CN105797216A - 一种用家蚕丝素蛋白与羧甲基壳聚糖制备多孔材料的方法 - Google Patents

一种用家蚕丝素蛋白与羧甲基壳聚糖制备多孔材料的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种多孔材料的制备方法，其特征在于：以丝素蛋白与羧甲基壳聚糖作为原料，包括丝素蛋白溶液的制备，羧甲基壳聚糖溶液的制备，丝素蛋白/羧甲基壳聚糖复合材料的制备；所述再生丝素/羧甲基壳聚糖复合材料的制备是将交联剂戊二醛、增塑剂甘油与丝素、羧甲基壳聚糖一同混合，经预冷后，冷冻干燥成型；所述预冷是在‑20℃放置6小时，然后‑80℃放置12小时。本发明节约时间，所得材料表面光滑，质地柔软，蓬松多孔，可塑性较强，可以根据需求更改形状以达到更广泛的生物医学应用。并且，所制得的材料孔径更均匀，在100微米左右；吸水性更好，并且具有抗菌抗感染作用，与生物体的生物相容性更好。

Description

一种用家蚕丝素蛋白与羧甲基壳聚糖制备多孔材料的方法
技术领域
本发明涉及生物组织工程及生物材料技术领域，公开一种新型多孔材料及其制备方法，具体来说是用再生丝素和羧甲基壳聚糖制备多孔材料的方法。
背景技术
丝素属于天然蛋白，来源较广，生物相容性良好，其氨基酸组成对人体有保健的功效，是开发医用高分子材料的理想原材料。但由于纯丝素膜的机械性能差且易溶于水，大大限制了其应用。而羧甲基壳聚糖是一种生物安全性高的大分子，存在大量羟基、羧基，能与丝素分子中的氨基、羟基等形成分子间氢键，防止丝素分子内氢键的形成，从而改变丝素的结构。将来源广泛且生物相容性良好的再生丝素蛋白与羧甲基壳聚糖共混制成多孔材料，使两者能有效发挥各自优点，构建一种新型生物医学共混多孔材料。
《丝素蛋白/壳聚糖三维多孔支架材料的构建表征与细胞学体外实验研究》(硕士学位论文，柳磊)中由本课题组公开了将一定浓度的丝素蛋白溶液和壳聚糖溶液以不同质量比例混合，通过数次冷冻干燥合并化学交联的方法制备出具有一定强度的多孔性支架，对其微观结构及相关性能进行研究。经进一步研究发现，该文献所公开的制备方法仍存在以下一些问题，主要在于所制得的支架材料①形态表面较粗糙；②孔径尺寸的均匀度不理想；③吸水性不佳等。
发明内容
基于上述技术问题，本发明提供了一种品质更优的多孔材料的制备方法，其孔隙均匀度，吸水性、生物相容性等性能均得到改善。
一种多孔材料的制备方法，其特征在于：以丝素蛋白与羧甲基壳聚糖作为原料，包括丝素蛋白溶液的制备，羧甲基壳聚糖溶液的制备，丝素蛋白/羧甲基壳聚糖复合材料的制备；所述再生丝素/羧甲基壳聚糖复合材料的制备是将交联剂戊二醛、增塑剂甘油与丝素、羧甲基壳聚糖一同混合，经预冷后，冷冻干燥成型；
所述预冷是：在-20℃放置6小时，然后-80℃放置12小时。
上述冷冻干燥的条件为：在温度-50℃～-55℃，真空度10～40Pa处理48h。
上述丝素蛋白与羧甲基壳聚糖的质量比分别为1-9∶3。
上述甘油的质量浓度为0.5-3％，戊二醛质量浓度为0.05％-0.2％。
本发明节约时间，所得材料表面光滑，质地柔软，蓬松多孔，可塑性较强，可以根据需求更改形状以达到更广泛的生物医学应用。并且，所制得的材料孔径更均匀，在100微米左右；吸水性更好，并且具有抗菌抗感染作用，与生物体的生物相容性更好。
上述再生丝素溶液的制备，是在0.5％的Na2CO3溶液中脱胶，获得纤维状丝素，再于CaCl2、CH3CH2OH、H2O以摩尔质量比为1∶2∶8的三元溶剂溶解丝素，透析后得到再生丝素溶液。
上述多孔材料的制备方法，包括以下步骤：
A.再生丝素溶液的制备
(1)脱胶
称取蚕茧，去除蚕蛹后将茧壳剪成1平方厘米大小的碎片，加入沸腾的0.5％Na2CO3溶液中(浴比为1∶50)煮沸30分钟；捞出蚕茧并用去离子水反复搓洗直至无滑腻感；用苦味酸奶胭脂红溶液检测，直至丝胶完全脱去，在室温条件下晾干获得纤维状丝素蛋白；
(2)溶解
配制CaCl2、CH3CH2OH、H2O以摩尔质量比为1∶2∶8的三元溶剂，将丝素以1∶10的浴比加入三元溶剂中，置于70±5℃的水浴锅内不断搅拌，直至纤维状丝素完全溶解；
(3)透析
将上述冷却后的溶液倒入洁净的透析袋中，挤出透析袋内空气，两头封口，置于丝素溶液10倍体积的去离子水中透析三天；透析分为三个过程，第一天每2小时换一次透析液，第二天每3小时换一次透析液，第三天每4小时换一次透析液；3天后，用脱脂棉过滤掉溶液中的杂质，在4℃6000r/min离心10分钟后，存入试剂瓶中，放入冰箱备用；
B.羧甲基壳聚糖溶液的制备
将一定质量的羧甲基壳聚糖粉末溶于体积分数为2％(v/v)的乙酸溶液中，室温(25℃)下磁力搅拌器搅拌过夜，配制成质量体积分数为4％(w/v)的羧甲基壳聚糖乙酸溶液，置于冰箱待用；
C.再生丝素/羧甲基壳聚糖复合材料的制备
(1)将4％的丝素溶液与4％的羧甲基壳聚糖溶液混合，再加入的甘油和戊二醛，强力搅拌均匀后，置于4℃消泡过夜，24小时后倾倒入塑料培养皿中，于-20℃冰箱中预冻6小时，-80℃冷冻12h，然后进行冷冻干燥48小时，得再生丝素/羧甲基壳聚糖初制复合材料；
(2)将所得初制复合材料浸入75％甲醇、lmol/L NaOH(体积比为1∶1)混合溶液中浸泡2小时，去离子水冲洗2-3次，于-20℃冰箱中预冻6小时，-80℃冷冻过夜，然后进行冷冻干燥48小时，得再生丝素/羧甲基壳聚糖复合材料。
有益效果
1.本发明获得的多孔材料为色为亮白或者浅黄白色、海绵状、蓬松多孔、有弹性、相互连通的三维多孔状材料，孔径100微米左右。
2.本发明是在现有技术所存在的技术问题展开分析，经优化得到最佳的丝素蛋白与羧甲基壳聚糖制备多孔材料的方法。所制得的复合后吸水性更好，并且具有不同程度的抗菌抗感染作用。且本发明只需两次冷冻干燥，更节约时间，并且所得材料表面光滑，质地柔软，蓬松多孔，可塑性较强，可以根据需求更改形状以达到更广泛的生物医学应用。调整预冷工艺，所得材料的孔径大小更均匀，孔径为100±19.5微米。
3.本发明方法所制备的多孔材料的孔隙率、孔径大小及生物力学参数等，可以根据原料含量比例，主辅料以及辅料之间的比例，工艺条件进行调节。本发明的压缩、弯曲、拉伸力学测试结果可以满足不同的组织工程学材料的要求；其形态及几何尺寸可以根据临床需求而改变，生物安全性符合国颁标准。
附图说明
图1A-对照组(丝素/壳聚糖复合材料)的宏观形态图；B-实验组(丝素/羧甲基壳聚糖复合材料)的宏观形态图。
图2对照组的丝素/壳聚糖复合材料扫描电镜图；(a)20％SF-80％CS(b)40％SF-60％CS(c)60％SF-40％CS(d)80％SF-20％CS。
图3本发明的丝素/羧甲基壳聚糖(SF/CMCS)复合材料扫描电镜图；(A)SF∶CMCS＝2∶1(B)SF∶CMCS＝1∶2(C)SF∶CMCS＝1∶1。
图4本发明丝素/羧甲基壳聚糖复合材料植入皮下4周后的组织切片图；(A)放大倍数40×；(B)100×；(C)400×。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明方法进行详细描述，下面的描述是为了进一步说明本发明，而不构成对本发明的限定。
实施例1
一种多孔生物材料的制备方法，按照以下步骤进行：
表1丝素/羧甲基壳聚糖配比以及甘油和戊二醛的配比
1.再生丝素溶液的制备
在0.5％的Na2CO3溶液中脱胶，获得纤维状丝素，再于CaCl2、CH3CH2OH、H2O以摩尔质量比为1∶2∶8的三元溶剂溶解丝素，透析后得到再生丝素溶液。具体步骤如下：
(1)脱胶
称取一定量的蚕茧，去除蚕蛹后将茧壳剪成1平方厘米大小的碎片，加入沸腾的0.5％Na2CO3溶液中(浴比为1∶50)煮沸30分钟。捞出蚕茧并用去离子水反复搓洗直至无滑腻感。重复2次，再用苦味酸奶胭脂红溶液检测，直至丝胶完全脱去。在室温条件下晾干获得纤维状丝素蛋白。
(2)溶解
配制CaCl2、CH3CH2OH、H2O以摩尔质量比为1∶2∶8的三元溶剂，将丝素以1∶10的浴比加入三元溶剂中，置于70±5摄氏度的水浴锅内用玻璃棒不断搅拌，直至纤维状丝素完全溶解。
(3)透析
将上述冷却后的溶液倒入洁净的透析袋中，挤出透析袋内空气，两头封口，置于丝素溶液10倍体积的去离子水中透析三天。透析分为三个过程，第一天每2小时换一次透析液，第二天每3小时换一次透析液，第三天每4小时换一次透析液。3天后，用脱脂棉过滤掉溶液中的杂质，在4摄氏度6000r/分钟下离心10分钟后，存入试剂瓶中，放入冰箱备用。
2.羧甲基壳聚糖溶液的制备
将一定质量的羧甲基壳聚糖粉末溶于体积分数为2％(v/v)的乙酸溶液中，室温(25摄氏度)下磁力搅拌器搅拌过夜，配制成质量体积分数为4％(w/v)的羧甲基壳聚糖乙酸溶液，贴上标签，置于冰箱待用。
3.再生丝素/羧甲基壳聚糖复合材料的制备
将4％的丝素溶液与4％的羧甲基壳聚糖溶液按比例混合，再加入2.0％的甘油和0.20％的戊二醛，强力搅拌均匀后，置于4摄氏度冰箱中消泡过夜，24小时后倾倒入塑料培养皿中，于-20摄氏度冰箱中预冻6小时，-80摄氏度冷冻过夜，冷冻干燥48h，得再生丝素/羧甲基壳聚糖初制复合材料。
将上述所制得支架材料浸入75％甲醇、1mol/L NaOH(体积比为1∶1)混合溶液中浸泡2小时，去离子水冲洗2-3次，于-20摄氏度冰箱中预冻6小时，-80摄氏度冷冻过夜，-50℃～-55℃，真空度10～40Pa冷冻干燥48小时，得再生丝素/羧甲基壳聚糖复合材料。
所得多孔材料几何形态描述：所制得的再生丝素/羧甲基壳聚糖复合材料色泽亮白，表面光滑，质地柔软。
各种性能检测：
(1)采用扫描电镜观察其断面结构。
(2)复合材料热水溶失率的测定
采用烘干质量法测试复合材料的热水溶失率。测定充分平衡后的复合材料质量G1，以1∶100的浴比放入37摄氏度的蒸馏水中恒温振荡1小时后取出，并于60摄氏度烘干至恒温后测定重量G2。计算公式如下：
(3)溶胀度的测定
采用质量称量法测试复合材料的溶胀度。首先测定复合材料在充分平衡后的质量m1(g)，然后复合材料在20摄氏度蒸馏水中浸渍24小时后取出，复合材料表面水分用吸水纸吸干，再次测量复合材料质量m2(g)，根据下式计算复合材料的溶胀度：
(4)含水率的测定
在温度为20摄氏度，湿度为65％的条件下使复合材料达到吸湿平衡，称取复合材料质量W1(g)，然后将复合材料置于60摄氏度烘箱中烘干至质量不再变化，称取此时质量W2(g)。计算公式如下：
(5)力学性能的测试
将所有复合材料用裁样刀裁成长条形试样，长为3厘米，宽为1厘米，每种样品准备三个不同重复，用螺旋测微器测量复合材料的厚度，在万能力学试验机上固定复合材料，用5mm/分钟的拉伸速度进行拉伸试验。测试温度为20摄氏度，相对湿度为65％，根据下式计算断裂强度：σ＝F/(A·B)，其中：σ为断裂强度(N/mm2)，F为最大负荷(N)，A为试样的宽度(mm)，B为试样的厚度(mm)。
(6)红外光谱检测
将样品用KBr压片。采用傅立叶变换红外光谱仪(美国Nicolet公司)测定其在波数4000～400cm-1的吸收光谱。
(7)DSC热分析检测
在氮气保护氛围下对试样进行测试，氮气流量为20mL/分钟，以10摄氏度/分钟的升温速率从30摄氏度升温到250摄氏度，恒温5分钟，然后以10摄氏度/分钟的降温速率降温至30摄氏度，恒温5分钟，然后再以10摄氏度/分钟的升温速率升温至250摄氏度，记录结晶和熔融过程。
(8)体内安全性研究
试验鼠腹腔注射乙醚，待鼠麻醉后，将其固定于手术台上，剔除鼠背部皮毛，暴露皮肤。75％乙醇消毒后，选取试验鼠背部合适部位切开皮肤一个小口，用钝器在切口部位制取大小合适的皮下囊，将实验材料放入皮下囊并缝合。最后将试验鼠放于笼子中进行正常术后饲养。
①石蜡包埋切片
取材固定：取小鼠背部植入材料处的组织，用生理盐水快速清洗后，立即加入中性甲醛固定液，固定30-50分钟。
冲洗：组织固定后，经自来水流水冲洗，数小时或过夜。
脱水：为减少组织收缩，使用低浓度到高浓度的酒精进行脱水。材料依次经70％CH2OH(30分钟)→80％CH2OH(30分钟)→90％CH2OH(30分钟)→95％CH2OH I(20分钟)→95％CH2OH II(20分钟)→100％CH2OH I(20分钟)→100％CH2OH II(20分钟)。
透明：使用纯酒精和二甲苯等量混合液浸泡15分钟，再经过二甲苯I 15分钟，二甲苯II 15分钟，直至透明。
浸蜡：将材料放入二甲苯和石蜡各半的混合液中15分钟，再依次放入石蜡I、石蜡II浸蜡各1小时。
包埋：用镊子夹取石蜡模子在酒精灯上加热片刻，放在桌面上，倒入少许石蜡，再将镊子在酒精灯上稍加热，夹取材料将切面朝下放入蜡模中，放上包埋盒，轻轻倒入熔蜡。
切片展片：切片机上进行切片，在45摄氏度下进行展片。
②HE染色
脱蜡复水：将水浴锅温度调节至60摄氏度，将切片放入水浴锅内，30分钟后等待蜡熔化。之后石蜡切片经二甲苯I脱蜡5分钟，二甲苯II脱蜡5分钟，然后依次放入100％、95％、90％、80％、70％各级浓度的乙醇中各3-5分钟，再放入蒸馏水中3分钟。
染色水洗：切片放入苏木精中染色约10分钟，再用自来水流水冲洗10分钟，使切片颜色变蓝。
分化漂洗：切片放入1％盐酸乙醇液中分化数十秒，当切片颜色变红，颜色变浅即可。再放入自来水中洗1分钟，0.2％氨水返蓝30秒，再用自来水洗约1分钟。
复染：伊红染色3分钟左右，自来水速洗。
脱水、透明、封片：将切片依次放入80％乙醇10-20秒，90％乙醇10-20秒，95％乙醇I 2-3分钟，95％乙醇II 2-3分钟，无水乙醇I 3-5分钟，无水乙醇II 3-5分钟，二甲苯I 3-5分钟，二甲苯II 3-5分钟，二甲苯III 3-5分钟，最后用中性树胶封固。
观察：用显微镜对切片进行观察分析。
检测结果显示：内部结构为质地均一的蓬松多孔，孔和孔之间相互贯通，孔径分布较为均匀，孔径大小各不相同，孔径为100±21.5μm。热水溶失率56.55％～80.37％，溶胀率266.31％～591.96％，含水率24.30％～35.54％，拉伸强度最大650Pa。红外特征谱带显示，共混体系中无规线团结构增加。DSC检测表明，丝素中电子受体与羧甲基壳聚糖中的电子供体形成氢键，使羧甲基壳聚糖中非结晶区与水分子的结合性更强。体内安全性测试表明，术后四周，材料植入材料处伤口及周围软组织无充血和肿胀，无异常分泌物出现。植入材料边缘圆润，质地变形、变软、变小。组织切片观察(图4)材料周围的形成的由成纤维细胞组成纤维囊壁较完整。且材料与组织界限逐渐模糊。说明复合材料在实验鼠内具有生物安全性。
实施例2
一种多孔生物材料的制备方法，按照以下步骤进行：
表2丝素/羧甲基壳聚糖配比以及甘油和戊二醛的配比
1.再生丝素溶液的制备
在0.5％的Na2CO3溶液中脱胶，获得纤维状丝素，再于CaCl2、CH3CH2OH、H2O以摩尔质量比为1∶2∶8的三元溶剂溶解丝素，透析后得到再生丝素溶液。具体步骤如下：
(1)脱胶
称取一定量的蚕茧，去除蚕蛹后将茧壳剪成1平方厘米大小的碎片，加入沸腾的0.5％Na2CO3溶液中(浴比为1∶50)煮沸30分钟。捞出蚕茧并用去离子水反复搓洗直至无滑腻感。重复2次，再用苦味酸奶胭脂红溶液检测，直至丝胶完全脱去。在室温条件下晾干获得纤维状丝素蛋白。
(2)溶解
配制CaCl2、CH3CH2OH、H2O以摩尔质量比为1∶2∶8的三元溶剂，将丝素以1∶10的浴比加入三元溶剂中，置于70±5摄氏度的水浴锅内用玻璃棒不断搅拌，直至纤维状丝素完全溶解。
(3)透析
将上述冷却后的溶液倒入洁净的透析袋中，挤出透析袋内空气，两头封口，置于丝素溶液10倍体积的去离子水中透析三天。透析分为三个过程，第一天每2小时换一次透析液，第二天每3小时换一次透析液，第三天每4小时换一次透析液。3天后，用脱脂棉过滤掉溶液中的杂质，在4摄氏度6000r/分钟下离心10分钟后，存入试剂瓶中，放入冰箱备用。
2.羧甲基壳聚糖溶液的制备
将一定质量的羧甲基壳聚糖粉末溶于体积分数为2％(v/v)的乙酸溶液中，室温(25摄氏度)下磁力搅拌器搅拌过夜，配制成质量体积分数为4％(w/v)的羧甲基壳聚糖乙酸溶液，贴上标签，置于冰箱待用。
3.再生丝素/羧甲基壳聚糖复合材料的制备
将4％的丝素溶液与4％的羧甲基壳聚糖溶液等比例混合，再加入下表含量的甘油和0.20％的戊二醛，强力搅拌均匀后，置于4摄氏度冰箱中消泡过夜，24小时后倾倒入塑料培养皿中，于-20摄氏度冰箱中预冻6小时，-80摄氏度冷冻过夜，冷冻干燥48小时，得再生丝素/羧甲基壳聚糖初制复合材料。
将上述所制得支架材料浸入75％甲醇、1mol/L NaOH(体积比为1∶1)混合溶液中浸泡2小时，去离子水冲洗2-3次，于-20摄氏度冰箱中预冻6小时，-80摄氏度冷冻过夜，-50℃～-55℃，真空度10～40Pa冷冻干燥48小时，得再生丝素/羧甲基壳聚糖复合材料。
制得的多孔材料几何形态描述：表面较光滑，内部结构呈现疏松多孔结构，其中低浓度甘油含量的复合材料呈亮白色，而高浓度甘油含量的复合材料呈浅黄白色。
按照实施例1方法进行性能检测。结果显示：内部结构为质地均一的蓬松多孔，孔径100±22.7μm。热水溶失率59.41％～76.35％，溶胀率302.43～761.91％，含水率28.23％～33.18，拉伸强度为550Pa。DSC检测表明，甘油醇羟基与再生丝素/羧甲基壳聚糖共混膜中亲水性极性基团以及水分子形成氢键的能力较强，氢键多使共混膜中分子链段间很大程度得到了交联，使分子排列规整，结晶度增加，热运动稳定性增加。热重分析结果表明，甘油的加入，共混材料的热失重稳定性有所降低，这是因为甘油可以增加材料的柔韧性。体内安全性测试表明，术后，动物伤口附近皮肤愈合较好，未出现红肿、感染、充血等现象，并且材料部分出现大量细胞生长，说明复合材料在实验鼠体内具有一定的生物安全性。
实施例3
一种多孔生物材料的制备方法，按照以下步骤进行：
表3丝素/羧甲基壳聚糖配比以及甘油和戊二醛的配比
1.再生丝素溶液的制备
在0.5％的Na2CO3溶液中脱胶，获得纤维状丝素，再于CaCl2、CH3CH2OH、H2O以摩尔质量比为1∶2∶8的三元溶剂溶解丝素，透析后得到再生丝素溶液。具体步骤如下：
(1)脱胶
称取一定量的蚕茧，去除蚕蛹后将茧壳剪成1平方厘米大小的碎片，加入沸腾的0.5％Na2CO3溶液中(浴比为1∶50)煮沸30分钟。捞出蚕茧并用去离子水反复搓洗直至无滑腻感。重复2次，再用苦味酸奶胭脂红溶液检测，直至丝胶完全脱去。在室温条件下晾干获得纤维状丝素蛋白。
(2)溶解
配制CaCl2、CH3CH2OH、H2O以摩尔质量比为1∶2∶8的三元溶剂，将丝素以1∶10的浴比加入三元溶剂中，置于70±5摄氏度的水浴锅内用玻璃棒不断搅拌，直至纤维状丝素完全溶解。
(3)透析
将上述冷却后的溶液倒入洁净的透析袋中，挤出透析袋内空气，两头封口，置于丝素溶液10倍体积的去离子水中透析三天。透析分为三个过程，第一天每2小时换一次透析液，第二天每3小时换一次透析液，第三天每4小时换一次透析液。3天后，用脱脂棉过滤掉溶液中的杂质，在4摄氏度6000r/分钟下离心10分钟后，存入试剂瓶中，放入冰箱备用。
2.羧甲基壳聚糖溶液的制备
将一定质量的羧甲基壳聚糖粉末溶于体积分数为2％(v/v)的乙酸溶液中，室温(25摄氏度)下磁力搅拌器搅拌过夜，配制成质量体积分数为4％(w/v)的羧甲基壳聚糖乙酸溶液，贴上标签，置于冰箱待用。
3.再生丝素/羧甲基壳聚糖复合材料的制备
将4％的丝素溶液与4％的羧甲基壳聚糖溶液等比例混合，再加入2.0％的甘油和下表比例的戊二醛，强力搅拌均匀后，置于4摄氏度冰箱中消泡过夜，24小时后倾倒入塑料培养皿中，于-20摄氏度冰箱中预冻6小时，-80摄氏度冷冻过夜，冷冻干燥48小时，得再生丝素/羧甲基壳聚糖初制复合材料。
将上述所制得支架材料浸入75％甲醇、1mol/L NaOH(体积比为1∶1)混合溶液中浸泡2小时，去离子水冲洗2-3次，于-20摄氏度冰箱中预冻6小时，-80摄氏度冷冻过夜，-50℃～-55℃，真空度10～40Pa冷冻干燥48小时，得再生丝素/羧甲基壳聚糖复合材料。
多孔材料几何形态描述：表面光滑，蓬松多孔，有一定的弹性，压缩后可恢复原貌。低浓度戊二醛复合材料颜色亮白，高浓度戊二醛复合材料颜色呈浅黄白色。
按照实施例1方法进行性能检测。结果显示：内部结构为质地均一的蓬松多孔，孔径100±13μm。热水溶失率59.41％～64.38％，溶胀率391.87％～914.86％，含水率31.91％～42.47％，拉伸强度为650Pa。红外特征谱带显示，戊二醛加入不但使共混材料发生交联反应，还减少了丝素蛋白分子链与羧基之间形成氢键作用，使共混材料的结构变得更加稳定。DSC检测表明，加入戊二醛使得复合材料中分子间作用力增强，链段的排列更为紧密有序，结晶度增加。体内安全性测试表明，术后一段时间组织切片观察材料部分出现大量细胞生长，且材料与组织界限逐渐模糊，说明样品的安全性指标合格。
实施例4
将背景技术所载文献“丝素蛋白/壳聚糖三维多孔支架材料的构建表征与细胞学体外实验研究”中制备的复合材料(对照组)与使用本发明制备的复合材料(本发明组)进行性能对比。
1.宏观形态对比(图1)
由两组复合材料的形态可以得出，对照组大体呈浅黄白色，表面粗糙，内部结构疏松呈海绵状，有一定的弹性，压缩后可恢复原貌。本发明组大体呈亮白或浅黄白色，表面光滑，呈现海绵状，蓬松多孔，质地比较柔软，有弹性；材料可塑性强，根据需要可以对材料进行裁剪以达到所需要的形状。与对照组相比，本发明的制备的丝素与羧甲基壳聚糖复合材料表面更光滑，柔韧性和可塑性较强。
2.微观形态对比(图2和图3)
对照组中将丝素/壳聚糖按不同比例混合后，所得材料扫描电镜图差异明显，大多数材料孔壁厚度均匀，但孔与孔之间连通性较差，孔径大小差异显著。本发明中丝素/羧甲基壳聚糖按不同比例混合后未出现明显的相分离现象，说明二者之间的相容性较好。本发明所得材料孔壁厚度均匀，内部为不规则孔状，孔和孔之间相互贯通，孔径分布较为均匀；孔径100±19.5μm。
与对照组相比，本发明复合材料孔与孔之间的连通性较好，孔径分布均匀。更有利于细胞在复合支架中生长于增值，更符合生物医学材料标准。

Claims (6)

1.一种多孔材料的制备方法，其特征在于：以丝素蛋白与羧甲基壳聚糖作为原料，包括丝素蛋白溶液的制备，羧甲基壳聚糖溶液的制备，丝素蛋白/羧甲基壳聚糖复合材料的制备；所述再生丝素/羧甲基壳聚糖复合材料的制备是将交联剂戊二醛、增塑剂甘油与丝素、羧甲基壳聚糖一同混合，经预冷后，冷冻干燥成型；所述预冷是在-20℃放置6小时，然后-80℃放置12小时。
2.如权利要求1所述的多孔材料的制备方法，所述冷冻干燥的条件为：在温度-50℃～-55℃，真空度10～40Pa处理48h。
3.如权利要求1或2所述的多孔材料的制备方法，所述丝素蛋白与羧甲基壳聚糖的质量比为1-9:3。
4.如权利要求1、2或3所述的多孔材料的制备方法，所述甘油的质量浓度为0.5-3%，戊二醛质量浓度为0-0.2%。
5.如权利要求1所述的多孔材料的制备方法，所述再生丝素溶液的制备，是在0.5%的Na2CO3溶液中脱胶，获得纤维状丝素，再于CaCl2、CH3CH2OH、H2O以摩尔质量比为1:2:8的三元溶剂溶解丝素，透析后得到再生丝素溶液。
6.如权利要求1所述的多孔材料的制备方法，所述多孔材料的制备方法，包括以下步骤：
A. 再生丝素溶液的制备
（1）脱胶
称取蚕茧，去除蚕蛹后将茧壳剪成1平方厘米大小的碎片，加入沸腾的0.5% Na2CO3溶液中（浴比为1:50）煮沸30分钟；捞出蚕茧并用去离子水反复搓洗直至无滑腻感；用苦味酸奶胭脂红溶液检测，直至丝胶完全脱去，在室温条件下晾干获得纤维状丝素蛋白；
（2）溶解
配制CaCl2、CH3CH2OH、H2O以摩尔质量比为1:2:8的三元溶剂，将丝素以1:10的浴比加入三元溶剂中，置于70±5℃的水浴锅内不断搅拌，直至纤维状丝素完全溶解；
（3）透析
将上述冷却后的溶液倒入洁净的透析袋中，挤出透析袋内空气，两头封口，置于丝素溶液10倍体积的去离子水中透析三天；透析分为三个过程，第一天每2小时换一次透析液，第二天每3小时换一次透析液，第三天每4小时换一次透析液；3天后，用脱脂棉过滤掉溶液中的杂质，在4℃ 6000r/min离心10分钟后，存入试剂瓶中，放入冰箱备用；
B. 羧甲基壳聚糖溶液的制备
将一定质量的羧甲基壳聚糖粉末溶于体积分数为2%（v/v）的乙酸溶液中，室温(25℃)下磁力搅拌器搅拌过夜，配制成质量体积分数为4%（w/v）的羧甲基壳聚糖乙酸溶液，置于冰箱待用；
C. 再生丝素/羧甲基壳聚糖复合材料的制备
（1）将4%的丝素溶液与4%的羧甲基壳聚糖溶液混合，再加入的甘油和戊二醛，强力搅拌均匀后，置于4℃消泡过夜，24小时后倾倒入塑料培养皿中，于-20℃冰箱中预冻6小时，-80℃冷冻12h，然后进行冷冻干燥48小时，得再生丝素/羧甲基壳聚糖初制复合材料；
（2）将所得初制复合材料浸入75%甲醇、1mol/L NaOH（体积比为1:1）混合溶液中浸泡2小时，去离子水冲洗2-3次，于-20℃冰箱中预冻6小时，-80℃冷冻过夜，然后进行冷冻干燥48小时，得再生丝素/羧甲基壳聚糖复合材料。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106729955A (zh) * 2016-11-28 2017-05-31 广州军区广州总医院 一种富含生长因子的壳聚糖可溶性纱布的制备方法
CN106769297A (zh) * 2016-12-12 2017-05-31 浙江理工大学 一种基于蛋白质组学测定古代丝织品的方法
CN106750521A (zh) * 2016-12-14 2017-05-31 江南大学 一种高柔韧性的废弃羊毛基生物塑料及其制备方法
CN107261196A (zh) * 2017-05-16 2017-10-20 苏州大学 一种抗菌丝素蛋白材料及其制备方法
CN107823694A (zh) * 2017-11-08 2018-03-23 西南大学 一种保湿性双层海绵敷料及其制备方法
CN110448715A (zh) * 2019-09-03 2019-11-15 西南大学 一种基于丝素蛋白的含姜黄素医用敷料的制备方法
CN111974355A (zh) * 2020-07-13 2020-11-24 广西科技大学 以二氧化硅为致孔剂的壳聚糖/丝素基双重结构多孔吸附过滤材料及其制备方法
CN113429588A (zh) * 2021-06-11 2021-09-24 西南大学 一种蚕茧提取物水凝胶的制备方法
CN116603091A (zh) * 2023-05-24 2023-08-18 南京医科大学第二附属医院 一种光动力抗菌敷料及其制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120190113A1 (en) * 2009-08-11 2012-07-26 Yi Gao Macroporous Microcarrier Specific to Liver Cell, Preparation Method and Use Thereof
CN102973984A (zh) * 2012-12-25 2013-03-20 成都维德医疗器械有限责任公司 一种复合材料多孔支架的制备方法与应用
CN103418029A (zh) * 2013-08-29 2013-12-04 中国人民解放军军事医学科学院卫生装备研究所 一种丝素/壳聚糖复合多孔支架的制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120190113A1 (en) * 2009-08-11 2012-07-26 Yi Gao Macroporous Microcarrier Specific to Liver Cell, Preparation Method and Use Thereof
CN102973984A (zh) * 2012-12-25 2013-03-20 成都维德医疗器械有限责任公司 一种复合材料多孔支架的制备方法与应用
CN103418029A (zh) * 2013-08-29 2013-12-04 中国人民解放军军事医学科学院卫生装备研究所 一种丝素/壳聚糖复合多孔支架的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FENG LIN等: "Deposition behavior and properties of silk fibroin scaffolds soaked in simulated body fluid", 《MATERIALS CHEMISTRY AND PHYSICS》 *
柳磊等: "丝素蛋白/壳聚糖三维多孔支架的构建与结构表征", 《中国组织工程研究》 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106729955A (zh) * 2016-11-28 2017-05-31 广州军区广州总医院 一种富含生长因子的壳聚糖可溶性纱布的制备方法
CN106769297A (zh) * 2016-12-12 2017-05-31 浙江理工大学 一种基于蛋白质组学测定古代丝织品的方法
CN106750521A (zh) * 2016-12-14 2017-05-31 江南大学 一种高柔韧性的废弃羊毛基生物塑料及其制备方法
CN106750521B (zh) * 2016-12-14 2019-02-12 江南大学 一种高柔韧性的废弃羊毛基生物塑料及其制备方法
CN107261196A (zh) * 2017-05-16 2017-10-20 苏州大学 一种抗菌丝素蛋白材料及其制备方法
CN107823694A (zh) * 2017-11-08 2018-03-23 西南大学 一种保湿性双层海绵敷料及其制备方法
CN110448715A (zh) * 2019-09-03 2019-11-15 西南大学 一种基于丝素蛋白的含姜黄素医用敷料的制备方法
CN111974355A (zh) * 2020-07-13 2020-11-24 广西科技大学 以二氧化硅为致孔剂的壳聚糖/丝素基双重结构多孔吸附过滤材料及其制备方法
CN113429588A (zh) * 2021-06-11 2021-09-24 西南大学 一种蚕茧提取物水凝胶的制备方法
CN113429588B (zh) * 2021-06-11 2022-06-14 西南大学 一种蚕茧提取物水凝胶的制备方法
CN116603091A (zh) * 2023-05-24 2023-08-18 南京医科大学第二附属医院 一种光动力抗菌敷料及其制备方法
CN116603091B (zh) * 2023-05-24 2024-01-19 南京医科大学第二附属医院 一种光动力抗菌敷料及其制备方法

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