WO2016023140A1

WO2016023140A1 - 一种用于细胞三维培养的基质支架及其构建方法和应用

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Publication number: WO2016023140A1
Application number: PCT/CN2014/000771
Authority: WO
Inventors: 王守立
Original assignee: 苏州堪赛尔生物技术有限公司
Priority date: 2014-08-15
Filing date: 2014-08-15
Publication date: 2016-02-18
Also published as: US20160206780A1; CN105431179A

Abstract

本发明提供一种用于细胞三维培养的基质支架及其构建方法和应用。所述基质支架是由蚕茧壳或蚕丝以特定方法制得的丝素蛋白类物质与壳聚糖、交联剂经交联反应而制得。该基质支架替代细胞外基质或组织、器官的基质的作用，进一步可用于细胞体外分化扩增、组织器官再造和肿瘤药物筛选。

Description

一种用于细胞三维培养的基质支架及其构建方法和应用技术领域

本发明涉及一种用于细胞三维培养的基质支架及其构建方法和应用。该支架起着替代细胞外基质或组织、器官的基质的作用，进一步可用于细胞体外分化扩增、组织器官再造和肿瘤药物筛选。

背景技术

近年来，随着大量的生物靶向性药物的临床应用，陆续出现的毒副作用也越来越受到关注。为何这些药物的毒副作用不能在临床前的研究结果中发现，主要的根源就是前期研究模型与体内环境存在一定差距，成功构建接近人体真实环境的研究模型也许就是解决上述问题的关键途径之一。

细胞是我们常用的研究对象，我们所从事的细胞学水平的研究也基本上是在二维培养状态下进行，由于体内细胞（不论是贴壁还是非贴壁生长的细胞）均是在一定基质支撑下生长，因此体外的二维培养环境不能真实反应细胞的体内环境。

近年来，三维培养技术逐渐成为细胞培养领域研究的热点，其利用各种材料与方法，使细胞附着在立体空间内生长，其生长更接近于细胞的体内生长模式，形成类似体内的组织结构，发挥其生理功能。根据培养方式的不同，目前常用的三维培养技术主要包括动力性培养和静止性培养两类。动力性培养主要包括旋转烧瓶培养和旋转细胞培养系统，这类培养技术虽然通过力学刺激使细胞更好地发挥功能，但由于条件要求较高不易推广使用。静止性培养是把细胞直接接种于三维载体上，在不施加任何物理方法下培养，常见的技术包括自发性细胞聚集、基质覆盖培养、预置基质培养和微载体培养等。期中，预置基质培养提供了与细胞体内生长类似的支架环境，且操作相对简单，但关键取决于基质材料选择。

目前常用的基质来源于胶原蛋白 I、明胶或提取的细胞外基质等动物性凝胶，但动物性凝胶价格昂贵且含有很多不确定成分。

CN101445971A, CN103418029A公幵了由丝素蛋白、壳聚糖制成的一种仿生细胞外基质丝素蛋白 /壳聚糖复合纳米纤维，为细胞生长和组织再生提供最佳的仿生生理环境。其缺点在于该发明所制备的丝素蛋白溶液，稳定性相对低，难于工业化应用。 CN102010601A, CN101624472A和 CN101624473A公开了由丝素蛋白、半乳糖基化壳聚糖在交联剂的作用下制得一种肝细胞特异性大孔微载体支架材料，适合于大规模培养肝细胞。其缺点在于制作工艺繁琐（壳聚糖经过糖基化后交联，后再用网筛过滤），且所制备的支架材料属大孔径支架，应用范围有限。

CN102942660A公开了一种天然生物交联的纳米复合三维凝胶支架，由丙烯酰胺类单体、无机纳米粘土、生物高分子和生物交联剂京尼平溶于水原位自由基聚合而成，可用于医用移植、药物释放和细胞培养。其缺点在于所使用的主要材料丙烯酰胺类受高热分解易释放出刺激性气体；且在酸碱环境下转变成的丙烯酸对细胞有较强的毒性作用。

CN103418029A公开了由丝素蛋白、壳聚糖制成的一种丝素 /壳聚糖复合多孔支架。其缺点在于该复合物的稳定性较差，不适于工业化生产和广泛应用。

中国专利 CN102952279A公布了用甲基乙烯基醚 /马来酸共聚物和交联剂反应制备水凝胶的方法及其在肿瘤组织培养中运用，但由于该基质胶中含有大量细胞生长因子（如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子及组织纤维酶原活化因子），这些细胞因子对培养细胞作用的不确定性。

发明内容

为克服现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种用于细胞三维培养的基质支架材料，所述的基质支架材料类似细胞体内环境的支架，可用于难培养细胞的体外扩增、组织器官再造和肿瘤药物筛选。

本发明技术方案如下：

一种用于细胞三维培养的基质支架，由丝素蛋白类物质、壳聚糖和交联剂经交联反应而制得，其特征在于所述的丝素蛋白类物质是由蚕茧壳或蚕丝经过脱胶、溶解、透析、干燥制得丝素粉，丝素粉再经如下方法制得所述的丝素蛋白类物质：

( 1 )将丝素粉溶解于溴化锂溶液中；

( 2 )将步骤（1 ) 的溶解后的丝素溶液用截流分子量为 3500Da的透析袋进行透析，制得透析后的丝素溶液；

( 3 )将装有步骤（2 )所制得的透析后的丝素溶液的透析袋放入聚乙二醇 6000粉中进行浓缩，所得浓缩液离心后取上清液，即得所述的丝素蛋白类物质。

上述所述的用于细胞三维培养的基质支架，其中所述的交联剂，优选为 1-乙基- 3- [3 - 二甲氨基丙基]碳化二亚胺（EDC) 和 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)。

优选地，上述所述的用于细胞三维培养的基质支架，其中将所述的丝素蛋白类物质、壳聚糖和交联剂交联反应后所得反应产物经梯度冷冻得到所述的基质支架，所述的梯度冷冻过程如下-

( 1 )将反应产物先放入- 20°C冰箱中预冷冻 12〜48 h，再放入 -80'C低温冰箱中冷冻 12〜 48h，最后放入冷冻干燥机冷冻干燥 24〜72 h, 得到初制的三维支架材料；

(2)将步骤（1 )制得的初制的三维支架材料浸入无水甲醇及 10%氢氧化钠 (体积比 1 ： 1) 溶液浸泡 12〜48 h，用去离子水冲洗后，置于冷冻干燥机内干燥 24〜72h后取出即得。

上述所述的用于细胞三维培养的基质支架，其中通过改变丝素蛋白类物质、壳聚糖和 / 或交联剂的用量以制得不同孔径和构象的用于细胞三维培养的基质支架。

优选地，上述所述的用于细胞三维培养的基质支架，其特征在于是通过包含如下步骤的方法制得-

( 1 )制备丝素蛋白类物质的溶液

1 )将蚕茧壳剪成碎片后加入浓度为 0. 5%的碳酸钠溶液煮沸 2— 3遍，再用去离子水洗后进行烘干；

2)将步骤 1 ) 制得的干燥丝素加入煮沸的 50%氯化钙溶液搅拌溶解，冷却后过滤；

3)将滤液装入透析袋中用去离子水透析制得丝素蛋白溶液，用保鲜袋封装，依次放入 -20度冰箱、 -80度冰箱，最后放入冷冻干燥器中进行干燥制得丝素粉；

4)称取步骤 3)制得的丝素粉 10g,溶解于 9M溴化锂水溶液中，室温下进行搅拌溶解；

5)将步骤 4)所制得的溶解后的丝素溶液冷却至常温后，倒入截流分子量为 3500Da的透析袋中透析 2— 4天，以去除丝素溶液中的小分子物质；

6)将步骤 5)制得的透析后的丝素溶液存放于透析袋,放入聚乙二醇 6000粉剂中，干燥浓缩,收集液体，离心取上清液即得；

(2) 制备壳聚糖溶液

1 )将 lmL冰醋酸用去离子水加至 100ml 得到 1%冰醋酸，将 pH调至 4. 6；

2)称取壳聚糖（脱乙酰度〉 90%)加入上述冰醋酸，配制成壳聚糖溶液；

(3)制备交联支架

1 )将步骤（1 )所制备的丝素蛋白类物质的溶液和步骤（2)所制备的壳聚糖溶液混合；

2 )浸入含 50匪 ol/l的 ED (：、 18醒 ol/lNHS的 95%乙醇水溶液中， 4° C下交联 24h;

3)将步骤 2) 的交联反应产物放入 -20Ό冰箱中预冷冻 24 h，再放入 _80°C低温冰箱中冷冻 24 h, 最后放入冷冻干燥机冷冻干燥 48 h，得到初制的三维支架材料；

4)将步骤 3) 所制的支架材料浸入无水甲醇及 10%氢氧化钠 (体积比 1 ： 1)溶液浸泡 24 h，用去离子水冲洗 3遍后，置于冷冻干燥机内干燥 48 h后取出，即得所述的用于细胞三维培养的基质支架。

优选地，上述所述的用于细胞三维培养的基质支架，其中所述的丝素蛋白类物质溶液的浓度为 1 %— 5%，所述的壳聚糖溶液的浓度为 1 %— 5%。

作为本发明另一目的，还提供上述所述的基质支架的应用，其特征在于用于细胞的体外扩增、组织器官再造或者药物筛选。

优选地，上述所述的应用，其中用于干细胞培养、肿瘤微环境构建、肿瘤药物筛选或者组织器官重建工程。

优选地，上述所述的应用，其中用于胚胎组织分离成肌细胞体外分化、肿瘤组织分离肿瘤相关巨噬细胞（TAMs ) 或者肿瘤相关纤维母细胞（TAFs) 的体外扩增。

作为本发明另一目的，还提供一种细胞体外扩增的方法，包括使用上述所述的基质支架作为细胞三维培养的支架材料。

本发明所述的基质构架，采用所述方法制得的丝素蛋白类物质与壳聚糖和交联剂进行交联反应，通过调整丝素蛋白类物质 /壳聚糖溶液与交联剂的浓度和比例，以得到不同孔径和 / 或构象的三维基质支架。

本发明还提供了上述所述的用于细胞三维培养的基质支架的制备方法。作为具体实施方式之一，所述方法包括如下步骤-

1、制备 1%〜5%丝素蛋白液

( 1 ) 将蚕茧壳（或蚕丝）剪成碎片后加入浓度为 0. 5%的碳酸钠溶液煮沸 3-2遍，再用去离子水洗两次再烘干。

(2) 将干燥的丝素加入煮沸的 50%氯化钙溶液搅拌，冷却后过滤。

(3) 将滤液装入透析袋中用去离子水透析制得丝素蛋白溶液，用保鲜袋封装，依次放入 -20度冰箱、 -80度冰箱，最后放入冷冻干燥器中。

(4) 称取丝素粉 10g，溶解于 9M溴化锂水溶液中，室温下搅拌 2小时进行溶解。

( 5) 将以上溶解后的丝素溶液冷却至常温后，倒入截流分子量为 3500Da的透析袋中透析三天，以去除丝素溶液中的小分子物质。

(6) 将制得的丝素蛋白液体存放透析袋，放入聚乙二醇 6000粉剂中，干燥浓缩，收集液体,离心取上清液。

(7) 取 3个称量瓶编号洗净后放入 60° C恒温烘箱中烘干，充分冷却,称量三者重量，记为 Ml。各取 10 ml丝素蛋白液放入称量瓶，称重为 M2。放入 60° C 供箱中 12h取出，冷却后称重记为 M3,按公式丝素蛋白溶液浓度 %= (M3-M1)

/ (M2— Μ1) χ100%。

2、制备 1%〜5%壳聚糖溶液

( 1 ) 将 lmL冰醋酸用去离子水加至 100ml 得到 1%冰醋酸，将 pH调至 4. 6。

(2) 称取 3〜5g壳聚糖（脱乙酰度〉90%)加入上述冰醋酸。

3、制备交联支架

( 1 ) 将步骤 1所制备的丝素蛋白溶液和步骤 2所制备的壳聚糖溶液混合。

(2) 浸入含 50ramol/l的 EDC；、 18mmol/lNHS的 95%乙醇水溶液中， 4° C下交联 24h。

(3) 放入 -20°C冰箱中预冷冻 24 h，再放入 -80 °C低温冰箱中冷冻 24 h，最后放入冷冻干燥机冷冻干燥 48 h，得到初制 S F/C S支架材料。

(4) 将所制支架浸入无水甲醇及 10%氢氧化钠（体积比 1 ： 1)溶液浸泡 24 h，用去离子水冲洗 3遍后，置于冷冻干燥机内干燥 48 h后取出镜检。

另一方面，本发明所述的基质支架的应用，优选应用于在胚胎组织分离成肌细胞体外分化、肿瘤组织分类肿瘤相关巨噬细胞（TAMs)和肿瘤相关纤维母细胞（TAFs)体外扩增中的应用。

有益效果

本发明以蚕茧壳或蚕丝为原料，经过特定的提取工艺制得了天然丝素蛋白类物质，以其作为原料，与天然的壳聚糖（chitosan, CS) 原料，运用无毒性交联剂 1-乙基 _3_ [3-二甲氨基丙基]碳化二亚胺（EDC)和 N羟基琥珀酰亚胺（NHS)进行交联反应，所制得的三维基质支架的构象接近细胞体内的空间构象，细胞种植后能尽快形成细胞生长微环境，有利于细胞尽快适应新的生长环境并发挥正常生理功能。本发明的主要优点：

1. 本发明从蚕茧壳或蚕丝中制得的丝素蛋白类物质和壳聚糖均被证明具有良好生物相容性和无毒性，与动物性凝胶相比，具有操作简单、成本低廉等优点。

2. 大多数的哺乳动物细胞在体内和体外均附着于一定的支架而生长，本发明所制得的所述的三维基质构架既适合于贴壁细胞也适合非贴壁细胞的培养。细胞在此三维环境中排除了二维培养中的接触性抑制效应，在此系统中进行的细胞体外研究结果，更能客观反映细胞生理状态的生命活动，提高研究结果的可靠性。

3. 通过调整丝素蛋白类物质 /壳聚糖溶液与交联剂的浓度和比例，可得到不同孔径和构象的三维基质支架，根据培养目的细胞所在体内的组织结构特点，可选用不同孔径和不同基质构象的三维培养系统，满足于不同组织来源的细胞的原代体外培养，应用范围及其广泛，可适用于难培养细胞体的体外扩增、组织器官再造和肿瘤药物筛选。

4. 本发明的细胞三维培养基质构架材料的构象类似于细胞体内微环境中的纤维组织构象，原代分离的细胞能尽快适应体外生长环境，立足于此三维（3D)培养过程中的细胞生物学行为与体内接近，减少体内外实验结果的误差，具有重大的社会效益。

5. 为细胞三维培养研究提供了一个新的研究途径，这一研究的应用，将在干细胞培养、肿瘤微环境构建、肿瘤药物筛选、组织器官重建工程等方面起着重要推动作用。附图说明

图 1. 本发明实施例 1制备的基质构架材料在光学显微镜和扫描电子显微镜下的图像图 2. 原代成肌细胞在本发明实施例 1制得的三维基质构架培养中的分化（肌管融合率）情况

图 3. 原代成肌细胞在本发明实施例 1制得的三维基质培养中的增殖（细胞周期）情况图 4. 肿瘤相关巨噬细胞（TAMs )在实施例 1制得三维基质培养中的生长（MTT) 情况图 5. 肿瘤相关纤维母细胞（TAFs )在实施例 1制得的三维基质培养中的生长（MTT) 情况

图 6. 本发明的基质支架材料与现有的丝素蛋白制得的支架材料降解性的影响对比情况图 7. 本发明的基质支架材料与现有的丝素蛋白制得的支架材料对细胞增殖能力的影响对比情况

其中- 图 1中：经过冷冻干燥后的三维基质构架材料，光学显微镜（日本 Olympus CX21 )观察通过调整丝素蛋白类物质 /壳聚糖溶液与交联剂的浓度和比例，得到不同孔径的三维基质支架，图 1A-B (放大倍数 X 400); 扫描电子显微镜（荷兰， Philips XL20) 电镜观察基质结构 (见图 1C)。

图 2中：从图中看出，随着培养时间的延长， 3D和 2D培养的成肌细胞肌管形成率开始逐渐上升，而 3D培养的成肌细胞的肌管形成率从培养的第 6天开始直到第 12天均保持一个平台期。 3D和 2D培养的成肌细胞肌管形成率在第 12天分别为 17%和 33%。

图 3中：从图中看出，成肌细胞在 2D培养基中 1天、 3天和 6天时合成期（S期）细胞分别为 33%、 28%和 23%，而 3D培养基中 1天、 3天和 6天时 S期细胞分别为 32%、 39%和 41%。

图 4: 从图中看出，从培养的第 4天开始， 3D和 2D培养的 TAMs的 0D值均明显上升，而 3D 培养的 TAMs的 0D值从培养的第 6天开始直到第 15天均保持一个较高的平台期。 3D和 2D培养的 TAMs的 OD值在第 15天分别为 0. 63和 0. 43。

图 5中：从图中看出，从培养的第 2天开始， 3D和 2D培养的 TAMs的 0D值均明显上升， 2D 培养的 TAMs的 0D值至第 10天开始下降；而 3D培养的 TAMs的 0D值持续升高到第 15天才开始下降。

图 6中：从图中看出，用现有技术所制备的丝素蛋白液所制备的三维支架 7W后的降解率高达 21. 2%，而使用本发明方法制 _备的丝素蛋白类物质为原料制备的三维支架随着时间的延长，其降解率并不明显增加， 7W后仅为 9. 4%。

图 7中：从图中看出，用现有技术所制备的丝素蛋白溶液不能很好地保持丝素蛋白原有的理化性质，导致所制备的三维支架的降解率随丝素蛋白溶液放置时间的延长而增高。而本发明方法制备的丝素蛋白类物质为原料所制备的三维支架稳定性较好，因此有利于原代组织细胞在新环境中的适应和增殖，原代培养细胞在 2周仍能保持较高的增殖能力，两组间有明显差异 P=0. 031 ) 具体实施方式

本发明提供的细胞三维培养的基质是采用本发明所述的丝素蛋白类物质 /壳聚糖溶液与交联剂进行交联反应，通过调整丝素蛋白类物质 /壳聚糖溶液与交联剂的浓度和比例，得到不同孔径和构象的三维基质支架，根据培养目的细胞所在体内的组织结构特点，配置不同孔径的三维基质，为接种后细胞提供了附着支架，排除了二维培养中的接触性抑制效应，使细胞在类似体内微环境状态下生长。

实施例 1: 用于细胞三维培养的基质构架材料及其构建方法

1 )制备 1%〜5%丝素蛋白液

( 1 ) 将蚕茧壳剪成 lcm²的碎片，加入浓度为 0. 5%的碳酸钠溶液浸没蚕茧壳煮沸 2-3 遍，每次至少 1个小时。

(2) 先用自然水洗 2- 3次，再用去离子水洗两次再烘干。

(3) 用 50%的氯化钙溶液加热至沸腾 (或溶解于 9M的溴化锂溶液中），将干燥的丝素加入搅拌，使丝素充分溶解，冷却至室温用布氏漏斗过滤。

(4) 将滤液装入透析袋中用去离子水透析 3-5天，制得丝素蛋白溶液。

(5) 用保鲜袋封装，放入 -20度冰箱（12个小时），再放入 -80度冰箱（6个小时），最后放入冷冻干燥器中至少 24个小时。

(6) 称取丝素粉 10g，溶解于 9M溴化锂水溶液中，室温下搅拌 2 小时进行溶解。 (7) 将以上溶解后的丝素溶液冷却至常温后，倒入截流分子量为 3500Da的透析袋中，用去离子水 4° C冰箱里透析三天,每隔 3小时换水一次，以去除丝素溶液中的小分子物质。

(8) 将制得的丝素蛋白液体存放透析袋，放入聚乙二醇 6000粉剂中，干燥浓缩，收集液体,将其以 3500r/min离心 15min，取上清液，置于 4° C冰箱中可保存一周。

(9) 取 3个称量瓶编号洗净后放入 60° C恒温烘箱中烘干，充分冷却,称量三者重量，记为 Ml。各取 10 ml丝素蛋白液放入称量瓶，称重为 M2。放入 60° C供箱中 12h 取出，冷却后称重记为 M3，按公式丝素蛋白溶液浓度 %= (M3-M1) / (M2— Μ1) χ100%

( 10) 本实施例得出的丝素蛋白浓度为约为 2%〜3%。

)制备 1%〜5%壳聚糖溶液

(2) 称取 3. lg壳聚糖（脱乙酰度〉 90%)加入上述冰醋酸。

( 3) 本实施例得到的是 1%的壳聚糖溶液。

)制备交联支架

(2) 浸入含 50mmol/l的 EDC、 18腿 ol/lNHS的 95%乙醇水溶液中， 4° C下交联 24h。

(3) 放入 -20°C冰箱中预冷冻 24 h，再放入 -80°C低温冰箱中冷冻 24 h，最后放入冷冻干燥机冷冻干燥 48 h，得到初制 S F/C S支架材料。

(5) 镜下观察图像结构：光学显微镜（日本 Olympus CX21 )观察通过调整丝素蛋白 /壳聚糖溶液与交联剂的浓度和比例，得到不同孔径的三维基质支架（见图 1A-B); 扫描电子显微镜（荷兰， Philips XL20) 电镜观察基质结构（见图 1C) 实施例 2: 成肌细胞进行丝素蛋白三维培养后的增殖与分化情况

1) 原代成肌细胞的分离培养和鉴定

( 1 ) 用妊娠 15周自愿终止妊娠的健康妇女捐赠的引产胚胎，无遗传病史。

(2) 无菌条件下，取出骨骼肌组织，除去筋膜和血管，用胰蛋白酶、胶原酶混合多步消化法分离出成肌细胞，差速贴壁纯化成肌细胞。

(3) 在含 10%小牛血清的 DMEM (生长培养基， GM) 培养 1天后，置于含 3%小牛血清的 DMEM (分化培养基， DM)中培养 6天后用相差倒置显微镜观察成肌细胞的肌管形成；用免疫组化鉴定肌球蛋白（Myosin)表达。

) 成肌细胞进行丝素蛋白三维培养的分化情况

( 1 ) 分别设立实验组和对照组 24孔培养板，前者含有实施例 1中制备的丝素蛋白三维基质（称为 3D培养，下同），后者是普通的培养板（称为 2D培养，下同）。

(2) 分别将上述成肌细胞按照 5 X lOVml接种到两组 24孔培养板，用 GM培养 1天后，改换成 DM培养，于 1、 2、 4、 6、 8天时行 Giemsa染色，观察成肌细胞融合成肌管的现象。

(3) 肌管融合率为单位视野下肌管内细胞核数量与所有细胞核数量的比值，肌管形成率反映出成肌细胞的分化状态。肌管形成率高表明大量细胞退出细胞周期，进入分化状态。实验重复三次，统计学分析。

(4) 实验结果显示，从培养的第 4天开始， 3D和 2D培养的成肌细胞肌管形成率开始逐渐上升， 2D培养的成肌细胞的肌管形成率直到培养的第 12天均保持的持续增高趋势，而 3D培养的成肌细胞的肌管形成率从培养的第 6天开始直到第 12天均保持一个平台期。 3D和 2D培养的成肌细胞肌管形成率在第 12天分别为 17%和 33%

(见图 2)。

(5) 实验结果表明，三维基质状态下为成肌细胞提供了类似体内环境的支架，有利于成肌细胞的增殖，因而减缓成肌细胞的诱导分化进程。

) 成肌细胞进行丝素蛋白三维培养的细胞周期情况

( 1 ) 同上 2) ( 1 )，分别设立实验组和对照组 24孔培养板，前者含有实施例 1中制备的丝素蛋白三维基质，后者是普通的培养板。

(2) 同上 2) (2)，分别将上述成肌细胞按照 5 X 107ml接种到两组 24孔培养板，用含

10%小牛血清的 DMEM培养 1天后，改换成含有含 3%小牛血清的 DMEM中培养。

( 3) 分别培养 6天时收集细胞，用 PBS洗 5minX 2，离心， 1， OOOrpm, 弃上清，将细胞重悬于 4Ό预冷的 PBS中，缓慢加入冷乙醇，使其终浓度为 70%， 4°C过夜。

(4) 离心后将等体积的细胞悬液和碘化丙啶（Propidium, PI )染液混合， 4°C， 30min_; 流式细胞仪（美国 C0ULTESR, Elite, ESP)进行检测，实验重复三次，统计学分析。

(5) 实验结果显示，成肌细胞在 2D培养基中 1天、 3天和 6天时合成期（S期）细胞分别为 33%、 28%和 23%，而 3D培养基中 1天、 3天和 6天时 S期细胞分别为 32 %、 39%和 41% (见图 3)。 (6) 实验结果表明，经 2D培养的成肌细胞中，大部分细胞退出细胞周期，向终末细胞分化，而在 3D培养的细胞中，处于合成期的细胞比例较高，大部分细胞处于增殖阶段，提示 3D培养基可用于难培养细胞的体外扩增。

实施例 3: 肿瘤组织提取的肿瘤间质细胞在丝素蛋白三维基质中的培养与扩增

1)肿瘤相关巨噬细胞（TMAs) 的分离培养和鉴定

(1) 将新鲜结肠癌组织切成 2mm大小碎片，用含 0.3%胶原酶的 PBS在 37°C下消化成细胞悬液，用 70 ra不锈钢网过滤细胞悬液，离心后用 PBS洗涤。

(2) 用不含血清的 RPMI-1640培养基重悬后加入培养瓶中培养 40分钟，用 CD68荧光标记鉴定贴壁的 TAMs。

2)肿瘤相关纤维母细胞（TAFs) 的分离培养和鉴定

(1) 将新鲜结肠癌组织切成碎片，接种含 15%FCS的 DMEM培养基， 5天后可见细胞从团块中长出来，胰酶消化传代。

(2) 根据 aSMA、 Vimentin、 Desmin表达和形态特点进行纯化。

)肿瘤间质细胞 TMAs和 TAFs在丝素蛋白三维基质培养中的扩增情况

(1) 同上实施例 2中的 2) (1)，分别设立实验组和对照组 24孔培养板，前者含有实施例 1中制备的丝素蛋白三维基质，后者是普通的培养板。

( 1 ) 分别将上述肿瘤组织分离并鉴定出的 TAMs和 TAFs按照 5 X lOVml接种到两组 24 孔培养板，用含 10%小牛血清的 DMEM培养 1天后，改换成含有含 5%小牛血清的 DMEM中培养。

(2) 分别于上述培养的第 1、 2、 4、 8、 16天时弃去培养液，加 500 μ 1/孔 MTT培养液

(100μ1ΜΤΤ+400μ 1培养基），置摇床震荡充分溶解结晶物。

(3) 用酶联免疫检测仪在 0D570nm处测各孔吸光值，重复三次，取平均值。

(6) 实验结果显示， TAMs从培养的第 4天开始， 3D和 2D培养的 TAMs的 0D值均明显上升， 2D培养的 TAMs的 0D值直到培养的第 10天均保持的持续增高趋势，之后逐渐下降；而 3D培养的 TAMs的 0D值从培养的第 6天开始直到第 15天均保持一个较高的平台期。 3D和 2D培养的 TAMs的 0D值在第 15天分别为 0.63和 0.43(见图 4)。 TAFs从培养的第 2天开始， 3D和 2D培养的 TAMs的 0D值均明显上升， 2D 培养的 TAMs的 0D值至第 10天开始下降；而 3D培养的 TAMs的 0D值持续升高到第 15天才开始下降（见图 5)。

(7) 实验结果表明，三维基质为 TAMs和 TAFs提供了类似体内环境的支架，有利于细胞的增殖培养。

实施例 4 : 对比试验：分别用本发明方法所制丝素蛋白类物质与按现有技术 (CN103418029A)制得丝素蛋白为原料制得的基质支架材料降解性的影响对比

1 ) 按 CN103418029A的实施例五制得浓度 20%丝素蛋白溶液

2) 按本发明实施例 1之步骤 1 ) 制得 3%丝素蛋白溶液；

3) 制备 1%〜5%壳聚糖溶液，同实施例 1之步骤 2);

4) 分别运用 1 )和 2)所制备的丝素蛋白液制备交联支架 A和 B，同实施例 1之步骤 3)。

A支架是按现有技术制得的丝素蛋白为原料制得的基质支架材料， B支架是按本发明方法制得的丝素蛋白类物质为原料制得的基质支架材料。

5) 降解性能检测

( 1 ) 将人工体液（SBF溶液）作为体外降解环境，降解温度为恒温 37°C。

(2) 取配置好的无菌 SBF溶液 40ml放置体积为 50ml的塑料瓶内。

( 3) 将支架 A和 B分别称重（记为 W。），置于 SBF中，置 37 °C恒温保湿。

(4) 分别于 ld， 7d， 14d， 21d， 28d， 35d， 42d, 49d 时的重量变化。计算重量时，先用去离子水冲洗干净， 60Ό烘箱烘干，称重记为，公式为：降解率 = (W„- W,) / W„ X 100%, 每个数据测 3各样本，取均数士标准差。

6) 结果分析：如本实验结果如图 6所示，用现有技术所制备的丝素蛋白液所制备的多维支架 7W后的降解率高达 21. 2%, 而使用本法制备的丝素粉为原料制备的多维支架随着时间的延长，其降解率并不明显增加， 7W后仅为 9. 4%。现有技术所制备的丝素蛋白为原料制得的基质支架材料稳定性不好，而本发明方法制备的基质支架材料的稳定性显著提高。

实施例 5: 对比试验，分别用本发明方法所制的丝素蛋白类物质与运用现有技术制备的丝素蛋白为原料制备的基质支架材料对细胞增殖能力的影响对比

1 ) 用现有技术所制备的丝素蛋白溶液

同实施例 4之步骤 1 );

2) 本发明所制备的 1%〜5%丝素蛋白液，同实施例 1之步骤 1 )。

3) 制备 1%〜5%壳聚糖溶液，同实施例 1之步骤 2)。

4) 分别运用放置 2W后的 1 ) 所制备的丝素蛋白液和 2 )所制备的丝素蛋白液制备交联支架 A和 B，同实施例 1之步骤 3)。 A支架是按现有技术制得的丝素蛋白为原料制得的基质支架材料， B支架是按本发明方法制得的丝素蛋白类物质为原料制得的基质支架材料。

5) MTT法检测上述三维支架 A和 B对原代培养结肠癌组织细胞增殖能力的影响

( 1 ) 取术后或活检标本，除去坏死和溃疡组织，用含双抗 PBS浸泡 10-20mi_n后放置无血清保存液（DMEM/RPMI 1640+10%双抗）中冰上保存。

(2) 将组织放入处理用 PBS (含 10%双抗和 1%FBS) 中剪碎组织（冰上进行）

( 3) 组织与液体置于离心管， 1000r/min， 5min，去除上清，取沉淀，用胰蛋白酶 +胶原酶消化， 37°C培养箱培养 1小时左右，每 10-15分钟摇晃一次。

(4) 离心，去除消化液，用 PBS低速离心洗 2-3次，去除上清，最后用培养基离心洗 1次，用完全培养基悬浮，并用吸管吹打分散制成细胞悬液，接种在含 10%的 FBS 的 DMED (或 RPMI1640) 中， 37°C， 5%C02下分瓶（皿）培养。

(5) 分别于上述培养的第 1、 2、 4、 8、 16天时弃去培养液，加 500 μ 1/孔 MTT培养液

( 100 μ 1ΜΤΤ+400 μ 1培养基），置摇床震荡充分溶解结晶物。

(6) 用酶联免疫检测仪在 OD570nm处测各孔吸光值，重复三次，取平均值。

6) 结果分析：结果如图 7所示。由于现有技术所制备的丝素蛋白溶液不能很好地保持丝素蛋白原有的理化性质，导致所制备的基质支架材料的降解率随丝素蛋白溶液放置时间的延长而增高，进而影响细胞增殖能力。而本法制备的丝素蛋白类物质为原料所制备的基质支架材料稳定性较好，因此有利于原代组织细胞在新环境中的适应和增殖，原代培养细胞在 2周仍能保持较高的增殖能力，两组间有明显差异 031 ) 上述实施例只是为了说明本发明的技术构思，目的是使一般技术人员了解本发明的内容并据以实施，但不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质内容所做出的等效变化及其不同领域的应用，都涵盖在本发明的保护范围。

Claims

权利要求书

1、一种用于细胞三维培养的基质支架，由丝素蛋白类物质、壳聚糖和交联剂经交联反应而制得，其特征在于所述的丝素蛋白类物质是由蚕茧壳或蚕丝经过脱胶、溶解、透析、干燥制得丝素粉，丝素粉再经如下方法制得所述的丝素蛋白类物质：

( 1 )将丝素粉溶解于溴化锂溶液中；

(2)将步骤（1 ) 的溶解后的丝素溶液用截流分子量为 3500Da的透析袋进行透析，制得透析后的丝素溶液；

(3)将装有步骤（2)所制得的透析后的丝素溶液的透析袋放入聚乙二醇 6000粉中进行浓缩，所得浓缩液离心后取上清液，即得所述的丝素蛋白类物质。

2、根据权利要求 1所述的用于细胞三维培养的基质支架，其中所述的交联剂为 1-乙基- 3- [3- 二甲氨基丙基]碳化二亚胺（EDC)和 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)。

3、根据权利要求 1一 2所述的用于细胞三维培养的基质支架，其中将所述的丝素蛋白类物质、壳聚糖和交联剂交联反应后所得反应产物经梯度冷冻得到所述的基质支架，所述的梯度冷冻过程如下：

( 1 )将反应产物先放入 -20°C冰箱中预冷冻 12〜48 h，再放入 -80°C低温冰箱中冷冻 12〜 48h，最后放入冷冻干燥机冷冻干燥 24〜72 h，得到初制的三维支架材料；

(2)将步骤（1 ) 制得的初制的三维支架材料浸入无水甲醇及 10%氢氧化钠（体积比 1 ： 1) 溶液浸泡 12〜48 h，用去离子水冲洗后，置于冷冻干燥机内干燥 24〜72 h后取出即得。

4、根据权利要求 1一 3所述的用于细胞三维培养的基质支架，其中通过改变丝素蛋白类物质、壳聚糖和 /或交联剂的用量以制得不同孔径和构象的用于细胞三维培养的基质支架。

5、根据权利要求 1一 4所述的用于细胞三维培养的基质支架，其特征在于是通过包含如下步骤的方法制得：

( 1 ) 制备丝素蛋白类物质的溶液

1 ) 将蚕茧壳剪成碎片后加入浓度为 0. 5%的碳酸钠溶液煮沸 2— 3遍，再用去离子水洗后进行烘干；

2 ) 将步骤 1 ) 制得的干燥丝素加入煮沸的 50%氯化钙溶液搅拌溶解，冷却后过滤；

3) 将滤液装入透析袋中用去离子水透析制得丝素蛋白溶液，用保鲜袋封装，依次放入 -20度冰箱、 -80度冰箱，最后放入冷冻干燥器中进行干燥制得丝素粉； 4) 称取步骤 3)制得的丝素粉 10g,溶解于 9M溴化锂水溶液中，室温下进行搅拌溶解；

5) 将步骤 4)所制得的溶解后的丝素溶液冷却至常温后，倒入截流分子量为 3500Da 的透析袋中透析 2— 4天，以去除丝素溶液中的小分子物质；

6) 将步骤 5)制得的透析后的丝素溶液存放于透析袋，放入聚乙二醇 6000粉剂中，干燥浓缩，收集液体,离心取上清液即得；

(2) 制备壳聚糖溶液

1 ) 将 lmL冰醋酸用去离子水加至 100ml 得到 1%冰醋酸，将 pH调至 4. 6；

2 ) 称取壳聚糖（脱乙酰度〉 90%)加入上述冰醋酸，配制成壳聚糖溶液；

(3) 制备交联支架

1 ) 将步骤（1 )所制备的丝素蛋白类物质的溶液和步骤（2) 所制备的壳聚糖溶液混合；

2 ) 浸入含 50隱 ol/l的 EDC：、 18瞧 ol/lNHS的 95%乙醇水溶液中， 4° C下交联 24h;

3) 将步骤 2) 的交联反应产物放入 -20°C冰箱中预冷冻 24 h，再放入 - 80°C低温冰箱中冷冻 24 h，最后放入冷冻干燥机冷冻干燥 48 h，得到初制的三维支架材料；

4) 将步骤 3)所制的支架材料浸入无水甲醇及 10%氢氧化钠 (体积比 1 ： 1)溶液浸泡 24 h, 用去离子水冲洗 3遍后，置于冷冻干燥机内干燥 48 h后取出，即得所述的用于细胞三维培养的基质支架。

6、根据权利要求 5所述的用于细胞三维培养的基质支架，其中所述的丝素蛋白类物质溶液的浓度为 1 %—5%，所述的壳聚糖溶液的浓度为 1 %—5%。

7—种权利要求 1一 6所述的基质支架的应用，其特征在于用于细胞的体外扩增、组织器官再造或者药物筛选。

8、根据权利要求 7所述的应用，其中用于干细胞培养、肿瘤微环境构建、肿瘤药物筛选或者组织器官重建工程。

9、根据权利要求 7所述的应用，其中用于胚胎组织分离成肌细胞体外分化、肿瘤组织分离肿瘤相关巨噬细胞（TAMs) 或者肿瘤相关纤维母细胞（TAFs) 的体外扩增。

10、一种细胞体外扩增的方法，包括使用权利要求 1一 6中所述的基质支架作为细胞三维培养的支架材料。