestran características únicas de transiciones de estructuras diversas y controlables, propiedades mecánicas deseadas, y facilidad de fabricación (vaciado de películas de una etapa sin tratamientos adicionales) . Estas características sugieren que estas películas tienen utilidad en aplicaciones biomédicas.

La presente invención así proporciona métodos para preparar películas de seda con resistencia a la tensión y ductilidad incrementadas. Los métodos comprenden mezclar una solución de fibroína de seda con glicerol, donde la concentración de glicerol en la solución de mezcla de fibroína de seda/glicerol es de aproximadamente 10% a 50% (p/p) ; variar la solución de mezcla de fibroína de seda/glicerol de una superficie de soporte de película; y secar la película. Este proceso simple confiere a las películas de seda de la presente invención con resistencia a la tensión y ductilidad diseñables, dependiendo de la concentración de glicerol, ofreciendo una alternativa a las películas de seda preparadas con solución de fibroína de seda en la ausencia de glicerol. Además, las películas de mezcla de seda comprenden otros biopolímeros, tal como PVA y PEO, también se pueden modificar mediante glicerol para aumentar la flexibilidad o ductilidad de la película de mezcla de seda/biopolímero, empleando el mismo proceso, como es descrito en lo anterior.

Adicionalmente, las mezclas de glicerol seda de la presente invención se pueden combinar con otras estructuras basadas en seda para formar estructuras de seda tridimensionales, esponjas de seda u otras estructuras compuestas de seda que tienen estructuras tridimensionales para aplicaciones tales como sistemas de suministro de fármaco, materiales diseñados de tejido o por dispositivos biomédicos. Por ejemplo, la película de seda dúctil de la presente invención se puede combinar con nanoesferas o microesferas de fibroína de seda que llevan un agente activo para proporcionar liberaciones sostenida en el agente activo. Como otro ejemplo, el compuesto basado en fibra de seda que comprende fibras de seda opcionalmente recubiertas con solución de fibroína de seda o gel de seda se pueden combinar con la película de seda dúctil en la presente invención para proporcionar materiales fibrosos flexibles para el uso como fibra óptica o fibras musculares. El glicerol se puede mezclar fácilmente con cualquier compuesto de seda para alterar las propiedades mecánicas de la estructura basada en seda. Alternativamente, el compuesto basado en seda se pueden volver o conformar con una película de seda/glicerol dúctil alrededor del contorno de la estructura basada en seda. Todos los compuestos de seda descritos en la presente pueden ser fácilmente funcionalizados con fármacos, antibióticos, moléculas de respuestas celulares, tintes, enzimas y otras moléculas pequeñas y grandes, con retención de la función.

Con la flexibilidad mejorada de la película de seda o la película de mezcla de seda por la modificación con glicerol, los procesos de la presente invención se pueden utilizar para modificar la variedad de películas de mezcla de seda o recubrimientos en una variedad de aplicaciones médicas tales como sistema de cierre de heridas, incluyendo dispositivos de reparación de heridas vasculares, apositos hemostáticos, esponjas, parches y pegamentos, suturas, suministro de fármaco (WO 2005/123114), sensor de biopolímero (WO 2008/127402), y en aplicaciones de diseño de tejido, tal como, por ejemplo, órganos diseñados de tejido u otra implantación biodegradable en el cuerpo humano (WO2004/0000915; WO2008/106485) . La flexibilidad mejorada de la película de seda es ventajosa ya que pueden proporcionar expansibilidad flexible o contractibilidad al material biomédico como es requerido por algunas aplicaciones tales como materiales de aposito funcionales o materiales de tejido tal como el tejido muscular. Por ejemplo, una película de seda dúctil de la presente invención puede conformada alrededor de una estructura (tal como un implante) . La película de seda puede comprender agentes activos adicionales seleccionados para adicionar al propósito del dispositivo, tal como agentes promovedores de tejido o hueso en un dispositivo dental. Adicionalmente, una vez que la película dúctil se ha conformado a la estructura, el glicerol puede ser removido mediante lixiviación como es descrito en la presente .

Las películas de mezcla de fibroína de seda/glicerol de la presente invención también proporcionan una plataforma adecuada para la unión y proliferación de fibroblastos. Debido a las propiedades mecánicas modificadas y potencialmente útiles para estas películas de mezcla de seda, la utilidad potencial de tales biomateriales en el cultivo de células y tejido es importante de estimar. Así, en estudios preliminares, la unión y proliferación de células de fibroblasto en películas de 30% (p/p) de glicerol-seda se compararon con las películas de seda pura tratadas con etanol y plástico de cultivo de tejido (TCP) como controles. La unión de célula inicial (3 horas) en todas las tres superficies fue similar (primera hilera en la Figura 6A) y como es cuantificado por el manchado de Azul de Alamar (Figura 6B) . La proliferación celular en catorce días de cultivo, sin embargo, fue diferente sobre las diferentes superficies. Después de cuatro días de cultivo, los fibroblastos sobre TCP crecen más rápido que aquellos en películas de seda puras y películas de seda de mezcla, una observación consistente con los estudios previos en las películas de seda puras (Sofía y colaboradores, 54 J. Biomed. ater. Res. 139-48 (2001); Wang y colaboradores, 29 Biomats. 894-903 (2008) . Después de catorce días de cultivo, el número de células de TCP fue aproximadamente 1.8 veces más que aquel en las películas de seda, y no hubo diferencia significante entre las películas de seda puras y las películas de seda mezcladas, como es determinado por el manchado de Azul de Alamar (Figura 6C) . La película de seda de 30% (p/p) de glicerol solamente difirieron de la película de seda tratada con metanol para la proliferación de fibroblastos en el período de tiempo de seis días a once días, en la cual las células crecieron más rápido en la película tratada con metanol que la película de glicerol (p<0.01, Figura 6C) . Las películas de seda modificadas con RGD exhiben excelentes propiedades de superficie para promover la unión rápida y la proliferación de fibroblastos, células similares a osteoblasto, y células madre mesenquimales derivadas de médula ósea humana Chen y colaboradores, 67 J. Biomed. Mater. Res. A, 559-70 (2003). Así, estrategias similares podrían ser empleadas con las películas de mezcla de seda-glicerol.

Las modalidades de la presente invención así proporcionan película de seda/glicerol que puede ser adecuada para construcciones diseñadas de tejido que pueden ser utilizada para reparación de órgano, reemplazo órgano o estrategias de regeneración que pueden beneficiarse de estos materiales de seda modificados. Una construcción diseñada de tejido que comprende material de mezcla de fibroína de seda/glicerol y opcionalmente por lo menos un agente bioactivo tal como una célula, se puede utilizar para la reparación de órgano, reemplazo de órgano o estrategias de regeneración incluyendo pero no limitadas a, el disco espinal, tejido craneal, dura, tejido nervioso, hígado, páncreas, riñon, vejiga, bazo, músculo cardiaco, músculo esquelético, tendones, ligamentos, tejidos de la córnea y tejido respiratorio. Cualquier tipo de células se puede adicionar a la construcción diseñada de tejido para el cultivo y la implantación posible, incluyendo células de los sistemas musculares y esqueléticos, tales como condrocitos, fibroblastos, células musculares y osteocitos, células paranquímales tales como hepatocitos, células pancreáticas (incluyendo células de Isleta), células de origen intestinal, y otras células tales como células nerviosas, células de médula ósea, células de la piel, células pluripotentes y células madre (incluyendo, por ejemplo, células madre embriónicas, células adultas y células madre pluripotentes inducidas) y combinaciones de los mismos, ya sea como es obtenido de donadores, de líneas de cultivo celular establecidas, o aun antes o después de la ingeniería genética molecular. Piezas de tejido también se pueden utilizar, que pueden proporcionar un número de diferentes tipos de célula en una sola estructura.

Alternativamente, la película de seda/glicerol flexible también se puede utilizar como recubrimientos sobre materiales biomédicos tal como dispositivo médico, materiales diseñados de tejido e implantes. Como es discutido en lo anterior, la flexibilidad mejorada de la película de seda modificada con glicerol puede proporcionar expansibilidad flexible y contractibilidad para corresponder a las propiedades contractibles del material biomédico, como es requerido por algunas aplicaciones como materiales de apositos funcionales o tejidos tal como un tejido muscular. Debido a que la película de seda modificada está menos propensa a romperse en el alargamiento, contracción, estiramiento de formación, el recubrimiento de tal película proporcionará compatibilidad mejorada y se conformará bien a los contornos del sustrato. Los sustratos o artículos para recubrimiento de la película de seda modificada puede incluir cualquier número de tejidos, tejido regenerado, dispositivo médico, implante médico, dispositivo veterinario' o implante veterinario. Por ejemplo, una película de seda/glicerol dúctil se puede envolver alrededor de un dispositivo o implante, tales como jaulas espinales, stents coronarios, implantes dentales o prótesis de cadera y rodilla.

Como es mencionado, la película de mezcla de seda/glicerol se puede modificar para contener por lo menos un agente activo. El agente se puede administrar con una solución de fibroína de seda antes de la formación de la película de mezcla de seda, o cargar en la película de mezcla de seda después de que se forma. La mayoría de agentes activos que se pueden utilizar en conjunción con la película de mezcla de seda en la presente invención es vasta. Por ejemplo, el agente activo puede ser un agente terapéutico o material biológico, tales como células, incluyendo células madre) , proteínas, péptidos, ácidos nucleicos (DNA, RNA, siRNA) , análogos de ácido nucleico, nucleótidos, oligonucleótidos o secuencias, ácidos nucleicos de péptido, aptámeros, anticuerpos, hormonas, antagonistas de hormona, factores de crecimiento o factores de crecimiento recombinantes y fragmentos y variantes de los mismos, citoquinas, o enzimas, antibióticos, virus, antivirales, toxinas, profármacos, agentes quimioterapéuticos, moléculas pequeñas, fármacos y combinaciones de los mismos. El agente activo ejemplar adecuado para modificar la película de mezcla de seda de la presente invención incluyen células (incluyendo células madre) , eritropoyetina (EPO) , péptidos YIGSR, glicosaminoglicanos (GAGs), ácido hialurónico (HA), integrinas, selectinas y cadherinas; analgésicos y combinaciones de analgésicos; esferoides/ antibióticos; insoluna; interferonas o¡ y ?; interleucinas ; adenosinas; agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, agentes anticáncer); factores a y ß de necrosis de tumor; anticuerpos, mediadores de unión celular, tal como RGD o integrinas, u otras proteínas naturalmente derivadas o genéticamente diseñadas, polisacáridos , lipoproteínas, citotoxinas, profármacos, inmunógenos o lipoproteínas.

Uno o más agentes activos se pueden utilizar para modificar la película de mezcla de seda/glicerol . Por ejemplo, cuando se utiliza la película de mezcla deseada de la presente invención como una plataforma para soporte de material biológico tales como células, puede ser deseable adicionar otros materiales para promover el crecimiento del agente, promover la funcionalidad del agente después de que se libera de la película de mezcla de seda, o incrementar la habilidad del agente para sobrevivir o retener su eficacia durante el período de procesamiento. Materiales y ejemplares conocidos para promover el crecimiento celular incluyen, pero no está limitados a, medio de crecimiento de células, tal como el Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) , suero bovino fetal (FBS) , aminoácidos no esenciales y antibióticos, y factores de crecimiento morfogénicos tal como el factor de crecimiento de fibroblasto (por ejemplo, FGF 1-9), factores de crecimiento de transformación (TGFs) , factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) , factor de crecimiento similar a insulina (IGF-I e IGF-II), factores de crecimiento morfogenéticos de hueso (por ejemplo, B Ps 1-7), proteínas similares a morfogenéticas de hueso (por ejemplo, GFD-5, GFD-7, y GFD-8), factores de crecimiento de transformación (por ejemplo, TGF-a, TGF-ß I-III), factor de crecimiento de nervios y proteínas relacionadas. Factores de crecimiento son conocidos en la técnica, ver, por ejemplo, Rosen & Thies, CELLULAR & MOL. BASIS BONE FORMATION & REPAIR (R. G. Landes Co . ) . Material adicional que es incrustado en la película de seda/glicerol puede incluir DNA, siRNA, antisentido, plásmidos, liposomas y sistemas relacionados para el suministro de materiales genéticos; péptidos y proteínas para activar las cascadas de señalización celular; péptidos y proteínas para promover la minerali zación o eventos relacionados de las células; péptidos de adhesión y proteínas para mejorar las interfaces de película-tejido; péptidos antimicrobianos; y proteínas y compuestos relacionados.

La incrustación de un agente bioactivo en la película producida de la mezcla de seda/glicerol permite el suministro de agentes activos de una manera liberada controlada. El mantenimiento del agente bioactivo en una forma activa por todo el proceso de incrustación del agente en la seda le permite se activo en la liberación de la película de seda. La liberación controlada del agente activo permite al agente activo sea liberado sosteniblemente a través del tiempo, con cinética de liberación controlada. En algunos casos, el agente bioactivo se suministra continuamente al sitio donde se necesita el tratamiento, por ejemplo, durante varias semanas. La liberación controlada a través del tiempo, por ejemplo, durante varios días o semanas, o más tiempo, permite el suministro continuo del agente bioactivo para obtener tratamiento preferidos. El vehículo de suministro controlado es ventajoso debido a que protege al agente bioactivo de la degradación in vivo en los fluidos corporales del tejido, por ejemplo, por las proteasas.

La liberación controlada del agente activo de la película de seda se puede diseñar para ocurrir a través del tiempo, por ejemplo, durante 12 horas o '24 horas. El tiempo de liberación puede ser seleccionado, por ejemplo, para ocurrir durante un período de tiempo de aproximadamente 12 horas a 24 horas; aproximadamente 12 horas a 42 horas; o, por ejemplo, aproximadamente 12 a 72 horas. En otra modalidad, la liberación puede ocurrir, por ejemplo, en el orden de aproximadamente 1 día a 15 días. El tiempo de liberación controlado se puede seleccionar basado en la condición tratada. Por ejemplo, tiempos más largos pueden ser más efectivos para la sanación de heridas, mientras que tiempo de suministro más cortos pueden ser más útiles para algunas aplicaciones cardiovasculares.

La liberación controlada del agente activo de la película de seda in vivo puede ocurrir, por ejemplo, en la cantidad de aproximadamente 1 ng a 1 mg/día. En otras modalidades, la liberación controlada puede ocurrir, en la cantidad de aproximadamente 50 ng a 500 ng/día, o, en otra modalidad, en la cantidad de aproximadamente 100 ng/día. Los sistemas de suministro que comprende el agente terapéutico y un portador se pueden formular de modo que incluyen, por ejemplo, 10 ng a 1 mg de agente terapéutico, o aproximadamente 1 g a 500 µg, o, por ejemplo, aproximadamente 10 µg a 100 \iq, dependiendo de la aplicación terapéutica .

La película producida de la mezcla de seda/glicerol de la presente invención también se puede configurar en la superficie para la aplicación del dispositivo bióptico. La técnica de configuración de superficie es conocida en la técnica, por ejemplo, la impresión por chorro de tinta de configuraciones, configuraciones de nanolitografía de pluma de rocío, impresión de microcontacto o técnicas litográficas suaves. Ver ilran y colaboradores, 98 P.N. A. S. 13660-64 (2001); Bettinger y colaboradores, 19 Adv. Mat . 2847-50 (2007). También ver PCT/US/07/83620; PCT/US2008/082487. La configuración topográfica sobre la superficie de la película de seda combinada con la claridad transparente óptica de la película de seda pueden proporcionar características de superficie de alta resolución que no son solamente adecuadas para el dispositivo bi-óptico tal como un injerto óptico, un lente, un arreglo de microlente (WO 08/127404), sino también adecuado para la construcción diseñada de tejido debido a su habilidad para dirigir la función celular de la reposición de matriz tal como la alineación y proliferación de tejido (WO 08/106485) .

Por consiguiente, modalidades particulares descritas en la presente proporcionan películas de células modificadas con glicerol que son útiles para dispositivos numéricos oculares y diseño de tejido ocular. Por ejemplo, en la aplicación en el diseño de tejido de la córnea, la superficie de la película de seda soporta la unión y proliferación de fibroblasto de la córnea. La configuración de superficie opcional de las películas de seda modificadas proporciona guía adicional a la alineación de la célula. La película de seda modificada con glicerol se puede utilizar para la reparación o tejido de la córnea in vivo o de regeneración de tejido de la córnea in vitro para la implantación subsecuente. Debido a su naturaleza blanda y flexible, la película de seda modificada por glicerol utilizando un método de la presente invención proporciona comodidad mejorada y compatibilidad al paciente en necesidad de tal implantación de tejido. Aplicaciones ejemplares adicionales de la película de seda modificada y el dispositivo biomédicos oculares incluyen, pero no están limitados a, fabricación de lentes de contacto blandos, lentes intraoculares, implantes de filtración de glaucoma, queratoprotesis , bucles esclerales y agentes de reemplazo viscoelásticos .

Otra aplicación de la película de seda modificada con glicerol en la presente invención es fabricar el dispositivo óptico flexible. Como es mencionado, la superficie de película de seda además puede ser configurada con características de alta resolución. Utilizando las películas de seda modificadas con glicerol de la presente invención, una etiqueta holográfica expansible, flexible, se puede proporcionar que es fácilmente alargada, estirada o deformada para corresponder al control de la superficie del producto en necesidad de, por ejemplo, una etiqueta. Por ejemplo, la película de seda puede ser nanoconfigurada con microrelieve de difracción de alta resolución para conferir una imagen holográfica, proporcionando de esta manera una etiqueta de identificación de producto holográfico comestible que fácilmente se conforma a una cápsula, tableta o producto alimenticio. Ver PCT/US09/47751.

Como es mencionado en la presente, las películas de seda modificadas con glicerol son comestibles. Los agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes de endulzamiento, saborizantes y perfumantes, conservadores y antioxidantes también pueden estar presentes en la película de seda o formulación que comprende la película de seda. Por ejemplo, una formulación de película de seda de sabor o formulación recubierta con película de seda de sabor de vitaminas, nutracéuticos, u otros farmacéuticos se pueden producir para uso pediátrico.

En resumen, las películas de seda mezcladas con glicerol (>10% p/p) son aparentemente enriquecidas en la estructura a-helicoidal, con transiciones adicionales a las estructuras de ß-lámina cristalinas en la remoción del glicerol por metanol o tratamientos con agua y re-secado de la película. Las películas de seda/glicerol ricas en la estructura de ß-lámina estuvieron compuestas de nano-filamentos característicos, mientras que aquellas ricas en la estructura -helicoidal no exhibieron estas morfologías. Las películas de mezcla, en ya sea los estados como es vaciado o agotado de glicerol, fueron más dúctiles que las películas de fibroína de seda puras tanto tratadas con etanol, como recocidas con agua, aunque fueron menos resistentes a la deformación por estiramiento. Ambas películas de seda mezcladas con glicerol (30% p/p) y tratadas con metanol soportaron la unión y crecimiento de fibroblasto. Mecanísticamente, la función del glicerol parece que imita aquella del agua en controlar las transiciones estructurales de las cadenas de fibroína de seda, proporcionando un punto de control nuevo y útil en regular la estructura y así las propiedades de material de los biomateriales basados en seda.

Asi, las modalidades de la presente invención proporcionan una película de seda que comprende una fibroína de seda y aproximadamente 10% (p/p) a aproximadamente 50% (p/p) de glicerol. Esta película de seda puede comprender aproximadamente 20% (p/p) a aproximadamente 40% (p/p) , o aproximadamente 30% (p/p) .

Adicionalmente, la película de seda puede incluir por lo menos un agente activo. El agente activo pueden ser células, proteínas, péptidos, análogos de ácido nucleico, nucleótidos u oligonucleótidos, ácidos nucleicos de péptido, aptámeros, anticuerpos o fragmentos o porciones de los mismos, hormonas, antagonistas de hormona, factores de crecimiento, factores de crecimiento recombinantes y fragmentos y variantes de los mismos, citoquinas, enzimas, compuestos antibióticos o antimicrobianos, virus, antivirales, toxinas, profármacos, agentes quimioterapéuticos, moléculas pequeñas o fármacos, o combinaciones de los mismos. En una modalidad particular, el agente activo es una célula. La célula puede ser seleccionada de hepatocitos, células de islote pancreático, ibroblastos, condrocitos, osteoblastos, células exocrinas, células de origen intestinal, células de ducto biliar, células paratiroides , células tiroides, células del eje adrenal-hipotalámico-pituitaria, células de músculo cardiaco, células epiteliales de riñon, células tubulares de riñon, células de membrana de basamento de riñon, células nerviosas, células de vaso sanguíneo, células que forman hueso y cartílago, células musculares lisas, células musculoesqueléticas, células osculares, células integumentales , células de médula ósea, queratinocitos , células pluripotentes, células madre pluripotentes inducidas, células madre adultas o células madre embriónicas, o combinaciones de los mismos.

La película de seda también puede incluir microesferas de seda o nanoesferas de seda incrustadas en la película de seda. La película de seda puede ser película que están en capas o plegada en una esponja o bloque. Las películas de seda también proporcionan construcciones para el diséño de tejido. En particular, la construcción diseñada de tejido puede ser una construcción de tejido de la córnea en la cual la célula es un fibroblasto de la córnea. En algunas modalidades, la película de seda además puede comprender un medio de crecimiento celular.

Las películas de seda de la presente invención también pueden incluir una configuración sobre la película de seda, tal como una configuración óptica, en particular una imagen holográfica.

Las modalidades de la presente invención también proporcionan un método para preparar una película de seda, que comprende mezclar una solución de fibroína de seda con glicerol, en donde la concentración de glicerol en la solución de mezcla de fibroína de seda/glicerol . es aproximadamente 10% a aproximadamente 50% (p/p) , vaciar la solución de mezcla de fibroína de seda/glicerol sobre una superficie de soporte de película, y secar la película de seda. El método también puede incluir etapas adicionales para sumergir la película de seda en un líquido en el cual el glicerol se disuelve durante un período de tiempo para eliminar el glicerol de la película de seda; y secar la película eliminada de glicerol. El método además puede comprender el recocido de la película, por ejemplo, al tratar la película con metanol o vapor de agua.

Las presentes modalidades también proporcionan un método para cubrir una superficie de un sustrato con la composición de seda al proporcionar un sustrato de soporte de película; y cubrir el sustrato de soporte de película con una película de mezcla de fibroína de seda/glicerol que comprende de aproximadamente 10% a 50% de glicerol (p/p) . La película de mezcla de fibroína de seda/glicerol además puede comprender por lo menos un biopolímero, tal como PVA o PEO. La película de mezcla de fibroína de seda/glicerol además puede comprender por lo menos un agente activo.

Otra modalidad de la invención es un sustrato cubierto con película de seda preparada de acuerdo con un método para cubrir una superficie de un sustrato con una composición de seda al proporcionar un sustrato de soporte de película; y cubrir el sustrato de soporte de película con una película de mezcla de fibroína de seda/glicerol que comprende aproximadamente 10% a 50% de glicerol (p/p) · El sustrato puede ser un tejido, tejido regenerado, dispositivo médico, implante médico, dispositivo veterinario o implante veterinario, tal como un implante dental. El sustrato también puede ser un compuesto basado en seda.

Otra modalidad de la presente invención es un método para incrustar por lo menos un agente activo en una película de seda, que comprende mezclar una solución de fibroína de seda con por lo menos un agente activo y glicerol, en donde la concentración de glicerol en la solución de mezcla de seda es aproximadamente 10% a 50% (p/p) ; vaciar la solución de mezcla de seda sobre una superficie de soporte de película; y secar la película. En este método, el agente activo pueden ser células, proteínas, péptidos, análogos de ácido nucleico, nucleótidos u oligonucleótidos, ácidos nucleicos de péptido, aptámeros, anticuerpos o fragmentos o porciones de los mismos, hormonas, antagonistas de hormona, factores de crecimiento o factores de crecimiento recombinantes y fragmentos y variantes de los mismos, citoquinas, enzimas, antibióticos o compuestos antimicrobianos, virus, antivirales, toxinas, profármacos, agentes quimioterapéuticos, moléculas pequeñas, fármacos o combinaciones de los mismos. Este método también puede incluir adicionalmente las etapas de sumergir la película de seda en un líquido en el cual el glicerol se disuelve durante un período de tiempo para eliminar el glicerol de la película de seda; y secar la película eliminada de glicerol. El método también puede incluir la etapa adicional de recocer la película .

En algunas modalidades de la presente invención se pueden definir en cualquiera de los siguientes párrafos numerados: 1. Una película de seda que comprende fibroína de seda y aproximadamente 10% (p/p) a aproximadamente 50% (p/p) de glicerol. 2. La película de seda del párrafo 1, en donde el contenido de glicerol de la película de seda es aproximadamente 20% (p/p) a aproximadamente 40% (p/p) . 3. La película de seda de cualquiera de los párrafos 1 a 2, donde el contenido de glicerol de la película de seda es aproximadamente 30% (p/p) · 4. La película de seda de cualquiera de los párrafos 1 a 3, que además comprende por lo menos un agente activo. 5. La película de seda de cualquiera de los párrafos 1 a 4, que además comprende microesferas de seda o nanoesferas de seda incrustadas en la película de seda. 6. La película de seda de cualquiera de los párrafos 1 a 5, en donde la película está en capas o plegada en una esponja o bloque . 7. La película de seda de cualquiera de los párrafos 1 a 6, en donde el por lo menos un agente activo se selecciona del grupo que consiste de células, proteínas, péptidos, análogos de ácido nucleico, nucleótidos u oligonucleótidos, ácidos nucleicos de péptido, aptámeros, anticuerpos o fragmentos o porciones de los mismos, hormonas, antagonistas de hormona, factores de crecimiento, factores de crecimiento recombinantes y fragmentos y variantes de los mismos, citoquinas, enzimas, antibióticos, o compuestos antimicrobianos, virus, antivirales, toxinas, profármacos, agentes quimioterapéuticos , moléculas pequeñas, fármacos y combinaciones de los mismos. 8. Una construcción para diseño de tejido que comprende la película de seda de cualquiera de los párrafos 1 a 7, en donde por lo menos un agente activo es una célula. 9. La construcción para diseño de tejido del párrafo 8, en donde la célula se selecciona del grupo que consiste de hepatocitos, células de islote pancreático, fibroblastos, condrocitos, osteoblastos, células exocrinas, células de origen intestinal, células de conducto biliar, células paratiroides, células tiroides, células del eje adrenal-hipotalámico-pituitaria, células de músculo cardiaco, células epiteliales de riñon, células tubulares de riñon, células de membrana de basamento de riñon, células nerviosas, células de vaso sanguíneo, células que forman hueso y cartílago, células de músculo liso, células de músculo esquelético, células osculares, células integumentarias, células de médula ósea, queratinocitos , células madre pluripotentes , células madre pluripotentes inducidas, células madre adultas, células madre embriónicas, y combinaciones de los mismos. 10. La construcción para el diseño de tejido del párrafo 9, en donde la construcción diseñada de tejido es una construcción de tejido de córnea y la célula es fibroblasto de córnea. 11. La construcción para el diseño de tejido de cualquiera de los párrafos 8 a 10, que además comprende un medio de crecimiento celular. 12. La película de seda de cualquiera de los párrafos 1 a 7, que además comprende una configuración óptica sobre la película de seda. 13. La película de seda del párrafo 12, en donde la configuración óptica es una imagen holográfica. 14. Un método para preparar una película de seda, que comprende : mezclar una solución de fibroína de seda con glicerol, en donde la concentración de glicerol en la solución de mezcla de fibroína de seda/glicerol es aproximadamente 10% a aproximadamente 50% (p/p) / vaciar la solución de mezcla de fibroina de seda/glicerol sobre una superficie de soporte de película; y secar la película de seda. 15. El método del párrafo 14, que además comprende las etapas de sumergir la película de seda en un líquido en el cual el glicerol se disuelve durante un período de tiempo para eliminar el glicerol de la película de seda; y secar la película eliminada de glicerol. 16. El método de los párrafos 14 o 15, que además comprende el recocido de la película. 17. Un método para cubrir una superficie de un sustrato con una composición de seda que comprende: proporcionar un sustrato de soporte de película; y cubrir el sustrato de soporte de película con una película de mezcla de fibroina de seda/glicerol que comprende de aproximadamente 10% a 50% de glicerol (p/p) . 18. El método del párrafo 17, en donde la película de mezcla de fibroina de seda/glicerol además comprende por lo menos un biopolímero . 19. El método del párrafo 18, en donde el biopolímero es PVA o PEO. 20. El método del párrafo 19, en donde la película de mezcla de fibroina de seda/glicerol además comprende por lo menos un agente activo. 21. Un sustrato cubierto de película de seda de acuerdo con el método de los párrafos 17-20. 22. El sustrato cubierto con película de seda del párrafo 21, en donde el sustrato es un tejido, tejido regenerado, dispositivo médico, implante médico, dispositivo veterinario o implante veterinario. 23. El sustrato cubierto con película de seda de los párrafos 20 o 22, en donde el sustrato es un compuesto basado en seda. 24. Un método para incrustar por lo menos un agente activo en una película de seda, que comprende: mezclar una solución de fibroína de seda con por lo menos un agente activo y glicerol, en donde la concentración de glicerol en la solución de mezcla de seda es de aproximadamente 10% a 50% (p/p) ; vaciar la solución de mezcla de seda sobre una superficie de soporte de película; y secar la película. 25. El método del párrafo 24, en donde por lo menos un agente activo se selecciona del grupo que consiste de células, proteínas, péptidos, análogos de ácido nucleico, nucleótidos u oligonucleótidos, ácidos nucleicos de péptido, aptámeros, anticuerpos o fragmentos o porciones de los mismos, hormonas, antagonistas de hormona, factor de crecimiento, factor de crecimiento recombinantes y fragmentos y variantes de los mismos, citoquinas, enzimas, antibióticos o compuestos antimicrobianos, virus, antivirales, toxinas, profármacos, agentes quimioterapéuticos, moléculas pequeñas, fármacos y combinaciones de los mismos. 26. El método del párrafo 24 o 25, que además comprende las etapas de sumergir la película de seda en un líquido en el cual el glicerol se disuelve durante un período de tiempo para eliminar el desorden de la película de seda; y secar la película eliminada de glicerol. 27. el método de cualquiera de los párrafos 24 a 26, que además comprende recocer la película.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Purificación de fibroína de seda.

Soluciones de extracto acuoso de fibroína de seda se prepararon como es descrito previamente. Sofía y colaboradores, 54 J. Biomed. Mater. Res. 139-48 (2001) . Brevemente, capullos de Bombyx mori se hirvieron durante 20 min en una solución acuosa de carbonato de sodio 0.02 M, y luego se enjuagaron completamente con agua pura. Después del secado, la fibroína de seda extraída se disolvió en una solución de LiBr 9.3 M a 60°C durante 4 hr, produciendo una solución al 20% (p/v) . Esta solución se dializó contra agua destilada utilizando casetes de diálisis SLIDE-A-LYZER® Dialysis Cassettes, 3,500 MWCO (Pierce, Rockford, IL) durante 3 días para remover la sal. La solución fue ópticamente clara después de la diálisis y se centrifugó para remover las pequeñas cantidades agregados de seda que se formaron durante el proceso, usualmente de contaminantes ambientales que están presentes en los capullos. La concentración final de la solución acuosa de fibroína de seda fue aproximadamente 6% (p/v) . Esta concentración se determinó al pesar el sólido residual de un volumen conocido de solución después del secado .

La solución de fibroína de seda al 6% se almacenó a 4°C antes del uso y se puede diluir a una concentración menor con agua ultrapura. Para obtener una solución de fibroína de seda con una concentración más alta, la solución de fibroína de seda al 6% se puede dializar contra un polímero higroscópico, tal como polietilenglicol (PEG), amilasa o sericina. Por ejemplo, una solución de fibroína de seda al 6% se puede exponer a 25%-50%% en peso de PEG (MW 8,000 a 10,000) de solución en el exterior de un Cásete de Diálisis SLI DE-A-LYZER® 3,500 MWCO 2 a 12 hr mediante presión osmótica, y la concentración final de la solución se reposa se concentró entre 8%-30%% en peso o más grande.

Ejemplo 2 Preparación de películas de mezcla de seda/glicerol La solución de fibroína de seda purificada se mezcló con glicerol en relaciones en peso de 0%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% (p/p) · Las soluciones mezcladas se vaciaron en cajas petri y se secaron a temperatura ambiente en una campana de flujo laminar durante la noche. A menos que se establezca de otra manera, la ^película de mezcla seca' se refiere a las películas preparadas por el vaciado directo y el secado durante la noche, y las 'películas de mezcla húmeda' se refiere a las mismas películas vaciadas y secadas de las cuales el glicerol se extrae subsecuentemente en agua extrapura a 37 °C durante 1 hr, después de lo cual las películas se secan nuevamente en el aire. Para variables adicionales en los grupos de tratamiento, se utilizaron tratamientos con metanol, y en estos casos las películas (con y sin glicerol) se sumergieron en metanol al 90% (v/v) durante 1 hr y luego se secaron con aire.

Ejemplo 3. Disolución de películas de seda/glicerol Las películas de mezcla se cortaron en cuadros de aproximadamente 5 mm x 5 mm, y un cuadro de película se pesó se sumergió en agua pura en un tubo de 2 mi a una concentración de 1% (peso de película/volumen de agua) y se mantuvo a 37 °C durante 1 hr o 1 día. Después de la incubación, las películas de seda se removieron de la solución, se secaron con aire durante la noche, se pesaron y se compararon con la masa de película original para obtener la masa residual (%) . La solución restante se sometió a la medición de absorbencia de UV en 280 nm. Los valores de absorbencia se convirtieron a la cantidad de seda solubilizada en agua utilizando la solución de fibroína de seda purificada en varias concentraciones como estándares. La cantidad de seda disuelta luego se comparó con las masas de seda total en la película para obtener el porcentaje de la seda disuelta de película en agua.

Ejemplo 4. Análisis de películas de seda/glicerol mediante la espectroscopia Infrarroja Transformada de Fourier (FTIR) Las estructuras secundarias presentes en las películas, incluyendo la espiral aleatoria, alfa-hélices, láminas y vueltas de beta-placa se evaluaron utilizando la Auto Deconvolución de Fourier (FSD) de los espectros de absorbencia infrarroja. El análisis de FTIR de muestras tratadas se realizó con un espectrómetro Bruker Equinox 55/S FTIR (Bruker Optics Inc., Billerica, MA) , equipado con un detector de sulfato de triglicina deuterado y una reflexión múltiple, unión ATR IRacle® horizontal con un cristal de Germanio (Ge) de Pike Tech. ( adison, I) . Una película de seda en forma de cuadro de 5 mm x 5 mm se colocó en la celda de cristal de Ge y se examinó con el microscopio de FTIR en el modo de reflexión. Las mediciones de fondo se tomaron con una celda vacía y se sustrajeron de la lectura de muestra. Para cada medición, sesenta y cuatro exploraciones se registraron con una resolución de 4 crrf1, y el número de onda varió de 400 m"1 a 4000 crrf1.

El FSD de los espectros infrarrojos que cubren la región de amida I (1595 cm_1-1705 cnf1) se realizó mediante el software Opus 5.0 (Opus Software, Inc., San Francisco, CA) como es descrito previamente Hu y colaboradores, 39 Macromolecules, 6161-70 (2006) . Las bandas de absorción en el intervalo de frecuencia 1616 cm-1-1637 cm"1 y 1695 cm_1-1705 cm"1 representaron la estructura de ß-lámina enriquecida; las bandas en el intervalo 1638 cm-1-1655 cm-1 fueron adscritas a la estructura de espiral aleatoria; las bandas en el intervalo 1656 cm_1-1663 cm"1 adscritos a las alfa-hélices; y las bandas en el intervalo 1663 cm_1-1695 cm-1 a las vueltas. Id.

Ejemplo 5. Propiedades mecánicas de las películas de seda/glicerol Las pruebas de tensión se realizaron en una estructura de prueba Instron 3366 equipada con una celda de carga de capacidad de 10 N y el sistema de prueba BIOPULS™ (Instron®, Norwood, MA) , incluyendo abrazaderas neumáticas sumergibles y el baño líquido controlado en temperatura. Muestras de películas se vaciaron en moldes de silicona basado en el estándar D638-02a ASTM y se escalaron hacia arriba 2x, dando por resultado una longitud total de 80 mm para ajustar la superficie grandes necesarias para la sujeción y la longitud de calibre necesaria para la extensometría de video (28 mm) . Para un ambiente seco, las películas se acondicionaron en una cámara ambiental a 25°C y 50% de humedad relativa durante dos días. Para un ambiente húmedo, las muestras de película de seda/glicerol se hidrataron en solución salina regulada de fosfato 0.1 M (PBS) durante 1 hr, y luego se sumergieron en un baño BIOPULS™ (37±0.3°C) llenado con PBS durante al menos 5 min antes de la prueba. Las películas de fibroina de seda pura (0% de glicerol) se pre-trataron con metanol al 90% v/v durante 1 hr, y luego se trataron de la misma manera como las muestras de glicerol. Todas las películas se probaron en una velocidad de control de deformación de 0.1% s-1, basado en la longitud de sujeción a sujeción inicial (longitud nominal ~47 mm, velocidad de alargamiento nominal ~2.82 mm/min) . Los datos de deformación del extensómetro de carga y video se capturaron en 20 Hz., este último basado en dos marcadores pintados fiduciales colocados a una distancia nominal de ~1 cm en la superficie de la porción más delgada de cada película. Cinco réplicas de cada película se probaron. El área de sección transversal original se determinó al medir el espesor de película por SEM y al multiplicar por el ancho de muestras (10 mm) . El esfuerzo nominal y la deformación se graficaron, y el "módulo elástico lineal" inicial, deformación para la falla, y resistencia a la tensión final (UTS) se determinaron. UTS se determinó como el valor de esfuerzo más alto alcanzado durante la prueba. El "módulo elástico lineal" inicial se calculó al utilizar un ajuste de mínimos cuadrados entre el punto correspondiente a la carga de 0.1 N y el puno correspondiente a 50% del UTS. Esto se considera suficiente para capturar objetivamente a la porción lineal de la curva de esfuerzo/deformación para todas las muestras probadas. El alargamiento para la falla se determinó como los últimos puntos de datos antes de una disminución de >10% en la carga. Ejemplo 6. Microscopía Electrónica de Exploración (SEM) Las películas de seda se fracturaron en nitrógeno líquido y se dispersaron con platino. La sección transversal y morfologías de superficie de diferentes películas de seda se formaron en imagen utilizando un Zeiss SUPRA™ 55 VP SEM (Cari Zeiss, Inc., Jena, Alemania) .

Ejemplo 7. Cultivo de fibroblasto y adhesión sobre películas de seda Células de fibroblasto se expandieron en un medio de crecimiento que contiene DMEM al 90%, suero bovino fetal al 10% (FBS), 100 U/ml de penicilina, 1000 U/ml de estreptomicina. Los cultivos celulares se mantuvieron a 37 °C en una incubadora con 95% de aire y 5% de CO2. Los cultivos se renovaron con medio fresco en 37 °C cada dos días. Para la adhesión, las células se sembraron sobre películas de seda que se pre-vaciaron en placas de 24 cavidades con 50,000 células por cavidad en 1 mi de medio que contiene suero. Las cavidades vacías con plástico de cultivo de tejido (TCP) y nada de seda sirvieron como controles. La unión celular se evaluó 3 hr después del sembrado de las células al adicionar 50 µ? de azul de alamar al medio de cultivo, al cultivar durante otras 6 hr, y al determinar la fluorescencia del medio (Ex = 560 nm, Em = 590 nm) . Durante el cultivo, la proliferación celular se determinó utilizando el manchado de azul de alamar y la morfología celular se monitoreó mediante la microscopía de luz de contraste de fase (Cari Zeiss, Inc., Jena, Alemania) .

Todos los experimentos se realizaron con un mínimo de N = 3 para cada punto de dato. El análisis estadístico se realizó por el análisis de variación de una vía (ANOVA) y la Prueba de Comparaciones Múltiples de Newman-Keuls del Estudiante. Las diferencias se consideraron significantes cuando p=0.05, y muy significantes cuando p=0.01.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una película de seda, caracterizada porque comprende fibroína de seda y aproximadamente 10% (p/p) a aproximadamente 50% (p/p) de glicerol.

2. La película de seda de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el contenido de glicerol de la película de seda es de aproximadamente 20% (p/p) a aproximadamente 40% (p/p)

3. La película de seda de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada porque el contenido de glicerol de la película de seda es aproximadamente 30% (p/p) .

4. La película de seda de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque además comprende por lo menos un agente activo.

5. La película de seda de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque además comprende microesferas de seda o nanoesferas de seda incrustadas en la película de seda.

6. La película de seda de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la película está en capas o plegada en una esponja o bloque .

7. La película de seda de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el por lo menos un agente activo se selecciona del grupo que consiste de células, proteínas, péptidos, análogos de ácido nucleico, nucleótidos u oligonucleótidos, ácidos nucleicos de péptido, aptámeros, anticuerpos o fragmentos o porciones de los mismos, hormonas, antagonistas de hormona, factores de crecimiento o factores de crecimiento recombinantes y fragmentos y variantes de los mismos, citoquinas, enzimas, antibióticos o compuestos antimicrobianos, virus, antivirales, toxinas, profármacos, agentes quimioterapéuticos, moléculas pequeñas, fármacos y combinaciones de los mismos.

8. Una construcción para diseño de tejido, caracterizada porque comprende la película de seda de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde por lo menos un agente activo es una célula.

9. La construcción para diseño de tejido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la célula se selecciona del grupo que consiste de hepatocitos, células de Islote pancreático, fibroblastos, condrocitos, osteoblastos, células exocrinas, células de origen intestinal, células de conducto biliar, células paratiroides, células tiroides, células del eje adrenal hipotalámico-pituitaria, células de músculo cardiaco, células epiteliales de riñon, células tubulares de riñon, células de membrana de basamento de riñon, células nerviosas, células de vaso sanguíneo, células que forman hueso y cartílago, células de músculo liso, células de músculo esquelético, células osculares, células integumentarias, células de médula ósea, queratinocitos, células madre pluripotentes, células madre pluripotentes inducidas, células madre adultas y células madre embriónicas y combinaciones de los mismos.

10. La construcción para diseño de tejido de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la construcción diseñada de tejido es una construcción de tejido de cornea y la célula es fibroblasto de córnea.

11. La construcción para diseño de tejido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizada porque además comprende un medio de crecimiento celular .

12. La película de seda de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque además comprende una configuración óptica sobre la película de seda.

13. La película de seda de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la configuración óptica es una imagen holográfica.

14. Un método para preparar una película de seda, caracterizado porque comprende: mezclar una solución de fibroína de seda con glicerol, en donde la concentración de glicerol en la solución de mezcla de fibroína de seda/glicerol es de aproximadamente 10% a aproximadamente 50% (p/p) ; vaciar la solución de mezcla de fibroína de seda/glicerol sobre una superficie de soporte de película; y secar la película de seda.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque además comprende las etapas de sumergir la película de seda en un líquido adecuado y el glicerol se disuelve durante un período de tiempo para eliminar el glicerol de la película de seda; y secar la película eliminada de glicerol.

16. El método de conformidad con las reivindicaciones 14 o 15, caracterizado porque además comprende recocer la película.

17. Un método para cubrir una superficie de un sustrato con una composición de seda, caracterizado porque comprende : proporcionar un sustrato de soporte de película; y cubrir el sustrato de soporte de película con una película de mezcla de fibroína de seda/glicerol que comprende aproximadamente 10% a 50% de glicerol (p/p) .

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la película de mezcla de fibroína de seda/glicerol además comprende por lo menos un biopolímero.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el biopolimero es PVA o PEO.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la película de mezcla de fibroina de seda/glicerol además comprende por lo menos un agente activo.

21. Un sustrato cubierto de película de seda, caracterizado porque se prepara de conformidad con el método de las reivindicaciones 17-20.

22. El sustrato cubierto con película de seda de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el sustrato es un tejido, tejido regenerado, dispositivo médico, implante médico, dispositivo veterinario o implante veterinario .

23. El sustrato cubierto con película de seda de conformidad con las reivindicaciones 20 o 22, caracterizado porque el sustrato es un compuesto basado en seda.

24. Un método para incrustar por lo menos un agente activo en una película de seda, caracterizado porque comprende : mezclar una solución de fibroina de seda con por lo menos un agente activo y glicerol, en donde la concentración de glicerol en la solución de mezcla de seda es aproximadamente 10% a 50% (p/p) ; vaciar la solución de mezcla de seda sobre una superficie de soporte de película; y secar la película

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el por lo menos un agente activo se selecciona del grupo que consiste de células, proteínas, péptidos, análogos de ácido nucleico, nucleótidos u oligonucleótidos, ácidos nucleicos de péptido, aptámeros, anticuerpos o fragmentos o porciones de los mismos, hormonas, antagonistas de hormona, factores de crecimiento o factores de crecimiento recombinantes y fragmentos y variantes de los mismos, citoquinas, enzimas, antibióticos o compuestos antimicrobianos, virus, antivirales, toxinas, profármacos, agentes quimioterapéuticos , moléculas pequeñas, fármacos y combinaciones de los mismos.

26. El método de conformidad con la reivindicación 24 o 25, caracterizado porque además comprende la etapa de sumergir la película de seda en un líquido en el cual el glicerol se disuelve durante un período de tiempo para eliminar el glicerol de la película de seda; y secar la película eliminada de glicerol.

27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, caracterizado porque además comprende recocer la película.