CN113429588B - 一种蚕茧提取物水凝胶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种蚕茧提取物水凝胶的制备方法，通过羧甲基壳聚糖的引入，利用丝素蛋白或丝胶蛋白与羧甲基壳聚糖之间形成的氢键相互作用，降低了形成水凝胶所需的电压和施加电压时溶液中丝素蛋白或丝胶蛋白的浓度。相比较目前有关通过电沉积法制备丝素蛋白水凝胶的技术，本发明能够实现在更低的驱动电压下在阳极形成水凝胶，制备出性能优良、结构均一的丝素蛋白或丝胶蛋白水凝胶。本发明可降低成本，节约能源，同时降低制备难度；可在相同资源条件下获得更多的丝素蛋白或丝胶蛋白水凝胶，使其能够适用于大规模的工业生产，这能扩大丝素蛋白或丝胶蛋白水凝胶的应用潜力，符合社会经济可持续发展的目标。

Description

一种蚕茧提取物水凝胶的制备方法

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，涉及蚕茧提取物，具体涉及一种蚕茧提取物水凝胶的制 备方法。

背景技术

蚕茧是指桑蚕的茧，桑蚕蛹期的囊形保护层，内含蛹体。茧层呈长椭圆形、椭圆束腰形、 球形或纺锤形等不同形状，或中部稍缢缩，茧有白、黄、淡绿、肉红等颜色，表面白色，有 不规则皱纹，并有附着的蚕丝，呈绒毛状。茧层可以缫丝，茧衣及缫制后的废丝可作丝棉和 绢纺原料。蚕茧主要由蛋白质、水分、灰分等成分组成，其中蛋白质主要为丝胶蛋白(silk glue) 和丝素蛋白(Silk fibroin,SF)组成。丝胶蛋白是包裹在丝素蛋白纤维表层的一种天然大分子 蛋白，其具有良好的水溶性、促细胞黏附和增殖活性、低的免疫原性以及独特的原位荧光性、 抗氧化活性等性能，而被广泛应用在织物物理涂层、化妆品添加剂，以及食品、医药、功能 性生物材料领域。丝素蛋白具有良好的生物相容性，对机体无毒，无致敏和刺激作用，由丝 素蛋白制备出的水凝胶含水量高、有一定的柔韧性、在水中有较好的稳定性，在药物缓释、 组织工程和医用敷料等方面具有广阔的应用前景。电沉积法是指在电解池中，通过电极反应， 使得溶液中的物质沉积到电极表面的方法。有文献报道，采用电沉积法能快速制备出生物相 容性良好、具有粘附特性的SF水凝胶。Kaplan等人发现，在施加电压为25V，溶液中SF 质量分数为8％时，3分钟即可在阳极上获得SF水凝胶[Silkfibroin electrogelation mechanisms. Acta Biomaterialia,2011,7(6):2394-2400.]。然而在25V电压下制备SF水凝胶时，由于工作电 极上会产生大量氧气，使得SF水凝胶成型效果不好，水凝胶质地不均匀。此外，Kaplan等 人进一步的研究表明，当溶液中SF质量分数低于7％时，在电极上施加电压很难形成水凝胶 [Silk fibroin electrogelationmechanisms.Acta Biomaterialia,2011,7(6):2394-2400.]。降低成胶电 压有助于节约能源，避免在高电压下可能发生的电化学反应，获得成型效果良好的水凝胶， 并降低装置的制造成本，提高水凝胶体系的稳定性，因而有必要开发一种低电压下制备出质 地均一的丝素蛋白水凝胶的方法。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种蚕茧提取物水凝胶的制备方法。 发明人在研究中意外发现，通过电沉积法制备蚕茧提取物(丝素蛋白或丝胶蛋白)水凝胶时， 加入一定量的羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl Chitosan，CMCS)，可以降低形成丝素蛋白或 丝胶蛋白水凝胶所需的电压和施加电压时溶液中丝素蛋白或丝胶蛋白的浓度，制备出质地均 一的水凝胶，在节约能源、降低成本的同时，还能降低制备难度。

除特殊说明外，本发明所采用的百分数均为质量百分数。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种蚕茧提取物水凝胶的制备方法，其特征在于：采用三电极体系，以石墨电极为工作 电极，以铂片电极为对电极，以Ag/AgCl电极为参比电极，对含NaCl的蚕茧提取物/CMCS 混合溶液施加3～5V的直流电压，通电时间为2～5分钟，即可获得本发明水凝胶；所述蚕茧 提取物为丝素蛋白或丝胶蛋白。

根据本发明的一个实施方案，上述混合溶液中羧甲基壳聚糖溶液浓度为0.005～0.02g/mL。

根据本发明的一个实施方案，上述混合溶液中丝素蛋白或丝胶蛋白的质量分数为1％～5％。 进一步，上述混合溶液中NaCl的浓度为0.1％～0.3％。

根据本发明的一个实施方案，一种蚕茧提取物水凝胶的制备方法，其特征在于：用纯水 配置质量体积比为0.01～0.04g/mL的羧甲基壳聚糖溶液，调节pH至11～12；将丝素蛋白或丝 胶蛋白和羧甲基壳聚糖溶液混合，使混合溶液中丝素蛋白或丝胶蛋白的质量分数为1％～5％， 充分搅拌使其混合均匀，然后将其放置于4℃冰箱中过夜；在混合溶液中加入NaCl，使NaCl 浓度为0.1％～0.3％；利用电化学工作站，采用三电极体系，以石墨电极为工作电极，以铂片 电极为对电极，以Ag/AgCl电极为参比电极，对含NaCl的混合溶液施加3～5V的直流电压， 通电时间为2～5分钟，即可获得本发明水凝胶。

进一步，一种丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制备丝素蛋白溶液：取适量蚕茧在0.5％Na₂CO₃溶液中煮沸30～40min，蚕茧和Na₂CO₃溶液的浴比为1:40～1:80，再用蒸馏水洗涤；重复2～3次，室温下干燥过夜，获得丝素蛋白纤 维；再将干燥的丝素蛋白纤维在CaCl₂:CH₃CH₂OH:H₂O＝1:1:2～1:3:9的三元溶液中按1:7～1:12 的水浴比于60～80℃中溶解，将此溶液于蒸馏水中透析3天，制得丝素蛋白水溶液；通过 55～65℃水浴将其浓缩至丝素蛋白质量分数为3～10％；

2)用纯水配置质量体积比为0.01～0.04g/mL的羧甲基壳聚糖溶液，调节pH至11～12；

3)将丝素蛋白水溶液和羧甲基壳聚糖溶液按体积比1:1混合，使得最终的SF/CMCS混合溶 液中SF的质量分数为1％～5％，充分搅拌使其混合均匀，然后将其放置于4℃冰箱中过夜；

4)在SF/CMCS混合溶液中加入NaCl，使NaCl浓度为0.1％～0.3％；

5)利用电化学工作站，采用三电极体系，以石墨电极为工作电极，以铂片电极为对电极，以 Ag/AgCl电极为参比电极，对含NaCl的SF/CMCS混合溶液施加3～5V的直流电压，通电时 间为2～5分钟，即可获得本发明水凝胶。

有益效果：

本发明提供一种蚕茧提取物(丝素蛋白或丝胶蛋白)水凝胶的制备方法，通过羧甲基壳 聚糖的引入，利用丝素蛋白或丝胶蛋白与羧甲基壳聚糖之间形成的氢键相互作用，降低了形 成水凝胶所需的电压和施加电压时溶液中丝素蛋白或丝胶蛋白的浓度。就丝素蛋白水凝胶而 言，本发明将其所需电压从25V降低至4V，溶液中SF质量分数从8wt.％降至5wt.％。相比 较目前有关通过电沉积法制备SF水凝胶的技术，本发明能够实现在更低的驱动电压下在阳极 形成水凝胶，制备出性能优良、结构均一的丝素蛋白或丝胶蛋白水凝胶。本发明可降低成本， 节约能源，同时降低制备难度；可在相同资源条件下获得更多的丝素蛋白或丝胶蛋白水凝胶， 使其能够适用于大规模的工业生产，这能扩大丝素蛋白或丝胶蛋白水凝胶的应用潜力，符合 社会经济可持续发展的目标。此外，本发明所采用的丝素蛋白或丝胶蛋白水凝胶制备方法允 许精确控制，能通过控制电沉积方法中的各个参数(如时间、电压、电极形状等)来控制所 制备的水凝胶的性状(如厚度、形状)，具有很强的实际应用价值。

附图说明

图1为实施例1中不同电压下SF/CMCS水凝胶的宏观形貌图。

图2为实施例1中制备得到水凝胶的宏观形貌图。

图3为分别施加3V(a)、4V(b)和5V(c)时SF/CMCS水凝胶冷冻干燥后的扫描电镜图。

图4为施加电压分别为3V、4V和5V时SF/CMCS水凝胶的力学性能测试结果图。

图5为施加电压为4V时SF/CMCS水凝胶和CMCS水凝胶的力学性能测试结果图。

图6为SF溶液、CMCS水凝胶与SF/CMCS水凝胶冷冻干燥后产物的傅里叶变换红外光谱图。

图7为10％的SF溶液、4％的CMCS溶液和5％SF：2％CMCS混合溶液的粘度-时间曲线图。

图8为采用Bradford法测出SF/CMCS混合溶液(a)、水凝胶制备后剩余混合溶液(b)和SF溶 液(c)中SF浓度的标准曲线图。

图9a为SF、CMCS水凝胶和SF/CMCS水凝胶的热重曲线(TG曲线)，图9b、c、d分别为SF、CMCS水凝胶和SF/CMCS水凝胶的TG曲线和微商热重曲线(DTG曲线)(以物质的 质量变化速率对温度T作图)。

图10为分别用CMCS水凝胶、SF/CMCS水凝胶浸提液培养人胚肾细胞(HEK-293)1、3、5 天时，HEK-293的细胞活力比较结果图。

图11为不同形状SF/CMCS水凝胶的实物图，(a)“SWU”标记，(b)正方形和(c)五角星形(比例尺：1厘米)。

图12为丝胶蛋白基水凝胶的宏观形貌图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发 明进行进一步详细地说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用 于限定本发明。本发明所用原料及试剂均为市售产品。当蚕茧提取物为丝素蛋白时，本发明 水凝胶也用“SF/CMCS水凝胶”表示。

实施例1

(1)称取4g羧甲基壳聚糖(上海瑞永生物科技有限公司，RT1291)溶解于100mL纯水中，磁力搅拌4h使其充分溶解，调节pH至12，于4℃保存备用。

(2)称取20g的蚕茧，将茧壳剪成螺旋状，加入沸腾的1000mL 0.5％Na₂CO₃溶液中煮沸30min。捞出蚕茧并用去离子水反复搓洗直至无滑腻感，重复煮沸2次并搓洗，在室温条件下晾干获得纤维状丝素蛋白。

(3)以摩尔比为1:2:8的比例配制CaCl₂、CH₃CH₂OH、H₂O三元溶液100mL，将10g 丝素蛋白加入三元溶液中，置于70℃的水浴锅内用玻璃棒不断搅拌，直至纤维状丝素完全溶解。

(4)将上述冷却后的溶液倒入洁净的透析袋中，挤出透析袋内空气，两头封口，置于丝 素溶液10倍体积的去离子水中透析三天。透析分为三个过程，第一天每2h换一次透析液， 第二天每3h换一次透析液，第三天每4h换一次透析液。

(5)透析完之后用纱布过滤，过滤之后于4℃，8000转离心30min。

(6)将离心过滤后的丝素蛋白溶液放入60℃的水浴锅中浓缩至丝素蛋白质量分数为10％ 左右。然后放入4℃冰箱保存，7天之内使用。

(7)将上述丝素蛋白溶液与羧甲基壳聚糖按体积比为1:1混合，制得5％SF:2％CMCS 的混合溶液。然后放入4℃冰箱保存待用。

(8)于电解杯中加入20mL的5％SF:2％CMCS混合溶液，再加入0.05gNaCl，使得NaCl浓度为0.25％。

(9)利用电化学工作站，采用三电极体系，以石墨电极为工作电极，以铂片电极为对电 极，以Ag/AgCl电极为参比电极，对含NaCl的SF/CMCS混合溶液施加4V的直流电压，通电时间为2.5分钟，即可在石墨电极上获得SF/CMCS水凝胶。

实施例1中不同电压下SF/CMCS水凝胶的宏观形貌如图1所示。图a、b和c分别为在5％SF：2％CMCS混合溶液(5％SF为质量百分数；2％CMCS为质量体积分数)中施加电压 为1V(a)、2V(b)和6V(c)，持续时间为7.5min，在石墨电极上通过电沉积得到的水凝胶的 照片，箭头所指为水凝胶表面粗大的气泡。图d显示铂电极上没有水凝胶的形成(标尺:1cm)。 当施加的电压为1V和2V时，在石墨电极表面产生的水凝胶太薄而不能剥离。然而，当施 加的电压增加到6V时，产生的水凝胶显示出凹凸不平的结构，并且凝胶表面有肉眼可见的 孔洞(图1c)。故根据成型效果应排除使用1V、2V、6V及以上电压的制备条件。

实施例1中制备得到水凝胶的宏观形貌如图2所示。图a、b、c和d分别为对5％SF：2％CMCS溶液施加4V电压历时2.5min、5min、7.5min和10min后获得的水凝胶俯视图， 图e、f、g和h分别为图a、b、c和d的侧视图(标尺：1cm)。这表明本发明所提供的方法 可通过控制时间来调节制得的SF/CMCS水凝胶的厚度。

制备例2

参照实施例1制备实施例2的水凝胶，其中步骤9中所施加电压为3V。

制备例3

参照实施例1制备实施例3的水凝胶，其中步骤9中所施加电压为5V。

通过扫描电镜、力学性能测试对上述制备例中的水凝胶进行表征，结果见说明书附图3、 4，水凝胶具体孔径大小见表1。

图3为分别施加3V(a)、4V(b)和5V(c)时SF/CMCS水凝胶冷冻干燥后的扫描电镜图(标 尺:300μm)。结果显示SF/CMCS水凝胶均具有致密的三维多孔结构，通过比较孔径大小(说 明书附表1)，4V电压下制备出的SF/CMCS水凝胶的孔隙更小，为98.27±17.45μm。这表明可通过控制电沉积方法中的电压来调控SF/CMCS水凝胶内部的三维多孔结构。

表1水凝胶具体孔径大小

施加电压分别为3V、4V和5V时SF/CMCS水凝胶的力学性能测试结果如图4和表2所示。结果表明4V电压下制备出的SF/CMCS水凝胶的力学性能更好(对数据进行t检验，* 表示P小于0.05，数据具有显著性差异；**表示P小于0.01，数据具有极其显著性差异)。

表2 3V、4V和5V时SF/CMCS水凝胶的力学性能测试结果

施加电压为4V时SF/CMCS水凝胶和CMCS水凝胶的力学性能测试结果如图5和表3所示。力学性能测试结果表明，CMCS水凝胶的力学性能较SF/CMCS水凝胶的力学性能显 著增加(对数据进行t检验，*表示P小于0.05，表明数据具有显著性差异；**表示P小于0.01，表明数据具有极其显著性差异)。

表3 4V时SF/CMCS水凝胶和CMCS水凝胶的力学性能测试结果

图6为SF溶液、CMCS水凝胶与SF/CMCS水凝胶冷冻干燥后产物的傅里叶变换红外光谱(FTIR)图。SF/CMCS水凝胶样品组的傅里叶变换红外光谱展现出SF和CMCS的特征吸 收峰，证实SF/CMCS水凝胶中含有SF和CMCS。

图7为10％的SF溶液、4％的CMCS溶液和5％SF：2％CMCS混合溶液的粘度-时间曲线图。结果表明10％的SF溶液粘度为7.70±0.04mpa·s；4％的CMCS溶液粘度为51.77±0.09 mpa·s；而5％SF：2％CMCS混合溶液的粘度为25.85±0.13mpa·s。文献报道(Laliberté,M., Model for Calculating the Viscosity ofAqueousSolutions.J.Chem.Eng.Data 2007,52,321-335. https://doi.org/10.1021/je0604075)，当两种溶液混合时，若两种溶剂之间无相互作用，则混合 溶液的粘度可由公式(1)计算出。

lnη_m＝φ₁lnη₁+φ₂lnη₂ (1)

其中φ_i是组分i的体积分数，η_i是组分i的粘度

由公式(1)计算出的5％SF：2％CMCS的混合溶液的理论粘度为19.96mpa·s，比实际 粘度(25.85±0.13mpa·s)更小，故SF与CMCS之间是存在相互作用的。推测SF与CMCS 之间形成的氢键相互作用导致液体实际粘度高于理论粘度。

图8为采用Bradford法测出SF/CMCS混合溶液(a)、水凝胶制备后剩余混合溶液(b)和SF 溶液(c)中SF浓度的标准曲线。由公式(2)可计算出SF/CMCS水凝胶中的SF所占质量百分 比(n％)。

其中C₁是制备凝胶前SF/CMCS混合物中SF的浓度；C₂是制备凝胶后剩余溶液中SF的浓度。C₁和C₂可以分别由图8a和b中的标准校准曲线确定。m是冷冻干燥后制备的SF/CMCS 水凝胶的质量。V₁是凝胶化前SF/CMCS混合液的体积；V₂是制备水凝胶后剩余溶液的体积。 因此，C₁V₁为凝胶化前SF/CMCS溶液中SF的含量，C₂V₂为制备水凝胶后剩余溶液中SF的 含量，C₁V₁-C₂V₂代表SF/CMCS水凝胶中SF的质量。

由公式(2)计算得出SF/CMCS水凝胶中的SF所占质量百分比为65.2±13.9％。表明通 过羧甲基壳聚糖的引入，成功地在低电压下制备出丝素蛋白为主要成分的水凝胶体系。

图9a为SF、CMCS水凝胶和SF/CMCS水凝胶的热重曲线(TG曲线)，图9b、c、d 分别为SF、CMCS水凝胶和SF/CMCS水凝胶的TG曲线(黑色曲线)和微商热重曲线(DTG 曲线)(以物质的质量变化速率对温度T作图，蓝色曲线)。热重分析结果显示，样品质量 下降发生在两个不同的阶段。第一阶段(30℃-150℃)是由于失去结合水所致。SF/CMCS样 品的DTG曲线显示其在56℃时有峰值，而CMCS和SF样品DTG曲线的峰值分别出现在 69℃和91℃。这些结果表明，相较于SF和CMCS，SF/CMCS样品表面的结合水在更低的温 度下容易被去除。这可能是因为SF和CMCS中的大多数亲水基团已经参与氢键形成，亲水 基团被占据导致样品表现出较低的吸湿性。样品第二阶段(150℃-500℃)失重为样品的热分 解。CMCS和SF样品的DTG曲线在第二阶段的峰值分别出现在334℃和307℃，而SF/CMCS 样品的DTG曲线在第二阶段的峰值出现在329℃。SF/CMCS样品展现出比CMCS样品更低 的热稳定性，这可能是因为SF的引入降低了CMCS的结晶度所导致的。

分别用CMCS水凝胶、SF/CMCS水凝胶浸提液培养人胚肾细胞(HEK-293)1、3、5天时，HEK-293的细胞活力比较如图10和表4所示。结果表明，SF/CMCS水凝胶浸提液培养 3天时HEK-293细胞的增殖率(121.55±3.41％)高于CMCS水凝胶浸提液处理组 (103.54±2.99％)。培养5天时，SF/CMCS水凝胶组的细胞增殖率(153.24±9.98％)较CMCS 水凝胶组的细胞增殖率(121.17±11.61％)更高，表明SF/CMCS水凝胶生物相容性更好(对 数据进行t检验，*表示P小于0.05，表明数据具有显著性差异；**表示P小于0.01，表明数 据具有极其显著性差异)。

表4 CMCS水凝胶、SF/CMCS水凝胶浸提液培养细胞的结果比较

此外，本发明所采用的丝素蛋白或丝胶蛋白水凝胶制备方法允许精确控制，能通过控制 电沉积方法中的各个参数(如时间、电压、电极形状等)来控制所制备的水凝胶的性状(如 厚度、形状)，具有很强的实际应用价值。不同形状SF/CMCS水凝胶的实物如图11，(a)“SWU”标记，(b)正方形和(c)五角星形(比例尺：1厘米)。

制备例4

参照实施例1制备实施例4的水凝胶，其中丝胶蛋白质量分数4％，CMCS质量体积分数 0.5％，电压3V，时间5min。丝胶蛋白基水凝胶的宏观形貌如图12所示，a、b为不同视角观察的丝胶蛋白基水凝胶的宏观形貌。

Claims (5)

1.一种蚕茧提取物水凝胶的制备方法，其特征在于：采用三电极体系，以石墨电极为工作电极，以铂片电极为对电极，以Ag/AgCl电极为参比电极，对含NaCl的蚕茧提取物/CMCS混合溶液施加3~5V的直流电压，通电时间为2~5分钟，即得；所述蚕茧提取物为丝素蛋白或/和丝胶蛋白；所述混合溶液中丝素蛋白或丝胶蛋白的质量分数为1%~5%。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述混合溶液中羧甲基壳聚糖的浓度为0.005~0.02 g/mL。

3.如权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于：所述混合溶液中NaCl的浓度为0.1%~0.3%。

4.一种蚕茧提取物水凝胶的制备方法，其特征在于：用纯水配置质量体积比为0.01~0.04g/mL的羧甲基壳聚糖溶液，调节pH至11~12；将丝素蛋白或丝胶蛋白和羧甲基壳聚糖溶液混合，使混合溶液中丝素蛋白或丝胶蛋白的质量分数为1%~5%，充分搅拌使其混合均匀，然后将其放置于4℃冰箱中过夜；在混合溶液中加入NaCl，使NaCl浓度为0.1%~0.3%； 利用电化学工作站，采用三电极体系，以石墨电极为工作电极，以铂片电极为对电极，以Ag/AgCl电极为参比电极，对含NaCl的混合溶液施加3~5V的直流电压，通电时间为2~5分钟，即得。

5.一种丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）制备丝素蛋白溶液：取适量蚕茧在0.5% Na₂CO₃溶液中煮沸30~40 min，蚕茧和Na₂CO₃溶液的浴比为1:40~1:80，再用蒸馏水洗涤；重复2~3次，室温下干燥过夜，获得丝素蛋白纤维；再将干燥的丝素蛋白纤维在CaCl₂:CH₃CH₂OH:H₂O = 1:1:2~1:3:9的三元溶液中按1:7~1:12的水浴比于60~80℃中溶解，将此溶液于蒸馏水中透析3天，制得丝素蛋白水溶液；通过55~65℃水浴将其浓缩至丝素蛋白质量分数为3~10%；

2）用纯水配置质量体积比为0.01~0.04g/mL的羧甲基壳聚糖溶液，调节pH至11~12；

3）将丝素蛋白水溶液和羧甲基壳聚糖溶液按体积比1:1混合，使得最终的SF/CMCS混合溶液中SF的质量分数为1%~5%，充分搅拌使其混合均匀，然后将其放置于4℃冰箱中过夜；

4）在SF/CMCS混合溶液中加入NaCl，使NaCl浓度为0.1%~0.3%；

5）利用电化学工作站，采用三电极体系，以石墨电极为工作电极，以铂片电极为对电极，以Ag/AgCl电极为参比电极，对含NaCl的SF/CMCS混合溶液施加3~5V的直流电压，通电时间为2~5分钟，即获得水凝胶。

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