KR20190011234A - 개선된 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막 - Google Patents

개선된 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고막에 대한 천공 및 손상을 포함하는 중이의 복원에서 사용하기 위한 막의 제조에 관한 것이다. 더 특히, 본 발명은 개선된 생체분해, 기계적 및 구조음향 특성을 갖는 용매를 사용한 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막을 제조하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

개선된 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막
본 발명은 고막에 대한 천공 및 손상을 포함하는 중이의 복원에서 사용하기 위한 막의 제조에 관한 것이다. 더 특히, 본 발명은 개선된 생체분해, 기계적 및 구조음향 특성을 갖는 용매를 사용한 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막을 제조하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
하기 토의는 오직 본 발명의 이해를 수월하게 하도록 의도된다. 토의는 언급된 임의의 자료가 본 출원의 우선일에 일반 상식이거나 이의 일부라는 인정 또는 허용이 아니다.
이어드럼(eardrum) 또는 고막의 만성 천공은 고막성형술 또는 고실성형술 1형으로 공지된 기법인 천공을 커버하기 위한 이식편 재료에 의한 수술 중재를 요하는 비교적 흔한 증상이다.
자가이식편, 예컨대 근막, 지방, 연골막 및 연골은 이 수술에서 사용되는 가장 흔한 조직이다. 그러나, 이 접근법은 고막과의 이식편 기계적 특성의 불일치, 이식편의 비투명성, 도너 부위 이환율 및 증가한 수술 시간을 포함하는 다양한 제한을 갖는다.
최근 년에 걸친 재료 과학에서의 발전에 의해, 다양한 대안적인 스캐폴드 재료, 예컨대 탈세포화 조직(예를 들어, AlloDerm(등록상표)), 중합체(예를 들어, 히알우론산, 키토산 및 칼슘 알기네이트) 및 합성 재료[예를 들어, 폴리(글라이세롤 세바케이트)(PGS)]는 이식 재료로서 조사되었다. 그러나, 최적 스캐폴드의 선택은 비해결된 채 있다.
실크 피브로인은 조직 엔지니어링에서 바이오스캐폴드로서의 이의 잠재성에 대해 광범위하게 조사되었다. 이것은 항원 단백질 세리신의 제거 후 누에 고치로부터 유래된다. 실크 피브로인 용액은 광범위한 생물의학 분야에 대해 맞추기 위한 다양한 형태, 예컨대 필름, 섬유, 매트, 하이드로겔 및 스펀지로 가공처리될 수 있다.
실크 피브로인은 생체분해성, 생체적합성이고, 대부분의 다른 천연 및 합성 생체재료, 예컨대 콜라겐 및 폴리락트산(PLA)과 비교하여 우수한 기계적 강도 및 인성을 갖는다. 중요하게는, 실크 피브로인은 많은 상이한 세포 유형, 예컨대 연골세포, 내피, 상피, 교세포, 섬유아세포, 골아세포 및 케라틴세포의 부착 및 성장을 지지할 수 있다.
실크의 주요 이점 중 하나는 가공처리 조건의 단순한 변화를 통해 특정한 조직 엔지니어링 분야에 맞도록 중요한 특성을 변경하는 능력이다. 가공처리 방법(예를 들어, 물 대 유기 용매, 물 대 알코올 어닐링) 및 가공처리 변수(예를 들어, 건조 속도, 실크 농도)의 조작은 실크의 물리적 및 구조적 특성을 변경하고 스캐폴드 재료로서 이의 성능에 영향을 미칠 수 있다.
그러나, 많은 경우에, 기계적 특성에 영향을 미치기 위한 블렌딩 성분의 첨가는 도전으로 있다. 특히, 연장된 시간 프레임 동안 안정성을 유지시키는 막을 생성시키면서 다른 중합체의 첨가의 회피가 목표로 있다.
기계적 및 구조음향 특성을 개선하고, 생물의학 및 다른 분야에 대한 더 가요성인 실크 피브로인 기반 시스템을 제공하기 위한 실크 피브로인 필름의 물리적 및 기계적 특성을 변형시키기 위한 수요가 여전하다.
본 발명자들은 적절한 용매를 사용함으로써 그리고 매트릭스 물질, 예컨대 생체적합성 폴리우레탄을 포함함으로써 실크 피브로인 막의 기계적 및 구조음향적 특징, 효소 분해 속도 및 강도 및 가요성을 변경할 수 있다는 것을 발견하였다는 점에서 일반적인 분야의 원칙을 확인하였다.
동결건조된 실크는 긴 기간 동안 저장될 수 있다. 이것은 필름이 필요한 바대로 캐스팅되는 것을 허용하는 한편, 수성 실크 피브로인 용액은 즉시 캐스팅되고, 용액이 겔이 되고 사용될 수 없게 되기 전에 수일 내지 수주 내에 사용되어야 한다. 더구나, 생체적합성 폴리우레탄 실크와 같은 매트릭스 물질에 의해 제조된 장치는 사용된 용매에 따라 물 중에 가용성이 아니고, 에탄올 또는 메탄올에 의한 어닐링을 요하지 않고, 이 단계는 필름이 수축되고 왜곡되게 할 수 있다.
제1 양태에서, 본 발명은 실크 피브로인/생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스를 제공하고, 막 매트릭스는
(a) 막의 전체 용적(w/w)의 약 0.1% 내지 약 95%의 범위의 양의 실크 피브로인을 포함하고,
(b) 적어도 1% (w/w)의 생체적합성 폴리우레탄을 포함하고,
(c) 생체내 중이에 20Hz 내지 20KHz의 음파를 전달하고,
(d) 5MPa 내지 100MPa의 인장 강도를 갖고;
(e) 생체적합성 폴리우레탄 및 실크 피브로인 둘 다와 상용성인 용매 중에 용매화된 생체적합성 폴리우레탄 및 실크 단백질로부터 제조된다.
본 발명의 실크 피브로인 막 매트릭스는 조직 엔지니어링에 대한 작제물을 제공한다. 이것은 케라틴세포, 섬유아세포, 점막 상피, 내피 세포, 연골세포 등이 성장할 수 있는 매트릭스를 제공한다. 막 매트릭스는 이 세포가 환자에서 성장할 수 있는 스캐폴드를 제공하기 위해 유도 다능성 줄기 세포, 성체 줄기 세포 및 배아 줄기 세포, 및 이들의 조합을 사용하여 세포 치료에서 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 실크 피브로인 막 매트릭스는 생체적합성 폴리우레탄이 결여된 실크 피브로인 필름과 비교하여 명확한 특성을 갖는다. 탄성 및 내구성은 생체적합성 폴리우레탄의 사용 또는 포함 및 사용에 의해 증대된다. 재료 가공처리에서 실크 피브로인과 조합된 또한 생체적합성 폴리우레탄의 사용은 실크 피브로인에 의해 획득 가능한 기능적 특징, 및 생체재료 및 장치에서 잠재적인 이용성에 의해 더 가요성인 필름의 형성을 확장한다.
제2 양태에서, 본 발명은 실크 피브로인/생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스를 제공하고, 막 매트릭스는
(a) 막의 전체 용적(w/w)의 약 0.1% 내지 약 95%의 범위의 양의 실크 피브로인을 포함하고,
(b) 적어도 1% (w/w)의 생체적합성 폴리우레탄을 포함하고,
(c) 생체내 중이에 20Hz 내지 20KHz의 음파를 전달하고,
(d) 5MPa 내지 100MPa의 인장 강도를 갖고;
(e) 복합 막으로서 제조되고, 여기서 실크 피브로인은 생체적합성 폴리우레탄 막에 대한 코팅을 제공한다.
제3 양태에서, 본 발명은
(a) 고치 또는 섬유로부터 세리신의 제거 후 실크 단백질 또는 실크 단백질 복합체 용액을 제조하는 단계;
(b) 적합한 용매를 사용하여 생체적합성 폴리우레탄 및 실크 피브로인을 용해시키는 단계; 및
(c) 제조된 용액을 건조하여 실크 단백질 및 폴리우레탄 막 매트릭스를 제조하는 단계를 포함하는, 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스를 제조하는 방법을 제공한다.
제4 양태에서, 본 발명은 고막 천공 및 특히 본 명세서에 기재된 바와 같은 막 매트릭스를 포함하는 만성 천공의 복원을 위한 장치를 제공한다. 이와 관련하여, 막 매트릭스는 바람직하게는 대략 10MPa 내지 95MPa의 인장 강도, 더 바람직하게는 대략 10 내지 대략 50MPa의 인장 강도를 갖는다.
일 실시형태에서, 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스가 본 명세서에 제공되고, 여기서 막 매트릭스는 분해에 저항적이고/이거나, 말려들어감, 무기페 및 진주종에 저항하기 위한 장기간 구조 지지체를 제공한다.
이 양태의 일 실시형태에서, 장치는 복수의 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스를 포함한다. 이 실시형태에서, 장치는 실크 피브로인을 포함하는 적어도 하나의 제1 막 매트릭스 및 생체적합성 폴리우레탄을 포함하는 적어도 하나의 제2 막 매트릭스를 포함할 수 있다.
제5 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 막 매트릭스를 포함하는 외이도, 이완부 및/또는 갑상연골의 복원에서의 사용을 위한 장치를 제공한다.
제6 양태에서, 본 발명은, 대상체의 이어드럼, 또는 더 바람직하게는, 고막, 예컨대 대상체의 천공된 고막, 및/또는 대상체의 이완부에 근위인 이완부 및/또는 갑상연골에 이식되거나 적용될 때, 적어도 고막의 세포의 증식, 이동 및/또는 부착을 지지하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 막 매트릭스의 용도이다. 본 발명은 또한 수산화인회석 비함유 이식편을 커버하는 것을 포함하는 고실꼭지돌기절제술 후 대상체의 외이도의 재건을 위한 꼭지돌기 소멸 기법에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 막 매트릭스의 용도를 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 이러한 치료를 요하는 대상체에서 이어드럼, 더 바람직하게는 고막 천공, 예컨대 이완부에 근위인 만성 고막 천공, 및/또는 결함성 이완부 및/또는 갑상연골을 복원하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 손상된 조직 또는 복원하고자 하는 조직에 본 명세서에 기재된 바와 같은 막 매트릭스를 포함한다.
본 발명에 따라 제조된 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스는 적어도 1종의 활성제를 포함할 수 있다. 활성제는 바람직하게는 세포, 단백질, 펩타이드, 핵산 유사체, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 핵산, 압타머, 항체 또는 이의 단편 또는 부분, 호르몬, 호르몬 길항제, 성장 인자 또는 재조합 성장 인자 및 이의 단편 및 변이체, 사이토카인, 효소, 항생제 또는 항미생물 화합물, 바이러스, 항바이러스제, 독소, 프로드럭, 화학치료제, 소분자, 약물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 생체적합성 폴리우레탄이 결여된 실크 피브로인 막과 비교하여 명확한 특성을 갖는 실크 피브로인 및 생체적합성 폴리우레탄을 포함하는 막 매트릭스를 제공한다. 더 구체적으로, 생체적합성 폴리우레탄의 사용 또는 포함 및 사용에 의한 용해도, 생체상용성, 강도, 분해 특징 및 가요성의 변경.
재료 가공처리에서 실크 피브로인과 조합된 생체적합성 폴리우레탄의 사용은 실크 피브로인에 의해 획득 가능한 기능적 특징, 및 생체재료 및 장치 분야에서 잠재적인 이용성에 의해 더 강하거나 더 가요성인 필름의 형성을 확장한다.
본 발명은 또한 대상체의 외이도, 고막 천공, 및/또는 이완부의 복원에 사용하기 위한 키트를 제공하고, 상기 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 막 매트릭스를 포함한다. 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 생체활성 분자의 하나 이상의 용액을 또한 포함할 수 있다. 생체활성 분자의 하나 이상의 용액은 대상체로 막 매트릭스의 이식 전의 막에 대한 적용, 또는 이후 1회에 또는 다수의 경우에 생길 수 있는 대상체에 대한 막 매트릭스의 이식 또는 그래프팅 후 막 매트릭스에 대한 적용을 위한 것일 수 있다.
따라서, 본 발명의 막 매트릭스는 손상된 조직의 복원 및 재생에서 사용하기 위한 고객화된 이식편 임플란트를 제공한다. 일 형태에서, 이 손상된 조직은 이러한 치료를 요하는 대상체에서 천공된 고막 및/또는 이완부 및 갑상연골을 포함하는 외이도의 재건 및 재생이다.
막 매트릭스의 고객화는, 이것이 보수하도록 사용되면서, 조직의 원래의 형태를 실질적으로 닮도록 재생을 촉진하여서 대상체에 대한 개선된 치유 결과에 대한 더 우수한 기회가 가능하게 하는 데에 보조할 수 있다.
본 발명의 이들 및/또는 다른 양태 및 이점은 동반된 도면과 함께 취해져 예시적인 실시형태의 하기 설명으로부터 명확해지고 더 용이하게 이해될 것이다.
도면에서, 하기 약어가 적용된다:
TPU 열가소성 폴리우레탄
PBS 인산염 완충 식염수
도 1: 순수한 실크 막(a), 순수한 폴리우레탄 막(b) 및 실크:폴리우레탄 막의 1:4 혼합물(c)의 투명도.
도 2: 40%(w/w) 글라이세롤을 함유하는 순수한 실크 필름 및 실크 필름과 비교하여 1:4 실크:폴리우레탄 필름의 빈도 반응.
도 3: 1㎎/㎖의 프로테아제 용액에 노출된 28일에 걸쳐 실크/폴리우레탄의 1:4 혼합물의 시험관내 분해로부터 생긴 중량 소실.
본 발명자들은 적절한 용매를 사용함으로써 그리고 매트릭스 물질, 예컨대 생체적합성 폴리우레탄을 포함함으로써 실크 피브로인 막의 기계적 특징, 효소 분해 속도 및 가요성을 변경할 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 생체적합성 폴리우레탄과 조합되어 제조되는 복합 실크 피브로인 막에 관한 것이다. 이 매트릭스는 (i) 비교적 긴 기간 동안 저장될 수 있고, (ii) 물 중에 비교적 불용성이고, (iii) 많은 다른 천연 및 실크 피브로인 합성 생체재료와 비교하여 생체적합성 및 더 낮은 탄성을 갖는다.
본 발명에 따라 제조된 실크 피브로인 막 매트릭스는 광범위한 생물의학 분야에 대해 맞추기 위한 예컨대 필름, 섬유, 매트, 하이드로겔 및 스펀지로서 조직 엔지니어링에서 스캐폴드에서 다수의 용도를 갖는다.
실크 피브로인 막 매트릭스가 고막의 복원에서 사용될 때, 본 발명자들은 생체적합성 폴리우레탄을 사용함으로써 실크 피브로인 막의 기계적 및 구조음향 특징 중 하나 이상을 적어도 개선할 수 있다는 것을 발견하였다.
편의를 위해, 하기 부문은 일반적으로 본 명세서에 사용된 용어의 다양한 의미를 서술한다. 이 토의 후, 실크 피브로인 막 매트릭스에 관한 일반적인 양태가 기재되어 있고, 막의 다양한 실시형태의 특성 및 이들이 어떻게 사용될 수 있는지를 입증하는 구체적인 실시예가 이어진다.
정의
당해 분야의 숙련자는 본 명세서에 기재된 발명이 구체적으로 기재된 것 이외의 변경 및 변형에 민감하다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 모든 이러한 변경 및 변형을 포함한다. 본 발명은 또한 개별적으로 또는 총체적으로 본 명세서에 언급되거나 표시된 모든 단계, 특징, 제제 및 화합물 및 단계 또는 특징의 임의의 및 모든 조합 또는 임의의 2개 이상을 포함한다.
이 텍스트에 인용된 각각의 문헌, 참조문헌, 특허 출원 또는 특허는 본 명세서에 참고로 이의 전문이 명확히 포함되고, 이는 이것이 이 테스트의 일부로서 독자에 의해 읽혀지고 고려되어야 한다는 것을 의미한다. 이 텍스트에 인용된 이 문헌, 참조문헌, 특허 출원 또는 특허는 단지 간결의 이유로 이 텍스트에 반복되지 않는다. 그러나, 이 자료에 함유된 인용된 자료 또는 정보는 일반 상식인 것으로 이해되지 않아야 한다.
본 명세서에 또는 본 명세서에 참고로 포함된 임의의 문헌에 언급된 임의의 제품에 대한 제조사의 지시, 설명, 제품 명세서 및 제품 시트는 여기에 본 명세서에 참고로 포함되고, 본 발명의 실행에서 사용될 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 구체적인 실시형태에 의해 범위가 제한되지 않아야 한다. 이 실시형태는 오직 예시의 목적을 위해 의도된다. 기능적으로 동등한 생성물, 제제 및 방법은 명확히 본 명세서에 기재된 바대로 본 발명의 범위 내에 있다.
본 명세서에 기재된 발명은 값의 하나 이상의 범위(예를 들어, 크기, 농도 등)를 포함할 수 있다. 값의 범위는 범위 내의 모든 값, 예를 들어 범위를 한정하는 값, 및 범위에 대한 경계를 한정하는 그 값에 바로 인접한 값과 동일하거나 실질적으로 동일한 결과를 발생시키는 범위에 인접한 값을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함한다" 또는 변경, 예컨대 "포함" 또는 "포함하는"은 임의의 다른 정수 또는 정수의 군의 배제가 아니라 언급된 정수 또는 정수의 군의 포함을 나타내는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에 사용된 선택된 용어에 대한 다른 정의는 본 발명의 상세한 설명 내에 발견되고 이에 걸쳐 적용될 수 있다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 다른 과학 및 기숙 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련자에게 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
이 텍스트에 함유된 인용된 자료 또는 정보의 언급은 자료 또는 정보가 일반 상식의 일부이거나 호주 또는 임의의 다른 나라에서 공지된다는 것의 인정으로서 이해되지 않아야 한다.
본 발명의 장치 및 이것이 어떻게 사용될 수 있는지를 기재할 목적을 위해, 용어 "천공된", "천공" 또는 이의 "천공한다"의 임의의 다른 변경은 본 발명의 장치를 사용하여 복원될 수 있는 대상체의 고막에 대한 임의의 손상을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 몇몇 비배타적인 예에서, 이러한 손상은 물리적 힘 또는 질환의 결과로서 고막에서의 구멍 또는 찢어짐 또는 막 또는 막의 층의 임의의 일부의 변형 또는 소실을 포함할 수 있다. 고막 또는 이어드럼은 외이도의 안쪽 모서리에서의 이완부 및 긴장부를 포함한다. 이완부는 말려들어감 및 진주종에 놓이고, 인접한 하고실, 슬개골 및 외이도의 연조직은 대개 이 병태의 수술 치료 후 재건을 요한다.
본 발명의 장치 및 이것이 어떻게 사용될 수 있는지를 기재할 목적을 위해, 용어 "결함성" 또는 이의 용어의 임의의 다른 이러한 변경은 본 발명의 장치를 사용하여 복원되거나 재건될 수 있는 이완부의 연조직 또는 대상체의 둘러싼 부위의 골에 임의의 손상 또는 질환을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 이것은 무엇보다 진주종으로부터의 손상 또는 질환, 또는 꼭지돌기절제술 후 대상체의 외이도의 필요한 복원을 포함할 수 있다.
본 발명의 장치를 설명할 목적을 위해, 용어 "생체적합성 폴리우레탄"은, 신체에서 이식될 때, 둘러싼 조직에 대한 임의의 상당한 해로운 변경을 일으키지 않는, 카바메이트(우레탄)에 의해 연결된 유기 단위로 이루어진 중합체를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 생체적합성 폴리우레탄은, 그 치료의 수혜자 또는 수혜자에서 임의의 원치 않는 국소 또는 전신 효과를 유발하지 않으면서, 원하는 의학 치료를 수행하는 능력을 갖는다. 생체적합성 폴리우레탄은 생물학적 시스템에 임의의 독성 또는 해로운 효과를 갖지 않는다.
본 발명의 특징은 하기 비제한적인 설명 및 실시예를 참조하여 이제 기재될 것이다.
실시형태
본 발명에 따라 제조된 실크 피브로인 막 매트릭스는 생체분해성, 생체적합성이고, 대부분의 다른 천연 및 합성 생체재료, 예컨대 콜라겐 및 폴리락트산(PLA)과 비교하여 이의 기계적 강도, 연신율 및 강성 중 하나 이상에서 개선된다.
A. 실크 피브로인 막 매트릭스
본 발명은 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스를 제공한다. 본 발명의 막 매트릭스는 생체적합성 폴리우레탄이 결여된 실크 필름보다 더 높은 연성을 나타낸다.
본 발명의 막은 고막 천공, 특히 만성 천공의 복원을 위해 제조된다. 또한, 또는 대안에서, 본 발명의 막은 대상체의 외이도, 특히 이완부 및/또는 슬개골의 복원을 위해 제조될 수 있다. 바람직하게는, 막은 특히 고막의 복원에 적합한 장치를 전달하도록 제조된다.
제1 양태에서, 본 발명은 실크 피브로인/생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스를 제공하고, 막 매트릭스는
(a) 막의 전체 용적(w/w)의 약 0.1% 내지 약 95%의 범위의 양의 실크 피브로인을 포함하고,
(b) 적어도 1% (w/w)의 생체적합성 폴리우레탄을 포함하고,
(c) 생체내 중이에 20Hz 내지 20KHz의 음파를 전달하고,
(d) 5MPa 내지 100MPa의 인장 강도를 갖고;
(e) 실크 피브로인을 용해시키지 않으면서 생체적합성 폴리우레탄을 용해시킬 수 있는 용매 중에 용매화된 생체적합성 폴리우레탄 및 실크 단백질로부터 제조된다.
제2 양태에서, 본 발명은 실크 피브로인/생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스를 제공하고, 막은
(a) 막의 전체 용적(w/w)의 약 0.1% 내지 약 95%의 범위의 양의 실크 피브로인을 포함하고,
(b) 적어도 1% (w/w)의 생체적합성 폴리우레탄을 포함하고,
(c) 생체내 중이에 20Hz 내지 20KHz의 음파를 전달하고,
(d) 5MPa 내지 100MPa의 인장 강도를 갖고;
(e) 복합 막 매트릭스으로서 제조되고, 여기서 실크 피브로인은 생체적합성 폴리우레탄 막에 대한 코팅을 제공한다.
실크 피브로인은 막의 전체 용적의 약 0.1% 내지 약 95%(중량%)의 범위의 양으로 막에 존재한다. 바람직하게는 실크 피브로인은 막의 전체 중량의 약 5.0% 내지 약 75.0%로부터 선택된 양으로 존재한다. 바람직하게는, 실크 피브로인 함량은 막의 전체 중량의 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%이다.
본 발명에서 사용된 생체적합성 폴리우레탄은, 신체에 이식될 때, 둘러싼 조직에 상당한 해로운 변화를 야기하지 않는 유기 단위의 하나 이상의 중합체로 이루어진다. 예를 들어, 생체적합성 폴리우레탄은 카바메이트(우레탄) 링크에 의해 연결된 유기 단위의 하나 이상의 중합체로 이루어질 수 있다.
본 발명에서 사용된 생체적합성 폴리우레탄은 수혜자에서 바람직하지 않은 국소 또는 전신 효과를 발생시키지 않으면서 의학 치료에서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 이들은 생물학적 시스템에 임의의 독성 또는 손상을 주는 효과를 가지지 않을 것이다. 매우 바람직한 실시형태에서, 생체적합성 폴리우레탄은 폴리(알킬렌 옥사이드) 올리고머 및 코올리고머 복합제/제제 또는 복합제/공유로 결합된 제제, 예를 들어 a,x-다이하이드록시프로필폴리(다이메틸실록산)(PDMS)을 함유하는 생체적합성 폴리우레탄이다(이러한 조성물의 예는 WO/1992/000338, WO/1992/009647, WO/1999/001496, WO/1999/003863, WO/1999/050327, WO/1998/013405, WO/2001/007499, WO/1998/054242, WO/2000/064971 및 WO/2005/052019에서 발견될 수 있다. 각각의 내용에서, 확인된 명세서는 본 명세서에 참고로 구체적으로 포함된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 PDMS 생체적합성 폴리우레탄의 다른 예는 심혈관 분야(혈관 이식편, 혈액 펌프, 인공 심장, 심장박동기, 스텐트 등), 카테터, 정형외과 임플란트에 사용된 AorTech Biomaterials Pty로부터 입수된 Elast-Eon(등록상표)(PDMS/PHMO 마크로디올에 기초); 심장 밸브, 인공 심장 혈액 펌핑 격막에 사용된 Applied Biomedical Corp.로부터 입수된 Angioflex(등록상표)[PDMS/폴리(테트라메틸렌 옥사이드) 마크로디올에 기초]; 인공 심장, 대동맥 내 풍선 및 혈관 도관에 사용된 Arrow International로부터 입수된 Cardiothane(등록상표)-51[PDMS/폴리(테트라메틸렌옥사이드) 마크로디올에 기초]; 각각 장기간 및 단기간 생물의학 분야에 사용된 Polymer Technology Group으로부터 입수된 1,11-14 PurSilTM10,15 및 PurSil-ALTM (방향족 및 지방족 실록산 폴리에테르 TPU)을 포함한다. PDMS 폴리우레탄 공중합체의 예는 문헌[Stefanovic I.S., et al, (2015) JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH A, 103A(4), 1459 - 1475](이의 내용은 본 명세서에 참고로 구체적으로 포함됨)에서 발견될 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 폴리우레탄의 훨씬 또 다른 형태는 Pellethene 2368-80A(Dow Chemical Co) 또는 및 Biomer로부터 선택된다.
실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막의 생체적합성 폴리우레탄 함량은 적어도 약 1%(w/v)일 것이다. 바람직하게는, 생체적합성 폴리우레탄 함량은 막의 전체 용적(w/v)의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 이상으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 막 매트릭스에서 실크 대 생체적합성 폴리우레탄의 함량 비율은 1:1, 1:1.5, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5, 1:5, 1:5.5, 1:6, 1:6.5, 1:7, 1:7.5, 1:8, 1:8.5, 1:9, 1:9.5; 1:10, 1:10.5, 1:11, 1:11.5, 1:12, 1:12.5, 1:13, 1:13.5, 1:14, 1:14.5, 1:15, 1:15.5, 1:16, 1:16.5, 1:17, 1:17.5, 1:18, 1:18.5, 1:19, 1:19.5, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99 및 1:100으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 막 매트릭스에서 생체적합성 폴리우레탄 대 실크의 함량 비율은 1:1, 1:1.5, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5, 1:5, 1:5.5, 1:6, 1:6.5, 1:7, 1:7.5, 1:8, 1:8.5, 1:9, 1:9.5; 1:10, 1:10.5, 1:11, 1:11.5, 1:12, 1:12.5, 1:13, 1:13.5, 1:14, 1:14.5, 1:15, 1:15.5, 1:16, 1:16.5, 1:17, 1:17.5, 1:18, 1:18.5, 1:19, 1:19.5, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99 및 1:100으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
막 매트릭스의 인장 강도는 실크 피브로인 및 글라이세롤의 함량을 변경함으로써 변할 수 있다. 이상적으로, 인장 강도는 막이 생체조작되는 목적을 위해 선택된다. 예를 들어, 막이 조직 엔지니어링을 위한 바이오스캐폴드로서 형성되는 경우, 인장 강도는 150MPa 또는 필요한 경우 심지어 이것 초과만큼 클 수 있다. 바람직하게는, 막 매트릭스의 인장 강도는 5MPa 및 100MPa의 범위이고, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100MPa 또는 이 수 사이의 임의의 값의 인장 강도는 재료가 사용되는 목적에 따라 허용 가능하다. 예를 들어, 막 매트릭스가 골의 스캐폴드 복원으로서 또는 상처 복원에서 사용되는 경우, 장치의 인장 강도는 50MPa 내지 150MPa일 수 있다. 대안적으로, 막 매트릭스가 고막의 복원을 위한 장치로서 사용되는 경우, 재료의 인장 강도는 5 내지 50MPa의 범위일 것이다. 예를 들어, 이러한 막 매트릭스는 9, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50MPa 또는 이 수 사이의 임의의 값의 인장 강도를 가질 수 있다.
일 실시형태에서, 단일 막 매트릭스는 존재할 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 막 매트릭스의 다중 층은 존재할 수 있다.
이 양태의 일 실시형태에서, 막 매트릭스의 다중 층은 막 매트릭스의 동일한 유형을 포함할 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 막 매트릭스의 다중 층은 막 매트릭스의 상이한 유형을 포함할 수 있다.
예를 들어, 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄의 다중 층은 동시에 사용될 수 있다.
대안적으로, 적어도 하나의 막 매트릭스 층은 실크 피브로인 막 매트릭스를 포함할 수 있고, 적어도 하나의 제2 막 매트릭스 층은 생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 게다가, 적어도 하나의 제3 막 매트릭스 층은 실크 피브로인 및 생체적합성 폴리우레탄 둘 다의 막 매트릭스를 포함하여 존재할 수 있다.
실크 피브로인으로부터 본 발명의 막을 제조함으로써, 본 발명자들은 대부분의 다른 천연 및 합성 실크 피브로인 생체재료와 비교하여 찢어짐 또는 파괴 없이 변형률을 견딜 수 있는(강하고 탄력 있는) 개선된 막 매트릭스를 개발하였다. 재료의 강도 및 회복력은 파괴 또는 찢어짐 없이 신장하는 재료의 능력으로서 정의될 수 있다.
찢어짐 또는 파괴 없이 변형률을 견디는 막 매트릭스의 회복력은 생체적합성 폴리우레탄의 함량을 변경함으로써 변할 수 있다. 이상적으로, 막은 300% 이하로 연장될 때 탄성인 채 있을 수 있다. 즉, 이것은 300% 이하로 변형되고 여전히 이의 원래의 길이로 돌아갈 수 있다. 실크는 홀로 건조될 때 취성이지만, 심지어 습식일 때, 이것은 대개 더 높은 % 연신율에서 가소성으로 변형한다. 본 발명의 특정한 형태에서, 막은 5% 내지 300%의 연신율의 백분율을 가질 것이다. 낮은 연신율은 취성인 재료와 연관된다. 취성인 재료는 대개 더 높은 인장 강도 및 높은 모듈러스 그러나 낮은 연신율을 갖는다.
막이 조직 엔지니어링을 위해 바이오스캐폴드로서 형성될 때, 연신율의 백분율은 막이 적용되는 용도에 따라 필요한 경우 5% MPa만큼 낮고, 300% 초과만큼 높을 수 있다. 바람직하게는, 막 매트릭스의 연신율의 백분율은 50 내지 250%의 범위이고, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 또는 300% 또는 이 수 사이의 임의의 값의 연신율의 백분율은 허용 가능하다.
막 매트릭스가 예를 들어 골의 복원을 위해 또는 상처 복원에서 스캐폴드로서 사용되는 경우, 막의 연신율의 백분율은 5 내지 200%일 수 있다. 대안적으로, 막 매트릭스가 고막의 복원을 위한 장치로서 사용되는 경우, 재료의 연신율의 백분율은 80 내지 170%의 범위일 것이다.
재료 가공처리에서 실크 피브로인과 조합된 생체적합성 폴리우레탄의 사용은 생체재료 및 장치 분야에서 잠재적인 이용성에 의해 실크 피브로인에 의해 획득 가능한 기능적 특징 및 더 가요성인 막의 형성을 또한 확장한다.
본 발명의 장치의 막은 5 내지 2000MPa의 차수의 영 모듈러스를 보유할 수 있다. 예를 들어, 영 모듈러스는 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018, 1019, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, 1200, 1210, 1220, 1230, 1240, 1250, 1260, 1270, 1280, 1290, 1300, 1310, 1320, 1330, 1340, 1350, 1360, 1370, 1380, 1390, 1400, 1410, 1420, 1430, 1440, 1450, 1460, 1470, 1480, 1490, 1500, 1510, 1520, 1530, 1540, 1550, 1560, 1570, 1580, 1590, 1600, 1610, 1620, 1630, 1640, 1650, 1660, 1670, 1680, 1690, 1700, 1710, 1720, 1730, 1740, 1750, 1760, 1770, 1780, 1790, 1800, 1810, 1820, 1830, 1840, 1850, 1860, 1870, 1880, 1890, 1900, 1910, 1920, 1930, 1940, 1950, 1960, 1970, 1980, 1990 또는 사이의 임의의 값일 수 있다. 이상적으로, 영 모듈러스는 막이 사용되는 용도에 일치될 것이다. 예를 들어, 막 매트릭스가 골의 스캐폴드 복원으로서 또는 상처 복원에서 사용되는 경우, 영 모듈러스는 400MPa 내지 2000MPa일 수 있다. 대안적으로, 막 매트릭스가 고막의 복원을 위한 장치로서 사용되는 경우, 재료의 영 모듈러스는 100 내지 2000MPa의 범위일 것이다. 예를 들어, 이러한 막 매트릭스는 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 또는 500MPa 또는 이 숫자 사이의 임의의 값의 영 모듈러스를 가질 수 있다.
이 영 모듈러스 값은 천공 및 음향 특성의 크기를 실질적으로 일치시키도록 선택된다. 대략 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 또는 300MPa의 영 모듈러스가 바람직하다. 이와 관련하여, 중이 소골편에 대한 음파 전송은 장치를 포함하는 이식편의 "강성"에 따라 달라지고, 청각 결과에서의 본 개선에 대해 큰 천공에서의 중요한 문제이다.
본 발명의 막이 생물학적 환경, 예컨대 바이오스캐폴드에서 또는, 제한 없이, 상처 복원에서, 골에 대한 대체물로서 또는 고막의 복원에서를 포함하여 손상된 조직의 복원에서 사용되는 경우, 막은 막에 걸친 세포의 효율적인 성장 및 증식을 위해 세포 부착을 수월하게 하도록 채택된다. 본 발명의 실크 피브로인 막 매트릭스는 따라서 조직 엔지니어링에 대한 작제물을 제공한다. 이것은 케라틴세포, 섬유아세포, 교세포, 골아세포, 파골세포, 상피, 내피 세포, 연골세포 등이 성장할 수 있는 매트릭스를 제공한다. 막 매트릭스는 이 세포가 환자에서 성장할 수 있는 스캐폴드를 제공하기 위해 유도 다능성 줄기 세포, 성체 줄기 세포 및 배아 줄기 세포, 및 이들의 조합을 사용하여 세포 치료에서 또한 사용될 수 있다.
바람직하게는, 임의의 세포 유형은 도너로부터, 확립된 세포 배양 라인으로부터, 또는 분자 또는 유전자 수단에 의해 심지어 세포 변형 전에 또는 후에 얻어진 바대로, 케라틴세포, 근골격계의 세포, 예컨대 연골세포, 섬유아세포, 근육 세포 및 골세포 및 줄기 세포(예를 들어, 배아 줄기, 성체 줄기 세포, 및 유도 다능성 줄기 세포 포함), 및 이들의 조합을 포함하여 배양 및 가능한 이식을 위해 막에 첨가될 수 있다. 조직의 조각은 상이한 세포 유형에 의해 작제물을 생착시키도록 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 막은 매끄러울 필요가 없고, 이들은 대략 0.001마이크론 내지 대략 200마이크론의 크기의 범위인 이의 표면에서 기공 또는 표면 변형을 보유할 수 있다. 막이 기공을 포함하는 경우, 기공은 막을 횡단할 수 있거나, 이것은 일 말단에서 폐쇄될 수 있다. 기공이 막을 횡단하는 경우, 이것은 막을 통해 세포 성장을 지지하거나 그렇지 않을 수 있다. 막이 고막으로서 용도가 발견되는 경우, 이것은 막을 통해 세포의 가로지른 성장을 지지하지 않는다. 그러나, 이 막이 바이오스캐폴드로서 사용되는 경우, 이것은 막을 통한 세포의 가로지른 성장을 지지할 수 있다.
실시형태에서, 막은 세포 침윤 및 조직 형성을 수월하게 하는 대략 0.001 마이크론 내지 대략 200 마이크론의 직경을 갖는 이의 표면에서 하나 이상의 기공 또는 표면 변형을 포함한다. 바람직한 형태에서, 기공 또는 표면 변형은 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.006, 0.007, 0.008, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200마이크론 또는 이 숫자 사이의 임의의 값의 직경을 갖는다.
기공이 막에 존재할 때, 이것은 이러한 치료를 요하는 대상체에게 이식 시 숙주 조직 통합을 수월하게 하도록 새로운 조직 형성 및 개형을 위한 보이드 용적을 제공할 것이다. 이와 관련하여, 장치는 기계적 안정성을 또한 유지하면서 효율적인 영양소 및 대사물질 운반을 허용하는 구조를 제공한다.
막 매트릭스의 두께는 대략 1마이크론 내지 대략 2㎜로 변할 수 있다. 예를 들어, 막은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 2000마이크론의 두께를 가질 수 있다.
막이 대체 고막으로서 사용되는 경우, 이것은 대략 10 내지 대략 600마이크론의 두께를 가질 것이다. 가장 바람직하게는, 막은 대략 30 내지 대략 100마이크론의 두께를 갖는다. 예를 들어, 막은 30 내지 50마이크론, 50 내지 65마이크론, 65 내지 80마이크론 또는 80 내지 100마이크론의 범위이다.
막이 스캐폴드로서 사용되는 경우, 막은 예컨대 2㎜ 이하로 훨씬 더 두꺼울 수 있다. 이와 관련하여, 이러한 사용에서의 막의 상대 두께는 생체분해성의 속도 및 막이 의도된 용도를 위해 전달해야 하는 인장 강도, 인성 및 탄성의 정도에 기초하여 결정될 것이다.
본 발명의 막 매트릭스는 생체분해성 또는 더 바람직하게는 비생체분해성일 수 있다. 이와 관련하여, 막이 생체분해성인 경우에, 막은 완전한 용해를 위해 2년 이하 또는 초과가 걸리는 생체분해성을 가질 수 있다. 바람직하게는, 막은 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24개월에 걸쳐 생체분해성이다. 대상체에서 사용될 때 분해되는 바이오스캐폴드로서 사용될 때, 막은 1년 내지 12년, 이상적으로 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년의 생물학적 수명을 가질 수 있다. 바람직하게는, 막은 생체분해성이 아니거나, 적어도 실크가 생체분해성일 수 있는 경우 폴리우레탄은 생체분해성이 아닐 것이다.
본 발명의 실크 피브로인 막 매트릭스는 폴리우레탄이 결여된 실크 피브로인 필름과 비교하여 명확한 특성을 갖는다. 예를 들어, 가요성은 폴리우레탄의 사용 또는 포함 및 사용에 의해 증대된다.
본 발명의 막 매트릭스는 또한 이러한 치료를 요하는 대상체에 비자가유래인 하나 이상의 추가 재료 또는 이 위의 층을 포함할 수 있다. 예를 들어, 실크 막은 추가 가소제, 젤라틴, 콜라겐, 키토산, 알긴산, 히알우론산, 플루로닉 127, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), 및 1,2,6-헥산트라이올 및 및 1,3-프로판디올로부터 선택된 첨가제를 포함하는 적어도 하나의 첨가제 또는 층을 포함할 수 있다. 첨가제의 추가의 예는 문헌[Jose, R.R. et al., 2015. Polyol-Silk Bioink Formulations as Two-Part Room-Temperature Curable Materials for 3D Printing. ACS Biomaterials Science & Engineering, 1, pp.780-788](본 명세서에서 교차참조로 포함됨)에 예시되어 있다.
막에서 사용될 수 있는 재료는 히알우론산 기반 하이드로겔(Carbylan) 및 필름(Seprafilm); 칼슘 알기네이트; 폴리(글라이세롤 세바케이트); 물 가용성 및 불용성 키토산; 및 콜라겐을 포함하는 군으로부터 선택된 임의의 재료를 포함한다.
막 매트릭스는 또한 추가 가소제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 막 매트릭스는 장치가 사용 전에 건조 상태로 유지 가능하도록, 무엇보다, 젤라틴, 키토산, 알긴산, 히알우론산, 플루로닉 127, 지방족 폴리에스터, 폴리(알킬렌) 옥사이드, 폴리(L-락트산), 70/30 L-락타이드/e-카프로락톤 공중합체, 폴리(카프로락톤), 폴리(DL-락타이드-코-카프로락톤), 폴리(D-락타이드-코-카프로락톤), 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤), 폴리(락타이드-코-글리콜산), 폴리(비닐피롤리딘), 폴리(다이메틸실록산), 폴리(라이신), 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴, 프로테오글라이칸, 폴리펩타이드, 폴리(에틸렌-코-비닐) 알코올, 1,2,6-헥산디올, 1,3-프로판디올, 폴리(비닐) 알코올, 폴리(에틸렌)글리콜, 폴리(프로필렌)글리콜, 폴리-L-락타이드-코-글리콜라이드-코-ε-카프로락톤, 폴리(테트라플루오로에틸렌), 폴리(다이옥사논), 폴리글락틴 910, 또는 이들의 조합물을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 실크 피브로인 막 매트릭스는 또한 세포의 성장을 보조하거나 촉진하는 (존재할 때) 막으로 또는 이 위의 기공에서 함침되는 적어도 1종의 활성제를 포함할 수 있다. 활성제는 바람직하게는 비타민, 미네랄, 단백질(예컨대, 사이토카인, 효소 및 세포 성장 변형제, 예를 들어 성장 인자 또는 재조합 성장 인자 및 이의 단편 및 변이체), 단백질 저해제, 펩타이드, 핵산 유사체, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 핵산, 압타머, 항체 또는 이의 단편 또는 부분, 호르몬, 호르몬 길항제, 탄수화물, 보인자, 항생제 또는 항미생물 화합물, 소염제, 항증식제, 항히스타민제, 바이러스, 항바이러스제, 독소, 프로드럭, 화학치료제, 약물, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 생체활성 분자는 상피 성장 인자, 예를 들어 상피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장 인자-알파(TGF-α), 형질전환 성장 인자-베타(TGF-ß), 헤어핀 결합 상피 성장 인자(HB-EGF), 암피레귤린, 에피겐, 에피레귤린, 베타셀룰린; 섬유아세포 성장 인자, 예를 들어 산성 섬유아세포 성장 인자(FGF-1/aFGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF-2/bFGF); 케라틴세포 성장 인자, 예를 들어 케라틴세포 성장 인자 1(KGF-1/FGF-7), 케라틴세포 성장 인자 2(KGF-2/FGF-10); 인슐린 유사 성장 인자, 예를 들어 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1), 인슐린 유사 성장 인자 2(IGF-2); 혈소판 유래 성장 인자, 예를 들어 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 혈소판 유래 성장 인자-BB(PDGF-BB), 간세포 성장 인자(HGF), 사이토카인, 예를 들어 IL-6, IL-19, IL-24; 세포외 매트릭스 단백질, 예를 들어 히알우론산, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌; 및 비타민, 예를 들어 트랜스-레티노산(비타민 A), L-아스코르브산(비타민 C), (+)-α-토코페롤(비타민 E)을 포함하는 군으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 생체활성 분자를 포함한다. 더 바람직하게는, 생체활성 분자는 히알우론산; 비트로넥틴; 암피레귤린; 인터류킨 19(IL-19); 인터류킨 24(IL-24); 형질전환 성장 인자-알파 (TGF-α); VEGF; 및 피브로넥틴을 포함하는 군으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 생체활성 분자를 포함한다.
본 발명의 막 매트릭스는 장치의 형태에서 다중 막의 복합체로서 제조될 수 있다. 이러한 상황에서, 장치는 2개 이상의 막 층을 가질 수 있다. 각각의 층은 동일한 또는 상이한 특징에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 대안적인 형태에서, 복합 장치는 하나 이상의 막이 또 다른 표면 위에 적층되는 경우 제조될 수 있다. 이 표면은 장치가 이용되게 하는 방식으로 사용하기에 적합한 임의의 재료로 제조될 수 있다. 막이 조직 엔지니어링에 사용되는 경우, 막이 적층되는 표면은 바람직하게는 생체적합성인 유형이다. 표면은 막보다 더 경질이거나 더 큰 인장 강도를 갖는 또 다른 재료로부터 제조될 수 있다.
막이 장치로서 제조되는 경우, 장치에서 하나 이상의 막 층이 존재할 수 있다. 장치에서의 각각의 층의 두께는 대략 10마이크론 내지 대략 2㎜로 변할 것이다. 바람직하게는, 막이 대체품으로서 사용되는 경우, 고막은 대략 5 내지 대략 100㎛의 두께를 가질 것이다. 가장 바람직하게는, 하나 이상의 막 층은 대략 10 내지 대략 80㎛의 조합된 두께를 갖는다.
본 발명의 장치가 본 발명의 방법에 의해 제조된 것과 다른 재료로부터 제조된 층을 포함하는 경우, 이 재료는 임의의 소스, 예컨대 치료된 대상체에 비자가유래 소스일 수 있다. 이러한 재료는 비포유류 소스일 수 있다. 대안적으로, 이것은, 무엇보다, 고막, 심막, 뼈막, 진피, 근막을 포함하는 비자가유래 포유류 막으로부터의 탈세포화 조직을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 이러한 추가 재료는 특히 장치가 재건 수술에 배치되는 경우 적절할 수 있다.
실크 피브로인 막 매트릭스의 제작
제3 양태에서, 본 발명은
a. 고치 또는 섬유로부터 세리신의 제거 후 실크 단백질 또는 실크 단백질 복합체 용액을 제조하는 단계;
b. 용매를 사용하여 생체적합성 폴리우레탄 및 실크 피브로인을 용해시키는 단계; 및
c. 제조된 용액을 건조하여 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 복합체를 제조하는 단계를 포함하는, 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스를 제작하는 방법을 제공한다.
이후, 생성된 생성물은 필름 또는 막을 형성하도록 막 몰드로 캐스팅된다. 이 필름은, 기계적 특성 및 구조 특징에 대해 평가될 때, 아마도 필름에서 안정화하는 수소 결합된 가교결합으로서 β-시트의 형성에서 실크 피브로인 결정화 거동에 영향을 미침으로써 일어나는, 증대된 기계적 특성을 나타낸다.
제작의 이 방법의 단계 (b)에 따라, 생체적합성 폴리우레탄 및 실크 피브로인은 용매, 예컨대 헥사플루오로아이소프로판올, N,N-다이메틸아세트아마이드(DMAc) 또는 다이메틸폼아마이드(DMF)를 사용하여 용해된다. 바람직하게는, 생체적합성 폴리우레탄 및 실크 피브로인은 용매, 예컨대 헥사플루오로아이소프로판올, N,N-다이메틸아세트아마이드(DMAc) 또는 다이메틸폼아마이드(DMF) 중에 용해된 염, 예컨대 LiBr을 사용하여 용해된다.
대안적으로, 피브로인은 산, 예컨대 인산, 폼산, 황산, 염산의 농축 수성 용액 또는 염의 농축 수성, 유기 및 수성-유기 용액 중에 용해될 수 있다. 실크는 또한 유기 용매(다이메틸아세트아마이드(DMAc) 및 다이메틸폼아마이드(DMF)) 중에 리튬 할라이드 중에 가용성이다. 예를 들어, 피브로인의 10.0% 용액이 DMAA 또는 DMF 중의 LiBr의 2 내지 3M 용액 및 물 중의 LiBr의 9.5 내지 10M 용액 중에 50C에서 얻어질 수 있다. 피브로인은 또한 산(인산, 폼산, 황산, 염산)의 농축 수성 용액 및 염의 농축 수성, 유기 및 수성 유기 용액, 예컨대 LiCNS, LiBr, CaCl2, Ca(CNS)2, ZnCl2, NH4CNS, CuSO4 + NH4OH, Ca(NO3)2 중에 용해한다. ZnCl2의 추가의 수성 용액은 가장 효과적인 용매인 한편, DMAA, DMF 및 N-메틸-2-피롤리돈 중의 ZnCl2의 용액 중에, 피브로인은 155C에서 오직 용해하여 비교적 희석 용액(1.0 2.0중량%)을 형성한다. LiCl, LiBr, NaSCN 및 KSCN의 수성 및 수성-유기 용액은 또한 20중량% 이하의 피브로인을 용해시키고; 혼합물의 용해력은 용매 중의 물의 상대 함량의 감소에 따라 증가한다: 문헌[Sashina et al., 2006 RUSSIAN JOURNAL OF APPLIED CHEMISTRY Vol. 79 No. 6 869 to 876](이의 완전한 텍스트는 본 명세서에 참고로 포함됨)을 참고한다.
고치 또는 로우 실크로부터의 세리신의 제거의 공정은 탈검이라 불린다. 이러한 탈검 공정은 당해 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 탈검 공정의 예는 (1) 알칼리 수성 용액 중의 비누, 탄산나트륨 등의 비등의 방법, (2) 아스퍼질러스 종(Aspergillus sp.) 등으로부터 추출된 프로테아제를 사용한 탈검 방법, 및 (3) 높은 온도 및 높은 압력 포트를 사용한 높은 온도 높은 압력 방법을 포함한다.
본 발명의 제2 양태의 하나의 예시적인 형태에서, 제작 방법은
a) 실크 섬유를 탈검시키는 단계;
b) 단계 (a)의 탈검된 섬유를 건조시키고 캬오트로픽 염에서 생성물을 용해시키는 단계;
c) dH2O에 대해 단계 (b)의 실크 용액을 투석하여 실크 용액을 얻는 단계;
d) 단계 (c)의 실크 용액을 동결 건조시키는 단계;
e) 폴리우레탄을 첨가하고, 단계 (d)의 조성물을 용매, 예컨대 헥사플루오로아이소프로판올, N,N-다이메틸아세트아마이드 또는 다이메틸폼아마이드 중에 용해시키는 단계; 및
f) 막 매트릭스로 단계 (e)의 용액을 제작하는 단계를 포함한다.
실크 단백질 또는 실크 단백질 복합체 용액은 브롬화리튬(LiBr), 염화리튬(LiCl2), 염화아연(ZnCl2) 및 염화칼슘(CaCl2), 티오사이안화리튬(LiSCN)으로부터 선택된 것을 포함하는 적어도 하나의 화합물 또는 에탄올 수성 용액으로 구성된 캬오트로픽 염을 사용하여 용해될 수 있다. 바람직하게는, 브롬화리튬을 사용한다.
본 발명의 또 다른 예시적인 형태에서, 제작 방법은
a) 실크 섬유를 탈검시키는 단계;
b) 단계 (a)의 탈검된 섬유를 건조시키고 캬오트로픽 염 용액에서 생성물을 용해시키는 단계;
c) dH2O에 대해 단계 (b)의 실크 용액을 투석하여 실크 용액을 얻는 단계;
d) 단계 (c)의 실크 용액을 동결 건조시켜 실크 폼을 형성하는 단계;
e) 생체적합성 폴리우레탄을 용매, 예컨대 헥사플루오로아이소프로판올(HFIP), N,N-다이메틸아세트아마이드(DMAc) 또는 다이메틸폼아마이드(DMF) 중에 용해시킨 후, 이것을 막 몰드에 캐스팅하여 증발시키는 단계; 또는
f) 가열에 의해 생체적합성 폴리우레탄을 용해시키고, (f1) 이것을 막 몰드로 캐스팅하여 냉각시키거나, (f2) 막 몰드로 사출 성형하고 막이 냉각되게 하는 단계; 및
g) 선택적으로 단계 (e) 또는 (f)의 막의 표면을 플라스마의 적용, 바이오분자 또는 계면활성제의 흡착, 친수성 화합물의 공유 그래프팅, 중합, uv 처리, 화학 에칭, 오존 처리, 층 대 층 흡착, 전기침착 또는 전기화학 에칭 중 적어도 하나에 의해 처리하는 단계;
h) 단계 (c)의 수성 실크 생성물을 사용하여 단계 (e) 또는 (f)의 막을 코팅하는 단계; 또는
i) 적합한 용매, 예컨대 HFIP 또는 폼산 중에 단계 (d)의 실크 폼을 용해시키고, 단계 (e) 또는 (f)의 막을 코팅하는 단계를 포함한다.
이과학적 복원을 위한 장치
제4 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 막 매트릭스를 포함하는 이과학적 병태, 예컨대 천공, 특히 만성 천공의 복원을 위한 장치를 제공한다.
바람직하게는, 본 명세서에 기재된 실크 피브로인 막은 고막 천공의 복원을 위해 제작된다. 이러한 복원에 적합한 막 매트릭스는 바람직하게는 5MPa 내지 100MPa, 더 바람직하게는 대략 10MPa 내지 95MPa의 인장 강도, 바람직하게는 대략 10 내지 대략 50MPa의 인장 강도를 가질 것이다.
이러한 막이 고막의 천공의 복원에 사용될 때, 막은 음파를 전도해야 한다. 이와 관련하여, 본 발명의 막은 원래의 고막 또는 고막 재건에 사용된 연골과 실질적으로 일치하거나 이보다 큰 구조음향 특성을 보유해야 한다. 구조음향 특성은 상기 기재된 바와 같은 장치의 인장 강도, 탄성 및 두께와 관련된다. 추가로, 중이 소골편에 대한 음파 전송은 또한 장치의 "강성"에 따라 달라진다. 강성은 청력 결과에서의 본 개선에 큰 천공에서 중요한 문제이다. 하나 이상의 막의 특정한 인장 강도는 배치 직후 막에 의해 치료되는 대상체에 대한 개선된 청력 결과를 생성시키는 최적 음향 전송을 수월하게 한다.
바람직하게는, 본 명세서에 기재된 막은 생체내 중이에 20Hz 내지 20KHz의 음파를 전도하도록 강도, 탄성, 두께 및 "강성"을 가질 것이다.
본 명세서에 기재된 발명의 임의의 엔지니어링된 막 작제물은 재건 수술에 채택된 막 주위의 말초 스커트를 보유할 수 있다. 이것은 고실륜 이외에 또는 이의 일부로서 일 수 있다. 이와 관련하여, 장치는 이의 말초에서 실질적으로 두꺼워져서, 꼭지돌기염, 만성 억제성 중이염 또는 진주종의 치료의 일부로서 수행된 막이 꼭지돌기절제 수술(라디칼 꼭지돌기절제술, 관벽 하향 꼭지돌기절제술, 관벽 상향 꼭지돌기절제술, 피질 꼭지돌기절제술, 변형 라디칼 꼭지돌기절제술 포함)에서 사용되게 할 수 있다.
실크 막의 맥락에서 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "말초"는 막의 면을 포함하는 경계 선을 의미한다. 막의 말초는 반드시 원형이지 않고, 막의 동일한 두께일 필요는 없다. 예를 들어, 막의 말초는 5㎜ 두께 이하 내지 10마이크론일 수 있고, 사이의 임의의 두께를 포함할 것이다.
본 명세서에 기재된 막이 말초 스커트를 도입할 수 있지만, 막은 생체내 중이에 20Hz 내지 20KHz의 음파를 전도할 것이다.
바람직한 실시형태에서, 막은 5MPa 내지 100MPa의 인장 강도를 갖는다.
본 발명의 막은 원래의 고막 또는 고막 재건에 사용된 연골과 실질적으로 일치하거나 이보다 큰 구조음향 특성을 보유한다.
이러한 치료를 요하는 대상체의 고막의 복원에 사용될 때, 막은 중이 소골편에 20Hz 내지 20KHz의 음파를 전송할 수 있다.
구조음향 특성은 장치의 인장 강도, 탄성 및 두께와 관련된다. 이들은 바람직하게는 소리의 전도에 최적화된다.
중이 소골편에 대한 음파 전송은 장치의 "강성"에 따라 달라진다. 강성은 또한 청력 결과에서의 본 개선에 큰 천공에서 중요한 문제이다. 하나 이상의 막의 특정한 강성은 배치 직후 장치에 의해 치료되는 대상체에 대한 개선된 청력 결과를 생성시키는 최적 음향 전송을 수월하게 하고 파열에 대한 저항을 제공한다.
본 발명의 막의 장치는 또한 5MPa 내지 100MPa의 인장 강도를 보유한다. 이 값은 천공 및 음향 특성의 크기를 실질적으로 일치시키도록 범위 내로부터 선택된다.
바람직한 실시형태에서, 장치는 10MPa 내지 50MPa의 인장 강도를 갖는다. 더 바람직하게는, 본 발명의 장치는 30MPa 내지 50MPa의 인장 강도를 갖는다. 이러한 인장 강도는 천공에 대한 대부분의 흔한 부위인 긴장부에서 천공을 치료하는 데 특히 유용하다.
본 발명이 고막 천공, 특히 만성 천공의 복원을 위한 막을 제공하는 경우, 막 매트릭스 층은 막의 반대 측에 2개의 타원형 또는 실질적으로 원형인 면을 갖는 실질적으로 디스크 유사 형상이다. 바람직하게는, 면 중 하나 또는 둘 다는 대략 3㎜ 및 대략 25㎜, 더 바람직하게는 대략 10㎜ 내지 대략 20㎜의 직경을 갖는다. 바람직하게는, 장치의 하나 또는 둘 다의 타원형 면은 대략 9㎜ 및 대략 8㎜의 직경을 갖는다. 훨씬 더 바람직하게는, 장치의 하나 또는 둘 다의 타원형 면은 대략 6㎜ 및 대략 5㎜의 직경을 갖는다. 가장 바람직하게는, 장치의 하나 또는 둘 다의 면은 실질적으로 원형이고, 대략 9.5 내지 10㎜ 및 범위 5 내지 15㎜의 최적 직경을 갖는다.
본 발명의 막 매트릭스는 복원하고자 하는 영역의 크기 및 형상에 일치하도록 제조 후 트리밍될 수 있다. 이 트리밍은 적절한 절단 장치, 예컨대 수술 가위를 사용하여 수행될 수 있다. 장치는 또한 장치의 유연성 또는 벤딩성을 개선하도록, 또는 이것이 폴딩하고 이의 폴딩된 입체형태를 실질적으로 유지시키도록 장치의 하나 이상의 표면에서 홈을 금을 긋거나 절단함으로써 제조 후 조작될 수 있다.
또한, 막은 다른 특성을 제시할 수 있다. 본 발명은 이 바람직한 특성에 관해 이제 기재될 것이다.
A. 투명도
본 발명의 장치는 적어도 부분적으로 반투명이다. 바람직하게는, 장치에 의해 치료된 대상체의 고막 및 중이의 치료 후 검사를 도울 수 있도록 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 9091, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 99 및 100% 투명.
본 발명의 장치는 비손상된 고막에 유사하게 투명 또는 반투명일 수 있다. 이는 또한 장치를 사용한 고막의 복원 후 추적관찰 동안 감염 또는 결함을 위해 대상체의 중이의 검사가 가능하게 한다.
B. 생체분해성
바람직한 형태에서, 장치는 적어도 12개월의 생물학적 수명을 갖는 생체분해성이다. 바람직하게는, 장치는 적어도 36개월의 수명 기재치를 가질 것이다.
완전한 또는 실질적으로 완전한 상처 폐쇄가 발생하는 이러한 시간까지 장치가 제자리에 머물러야 하므로, 12개월 내지 36개월의 생체내 생물학적 수명이 바람직하다. 통상적으로, 조직 엔지니어링에서, 가능한 장기간 합병증, 예컨대 낭종 형성을 막도록 최소 시간의 양 동안 생체내 장치를 갖는 것이 유리하다. 예를 들어, 작은 천공은 비교적 짧은 기간(폐쇄를 위한 대략 2주와 완전한 개형을 위한 4주 내지 6주)에 치유할 수 있는 한편, 더 큰 천공은 신생 고막의 완전한 세포 개형을 위해 12개월 이하를 요하여 상당히 더 길게 걸릴 수 있다. 장치의 생물기계적 특성은 장치를 사용하여 치료된 대상체에서 진주종을 포함하는 레이저 합병증, 예컨대 비대증 및 말려들어감을 실질적으로 막도록 선택된다.
C. 세포 부착
본 발명의 실시형태에서, 막은 막에 걸친 세포의 효율적인 성장 및 증식을 위해 세포 부착을 수월하게 하도록 채택된다.
임의의 유형의 세포는 도너로부터, 확립된 세포 배양 라인으로부터, 또는 분자 또는 유전자 수단에 의해 심지어 세포 변형 전에 또는 후에 얻어진 바대로, 케라틴세포, 근골격계의 세포, 예컨대 연골세포, 섬유아세포, 근육 세포 및 골세포 및 줄기 세포(예를 들어, 배아 줄기, 성체 줄기 세포, 및 유도 다능성 줄기 세포 포함), 및 이들의 조합을 포함하여 배양 및 가능한 이식을 위해 조직 조작된 작제물에 첨가될 수 있다. 조직의 조각은 상이한 세포 유형에 의해 작제물을 생착시키도록 또한 사용될 수 있다. 바람직하게는, 막 구조는 사용될 때 예컨대 진주종에서 중이로의 케라틴세포의 이동을 막도록 중이로이 이것을 통한 세포의 침윤을 제거하거나 막는다.
이 실시형태의 일 형태에서, 막은 대략 0.001㎛ 내지 대략 5㎛의 범위인 기공 또는 표면 변형을 보유할 것이다. 이 실시형태의 또 다른 형태에서, 막의 바디 내의 기공은 중간 층의 세포 침투 및 조직 형성을 수월하게 하도록 대략 5㎛ 내지 대략 200㎛의 직경을 갖는다.
기공이 막에 존재할 때, 이것은 이러한 치료를 요하는 대상체로 이식 시 숙주 조직 통합을 수월하게 하도록 새로운 조직 형성 및 개형을 위한 보이드 용적을 제공할 것이다. 이와 관련하여, 장치는 기계적 안정성을 또한 유지하면서 효율적인 영양소 및 대사물질 운반을 허용하는 구조를 제공한다.
표면 기공 또는 변형은 존재할 때 이러한 치료를 요하는 대상체의 천공된 고막 또는 외이도에 그래프팅될 때 적어도 케라틴세포의 증식, 이동 및/또는 부착을 지지할 것이다. 이것은 손상, 예컨대 만성 천공으로부터 고막의 복원 및 재생을 수월하게 하기 위한 것이다. 따라서, 본 발명의 장치는 천연 상처 치유 과정을 통해 만성 고막 천공 또는 외이도 연조직 및 골의 결함성 부분의 가속된 폐쇄가 가능하게 하는 스캐폴드를 제공한다.
D. 두께
본 발명의 장치의 두께는 막으로부터 필요한 구조음향 특성 및 기계적 특성, 막 층의 수 또는 장치를 사용하여 치료된 대상체에서 고막 천공 또는 외이도의 결함성 부분의 크기와 같은 인자에 따라 변할 것이다. 본 발명에 따라, 막은 중이 소골편에 20Hz 및 20KHz의 음파를 전송해야 한다. 이 매개변수의 국한 내에, 막은 본 발명의 방법에 따라 제조된 단일 층으로서 제조될 수 있다. 대안적으로, 장치는 일련의 상이한 재료로부터 제조된 다른 층과 함께 본 발명의 방법의 생성물에 의해 형성된 복수의 층을 가질 수 있다. 복수의 층이 존재하는 경우, 장치의 막 부분은 중이 소골편에 대해 20Hz 내지 20KHz의 음파를 전송할 수 있다.
중이 소골편에 20Hz 내지 20kHz의 음파를 전송하는 장치의 막 부분이 제공되고, 막의 스커트는 더 큰 두께일 수 있다. 이것은 재건 수술이 적절한 경우 바람직하다. 이와 관련하여, 장치는 꼭지돌기염, 만성 화농성 중이염 또는 진주종에 대한 치료의 부분으로서 수행된 꼭지돌기절제술(라디칼 꼭지돌기절제술, 관벽 하향 꼭지돌기절제술, 관벽 상향 꼭지돌기절제술, 피질 꼭지돌기절제술, 변형 라디칼 꼭지돌기절제술 포함) 동안 수술 요건을 수용하도록 이의 말초에서 실질적으로 두꺼워질 수 있다.
실크 막의 맥락에서 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "말초"는 막의 면을 포함하는 경계 선을 의미한다. 막의 말초는 반드시 원형이지 않고, 막의 동일한 두께일 필요는 없다. 예를 들어, 막의 말초는 5㎜ 두께 이하 내지 10마이크론일 수 있고, 사이의 임의의 두께를 포함할 것이다.
본 발명을 기술할 목적을 위해, 용어 "막", "막 매트릭스", "막 층", "막 매트릭스 층", "섬유성 막" 및 "필름"은 상호 교환되어 사용될 수 있다.
바람직한 형태에서, 장치는 서로에 인접하게 적층된 1개 내지 3개의 막을 갖는다. 따라서, 장치는 단일 막, 2개의 막 또는 3개의 막으로 이루어질 수 있다.
장치의 막 층은 장치의 외부에서 하나 이상의 막의 노출된 면 사이에 거리로서 측정된 두께를 갖는다.
막 층은 대략 1 내지 대략 600마이크론의 조합된 두께를 가질 것이다. 그렇지만, 상기 두께는 중이 소골편에 20Hz 내지 20KHz의 음파를 전송하도록 선택되어야 한다. 이 매개변수의 범위 내의 막의 작제물에서의 변동성은 인식되어야 한다. 바람직하게는, 이 매개변수를 만족시키는 막 층은 대략 10 내지 대략 300마이크론의 조합된 두께를 갖는다. 가장 바람직하게는, 막 층은 대략 30 내지 대략 150마이크론의 조합된 두께를 갖는다. 예시에 의해, 막 층은 대략 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590 및 대략 600마이크론의 조합된 두께를 갖는다.
막이 하나 초과의 층을 포함하는 경우, 적어도 하나의 층은 섬유성 재료를 포함할 수 있다.
다양한 양태에서, 적어도 본 발명의 방법에 따라 제조된 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스를 포함하는 제1 층 및 제1 층과 동일하거나 상이할 수 있는 재료의 조성을 갖는 제2 층을 포함하는 섬유성 막이 개시되어 있다. 다중 층이 존재하는 경우, 층은 바람직하게는 각각의 층에서의 임의의 섬유가 정렬되도록 배열될 것이다.
실크 막은 추가 가소제, 젤라틴, 콜라겐, 키토산, 알긴산, 히알우론산, 플루로닉 127 및 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)로부터 선택된 적어도 하나의 첨가제를 포함할 수 있다.
E. 층 조성물
본 발명의 일 실시형태에서, 장치는 다중 층을 포함할 수 있고, 적어도 하나의 층은 실크 피브로인으로 이루어지고, 적어도 하나의 층은 생체적합성 중합체로 이루어진다.
또 다른 실시형태에서, 장치는 다중 층을 포함할 수 있고, 적어도 하나의 층은 실크 피브로인 막 매트릭스로 이루어지고/지거나, 적어도 하나의 층은 생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스로 이루어지고/지거나, 적어도 하나의 층은 조합된 실크 피브로인/생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 다중 층이 존재할 수 있고, 적어도 하나의 층은 본 발명에 따른 막 매트릭스이고, 적어도 하나의 층은 본 발명의 것과 다른 재료로 이루어진다.
이 실시형태에서, 장치를 제조하기 위해 사용된 막의 층에 사용될 수 있는 재료는 히알우론산 기반 하이드로겔(Carbylan) 및 필름(Seprafilm); 칼슘 알기네이트; 폴리(글라이세롤 세바케이트); 물 가용성 및 불용성 키토산; 및 콜라겐을 포함하는 군으로부터 선택된 임의의 재료를 포함한다.
콜라겐은 주요 세포외 매트릭스 성분이고, 높은 인장 강도, 가요성, 비반응성, 비독성 및 비발암성을 포함하는 물리적 특성을 갖는다. 고막의 프로프리아층(lamina propria)의 주요 구성성분으로서, 콜라겐은 고막의 회복력 및 통합성을 유지시키는 것을 돕고, 그래서 청력에서 중요한 역할을 한다.
장치에 사용된 하나 이상의 층은 가소제를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 장치는 장치가 사용 전에 건조 상태로 유지 가능하도록, 무엇보다, 글라이세롤, 젤라틴, 키토산, 알긴산, 히알우론산, 플루로닉 127, 지방족 폴리에스테르, 폴리(알킬렌) 옥사이드, 폴리(L-락트산), 70/30 L-락타이드/e-카프로락톤 공중합체, 폴리(카프로락톤), 폴리(DL-락타이드-코-카프로락톤), 폴리(D-락타이드-코-카프로락톤), 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤), 폴리(락타이드-코-글리콜산), 폴리(비닐피롤리딘), 폴리(다이메틸실록산), 폴리(라이신), 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴, 알기네이트, 피브린, 히알우론산, 프로테오글라이칸, 폴리펩타이드, 폴리(에틸렌-코-비닐) 알코올, 폴리(비닐) 알코올, 폴리(에틸렌)글리콜, 폴리(프로필렌)글리콜, 폴리-L-락타이드-코-글리콜라이드-코-ε-카프로락톤, 폴리(테트라플루오로에틸렌), 폴리(다이옥사논), 폴리글락틴 910 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 하나 이상의 가교결합제는 실크 및 폴리우레탄을 공유로 결합시키도록 또한 사용될 수 있다. (실크와 함께) 사용된 예는 글루타르알데하이드, 게니핀, 겨자무과산화효소(HRP)와 과산화수소(H2O2), 타이로시나제(예를 들어, 버섯 타이로시나제) 또는 트랜스글루타마제(예를 들어, 미생물 트랜스글루타마제) - 효소 가교결합, 에틸렌 글리콜계 시스템: 예를 들어 폴리에틸렌 다이글라이시딜 에테르(PEGDE), 에틸렌 글리콜, 다이글라이시딜 에테르(EGDE), 트리스(2,2'-바이피리딜)다이클로로루테늄(II) 6수화물과 과황산나트륨(SPS) 또는 과황산암모늄(APS) 및, 1-에틸-3,3-다이메틸아미노프로필-카보다이이미드(EDC)-N-하이드록시숙신이미드를 포함한다.
지방족 폴리에스테르는 D-락타이드, L-락타이드, 폴리(락트산), 폴리(락타이드)글리콜산, 폴리(글리콜산), 폴리(글리콜라이드), 글리콜라이드, 폴리(락타이드-코-글리콜라이드), 폴리(락트산-코-글리콜산), 엡실론-카프로락톤, 폴리(엡실론-카프로락톤) 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 폴리(알킬렌) 옥사이드는 폴리(에틸렌) 옥사이드 및 폴리(프로필렌) 옥사이드로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 장치가 본 발명의 방법에 의해 제조된 것과 다른 재료로부터 제조된 층을 포함하는 경우, 이 재료는 임의의 소스, 예컨대 치료된 대상체에 비자가유래 소스일 수 있다. 이러한 재료는 비포유류 소스일 수 있다. 대안적으로, 이것은, 무엇보다, 고막, 심막, 뼈막, 진피, 근막을 포함하는 비자가유래 포유류 막으로부터의 탈세포화 조직을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 이러한 추가 재료는 특히 장치가 재건 수술에 배치되는 경우 적절할 수 있다.
F. 막 매트릭스에서의 활성제
실시형태에서, 막 매트릭스는 적어도 1종의 활성제를 포함한다. 활성제는 세포, 단백질, 펩타이드, 핵산 유사체, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 핵산, 압타머, 항체 또는 이의 단편 또는 부분, 호르몬, 호르몬 길항제, 성장 인자 또는 재조합 성장 인자 및 이의 단편 및 변이체, 사이토카인, 효소, 항생제 또는 항박테리아제/항미생물 화합물, 바이러스, 항바이러스제, 독소, 프로드럭, 화학치료제, 소분자, 약물, 또는 이들의 조합물일 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 막은 생체내 이식, 및 시험관내 배양 후 고막 케라틴세포의 증식, 이동 및/또는 부착을 지지하는 일련의 생체적합성 활성제를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 장치가 비교적 연질인 것을 제공하는 생체재료가 선택된다.
이 실시형태에 따라, 실크 피브로인 및/또는 생체적합성 폴리우레탄 용액을 적어도 1종의 활성제(여기서, 활성제는 용매, 예컨대 헥사플루오로아이소프로판올 또는 다이메틸폼아마이드 처리에 의해 탈활성화되지 않음); 용액을 필름 지지 표면에 캐스팅하는 단계; 및 필름을 건조시키는 단계를 포함하는 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스에서 적어도 1종의 활성제를 임베딩하는 방법이 제공된다.
대안적인 실시형태에서, 본 발명에 따라 제조된 실크 피브로인 및/또는 생체적합성 폴리우레탄 용액을 필름 지지 표면에 캐스팅하는 단계; 및 활성제의 존재 하에 필름을 건조시키는 단계를 포함하는 적어도 1종의 활성제를 막 매트릭스로 함침시키는 방법이 제공된다.
본 발명의 막으로 도입되거나 침지된 생체활성 분자는 고막의 세포의 성장을 돕거나 촉진하는 물질을 포함한다. 생체활성 분자는 장치의 표면에 결합되거나 장치의 기공에 위치할 수 있다.
생체활성 분자는 비타민, 단백질, 펩타이드, 효소, 탄수화물, 보인자, 뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA 또는 이의 유도체), 소형 유기 분자(예를 들어, 약물), 항생제, 항바이러스제, 항미생물제, 소염제, 항증식제, 사이토카인, 단백질 저해제, 항히스타민제의 군으로부터 선택된 분자를 포함한다. 바람직하게는, 생체활성 분자는 상피 성장 인자, 예를 들어 상피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장 인자-알파(TGF-α), 형질전환 성장 인자-베타(TGF-ß) 헤어핀 결합 상피 성장 인자(HB-EGF), 암피레귤린, 에피겐, 에피레귤린, 베타셀룰린; 섬유아세포 성장 인자, 예를 들어 산성 섬유아세포 성장 인자(FGF-1/aFGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF-2/bFGF); 케라틴세포 성장 인자, 예를 들어 케라틴세포 성장 인자 1(KGF-1/FGF-7), 케라틴세포 성장 인자 2(KGF-2/FGF-10); 인슐린 유사 성장 인자, 예를 들어 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1), 인슐린 유사 성장 인자 2(IGF-2); 혈소판 유래 성장 인자, 예를 들어 혈관 내피 성장 인자 165(VEGF165), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 사이토카인, 예를 들어 IL-6, IL-19, IL-24; 세포외 매트릭스 단백질, 예를 들어 히알우론산, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌; 및 비타민, 예를 들어 트랜스-레티노산(비타민 A), L-아스코르브산(비타민 C), (+)-α-토코페롤(비타민 E)을 포함하는 군으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 생체활성 분자를 포함한다. 더 바람직하게는, 생체활성 분자는 히알우론산; 비트로넥틴; 암피레귤린; 인터류킨 19(IL-19); 인터류킨 24(IL-24); 형질전환 성장 인자-알파 (TGF-α); VEGF; 및 피브로넥틴을 포함하는 군으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 생체활성 분자를 포함한다.
생체활성 분자의 농도는 바람직하게는 5ng/㎖ 내지 150㎍/㎖이다.
히알우론산이 실크 막에 존재할 때, 이것은 바람직하게는 대략 1㎍/㎖ 내지 대략 10㎍/㎖, 더 바람직하게는 대략 5㎍/㎖의 농도일 것이다.
비트로넥틴이 실크 막에 존재할 때, 이것은 바람직하게는 대략 0.1㎍/㎖ 내지 대략 1.0㎍/㎖, 더 바람직하게는 대략 0.5㎍/㎖의 농도일 것이다.
암피레귤린이 실크 막에 존재할 때, 이것은 바람직하게는 대략 20ng/㎖ 내지 대략 100ng/㎖, 더 바람직하게는 대략 60ng/㎖의 농도일 것이다.
IL-19 또는 IL-24가 실크 막에 존재할 때, 이것은 바람직하게는 대략 20ng/㎖ 내지 대략 100ng/㎖, 더 바람직하게는 대략 60ng/㎖의 농도일 것이다.
TGF-α가 실크 막에 존재할 때, 이것은 바람직하게는 대략 20ng/㎖ 내지 대략 140ng/㎖, 더 바람직하게는 대략 80ng/㎖의 농도일 것이다.
VEGF가 실크 막에 존재할 때, 이것은 바람직하게는 대략 60ng/㎖ 내지 대략 200ng/㎖, 더 바람직하게는 대략 100ng/㎖의 농도일 것이다.
본 발명의 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막은 의학 장치의 형성에 사용될 수 있다. 생체활성 분자는 장치의 형성 동안 첨가될 수 있고/있거나, 장치가 형성된 후 및/또는 장치의 이식 또는 그래프팅 동안 장치에 별개로 첨가될 수 있다.
장치는, 제한 없이, 개별적으로 또는 임의의 조합으로 본 명세서에 기재된 임의의 화합물을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 생체활성 분자는 즉시 방출 또는 연장된 방출을 위해 공지된 방법에 의해 제제화될 수 있다. 추가적으로, 장치는 상이한 방식으로 2개 이상의 생체활성 분자를 포함할 수 있고, 예를 들어 무엇보다, 장치는 하나의 생물학적 활성 화합물에 의해 함침되고 또 다른 것에 의해 코팅될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 장치는 연장된 방출을 위해 제제화된 하나의 생체활성 분자 및 즉시 방출을 위해 제제화된 제2 생물학적 활성 화합물을 포함한다.
고막의 복원을 포함하는 상처 치유는 충분한 영양을 필요로 한다. 상처 치유 영양소는 아연, 철, 비타민 C, 아르기닌의 소스, 및 다른 생체활성 분자를 포함한다. 따라서, 장치는 상처 치유에 필요한 하나 이상의 이들 영양소의 생리학적으로 이용 가능한 형태에 의해 함침되거나 코팅될 수 있다. 이 영양소가 연장된 방출에 대해 제제화되는 것이 바람직하다.
바람직한 실시형태에서, 면역조정제로서 사용되는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드(항생제 포함)는 바람직하게는 고막 또는 외이도의 결함성 부분에 대한 복원을 요하는 대상체와 동일한 종으로부터 유래된다. 예를 들어, 대상체가 인간인 경우, 면역조정제로서 사용되는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 바람직하게는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 대한 면역 반응의 가능성을 감소시키기 위해 인간이거나 인간화된다.
생체활성 분자는, 이러한 치료를 요하는 대상체에 대한 고막에서의 천공 또는 외이도의 결함성 부분을 폐쇄하는 것을 촉진하도록 이식편으로서 사용되면서, 생체내 장치 위로 또는 장치로 고막 케라틴세포 및 점막 세포를 포함하는 세포의 성장, 이동 및/또는 증식을 증대시키는 것으로 고려된다. 게다가, 이 생체활성 분자가 실질적으로 발병전 상태의 것에 대한 기능을 복구하려는 의도로 상처 부위의 치유 후 개형을 허용하도록 생물학적 신호를 제공하여서, 상기 대상체에 대한 장기간에 치유 및 청각 결과를 증대시킬 것으로 예상된다. 본 발명의 장치는 생체활성 분자를 포함하지 않을 수 있지만, 이러한 치료를 요하는 대상체에서 고막 또는 외이도를 복원하기 위한 폐쇄 시간은 생체활성 분자를 포함하는 장치의 사용과 비교할 때 감소할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 제조된 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막은 헤비 듀티 또는 고강도 재건 분야에 이르는 다양한 분야에 채택될 수 있다. 예를 들어, 막의 말초 스커트는 재건 재료 또는 조직 엔지니어링 또는 재건 스캐폴드를 형성하도록 채택될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 복합 재료는 정형외과 분야에 대한 수술 도구로서 채택될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 복합 재료는 골 스캐폴드 재료를 형성하도록 채택될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 골 스캐폴드 재료는 골전도성 물질, 골유도성 물질, 골원성 물질, 또는 임의의 이들의 조합물을 포함할 수 있다.
G. 제조
본 발명의 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막이 캐스팅되지만, 본 발명은 막에서 다중 층의 형성을 고려한다. 이 정도로, 본 발명의 방법에 의해 형성되지 않은 층은 장치의 제조 동안 부착되기 전에 별개로 형성될 수 있다. 대안적으로, 막 층은 장치를 폴딩함으로써 생성될 수 있다.
다층의 장치를 개발하는 데 사용하기에 적합한 추가 층을 제조하는 방법은 전기스피닝을 포함하는 스피닝; 마이크로위빙을 포함하는 위빙; 또는 캐스팅 또는 딥 코팅 중 적어도 임의의 하나 이상을 포함한다.
위빙된 방법은 마이크로 스케일에도 불구하고 표준 텍스타일 틀과 유사한 마이크로위빙 장치의 사용을 포함할 수 있다. 결과는 실질적으로 구조화된 위빙된 재료이고, 비위빙된 방법은 무엇보다 캐스팅을 포함할 수 있다. 캐스팅은 캐스팅 용기로 섬유를 함유하는 가용화된 피브로인 용액의 용적을 배치하고 액체가 증발되게 허용하여서, 피브로인 단백질의 고체 캐스트 뒤로 남게 하는 것을 수반한다.
전기스피닝은 단백질의 액체 용액으로부터 매우 미세한(마이크로 또는 나노 스케일) 피브로인 섬유를 배출시키도록 전기 전하를 이용한다. 이것은 크고 복잡한 분자를 사용한 섬유의 제조에 특히 적합하다.
장치를 제조하기 위한 이러한 방법은 장치의 표면 내에 및 상에 기공을 생성한다. 기공의 형상 및 크기는 장치를 제조하기 위해 이용된 방법에 따라 달라질 것이다.
H. 크기 및 형상
장치가 고막 복원에 사용되는 경우, 장치는 장치의 반대 층에 2개의 타원형 또는 실질적으로 원형인 면을 갖는 실질적으로 디스크 유사 형상으로 존재한다.
이러한 장치는 천공된 고막의 복원에서의 이의 사용을 수월하게 하는 임의의 크기, 형상 또는 입체구성으로 형성될 수 있다. 예를 들어, 장치는 특히 고실성형술 1형 또는 고막성형술의 맥락에서 고막 천공의 폐색을 수월하게 하는 크기, 형상 또는 입체구성으로 형성될 수 있다.
또 다른 형태에서, 장치는 외이도, 이완부 및 상고실 영역의 재건을 수월하게 하는 형상 또는 입체형태로 형성된다. 따라서, 장치는 외이도 연조직 및 골의 결함성 부분에 합치하도록 채택된다. 이것은 장치의 폴딩 또는 장치의 하나 이상의 측에 금을 긋는 것을 포함할 수 있어서, 장치의 변형 입체형태가 유지된다. 따라서, 장치의 크기, 형상 및 입체형태는 외이도의 결함성 부분을 커버하거나 이에 들어맞기에 충분할 것이다.
장치가 중이의 재건 수술에 사용되는 경우, 이것은 막의 복수의 층에 의해 형성된 스커트에 의해 둘러싸인 원래의 고막과 유사한 디스크 유사 형상을 포함한다. 스커트는 수술 동안 제거되는 조직의 재건 빌딩을 위한 기초를 제공한다.
따라서, 본 명세서에 제공된 더욱 또 다른 양태는 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막을 포함하는 적어도 1개의 층, 또는 적어도 2개의 층(여기서, 적어도 1개의 층은 실크 피브로인 막이고, 적어도 1개의 층은 생체적합성 폴리우레탄 막임)을 포함하는 골 스캐폴드 재료를 이환된 또는 손상된 골 조직의 표적 부위에 배치하는 것을 포함하는 대상체에서 이환된 또는 손상된 골 조직을 복원하거나 대체하는 방법에 관한 것이다.
몇몇 실시형태에서, 골 스캐폴드 재료는 골전도성 물질, 골유도성 물질, 골원성 물질, 또는 임의의 이들의 조합물을 추가로 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 골 스캐폴드 재료는 세포(예를 들어, 줄기 세포)를 추가로 포함할 수 있다. 이 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 골 스캐폴드 재료는 세포(들)(예를 들어, 원래의 세포 또는 외인성으로 첨가된 세포)가 성장하고 세포외 매트릭스와 대체하기 위한 일시적인, 생체분해성 지지체 도관으로 사용될 수 있어서, 시간에 따라 생물화학 특성을 추가로 개선한다.
본 발명의 장치의 전면은 고막 천공 또는 외이도의 결함성 부분의 치수에 따라 선택되는 타원형 또는 원형 이외의 형상일 수 있다.
본 발명의 장치의 전면은 다양한 크기를 포함할 수 있다. 바람직한 형태에서, 전면은 대략 10㎜ 내지 20㎜의 직경, 더 바람직하게는 대략 15㎜의 직경을 갖는 타원형 형상 또는 실질적으로 원형 형상이다. 첫째의 바람직한 형태에서, 전면은 대략 9㎜ x 대략 8㎜의 직경을 갖는 타원형 형상이다. 둘째의 바람직한 형태에서, 전면은 대략 6㎜ x 대략 5㎜의 타원형 형상이다. 셋째의 바람직한 형태에서, 전면은 대략 3㎜의 직경을 갖는 실질적으로 원형 형상이다.
장치는 전면의 외부 테두리 주위로부터 트리밍되어서, 고막 천공 또는 이용 가능한 장치보다 더 작은 외이도의 결함성 부분의 복원을 위해 상기 장치를 고객화할 수 있다.
본 발명의 장치는 복원을 요하는 고막의 영역의 크기 및 형상과 일치하도록 제조 후 트리밍될 수 있다. 이 트리밍은 적절한 절단 장치, 예컨대 레이저 절단을 이용하여 또는 수술 가위에 의해 수행될 수 있다. 장치는 또한 장치의 유연성 또는 벤딩성을 개선하도록, 또는 이것이 폴딩하고 이의 폴딩된 입체형태를 실질적으로 유지시키도록 장치의 하나 이상의 표면에서 홈에 금을 긋거나 홈을 절단함으로써 제조 후 조작될 수 있다.
바람직하게는, 양면은 대략 3㎜ 내지 대략 25㎜, 더 바람직하게는 대략 10㎜ 내지 대략 20㎜의 직경을 갖는다. 바람직하게는, 장치의 타원형 양면은 대략 9㎜ 및 대략 8㎜의 직경을 갖는다. 훨씬 더 바람직하게는, 장치의 타원형 양면은 대략 6㎜ 및 대략 5㎜의 직경을 갖는다. 가장 바람직하게는, 장치의 양면은 실질적으로 원형이고, 대략 3㎜의 직경을 갖는다.
장치의 일면 또는 양면은 절단 도구, 예컨대 카위 또는 나이프 또는 블레이드를 포함하는 다양한 상이한 도구를 사용하여 금이 그어지거나 절단될 수 있다.
I. 키트
본 발명은 또한 대상체의 외이도, 고막 천공, 및/또는 이완부의 복원에서 사용하기 위한 키트를 제공하고, 상기 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 장치를 포함한다. 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 생체활성 분자의 하나 이상의 용액을 또한 포함할 수 있다. 생체활성 분자의 하나 이상의 용액은 대상체로 장치의 이식 전의 장치에 대한 적용, 또는 이후 1회에 또는 다수의 경우에 생길 수 있는 대상체의 고막에 대한 장치의 이식 또는 그래프팅 후 장치에 대한 적용을 위한 것일 수 있다.
본 발명의 장치는 고막의 복원 또는 외이도의 재건을 수월하게 하기 위한 키트의 형태로 제공될 수 있다. 이와 관련하여, 키트에서의 장치는 랩핑 또는 용기에서 및 무균 형태로 제공될 수 있다. 키트는 동일한 또는 상이한 크기의 하나 이상의 장치 및 고막 또는 외이도의 복원을 수월하게 하는 임의의 다른 의학 장치, 일회용품 또는 약물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 키트에서의 장치는 키트 함량의 나머지로부터 별개인 무균 용기 또는 랩핑에서 제공될 것이다. 키트는 또한 천연 또는 합성 재료의 장치의 지지체, 예를 들어, 무엇보다도 플라스틱 필름 또는 시트를 포함할 수 있다. 상기 일회용품은 하나 이상의 붕대, 고막 및 둘러싼 피부를 무균화하기 위한 무균화 수단, 글러브, 무균 시트, 면봉, 항생제 크림 또는 연고를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 키트는 적어도 하나의 장치 및 하나 이상의 생체활성 분자를 포함한다. 키트는 대상체에 대한 이식 또는 그래프팅 전에 장치에 적용하기 위한 생체활성 분자를 또한 포함할 수 있다. 생체활성 분자는 하나 이상의 용액의 형태일 수 있다. 게다가 또는 대안적으로, 생체활성 분자는 장치가 이식 또는 그래프팅된 후 장치에 의해 치료된 대상체의 고막에 적용될 수 있다. 이는 즉시 및/또는 이식 후 시간 또는 일의 기간에 걸쳐 치료의 순서로 있을 수 있다.
J. 사용 방법
추가의 양태에서, 본 발명은 이러한 치료를 요하는 대상체에서 이어드럼, 더 바람직하게는 고막 천공, 예컨대 만성 고막 천공, 및/또는 결함성 이완부 및/또는 갑상연골의 복원을 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 장치를 사용하는 것을 포함한다.
본 발명은 이러한 치료를 요하는 대상체에서 고막 천공을 복원하는 방법을 추가로 제공하고, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 장치를 사용하는 것을 포함한다.
본 발명은 고막 천공을 복원하기 위한 장치의 사용이 고막의 유일한 치료일 수 있거나, 고막을 치료하거나 복원하는 과정에서 동시에 또는 동반하여 사용되는 다른 치료법 또는 치료 이외일 수 있다는 것을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 고막을 장치와 접촉시키는 것, 및 고막을 장치와 접촉시키는 것을 포함하지 않는 추가 치료를 사용하여 고막을 치료하는 것을 포함하는 고막의 복원을 제공하고, 접촉 및 추가 치료는 개별적으로 또는 함께 고막 손상의 적어도 하나의 양태에서의 측정 가능한 개선, 이의 유지 또는 이의 악화의 감소를 발생시킨다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 고막, 또는 더 바람직하게는, 고막, 예컨대 대상체의 고막의 천공된 긴장부, 및/또는 대상체의 이완부 및/또는 갑상연골에 그래프팅되거나 적용될 때 적어도 고막의 세포의 증식, 이동 및/또는 부착을 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 장치의 사용을 제공한다. 본 발명은 또한 수산화인회석 비함유 이식편을 커버하는 것을 포함하는 고실꼭지돌기절제술 후 대상체의 외이도의 재건을 위한 꼭지돌기 소멸 기법에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 장치의 용도를 제공한다.
본 발명의 장치는 고막의 모든 부분을 포함하는 고막 또는 고막 천공에서 사용될 수 있고, 대상체로부터의 자가이식편을 사용한 기존의 기법에 의해 당해 분야에 공지된 바와 같은 온레이, 언데레이 또는 심지어 인레이 기법으로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 장치는 이러한 치료를 요하는 대상체에서 천공된 고막의 복원 및 재생 및/또는 이완부 및 갑상연골을 포함하는 외이도의 재건 및 재생에서 사용하기 위한 고객화된 이식편 임플란트를 제공한다. 장치의 고객화는 원래의 형태와 실질적으로 닮도록 고막 및/또는 외이도를 포함하는 고막의 재생을 촉진하는 것을 도와서, 대상체에 대한 개선된 치유 및 청력 결과에 대한 더 양호한 기회가 가능하게 할 수 있다. 장치에서의 섬유성 중간층의 포함은 대상체에서의 비대증, 재천공 및 진주종 형성에 대한 가능성을 감소시키면서 고막이 음향적으로 더 효율적이게 만드는 데 특히 유리하다.
본 발명은 또한 이러한 치료를 요하는 대상체에서 결함성 이완부를 포함하는 외이도의 재건에서 사용하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 장치를 사용하는 단계를 포함한다. 이완부는 기술적으로 고막의 부분이고, 이것은 갑상연골이라 불리는 외이도의 인접한 골을 또한 침식시키는 진주종에서 통상적으로 관여된 영역이고, 상고실을 또한 수반할 수 있다. 따라서, 본 발명의 장치를 사용한 진주종에서의 고막의 재건은 폐쇄되고 상호연결되는 상고실 및 갑상연골의 개건을 대개 요한다.
따라서, 이 치료는 고막 천공의 복원과 함께일 수 있다. 대안적으로, 치료는 고막 천공의 복원을 갖지 않거나 이를 요하지 않는 대상체의 외이도를 재건하는 것일 수 있다.
본 발명은 또한 이어드럼, 및 구체적으로 대상체의 고막, 및/또는 이완부 또는 갑상연골로 그래프팅되거나 이식될 때 적어도 고막의 세포의 증식, 이동 및/또는 부착을 지지하기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같은 장치의 사용을 제공한다.
귀 수술에서, 꼭지돌기절제술 후 골성 외이도의 재건이 보통 필요하다. 장치는 이러한 치료를 요하는 대상체의 갑상연골의 재건에서 사용될 수 있다. 이 재건 과정에서 본 발명의 장치를 사용하는 것의 이익은 이것이 이의 다공성 구조를 통해 부위로 통합하고 혈액 공급을 도울 수 있고, 장치에서의 생체분자가 재건된 부위로 대상체 자체의 세포 및 조직의 성장을 촉진할 수 있다는 것이다.
또한, 본 발명의 장치는 만성 중이염에 대한 예컨대 꼭지돌기절제술, 예를 들어, 고실꼭지돌기절제술 동안 이환되거나 손상될 수 있는 외이도의 바닥의 재생에서 또는 이를 복원하기 위해 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 꼭지돌기 소멸은 꼭지돌기강의 크기를 감소시키도록 만성 중이염에 대한 관벽 하향 고실꼭지돌기절제술 후 표시된다. 고실꼭지틈새 또는 꼭지돌기 소멸의 다른 표시는 일시적인 골 절제(외상 또는 종양에 2차적) 및 뇌척수액 누수의 재건을 포함한다. 소멸 없이, 관벽 하향 꼭지돌기강은 지속적인 이루를 발생시키고, 청력 보조의 사용, 감염에 대한 감수성으로 인한 물 액침 편형성 및 현기증에 대한 경향에 의한 어려움으로 빈번한 강의 청소를 요할 수 있다. 대부분의 소멸 기법은 국소 플랩(예를 들어, 근육, 뼈막 또는 근막) 또는 유리 이식편(예를 들어, 골 칩 또는 파테, 연골, 지방 또는 세라믹 재료, 예컨대 수산화인회석)으로 이루어진다. 수산화인회석이 주요 동종이식편 재료인 한편, 이것은 치유 단계에서 생존 가능 조직에 의해 커버될 필요가 있다. 동종이식편, 예컨대 플라스틱 메쉬, 프로플라스트 및 다공성 폴리프로필렌은 감염으로 인해 장기간 성공적이 아니다. 프로플라스트는 지속되는 거대 세포 반응과 연관되는 것으로 밝혀졌다. 누공, 지속적인 배수 및 과립화 조직 플라스틱의 점진적인 폐지를 발생시킨다. 마지막으로, 알로플라스트는 망상 골 및 이의 줄기 세포가 없고, 한계 혈관분포를 갖는다.
따라서, 본 발명의 장치는 수산화인회석 비함유 이식편을 커버하기 위해 고실꼭지돌기절제술 후 재건을 위한 꼭지돌기 소멸 기법에서 사용될 수 있다.
장치의 또 다른 이익은 이것이 수술 발견된 적대적인 중이 환경에서 진주종, 무기폐 및 재발성 천공의 사례에서 매우 유용하게 만드는 강직성 및 안정성을 제공할 수 있다는 것이다. 실크 막에 의한 폴리우레탄의 포함은 만성 중이 질환, 예컨대 유스타키오관 기능 저하증을 갖는 환자에 대한 진행 중인 구조 지지체를 제공할 수 있는 더 오래 지속하는 이식편을 제공할 것이다.
실시예
재료 및 방법
실시예 1 - 실크 폼의 제조
다화성 봄빅스 모리(Bombyx mori) 누에로부터의 감겨진 탈검된 섬유를 북동인도에서의 제조 센터로부터 구입하였다. 섬유를 2g/ℓ의 탄산나트륨(Sigma-Aldrich(미국 미주리주 세인트 루이스)) 및 1g/ℓ의 무향 올리브 오일 비누(Vasse Virgin(호주 웨스트 오스트레일리아 윌야브럽)를 사용하여 98℃에서 30분 동안 탈검시켰다. 탈검을 회전 건조 기계(Ahiba IR Pro(미국 로렌스빌 데이터컬러))를 사용하여 수행하였다. 탈검된 섬유를 40℃에서 밤새 건조시킨 후, 60℃에서 5시간 동안 9.3M 브롬화리튬에 의해 용해시켰다. 용해된 실크 용액을 탈이온수(dH2O)에 대해 3일 동안 4℃에서 투석하여 중량측정 분석에 의해 계산된 바대로 4 내지 5% w/v의 농도의 수성 실크 용액을 얻었다. 각각의 뱃치로부터의 실크 용액을 4%로 희석하고 이후 관으로 피펫팅하고, 각각의 관에 20㎖가 있다. 용액을 -80℃ 동결기에서 24시간 동안 동결시켰다. 동결된 관을 동결기로부터 제거하고, 이의 뚜껑을 제거하고, 고무 밴드에 의해 제자리에 고정된 실험실 와이퍼(Kimwipes)에 의해 대체하고, 이후 미리 냉각된 FreeZone 동결건조기(Labconco(미국 미주리주 캔자스 시티)로 옮기고, 4일 동안 건조시켰다.
실시예 2 - 블렌딩된 실크 피브로인/폴리우레탄 막의 제조
동결 건조된 실크 폼을 메스에 의해 작은 조각으로 썰고, 폴리우레탄 펠릿과 함께 무균 원심분리 관에 첨가하였다. 이후, 2개의 재료를 실온에서 회전 혼합기에서 5시간 동안 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올(HFIP) 중에 용해시켰다. 2개의 재료의 최종 농도가 5%(w/v) 폴리우레탄 및 1.25%(w/v) 실크 피브로인(또는 1:4 실크:폴리우레탄)이도록 사용된 실크, 폴리우레탄 및 HFIP의 양을 계산하였다. 용해된 샘플을 2분 동안 7000 x g에서 원심분리하여 버블을 제거하고, 이후 55㎜ 직경 페트리 접시로 캐스팅하고, 퓸 후드에서 24시간 동안 건조되게 하였다. 모든 막의 최종 두께는 100㎛였다.
실시예 3 - UV-가시광선 분광광도법
가시광선 파장에 걸친 필름 투명도를 확산 반사 액서서리에 의해 Cary 5000 UV-가시광선 분광광도계(Agilent(미국 캘리포니아주 산타 클라라))에서 측정하였다. 샘플의 % 투과율을 700 내지 380㎚의 스캐닝에 의해 결정하였다. 샘플을 전체 투과율을 결정하기 위해 부착된 기준 표준품에 의해 그리고 다시 확산 투과율을 결정하기 위해 부착된 광 트랩에 의해 스캐닝하였다. 생성된 전체 및 확산 투과율 스캔을 각각의 필름 유형에 대해 함께 작도하였다. 각각의 샘플의 혼탁도를 380, 550 및 700㎚에서 또한 정량화하였다.
실시예 4 - 인장 기계적 특성
인장 시험을 위한 필름을 5㎜ 폭 스트립으로 썰고, 이후 인장 시험 전 적어도 48시간 동안 20℃±2℃ 및 65%±2% 상대 습도에서 컨디셔닝하였다. 인장 시험을 100N 로드 셀에 의해 모델 5967 시험기(Instron, Norwood, 미국 매사추세츠주)에서 수행하였다. 샘플을 15㎜의 게이지 길이를 사용하여 파괴까지 시험하였다. 15㎜/분의 연장 속도 및 0.1N의 프리-로드. 각각의 필름의 두께를 스트립으로 절단 전에 측정하였다; 필름을 3 소수 자리 디지털 마이크로미터(Kinchrome(호주 맬버른))를 사용하여 6 위치에서 측정하였다. 이 측정의 평균 두께를 이용하여 횡단 면적 및 후속하여 각각의 필름의 스트레스 및 변형률을 계산하였다. 적어도 3개의 필름에 걸쳐 최소 20개의 스트립을 시험하고, 인장 특성은 이 측정의 평균±표준 편차로서 표시된다.
실시예 5 - 필름 음향 특성
원형 샘플을 7.5㎜의 내부 직경을 갖는 중공 나일론 관으로 이루어진 커스텀 빌트 모델 외이도의 말단에 탑재하였다. 관의 반대 말단에 탑재된 ER-2 청각학 이어폰(Etymotic Research(미국 일리노이주 엘크 글러브 빌리지))을 사용하여 PCI 신호 생성기(PCI-6711, National Instruments(미국 오스틴))에 의해 생성된 정기적 처프 신호에 의해 샘플을 여기시켰다. 프로브 마이크로폰(ER-7C; Etymotic Research)을 사용하여 외이도 내에 동적 압력 반응을 측정하였다. 프로브를 관벽에서의 홀을 통해 공급하여서, 이것은 외이도 내의 샘플에 바로 인접하게 있었다. 상이한 재료의 음향 반응을 레이저 도플러 진동계(CLV-2534, Polytec(독일 발드브론))를 사용하여 결정하고, 이것은 클램핑된 샘플의 노출된 면을 초점화하였다.
전용 PC에 연결된 데이터 획득 카드(PCI-4462, National Instruments)를 사용하여 진동계 및 프로브 마이크로폰 둘 다로부터의 신호를 검출하였다. 빠른 푸리에 변환을 소프트웨어 패키지 Vibsoft 84 버전 5.0(Polytec(독일 발드브론))을 사용하여 12.5Hz 내지 20kHz의 주파수 범위에 걸쳐 수행하고, 전달 함수는 dB rel 1㎜/s/Pa로서 계산되었다. 제1 공명 피크의 진폭은 100Hz 하래 및 8kHz 위의 모든 주파수를 처음에 배제함으로써 계산되었다. Origin 2015를 사용하여 최대 진폭 및 상응하는 주파수를 결정하였다. 각각의 샘플에 대한 FFT 선도는 제1 공명 피크와 관련된 이 최대를 확인시키도록 나타났다. 이 측정은 샘플마다 30회 측정에 대해 결정되었다(각각의 막으로부터 펀칭된 3개의 10㎜ 디스크를 갖는 10개의 실크 막). 시험된 상이한 재료의 음파 전송 특성을 기술하도록 평균 피크 주파수 및 진폭을 이용하였다.
실시예 6 - 압력 로드 하의 필름의 측면 변위
고막 복원에 대한 재료로서 실크 필름의 적합성을 시험하기 위해, 필름에 7kPa 이하의 압력을 인가하도록 설계된 커스텀 빌트 모델 외이도에서 필름을 시험하였다. 모델은 문헌에 기재된 바와 같은 평균 인간 외이도와 일치하는 내부 치수를 갖는 나일론 플라스틱 관으로 이루어진다(Grewe et al., 2013). 필름 디스크는 고무 O-링을 갖는 스크류를 사용하여 (관의 중이 면을 나타내도록) 관의 일 말단에 대항하여 유지되는 한편, (귀의 외부 구멍을 나타내는) 관의 다른 말단을 주사기 펌프에 연결하였다. 압력 센서를 샘플의 바로 앞의 관 내의 작은 포트를 통해 연결하여서, 압력은 실시간으로 모니터링될 수 있다. 작은 전자 변위 센서를 필름의 바로 앞에 배치하였다. 광학 센서는 적외선(IR) LED 및 검출기로 이루어지고, 샘플과 센서 사이의 거리는 반사된 IR 광의 강도의 변화로 측정되었다. 센서는 (선형 번역 단계에 의해 측정된 바와 같은) 2㎜ 내지 5㎜ 사이의 거리에 의한 출력 전압의 선형 변동을 생성하였다. 백색 보정 유체의 작은 점은 이의 반사율을 개선하도록 각각의 샘플의 중앙에 위치하였다.
실시예 7 - 필름 2차 구조
결정질(β-시트 및 턴) 및 비결정질(α-나선 및 랜덤 코일) 모티프의 비율은 Vertex 70 푸리에 변환 적외선(FTIR) 분광광도계(Bruker(미국 매사추세츠주 빌레리카))를 사용하여 각각의 필름 유형에서 측정되었다. 4000 내지 600cm-1의 범위에 걸쳐 흡광도 모드에서 스캔을 취했다. 각각의 유형의 전체 3개의 필름의 스캔을 취하고, 6 스캔은 필름 유형마다 전체 18회 측정에 대해 필름마다 취해졌다(필름의 테두리, 상부 표면, 필름 바닥 표면의 테두리, 필름 상부 표면의 중앙, 필름 바닥 표면의 중앙). 상부 및 바닥 표면 스캔은 평균이 되고, 아마이드 I 영역(1705 내지 1595 cm-1)은 상기 기재된 바와 같은 7개의 공지된 입체형태 위치를 사용하여 디컨볼루션 및 곡선 핏팅으로 처리되었다(Rajkhowa et al., 2012). 이 7개의 디컨볼루션된 피크의 각각의 상대 피크 면적을 이용하여 측쇄, β-시트, 랜덤 코일, α-나선 및 알파-턴의 함량(%)을 결정하였다. 피크 면적(%)은 6회 측정(3개의 별개의 필름의 중앙 및 테두리 영역)의 평균±표준 편차로 표시된다. 필름 유형마다 모든 샘플의 평균이 된 스캔을 또한 디컨볼루션 후 작도하였다.
실시예 8 - 분해에 대한 저항
이전의 작업(Rajkhowa et al., 2011)에 기초한 변형 방법을 이용하여 시험관내 효소 분해 연구를 이용하여 필름을 시험하였다. 필름을 적어도 48시간 동안 20℃±2℃ 및 65%±2% 상대 습도에서 컨디셔닝하고, 이후 필름마다 5개의 스트립으로 절단하였다. 필름 스트립을 30분 동안 UV 광을 사용하여 무균화하기 전에 4 소주 자리 균형을 이용하여 각각의 샘플의 중량을 기록하였다. 이후, 각각의 스트립을 무균성으로 15㎖ 플라스틱 관으로 옮겼다. 대조군 샘플을 0.1M 인산염 완충 식염수(PBS) pH 7.4와 항온처리하는 한편, 실험 샘플을 1㎎/㎖ 프로테아제 XIV(Sigma-Aldrich(미국 미주리주 세인트 루이스))를 함유하는 0.1M PBS와 항온처리하였다. 샘플을 3일에 걸쳐 항온처리하고, 프로테아제 용액 및 완충제를 매일 바꿔서 최적 효소 활성을 유지시켰다. 샘플을 6시간, 1일 및 3일 후 제거하였다. 각각의 시점에, 대조군 및 실험 필름 스트립을 항온처리기로부터 제거하고, dH2O에 의해 완전히 세정하고, 이후 30분 동안 2% 아세트산 중에 침지시켜 결합된 프로테아제를 제거하였다. 이후, 스트립을 다시 완전히 세정하여서 아세트산을 제거하고, 퓸후드에서 밤새 건조시켰다. 건조되면, 필름 스트립을 적어도 48시간 동안 20℃±2℃ 및 65%±2% 상대 습도로 다시 컨디셔닝하고 재칭량하였다. 전체 5개의 스트립을 각각의 실험 군에 대해 및 각각의 시점에 칭량하였다. 각각의 시점에 샘플의 중량 손실은 원래의 (컨디셔닝된) 중량의 백분율로서 표시된 5개의 샘플의 평균±표준 편차로서 제시된다.
실시예 9 - 표면 계량학 및 조도
각각의 샘플의 표면 조도는 광학 프로필로메트리를 사용하여 계산되었다. 간단히 말하면, 3개의 필름의 상부 및 바닥을 Veeco Dektak 150 Contour GT(Bruker(미국 매사추세츠주 빌레리카))에서 영상화하였다. 스캔을 2 x 승수를 이용하여 50 x의 확대에서 취했다. 이후, 각각의 스캔에 대한 출력 파일을 오픈 소스 소프트웨어 Gwyddion(버전 2.44)으로 불러오고, 스캔을 플레인 레벨링에 의해 보정하고, 이후 평균 제곱근(RMS) 조도(Rq)를 계산하였다. Gwyddion에 의해 확인된 임의의 소실 데이터를 마스킹하고 조도 계산으로부터 배제하였다. 조도 데이터는 측정된 각각의 유형의 3개의 필름의 평균±표준 편차로서 제시된다.
실시예 10 - 주사 전자 현미경
조직 배양 플레이트에서의 샘플을 PBS for 실온에서 30분 동안 PBS 중에 세정하고, 이후 실온에서 각각 1시간 동안 에틸 알코올의 증가하는 등급(50%, 70%, 95%, 100% 슈퍼 건조 2 변경)에 의해 탈수시켰다. CO2 중의 샘플의 임계점 건조를 Emitech, 모델 K850 임계점 건조기에서 수행하였다. 아르곤 가스에서의 0.07torr에서의 스퍼터 코팅을 Polaron Equipment Inc, 모델 E5100 스퍼터 코터에서 25kV에서 2분 동안 수행하였다. 샘플을 알루미늄 스터브에 탑재하고, Philips, 모델 XL30 주사 전자 현미경에서 바라보았다. 18x, 200x 및 500x 확대로 영상을 취했다. 각각의 영상에 각인된 데이터막대에 영상 정보를 기록하였다.
실시예 11 - 나노압인
재료를 금속 스터브에 초강력 접착시키고, Hysitron NanoIndenter 950의 스테이지에 배치하였다. 샘플을 알루미늄 대조군 샘플에 대항하여 보정하였다. 각각의 시험 샘플에 대해, 각각의 측정 점에서 소프트웨어에서 계산된 경도 및 감소한 모듈러스에 대해 20회 측정을 하였다.
실시예 12 - 세포 이동
DMEM/10%FBS 중에 성장한 스톡 배양물로부터의 인간 고막 케라틴세포를 24시간 동안 트랜스웰 배양 인서트로 플레이팅한다. 트랜스웰 막을 2㎜ 생검 펀치에 의해 이전에 천공하여서 3개의 홀을 생성해야 한다. 인서트를 시험 재료 위에 배치하고, 세포를 배양 배지 중에 커버하였다. 48시간에 걸쳐, 세포는 지지 막으로부터 시험 재료로 이동한다. 이후, 세포를 포르말린 중에 고정하고, 시험 재료로 이동한 세포를 핵 염색(DAPI) 후 형광 현미경에서 영상화하고, PBS/글라이세롤 폴리우레탄 중의 커버슬립 하에 슬리이드에 탑재하였다. 이동의 양은 커버된 표면 면적의 비율에 기초하여 예상된다.
실시예 13 - 세포 생존능력
세포독성 대조군으로서 5% DMSO를 갖는 인간 고막 케라틴세포 배양물을 사용하여 세포 생존능력에 대한 정량적 비색 검정을 수행하였다. MTS 기질 변환에 의해 예상된 96웰 배양 플레이트 및 세포 수에서 CellTiter 96(등록상표) Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay 키트를 사용하여 검정을 수행하였다. Epoch, BioTek 플레이트 판독기에서 플레이트를 판독하였다.
결과:
투명도:
폴리우레탄계 막은 가시광선 파장에 걸쳐 순수한 실크 막에 대한 유사한 전체 투명도를 보여주었다(도 1). 폴리우레탄계 막은 확산 투과율을 보여주어서, 이들이 광을 더 산란시킨다는 것을 제안한다(필름이 약간 안개 끼게/혼탁하게 만듦). 그러나, 이것은 사용된 폴리우레탄의 유형에 따라 달라진다. 더 투명하거나 덜 투명한 다른 폴리우레탄을 또한 선택할 수 있다.
음향 특성( LDV ):
폴리우레탄의 더 낮은 강성은 실크계 막의 음향 특성을 개선한다(도 2). 순수한 실크 막과 비교하여, 실크/폴리우레탄 막은 더 낮은 공명 피크를 가져서, 이들이 원래의 이어드럼의 공명(500 내지 1,000Hz)에 더 가깝게 한다. 실크계 막의 더 높은 진폭이 유지되고, 순수한 실크 막과 비교하여, 진동 진폭은 3,000Hz 미만의 주파수에서 더 양호하다(도 2).
기계적 특성(인장 강도, 영 모듈러스 , 최대 연신율 , 공기 압력 로드 하의 변위, 나노압인):
공기 압력 로드 하의 변위:
표 1은 폴리우레탄 함량이 필름에서 증가하면서 전체적으로 강성(영 모듈러스)이 감소하고, 파단 시 연신율이 증가한다는 것을 보여준다. 이것은 필름의 전체 감촉과 일치한다. 필름에서 폴리우레탄 함량이 더 높을수록, 이것은 더 탄성이고 가요성이게 느낀다. 폴리우레탄이 주요 성분이 되면서(즉, 필름에 50% 초과의 폴리우레탄이 있을 때), 폴리우레탄은 이 매트릭스 내에 가라앉은 실크의 매트릭스 및 구라는 것이 제안된다. 실크는 강성화제(stiffening agent)로서 작용한다.
Figure pct00001
화학 특성(β-시트 함량, 분해에 대한 저항 ):
분해에 대한 저항
28일 동안 1㎎/㎖의 프로테아제 효소 칵테일과 시험관내 항온처리될 때 상당한 분해가 관찰되지 않았다(도 3). 28일 후 평균 중량 손실은 0.4% w/w를 소실한 대조군 필름(효소 없이 항온처리됨)과 비교하여 0.8% w/w였다. 이것은 글라이세롤에 의해 가소화된 실크 막에 비해 상당한 개선이었다.
사용된 프로테아제 유형 및 선택된 농도는 이전의 방법에 기초하고, 실크 섬유를 분해하는 데 있어서의 이의 효율에 대해 선택되었다(Horan et al., 2005). 연구는 가속 분해 연구로서 보일 수 있다. 분해는 생체내 환경에서 훨씬 더 느린 것으로 생각된다.
참고문헌
Figure pct00002
Figure pct00003

Claims (13)

  1. 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스로서, 상기 막 매트릭스는,
    (a) 상기 막의 전체 용적(w/w)의 약 0.1% 내지 약 95%의 범위의 양의 실크 피브로인을 포함하고;
    (b) 적어도 1%(w/w)의 생체적합성 폴리우레탄을 포함하고;
    (c) 생체내 중이에 20Hz 내지 20KHz의 음파를 전달하고;
    (d) 5MPa 내지 100MPa의 인장 강도를 갖고;
    (e) 생체적합성 폴리우레탄 및 실크 피브로인 둘 다와 상용성인 용매 중에 용매화된 생체적합성 폴리우레탄 및 실크 단백질로부터 제조된, 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스.
  2. 제1항에 있어서, 복수의 막 매트릭스를 추가로 포함하는, 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스.
  3. 제2항에 있어서, 적어도 하나의 제1 막 매트릭스는 실크 피브로인을 포함하고, 적어도 하나의 제2 막 매트릭스는 생체적합성 폴리우레탄을 포함하는, 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스.
  4. 제1항에 따른 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스를 제조하는 방법으로서,
    (a) 고치 또는 섬유로부터 세리신의 제거 후 실크 단백질 또는 실크 단백질 복합체 용액을 제조하는 단계;
    (b) 용매를 사용하여 생체적합성 폴리우레탄 및 실크 피브로인을 용해시키는 단계; 및
    (c) 제조된 용액을 건조하여 실크 단백질 생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스를 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  5. 제4항의 방법에 따라 제조된 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스.
  6. 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스로서, 상기 막 매트릭스는,
    (a) 상기 막의 전체 용적(w/w)의 약 0.1% 내지 약 95%의 범위의 양의 실크 피브로인을 포함하고,
    (b) 적어도 1% (w/w)의 생체적합성 폴리우레탄을 포함하고,
    (c) 생체내 중이에 20Hz 내지 20KHz의 음파를 전달하고;
    (d) 5MPa 내지 100MPa의 인장 강도를 갖고;
    (e) 복합 막으로서 제조되고, 여기서 상기 실크 피브로인은 생체적합성 폴리우레탄 막에 대한 코팅을 제공하는, 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스.
  7. 제1항, 제5항 또는 제6항 중 어느 한 항에 따른, 적어도 1종의 활성제를 포함하는, 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스.
  8. 제7항에 있어서, 상기 활성제는 세포, 단백질, 펩타이드, 핵산 유사체, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 핵산, 압타머, 항체 또는 단편 또는 이의 부분, 호르몬, 호르몬 길항제, 성장 인자 또는 재조합 성장 인자 및 이의 단편 및 변이체, 사이토카인, 효소, 항생제 또는 항미생물 화합물, 바이러스, 항바이러스제, 독소, 프로드럭, 화학치료제, 소분자, 약물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스.
  9. 제7항에 있어서, 상기 막은 케라틴세포, 섬유아세포, 점막 상피, 내피 세포, 연골세포, 유도 다능성 줄기 세포, 성체 줄기 세포 및 배아 줄기 세포, 및 이들의 조합의 성장을 지지하는, 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스.
  10. 제7항에 있어서, 상기 막 매트릭스는 분해에 저항적이고/이거나, 말려들어감, 무기페 및 진주종에 저항하기 위한 장기간 구조 지지체를 제공하는, 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스.
  11. 제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스를 포함하는 장치.
  12. 제11항에 있어서, 복수의 실크 피브로인 생체적합성 폴리우레탄 막 매트릭스를 추가로 포함하는, 장치.
  13. 제12항에 있어서, 적어도 하나의 제1 막 매트릭스는 실크 피브로인을 포함하고, 적어도 하나의 제2 막 매트릭스는 생체적합성 폴리우레탄을 포함하는, 장치.
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