CN103418029A - 一种丝素/壳聚糖复合多孔支架的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丝素/壳聚糖复合多孔支架的制备方法。本发明按照下述步骤进行:首先以桑蚕丝为原料,经过脱胶、溶解、透析、浓缩制备丝素蛋白溶液,将壳聚糖溶解于醋酸水溶液中;将丝素蛋白溶液和壳聚糖溶液混合,丝素与壳聚糖的重量比为5:1-2:1;最后通过冷冻干燥相分离法制备本发明材料。本发明将丝素蛋白溶液与壳聚糖溶液进行混合后再冷冻干燥,以提高支架的力学性能。
Description
技术领域
本发明属于生物医学工程领域,更具体的说,是涉及一种用于组织工程及疫苗生产的丝素/壳聚糖复合多孔支架的制备方法。
背景技术
丝素蛋白大分子是由 H 链(分子量 350 kDa),P25 糖蛋白(分子量 28kDa)及L 链(分子量 25.8kDa)组成,三者比例为 H: P25: L =6: 1: 6,其分子量分布见图1。丝素蛋白(SF)材料由无定形区和结晶区构成,其中结晶区的结晶类型主要有两种,分别称为 SilkⅠ型和 SilkⅡ型。SilkⅠ晶体中大分子链的立体构象呈曲柄形,是介于β-折叠与α-螺旋之间的一种中间形态;Silk II 晶体中呈反平行β-折叠层结构,属单斜晶系。在折叠层中,邻近肽链骨架通过N-H与C=O之间形成氢键,相邻链段之间的氢键和分子间引力使它们结合得相当紧密,从而使更多的肽链平行稳定排列,构成锯齿状的片层结构从而形成类似于贝壳、牙釉质等“外向型”结构的生物材料。由于丝素蛋白的低免疫原性、缓慢的降解速度、良好的生物相容性(丝素蛋白具有与胶原同等的体内、体外生物相容性)及特有的理化性质,丝素蛋白作为一种新的生物材料而受到越来越多的关注,众多的研究发现,丝素蛋白可以以多种形式如凝胶、薄膜和海绵网状等形式在体外支持多种哺乳动物细胞(成纤维细胞、类成骨细胞等)的黏附和生长。但单纯的丝素蛋白存在一定的缺陷,例如纯丝素材料在含水量极低时容易破碎,在低湿环境应用时强度不够,结晶区偏少也会导致丝素材料在溶液中的溶失率较高等,这些使其在某些应用中受到限制,希望通过复合材料性能互补的原理,来多方位的改善丝素材料的物理性能。
壳聚糖是由甲壳类动物提取的甲壳素部分脱乙酰的产物,是自然界中少见的一种带正电荷的碱性多糖,因具有无毒性、无免疫原性,可以在溶菌酶的作用下生物降解,并且具有良好的可加工性而被广泛应用于组织工程研究中。
因此,将壳聚糖(CS)和,丝素蛋白(SF)进行复合,从而将CS的良好加工性和SF的良好生物相容性有机结合,有望制备出具有良好综合性能的复合多孔支架材料。组织工程以及疫苗的研制、生产都需要实现细胞的规模化培养,理想的支架材料应具备良好的力学性能以及细胞相容性,所以,该支架材料可望用于组织工程及疫苗的研制生产中。
发明内容
为了克服单一丝素材料在含水量极低时容易破碎,在低湿环境应用时强度不够,结晶区偏少导致的在溶液中的溶失率较高等缺点,本发明提供一种丝素/壳聚糖复合多孔支架的制备方法。
为此,本发明丝素/壳聚糖复合多孔支架的制备方法,按照下述步骤进行:
首先以桑蚕丝为原料,经过脱胶、溶解、透析、浓缩制备丝素蛋白溶液,将壳聚糖溶解于醋酸水溶液中;将丝素蛋白溶液和壳聚糖溶液混合,丝素与壳聚糖的重量比为5:1-2:1;最后通过冷冻干燥相分离法制备本发明材料。
丝素脱胶的方法采用下述任一方法:浸泡于Na2CO3的水溶液中,温度为60-100℃;或浸泡于中性皂的水溶液中,温度为90-100℃;或浸泡于去离子水中在温度为110-130℃,压力为0.05-0.18MPa条件下脱胶。
丝素溶解的方法采用下述任一方法:溶解于CaCl2、乙醇、水的三元溶液中,CaCl2、乙醇、水的摩尔比为1:2:8,温度为50-100℃,溶解时间为2-5h;或溶解于CaCl2的水溶液中,CaCl2的质量百分比浓度为30-50%,溶解温度90-100℃,溶解时间5-20min;溶解于9.3mol/L的LiBr溶液中,溶解温度50-70℃,溶解时间30-60min。
丝素浓缩的方法采用下述任一方法:透析袋透析法;或加热挥发法;或中空纤维超滤法。
丝素与壳聚糖混合溶液的冷冻温度为:普通冰箱冷冻-20℃;或低温冰箱-80℃;或液氮-196℃。
本发明的有益效果是:为了解决单一丝素材料在含水量极低时容易破碎,在低湿环境应用时强度不够,结晶区偏少导致的在溶液中的溶失率较高等缺点,本发明将丝素蛋白溶液与壳聚糖溶液进行混合后再冷冻干燥,以提高支架的力学性能。采用本发明的方法制备的复合多孔支架在压缩应变为10%时,压缩应力最高可达2.5KPa(见图2)。将成骨前体细胞MC3T3-E1细胞在所述的丝素/壳聚糖复合多孔支架上进行培养,结果表明本发明的复合多孔支架具有良好的细胞相容性。
附图说明
图1是凝胶渗透色谱法测得丝素的分子量分布图;
图2是丝素/壳聚糖复合多孔支架的压缩应力-应变图;
图3和图4是成骨前体细胞MC3T3-E1在丝素/壳聚糖复合多孔支架上培养的电镜图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细描述。
本发明中丝素蛋白是以桑蚕丝为原料,经过脱胶、溶解、透析、浓缩制备而成,脱胶的方法为通过将桑蚕丝浸入60-100℃的Na2CO3水溶液中、或90-100℃的中性皂水溶液中、或去离子水中高温高压进行;溶解方法为溶解于在CaCl2、乙醇、水的三元溶液中(摩尔比1:2:8)、或CaCl2的水溶液中、或LiBr溶液中;透析在流水冲洗下在透析袋中进行;浓缩采用在透析袋透析法、或加热挥发法、或中空纤维超滤法进行,浓缩至所需的浓度(10-30%)。
本发明复合多孔支架的制备方法采用共混后冷冻干燥法制备而成。丝素和壳聚糖的比例(重量比)为5:1,4:1,3:1,2:1。
将成骨前体细胞MC3T3-E1细胞在所述的丝素蛋白/壳聚糖复合多孔支架上进行培养,结果表明所述复合支架材料具有良好的细胞相容性。
实施例一
市售桑蚕丝,浸入60℃Na2CO3水溶液中进行脱胶,Na2CO3水溶液的浓度为0.2%,每次30min,共3次,水洗后70℃干燥。溶解于60℃的CaCl2、乙醇、水的三元溶液中(摩尔比1:2:8),溶解时间为2h,装入透析袋,在流水冲洗下透析。将透析好的丝素溶液在聚乙二醇(PEG)水溶液中进行浓缩至浓度为15%。在丝素溶液中按照5:1(重量比)的比例加入壳聚糖,加入乙酸配置成1%的乙酸混合溶液,充分搅拌溶解,在-20℃冷冻后再进行冷冻干燥,制备成所需的支架材料。
实施例二
市售桑蚕丝,浸入90-100℃的中性皂水溶液中进行脱胶,水洗后70℃干燥。溶解于95℃的CaCl2水溶液中,溶解时间为10min,装入透析袋,在流水冲洗下透析。将透析好的丝素溶液加热搅拌浓缩至浓度为20%。在丝素溶液中按照4:1(重量比)的比例加入壳聚糖,加入乙酸配置成1%的乙酸混合溶液,充分搅拌溶解,在-196℃冷冻后再进行冷冻干燥,制备成所需的支架材料。
实施例三
市售桑蚕丝,浸入去离子水中高温高压进行脱胶,水洗后70℃干燥。溶解于70℃的CaCl2、乙醇、水的三元溶液中(摩尔比1:2:8),溶解时间为4h,装入透析袋,在流水冲洗下透析。将透析好的丝素溶液在PEG水溶液中进行浓缩至浓度为25%。在丝素溶液中按照3:1(重量比)的比例加入壳聚糖,加入乙酸配置成1%的乙酸混合溶液,充分搅拌溶解,在-80℃冷冻后再进行冷冻干燥,制备成所需的支架材料。
实施例四
市售桑蚕丝,浸入90℃Na2CO3水溶液中进行脱胶,每次30min,共3次,水洗后70℃干燥。溶解于60℃的LiBr溶液中,溶解时间为4h,装入透析袋,在流水冲洗下透析。将透析好的丝素溶液在PEG水溶液中进行浓缩至浓度为30%。在丝素溶液中按照2:1(重量比)的比例加入壳聚糖,加入乙酸配置成1%的乙酸混合溶液,充分搅拌溶解,在-196℃冷冻后再进行冷冻干燥,制备成所需的支架材料。在复合膜上接种成骨前体细胞MC3T3-E1,细胞在微米级羟基磷灰石/壳聚糖复合膜上的伸展状态如图3和图4所示。结果表明本发明的复合多孔支架具有良好的细胞相容性。
实施例五
市售桑蚕丝,浸入100℃Na2CO3水溶液中进行脱胶,每次30min,共3次,水洗后70℃干燥。溶解于70℃的CaCl2、乙醇、水的三元溶液中(摩尔比1:2:8),溶解时间为5h,装入透析袋,在流水冲洗下透析。将透析好的丝素溶液在PEG水溶液中进行浓缩至浓度为20%。在丝素溶液中按照2:1(重量比)的比例加入壳聚糖,加入乙酸配置成1%的乙酸混合溶液,充分搅拌溶解,在-196℃冷冻后再进行冷冻干燥,制备成所需的支架材料。
尽管结合附图对本发明进行了上述描述,但是本发明并不局限于上述的具体实施方式,上述的具体实施方式仅仅是示意性的,而不是限制性的,本领域的技术人员在本发明的启示下,在不脱离本发明的宗旨下做出的许多变形,均属于本发明的保护之列。
Claims (5)
1.一种丝素/壳聚糖复合多孔支架的制备方法,其特征是,按照下述步骤进行:
以桑蚕丝为原料,通过脱胶、溶解、透析和浓缩步骤制备丝素蛋白溶液;
将壳聚糖溶解于醋酸水溶液中;
将丝素蛋白溶液和壳聚糖溶液混合,混合溶液中丝素与壳聚糖的重量比为5:1-2:1;
通过冷冻干燥相分离法制备丝素/壳聚糖复合多孔支架。
2.根据权利要求1所述的丝素/壳聚糖复合多孔支架的制备方法,其特征在于,丝素脱胶的方法采用下述任一方法:浸泡于Na2CO3的水溶液中,温度为60-100℃;或浸泡于中性皂的水溶液中,温度为90-100℃;或浸泡于去离子水中在温度为110-130℃,压力为0.05-0.18MPa条件下脱胶。
3.根据权利要求1所述的丝素/壳聚糖复合多孔支架的制备方法,其特征在于,丝素溶解的方法采用下述任一方法:溶解于CaCl2、乙醇、水的三元溶液中,CaCl2、乙醇、水的摩尔比为1:2:8,温度为50-100℃,溶解时间为2-5h;或溶解于CaCl2的水溶液中,CaCl2的质量百分比浓度为30-50%,溶解温度90-100℃,溶解时间5-20min;溶解于9.3mol/L的LiBr溶液中,溶解温度50-70℃,溶解时间30-60min。
4.根据权利要求1所述的丝素/壳聚糖复合多孔支架的制备方法,其特征在于,丝素浓缩的方法采用下述任一方法:透析袋透析法;或加热挥发法;或中空纤维超滤法。
5. 根据权利要求1所述的丝素/壳聚糖复合多孔支架的制备方法,其特征在于,丝素与壳聚糖混合溶液的冷冻温度为:普通冰箱冷冻-20℃;或低温冰箱-80℃;或液氮-196℃。
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Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
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C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20131204 |