CN103418029A

CN103418029A - 一种丝素/壳聚糖复合多孔支架的制备方法

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Publication number: CN103418029A
Application number: CN2013103819551A
Authority: CN
Inventors: 李瑞欣; 张西正; 侍才洪; 郭勇; 徐成; 李�昊; 杨健; 关静; 武继民
Original assignee: Institute of Medical Equipment Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Institute of Medical Equipment Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2013-08-29
Filing date: 2013-08-29
Publication date: 2013-12-04

Abstract

本发明公开了一种丝素/壳聚糖复合多孔支架的制备方法。本发明按照下述步骤进行：首先以桑蚕丝为原料，经过脱胶、溶解、透析、浓缩制备丝素蛋白溶液，将壳聚糖溶解于醋酸水溶液中；将丝素蛋白溶液和壳聚糖溶液混合，丝素与壳聚糖的重量比为5:1-2:1；最后通过冷冻干燥相分离法制备本发明材料。本发明将丝素蛋白溶液与壳聚糖溶液进行混合后再冷冻干燥，以提高支架的力学性能。

Description

一种丝素/壳聚糖复合多孔支架的制备方法

技术领域

本发明属于生物医学工程领域，更具体的说，是涉及一种用于组织工程及疫苗生产的丝素/壳聚糖复合多孔支架的制备方法。

背景技术

丝素蛋白大分子是由 H 链（分子量 350 kDa），P25 糖蛋白（分子量 28kDa）及L 链（分子量 25.8kDa）组成，三者比例为 H: P25: L =6: 1: 6，其分子量分布见图1。丝素蛋白（SF）材料由无定形区和结晶区构成，其中结晶区的结晶类型主要有两种，分别称为 SilkⅠ型和 SilkⅡ型。SilkⅠ晶体中大分子链的立体构象呈曲柄形，是介于β-折叠与α-螺旋之间的一种中间形态；Silk II 晶体中呈反平行β-折叠层结构，属单斜晶系。在折叠层中，邻近肽链骨架通过N-H与C=O之间形成氢键，相邻链段之间的氢键和分子间引力使它们结合得相当紧密，从而使更多的肽链平行稳定排列，构成锯齿状的片层结构从而形成类似于贝壳、牙釉质等“外向型”结构的生物材料。由于丝素蛋白的低免疫原性、缓慢的降解速度、良好的生物相容性（丝素蛋白具有与胶原同等的体内、体外生物相容性）及特有的理化性质，丝素蛋白作为一种新的生物材料而受到越来越多的关注，众多的研究发现，丝素蛋白可以以多种形式如凝胶、薄膜和海绵网状等形式在体外支持多种哺乳动物细胞（成纤维细胞、类成骨细胞等）的黏附和生长。但单纯的丝素蛋白存在一定的缺陷，例如纯丝素材料在含水量极低时容易破碎，在低湿环境应用时强度不够，结晶区偏少也会导致丝素材料在溶液中的溶失率较高等，这些使其在某些应用中受到限制，希望通过复合材料性能互补的原理，来多方位的改善丝素材料的物理性能。

壳聚糖是由甲壳类动物提取的甲壳素部分脱乙酰的产物，是自然界中少见的一种带正电荷的碱性多糖，因具有无毒性、无免疫原性，可以在溶菌酶的作用下生物降解，并且具有良好的可加工性而被广泛应用于组织工程研究中。

因此，将壳聚糖（CS）和，丝素蛋白（SF）进行复合，从而将CS的良好加工性和SF的良好生物相容性有机结合，有望制备出具有良好综合性能的复合多孔支架材料。组织工程以及疫苗的研制、生产都需要实现细胞的规模化培养，理想的支架材料应具备良好的力学性能以及细胞相容性，所以，该支架材料可望用于组织工程及疫苗的研制生产中。

发明内容

为了克服单一丝素材料在含水量极低时容易破碎，在低湿环境应用时强度不够，结晶区偏少导致的在溶液中的溶失率较高等缺点，本发明提供一种丝素/壳聚糖复合多孔支架的制备方法。

为此，本发明丝素/壳聚糖复合多孔支架的制备方法，按照下述步骤进行：

首先以桑蚕丝为原料，经过脱胶、溶解、透析、浓缩制备丝素蛋白溶液，将壳聚糖溶解于醋酸水溶液中；将丝素蛋白溶液和壳聚糖溶液混合，丝素与壳聚糖的重量比为5:1-2:1；最后通过冷冻干燥相分离法制备本发明材料。

丝素脱胶的方法采用下述任一方法：浸泡于Na₂CO₃的水溶液中，温度为60-100℃；或浸泡于中性皂的水溶液中，温度为90-100℃；或浸泡于去离子水中在温度为110-130℃，压力为0.05-0.18MPa条件下脱胶。

丝素溶解的方法采用下述任一方法：溶解于CaCl₂、乙醇、水的三元溶液中，CaCl₂、乙醇、水的摩尔比为1:2:8，温度为50-100℃，溶解时间为2-5h；或溶解于CaCl₂的水溶液中，CaCl₂的质量百分比浓度为30-50%，溶解温度90-100℃，溶解时间5-20min；溶解于9.3mol/L的LiBr溶液中，溶解温度50-70℃，溶解时间30-60min。

丝素浓缩的方法采用下述任一方法：透析袋透析法；或加热挥发法；或中空纤维超滤法。

丝素与壳聚糖混合溶液的冷冻温度为：普通冰箱冷冻-20℃；或低温冰箱-80℃；或液氮-196℃。

本发明的有益效果是：为了解决单一丝素材料在含水量极低时容易破碎，在低湿环境应用时强度不够，结晶区偏少导致的在溶液中的溶失率较高等缺点，本发明将丝素蛋白溶液与壳聚糖溶液进行混合后再冷冻干燥，以提高支架的力学性能。采用本发明的方法制备的复合多孔支架在压缩应变为10%时，压缩应力最高可达2.5KPa（见图2）。将成骨前体细胞MC3T3-E1细胞在所述的丝素/壳聚糖复合多孔支架上进行培养，结果表明本发明的复合多孔支架具有良好的细胞相容性。

附图说明

图1是凝胶渗透色谱法测得丝素的分子量分布图；

图2是丝素/壳聚糖复合多孔支架的压缩应力-应变图；

图3和图4是成骨前体细胞MC3T3-E1在丝素/壳聚糖复合多孔支架上培养的电镜图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细描述。

本发明中丝素蛋白是以桑蚕丝为原料，经过脱胶、溶解、透析、浓缩制备而成，脱胶的方法为通过将桑蚕丝浸入60-100℃的Na₂CO₃水溶液中、或90-100℃的中性皂水溶液中、或去离子水中高温高压进行；溶解方法为溶解于在CaCl₂、乙醇、水的三元溶液中（摩尔比1:2:8）、或CaCl₂的水溶液中、或LiBr溶液中；透析在流水冲洗下在透析袋中进行；浓缩采用在透析袋透析法、或加热挥发法、或中空纤维超滤法进行，浓缩至所需的浓度（10-30%）。

本发明复合多孔支架的制备方法采用共混后冷冻干燥法制备而成。丝素和壳聚糖的比例（重量比）为5:1，4:1，3:1，2:1。

将成骨前体细胞MC3T3-E1细胞在所述的丝素蛋白/壳聚糖复合多孔支架上进行培养，结果表明所述复合支架材料具有良好的细胞相容性。

实施例一

市售桑蚕丝，浸入60℃Na₂CO₃水溶液中进行脱胶，Na₂CO₃水溶液的浓度为0.2%，每次30min，共3次，水洗后70℃干燥。溶解于60℃的CaCl2、乙醇、水的三元溶液中（摩尔比1:2:8），溶解时间为2h，装入透析袋，在流水冲洗下透析。将透析好的丝素溶液在聚乙二醇（PEG）水溶液中进行浓缩至浓度为15%。在丝素溶液中按照5:1（重量比）的比例加入壳聚糖，加入乙酸配置成1%的乙酸混合溶液，充分搅拌溶解，在-20℃冷冻后再进行冷冻干燥，制备成所需的支架材料。

实施例二

市售桑蚕丝，浸入90-100℃的中性皂水溶液中进行脱胶，水洗后70℃干燥。溶解于95℃的CaCl₂水溶液中，溶解时间为10min，装入透析袋，在流水冲洗下透析。将透析好的丝素溶液加热搅拌浓缩至浓度为20%。在丝素溶液中按照4:1（重量比）的比例加入壳聚糖，加入乙酸配置成1%的乙酸混合溶液，充分搅拌溶解，在-196℃冷冻后再进行冷冻干燥，制备成所需的支架材料。

实施例三

市售桑蚕丝，浸入去离子水中高温高压进行脱胶，水洗后70℃干燥。溶解于70℃的CaCl₂、乙醇、水的三元溶液中（摩尔比1:2:8），溶解时间为4h，装入透析袋，在流水冲洗下透析。将透析好的丝素溶液在PEG水溶液中进行浓缩至浓度为25%。在丝素溶液中按照3:1（重量比）的比例加入壳聚糖，加入乙酸配置成1%的乙酸混合溶液，充分搅拌溶解，在-80℃冷冻后再进行冷冻干燥，制备成所需的支架材料。

实施例四

市售桑蚕丝，浸入90℃Na₂CO₃水溶液中进行脱胶，每次30min，共3次，水洗后70℃干燥。溶解于60℃的LiBr溶液中，溶解时间为4h，装入透析袋，在流水冲洗下透析。将透析好的丝素溶液在PEG水溶液中进行浓缩至浓度为30%。在丝素溶液中按照2:1（重量比）的比例加入壳聚糖，加入乙酸配置成1%的乙酸混合溶液，充分搅拌溶解，在-196℃冷冻后再进行冷冻干燥，制备成所需的支架材料。在复合膜上接种成骨前体细胞MC3T3-E1，细胞在微米级羟基磷灰石/壳聚糖复合膜上的伸展状态如图3和图4所示。结果表明本发明的复合多孔支架具有良好的细胞相容性。

实施例五

市售桑蚕丝，浸入100℃Na₂CO₃水溶液中进行脱胶，每次30min，共3次，水洗后70℃干燥。溶解于70℃的CaCl₂、乙醇、水的三元溶液中（摩尔比1:2:8），溶解时间为5h，装入透析袋，在流水冲洗下透析。将透析好的丝素溶液在PEG水溶液中进行浓缩至浓度为20%。在丝素溶液中按照2:1（重量比）的比例加入壳聚糖，加入乙酸配置成1%的乙酸混合溶液，充分搅拌溶解，在-196℃冷冻后再进行冷冻干燥，制备成所需的支架材料。

尽管结合附图对本发明进行了上述描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明的宗旨下做出的许多变形，均属于本发明的保护之列。

Claims

1.一种丝素/壳聚糖复合多孔支架的制备方法，其特征是，按照下述步骤进行：

以桑蚕丝为原料，通过脱胶、溶解、透析和浓缩步骤制备丝素蛋白溶液；

将壳聚糖溶解于醋酸水溶液中；

将丝素蛋白溶液和壳聚糖溶液混合，混合溶液中丝素与壳聚糖的重量比为5:1-2:1；

通过冷冻干燥相分离法制备丝素/壳聚糖复合多孔支架。

2.根据权利要求1所述的丝素/壳聚糖复合多孔支架的制备方法，其特征在于，丝素脱胶的方法采用下述任一方法：浸泡于Na₂CO₃的水溶液中，温度为60-100℃；或浸泡于中性皂的水溶液中，温度为90-100℃；或浸泡于去离子水中在温度为110-130℃，压力为0.05-0.18MPa条件下脱胶。

3.根据权利要求1所述的丝素/壳聚糖复合多孔支架的制备方法，其特征在于，丝素溶解的方法采用下述任一方法：溶解于CaCl₂、乙醇、水的三元溶液中，CaCl₂、乙醇、水的摩尔比为1:2:8，温度为50-100℃，溶解时间为2-5h；或溶解于CaCl₂的水溶液中，CaCl₂的质量百分比浓度为30-50%，溶解温度90-100℃，溶解时间5-20min；溶解于9.3mol/L的LiBr溶液中，溶解温度50-70℃，溶解时间30-60min。

4.根据权利要求1所述的丝素/壳聚糖复合多孔支架的制备方法，其特征在于，丝素浓缩的方法采用下述任一方法：透析袋透析法；或加热挥发法；或中空纤维超滤法。

5. 根据权利要求1所述的丝素/壳聚糖复合多孔支架的制备方法，其特征在于，丝素与壳聚糖混合溶液的冷冻温度为：普通冰箱冷冻-20℃；或低温冰箱-80℃；或液氮-196℃。