CN112354011B - 一种肝组织工程支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肝组织工程支架及其制备方法，所述肝组织工程支架以氧化蔗糖作为交联剂将玉米醇溶蛋白交联在聚糖水凝胶中。本发明了制备的壳聚糖‑玉米醇溶蛋白支架材料，经过理化性质表征证明支架具有良好的生物相容性以及机械性能等性质，可以满足细胞接种支架并支持细胞在支架上生长；通过体外细胞实验结果得到，支架具有促进BMSC细胞增殖的作用。本发明构建的三维多孔肝脏组织工程壳聚糖‑玉米醇溶蛋白支架满足接种细胞并支持细胞在体外环境下在支架上生长发育成为一个组织的要求，并且支架对BMSC细胞具有一定的促进增殖作用，大大缩短了体外组织构建的周期，为肝组织工程支架构建提供了新的思路和方向。

Description

一种肝组织工程支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及组织工程学技术领域，更具体地，涉及一种肝组织工程支架及其制备方法。
背景技术
肝脏是机体最重要的生命器官之一，具有复杂的结构和多种生理功能，急、慢性肝脏疾病，尤其是肝功能衰竭严重影响着人们的健康。肝脏移植是从根本上治疗慢性肝病与肝功能衰竭的方法，尤其是急性肝衰竭目前在临床上相对有明显治疗效果的治疗手段就是肝移植。但受到供体肝脏匮乏、异种移植失败和需要长期使用免疫抑制的限制。因此，肝脏疾病治疗急需寻求新的方法。而我国是世界上急性肝衰竭发病人数最多的国家，寻找一种可行性高、患者接受治疗后恢复良好、毒副作用小且经济实惠的治疗手段意义重大。
组织工程学是20世纪80年代末发展起来的一门新兴交叉学科，组织工程包括三大要素：细胞、支架、生长因子。组织工程学融合了工程学和生命科学的基本原理、基本理论、基本技术和基本方法，在体外构建一个有生物活性的种植体，植入体内代替细胞外基质为细胞提供一个临时的生长环境与附着位点，修复组织缺损，替代器官功能，或作为一种体外装置，暂时替代器官功能，达到提高生存质量，延长生命活动的目的。它的科学意义不仅在于为解除病人痛苦提供了一种新的治疗方法，更主要的是提出了复制“组织”、“器官”的新思想，它标志着"生物科技人体时代"的到来，是"再生医学的新时代"，是"一场深远的医学革命"。肝脏组织工程为肝病的治疗带来了新的希望，但是肝组织工程的发展依然需要克服一系列技术挑战，包括种子细胞种类、来源；支架材料性能和结构的要求；组织、器官体外培养和构建等方面的难题，材料形状不可控和灭活的高成本是其最明显的两个缺点(HamidKS,Parekh SG,Adams SB.Salvage of severe foot and an kle trauma with a 3dprinted scaffold.Foot Ankle Int.2016；37:433-439；Inza na JA,Olvera D,FullerSM,Kelly JP,Graeve OA,Schwarz EM,et al.3D pr inting of composite calciumphosphate and collagen scaffolds for bone regenera tion.Biomaterials,2014；35:4026-4034)。目前在组织工程中研究较多的细胞类型包括骨髓源干细胞、肝卵圆细胞、元代肝细胞和干细胞株等，如牙髓干细胞在组织再生领域的应用。
传统的修复方法是自体组织移植术，虽然在诸如脂肪组织、间充质干细胞等的自体移植上拥有相对成熟的技术并可以取得满意疗效，但它是以牺牲自体健康组织为代价的办法，会导致很多并发症及附加损伤。
折叠细胞是一切生物组织最基本的结构单位。干细胞是人体内一种有潜力能够分化为其他类型细胞的特别的细胞，也是生物工程广泛研究和利用的一种手段。折叠支架是用于支撑细胞成长为一个完整的组织的框架材料，其一些属性如支架材料与细胞的亲和度、材料的降解能力、机械强度的变化、孔隙率的改变等均可以影响细胞在其上的生长发育。生长因子折叠用于引导和协调组织内细胞活动的各种方法，目前已知的能够影响细胞活动的生长信息包括各种蛋白质因子和电信号，其中比较有代表性的就是血管内皮细胞生长因子，可通过TLR信号通路改变内皮细胞的生长代谢影响血管的发育，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。
总结过去二十年组织工程研究的经验和教训，越来越多的研究人员意识到，组织工程研究应充分考虑各方面因素，拓宽现有的研究手段和思路，近年来，随着各学科的创新与发展，肝组织工程研究取得了丰硕的成果，相信随着人们对肝脏体内外构建研究的深入，组织工程化肝脏构建研究有望取得实质性突破。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种肝组织工程支架及其制备方法，其为一种阳离子聚合物联合植物蛋白的肝组织工程支架。
本发明第一个目的是提供一种肝组织工程支架。
本发明第二个目的是提供一种肝组织工程支架的制备方法。
本发明第三个目的是提供任一所述制备方法制备得到的肝组织工程支架。
本发明第四个目的是提供一种接枝有碱性成纤维细胞生长因子bFGF的肝组织工程支架。
本发明第五个目的是提供一种接枝有碱性成纤维细胞生长因子bFGF的肝组织工程支架的制备方法。
本发明第六个目的是提供所述制备方法制备得到的接枝有碱性成纤维细胞生长因子bFGF的肝组织工程支架。
本发明第七个目的是提供所述的肝组织工程支架在细胞培养中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本专利采用壳聚糖(CS)作为支架本体，将壳聚糖粉末制备壳聚糖水凝胶，并利用氧化蔗糖作为交联剂将玉米醇溶蛋白(zein)交联在壳聚糖中，冷冻干燥之后形成CS-zein结构的肝组织工程支架，同时利用该支架支持肝细胞的生长。支架的制备过程如图1所示：向蔗糖中加入高碘酸钠及氯化钡等制备氧化蔗糖交联剂，保存待用；向壳聚糖粉末中加入冰醋酸制备壳聚糖溶液，向溶液中加入玉米醇溶蛋白后再将氧化蔗糖交联剂加入壳聚糖溶液中，保存待用；将制备好的溶液加入戊二醛溶液后放入水浴，制备壳聚糖水凝胶，最后将水凝胶进行冷冻干燥即制得所需要的壳聚糖-玉米醇溶蛋白支架；进一步壳聚糖-玉米醇溶蛋白支架接枝碱性成纤维细胞生长因子bFGF。
本发明要求保护一种肝组织工程支架，所述肝组织工程支架以氧化蔗糖作为交联剂将玉米醇溶蛋白交联在聚糖水凝胶中。
本发明还要求保护一种肝组织工程支架的制备方法，以氧化蔗糖作为交联剂将玉米醇溶蛋白交联在聚糖水凝胶，冷冻干燥之后得到。
优选地，将壳聚糖的冰醋酸溶液与玉米醇溶蛋白混合，后再加入氧化蔗糖；加入戊二醛溶液，制备壳聚糖水凝胶，最后将水凝胶放入模具后进行冷冻干燥即制得所需要的壳聚糖-玉米醇溶蛋白支架。
更优选地，氧化蔗糖的制备方法为将蔗糖、高碘酸钠和去离子水充分混匀，溶解，充分反应，然后加入氯化钡，充分沉淀，固液分离，保留上清。
更优选地，蔗糖、高碘酸钠、去离子和氯化钡的用量比为10～11：19～20：250～300：10～12。
进一步更优选地，蔗糖、高碘酸钠、去离子和氯化钡的用量比为10.26：19.50：300：11.20。
更优选地，优选地，室温搅拌12～24h充分反应。
进一步更优选地，室温搅拌24h充分反应。
更优选地，优选地，在4～10℃搅拌0.5～1h充分沉淀。
进一步更优选地，在5℃搅拌1h充分沉淀。
优选地，包括以下步骤：
S1.1～2％质量浓度戊二醛溶液与含有20～30g/L的壳聚糖的质量浓度为1～2％的醋酸溶液混合，50～60℃恒温0.5～1h，冷冻干燥，得到壳聚糖支架固体；
S2.壳聚糖支架浸泡于玉米醇溶蛋白充分接触后，于氧化蔗糖水溶液中，浸泡0.5～1h，制得玉米醇溶蛋白—壳聚糖支架。
更优选地，步骤S1中，戊二醛溶液的质量浓度为2％。
更优选地，步骤S1中，壳聚糖溶液为浓度为含有25g/L的壳聚糖的质量浓度为1％的醋酸溶液混合。
更优选地，步骤S1中，两者的体积比为1：1。
更优选地，步骤S1中，60℃恒温1h。
更优选地，步骤S2中，浸泡30min。
任一所述制备方法制备得到的肝组织工程支架，也属于本发明的保护范围。
本发明还要求保护一种接枝有碱性成纤维细胞生长因子bFGF的肝组织工程支架，所述肝组织工程为接枝有碱性成纤维细胞生长因子bFGF的上文所述的肝组织工程支架。
本发明进一步保护一种接枝有碱性成纤维细胞生长因子bFGF的肝组织工程支架的制备方法，将所述的肝组织工程支架接接枝碱性成纤维细胞生长因子bFGF。
优选地，将上文所述的肝组织工程支架和bFGF分别活化羧基，之后进行紫外光接枝。
更优选地，用EDC和NHS为上文所述的肝组织工程支架活化羧基。
进一步更优选地，用EDC和NHS为上文所述的肝组织工程支架活化羧基的步骤为：所述的肝组织工程支架，浸入无水甲醇和氢氧化钠的混合液5～10min，去除液体，继续浸入含50～75mmol/L的EDC、10～20mmol/L的NHS的体积分数90～95％乙醇水溶液中，去离子水冲洗，冻干得壳聚糖-玉米醇溶蛋白支架。
进一步更优选地，所述的肝组织工程支架，浸入无水甲醇和氢氧化钠的混合液24h。
进一步更优选地，所述去除液体为：-20℃冷冻30min冷冻干燥48h。
进一步更优选地，继续浸入含50mmol/L的EDC、18mmol/L的NHS的体积分数95％乙醇水溶液中。
更优选地，用N-羟基琥珀酰亚胺为bFGF活化羧基。
进一步更优选地，用N-羟基琥珀酰亚胺为bFGF活化羧基的步骤为：N-羟基琥珀酰亚胺的DMF和PBS的混合液与bFGF混合。
更优选地，DMF和PBS的混合液中，DMF和PBS的体积比为4～5：1。
进一步更优选地，DMF和PBS的混合液中，DMF和PBS的体积比为4：1。
更优选地，N-羟基琥珀酰亚胺与bFGF的质量比为7～8：5。
进一步更优选地，N-羟基琥珀酰亚胺与bFGF的质量比为7.39：5。
更优选地，充分反应为0～4℃磁搅拌24～48h。
进一步更优选地，4℃磁搅拌48h。
更优选地，充分反应后将溶液的溶剂换为PBS。
进一步更优选地，进行浓缩后用PBS稀释至1ng/ml。
更优选地，避光风干再进行紫外光接枝。
进一步更优选地，紫外光下照射1～3min进行紫外光接枝。
更进一步更优选地，紫外光下照射2min进行紫外光接枝。
本发明还要求保护所述制备方法制备得到的接枝有碱性成纤维细胞生长因子bFGF的肝组织工程支架。
本发明还要求保护所述的肝组织工程支架在细胞培养中的应用。
优选地，所述的肝组织工程支架促进细胞增殖。
优选地，所述的肝组织工程支架增强细胞活性。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明了制备一种壳聚糖-玉米醇溶蛋白-bFGF支架材料，经过理化性质表征证明支架具有良好的生物相容性以及机械性能等性质，可以满足细胞接种支架并支持细胞在支架上生长；通过体外细胞实验结果得到，支架具有促进BMSC细胞增殖的作用。本发明构建的三维多孔肝脏组织工程壳聚糖-玉米醇溶蛋白支架满足接种细胞并支持细胞在体外环境下在支架上生长发育成为一个组织的要求，并且支架对BMSC细胞具有一定的促进增殖作用，大大缩短了体外组织构建的周期，为肝组织工程支架构建提供了新的思路和方向。
附图说明
图1为壳聚糖-玉米醇溶蛋白-蔗糖支架的合成示意图。
图2为支架的傅里叶红外(FT-IR)图。
图3为支架的扫描电镜(SEM)表征图。
图4为支架的热重表征图。
图5为支架的孔隙率表征图。
图6为3D轮廓扫描(白光干涉)表征图。
图7为支架的XRD图谱。
图8为支架的力学性能表征。
图9为支架的热水溶失率表征。
图10为支架的吸水膨胀率表征
图11为支架的体液模拟实验
图12为不同阶段支架的DAPI染色。
图13为支架接种细胞的细胞计数实验。
图14为接枝支架的细胞的CCK-8染色实验。
图15为接枝支架的细胞的CV染色实验。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
1、细胞株
骨髓间充质干细胞(bMSCs)材料来自本实验室已有的种子细胞，经本实验室传代培养。
2、主要试剂
壳聚糖，选用壳聚糖2000作为支架主体；玉米醇溶蛋白；蔗糖，用于制备氧化蔗糖交联剂；高碘酸钠，购自广州源晶生物公司，用于制备氧化蔗糖交联剂；24孔聚苯乙烯组织培养基板，为美国Corning康宁公司产品；低糖DMEM培养基均为GIBCOBRL公司产品；澳洲胎牛血清；戊二醛；醋酸；氯化钡；无水甲醇；氢氧化钠；乙醇。
3、仪器
德国LEO公司场发射扫描电镜：LEO 1530VP,Nikon显微镜，日本Olympus公司光学倒置显微镜，Sigma32184高速冷冻离心机，Thermo CO2培养箱，江苏省金坛市医疗仪器厂78-1磁力搅拌器，HV-85高压灭菌器，无菌操作台，广州科桥实验技术设备有限公司恒温水浴锅等。
4、统计学分析
本实验采用spss19.0统计软件进行方差分析，死亡率用平均值表示，分析函数为LSD和Duncan，P<0.05表示差异显著。
实施例1壳聚糖-玉米醇溶蛋白-氧化蔗糖支架的制备
将壳聚糖将其溶解于醋酸溶液中得到透明壳聚糖溶液；将蔗糖和高碘酸钠让其溶解于水中，搅拌后加入氯化钡搅拌沉淀，然后将混合液过滤得到氧化蔗糖交联剂。将玉米醇溶蛋白壳聚糖水凝胶相混合，加入适量的氧化蔗糖交联剂并搅拌；加入戊二醛溶液，60℃水浴得到黄色半透明胶样壳聚糖水凝胶，放置至室温后进行冷冻干燥，获得黄色固体样壳聚糖水凝胶，制得壳聚糖-玉米醇溶蛋白支架材料。取出后继续浸入无水甲醇/氢氧化钠溶液24h，冻干后取出继续浸入含有EDC和NHS的95％乙醇水溶液中进行交联，最后用去离子水冲洗，得壳聚糖-玉米醇溶蛋白支架。
具体做法如下：
一、壳聚糖溶液的制备
称取0.5g壳聚糖(CS)将其溶解于质量浓度为1％的20ml醋酸溶液中，搅拌均匀至壳聚糖完全溶解得到透明壳聚糖溶液。
二、氧化蔗糖交联剂的制备
称取10.26g蔗糖和19.50g高碘酸钠，并溶解于300g去离子水中，在25℃条件下搅拌24h，然后加入11.20g氯化钡，并在5℃条件下搅拌1h以保证充分沉淀。然后将混合液过滤，留取滤液为澄清透明且包含质量分数为6％的氧化蔗糖，放置在5℃条件下保存待用。
三、壳聚糖水凝胶的制备
加入2％戊二醛溶液，将第一部制得的壳聚糖溶液等质量置入96孔培养板中，60℃水浴1h后得到黄色半透明胶样壳聚糖水凝胶，置于4℃保存；冷冻干燥：将制备好的壳聚糖置于-20℃冷冻30min冷冻干燥24h后，获得黄色固体样壳聚糖支架(壳聚糖空白支架，CS支架)。
四、玉米醇溶蛋白的偶联
将含有2％质量浓度的玉米醇溶蛋白缓缓倾倒在支架上，使玉米醇溶蛋白溶液浸湿支架整体并充分接触。加入适量的上面制备的氧化蔗糖交联剂，室温下搅拌30min，可在4℃冰箱静置24h保存。
五、制备壳聚糖-玉米醇溶蛋白支架(CS-Zein支架)
将上一步制得的玉米醇溶蛋白，取出后继续体积比1:1的浸入无水甲醇/氢氧化钠溶液24h，-55℃冻干支架上的水分后取出，继续浸入含50mmol/L的EDC和18mmol/L的NHS的体积分数95％乙醇水溶液中，4℃下保存24h，去离子水冲洗，冻干得壳聚糖-玉米醇溶蛋白支架。
六、壳聚糖-玉米醇溶蛋白-bFGF生长因子(CS-Zein-bFGF)支架
配置20ml DMF/PBS(体积比4:1)溶液；称量N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)7.39mg溶于10ml DMF/PBS溶液中；稀释上述溶液，得终浓度7.39×10-3mg/ml的N-琥珀亚酰胺溶液；将上述溶液1ml加入棕色瓶中，加入5μg bFGF与4ml DMF/PBS溶液，反应总体积为5ml；4℃磁搅拌48h；超滤管超滤：4℃，4000rp/min，1h离心，循环6次，循环间隔0.5h；加入0.4ml PBS，配成10ng/μl样品；取0.1ml药品，加入0.9ml PBS，成1ng/ml；分装，-20℃保存。
接枝时，将1ng/ml的bFGF滴在壳聚糖-玉米醇溶蛋白支架，自然风干(避光)；将风干后的支架置于紫外光下照射2min进行紫外光接枝，形成生长因子接枝修饰支架。
实施例2壳聚糖-玉米醇溶蛋白-氧化蔗糖支架的红外检测
一、实验方法
为了确定壳聚糖与玉米醇溶蛋白的肽交联在一起生成的结构成分，采用傅里叶红外光谱检测对样品进行分析。
将壳聚糖支架(CS支架)和KBr在干燥机中进行干燥处理，将1～2mg试样与200mg纯KBr混合并研磨均匀，并将混合物研磨到粒度小于2μm，以免散射光影响。将混合物置于模具中，在油压机上用5～10MPa压力将混合物压成透明薄片，上机待定；同时，将空白支架(未交联玉米醇溶蛋白的壳聚糖CS-Zein支架)与实施例1最终制备得到的经过修饰的CS-Zein-bFGF支架进行干燥处理，上机测定。
二、实验结果
实验如图2所示，结果表明，普通CS的红外特征峰和其后经玉米醇溶蛋白修饰的二者存在明显不同，表明玉米醇溶蛋白肽成功的修饰在CS表面。CS的红外特征峰和CS-Zein的基本一致，差异在于CS-Zein样品在2966cm-1处和1240cm-1处存在特征峰。这些结果表明，CS经过氧化蔗糖的交联作用后，其表面确实与玉米醇溶蛋白肽形成了主要包含玉米醇溶蛋白肽和氧化蔗糖的物质，可断定，壳聚糖与玉米醇溶蛋白肽成功的交联。
实施例3扫描电镜观察
一、实验方法
将空白支架(未交联玉米醇溶蛋白的壳聚糖支架，CS支架)及CS-Zein支架进行自然风干，将风干后的支架样品粘贴固定于样品台上并做喷金处理，将样品置于扫描电镜样品室内，将样品室抽成真空，进行扫描电镜观察。
二、实验结果
结果如图3所示，图3A上下两行图分别为壳聚糖支架在不同倍数下电镜图片，左右两列图分别为未用玉米醇溶蛋白修饰的壳聚糖支架，以及用玉米醇溶蛋白和氧化蔗糖修饰过后的壳聚糖-玉米醇溶蛋白改性支架，支架的扫描电镜观察支架为三维多孔结构。图3B是两种支架材料在普通显微镜下观察到的支架形态，观察到支架具有多孔结构。
右侧图中红色箭头部分指向的明亮部分即是成功修饰在壳聚糖支架上的玉米醇溶蛋白，表明成功制备壳聚糖-玉米醇溶蛋白CS-Zein支架，图中经过玉米醇溶蛋白修饰的壳聚糖支架表明，玉米醇溶蛋白以及氧化蔗糖的成功修饰未能引起壳聚糖支架形貌上较大的变化。如图3A所示，在显微镜下可见明显而平滑的壳聚表面壁，并且有相连通的、足够多的孔隙，说明支架孔隙率相对比较高，满足壳聚糖-玉米醇溶蛋白肽支架作为肝组织工程支架的要求。
实施例4支架的热重表征
一、实验方法
样品在热稳定性分析仪中程序温度变化过程中重量随温度变化的情况，分析环境为0～300℃、氮气环境下，其纵坐标为重量百分比，表示样品在当前温度下的重量与初始重量的比值。
二、实验结果
结果如图4所示，未加载玉米醇溶蛋白的壳聚糖支架(CS支架)在81.71℃的时候降解了20％、剩余了80％的支架，而加载了玉米醇溶蛋白的壳聚糖支架(CS-Zein支架)在194.94℃时，才同样降解20％了、剩余80％。未加载玉米醇溶蛋白的壳聚糖支架在同样的194.94℃时，支架已经降解了33％，只剩余67％左右。350℃时，CS支架和CS-Zein支架的降解量分别为36％、30％左右。
未加载玉米醇溶蛋白的壳聚糖支架(CS支架)在温度为100℃左右以后，热稳定性较为稳定，但是在温度升高至350℃时，降解了整体支架的大约40％，稳定性明显降低。加入玉米醇溶蛋白之后的壳聚糖支架稳定性有所提高，并且在200℃之前较为明显。
在人体或哺乳动物体内正常温度约37℃、最高约40℃的温度范围内，两支架剩余量接近100％完整支架，完全可以发挥其作用，支持支架上面细胞生长，生成组织或器官。
实施例5孔隙率分析
一、实验方法
为测定壳聚糖支架(CS支架)的孔隙率，这里使用阿基米德法、以95％乙醇进行六次测定，数据测量制成如图、取平均值并计算方差。测定结果显示出支架样品的孔隙率均大于90％，符合实验对于支架孔隙率的要求。
支架的孔隙率使用下面公式计算：
P＝(m2-m1)/(m2-m3)
其中，m1为支架的干重，m2为支架吸饱乙醇后的质量，m3为支架浮于乙醇中的质量。选取5个样品测定孔隙率取平均值并计算方差ρ。
二、实验结果
支架作为细胞生长的支撑和环境，需要满足细胞在支架上生长所需要的必要条件，其中之一就是支架材料内部空间必须要有足够的空间来满足细胞生存，包括细胞代谢活动等重要环节，所以支架内部具有足够的空间是组织工程支架必须要满足的条件，要求支架内部孔隙率要达到90％以上才可以满足条件。
如图5所示，将支架材料分为六组不同大小和形状，进行孔隙率的测定。六组样品进行孔隙率测量的条件均没有差别，且满足90％孔隙率的要求。
实施例6 3D轮廓扫描(白光干涉)
一、实验方法
使用3D轮廓仪(白光干涉模式)对壳聚糖-玉米醇溶蛋白支架与壳聚糖支架进行支架表面的检测并与接种细胞之后的支架表面进行对比。
二、实验结果
如图6所示，为本研究所制备的壳聚糖-玉米醇溶蛋白支架(CS-Zein支架)在3D轮廓仪的白光干涉模式下进行检测的结果，检测支架的大小为长0.88mm，宽为0.66mm，以检测平面为基准，高度为1.43mm，深度为0.29mm。从图中的颜色变化可以看出，支架表面并非是平滑的，而且充满了凹凸不平的坑洞和陷落。从之前的研究中可以得到，不光滑的支架表面更有利于种子细胞的依附和生长，而本研究说制备的支架满足这个条件，即壳聚糖-玉米醇溶蛋白支架相对于普通机械制造的支架更有利于种子细胞的依附和增长。
实施例7 X射线衍射检测
一、实验方法
本实验结果是在华南理工大学分析测试中心所得，所用仪器为日本的D/max-IIIA型号X射线粉末衍射仪。
首先开启冷却水和XRD电源，然后启动计算机，在XRD稳定两分钟左右后，进入桌面Pmgr系统，将被测样品放置在测试架上，点击Display&Setup，点击Close出现对话框后，点击确认，点击画面上Right Coniocondition，双击空白处，出现Standard Condition Edit对话框，进行实验条件设定及对样品取名；同时点击上Right Conio Analysis，实验条件设定以后，点击Append、start。进入Right Conio Analysis画面，点击start，XRD开始测试，点击画面上Basic Process，进行数据处理。
二、实验结果
结果如图7所示，为本研究支架的XRD(X射线衍射)图谱，位于上方的图谱线为未交联玉米醇溶蛋白的壳聚糖支架(CS支架)基体，位于下方的图谱线是壳聚糖交联玉米醇溶蛋白后的支架(CS-Zein支架)。
从图中可以看出，图谱中位于入射角为30°左右的主要峰在交联了玉米醇溶蛋白之后，向左侧发生了偏移，也就是玉米醇溶蛋白的晶型发生了变化，从侧面反映出，壳聚糖、玉米醇溶蛋白与交联剂发生了反应，即壳聚糖与玉米醇溶蛋白在交联剂氧化蔗糖的作用下发生了交联反应。
(图中线谱杂乱，杂峰较多，可能与测试之前支架洗脱实验有关系，可能是由于支架上多余的清洗剂没有洗脱或洗净的原因，造成了如图所示的杂峰，但图中箭头所示的主要峰较明显，可以证明玉米醇溶蛋白在交联剂氧化蔗糖的作用下与壳聚糖基体支架发生了反应。)
实施例8支架的力学性能表征
一、实验方法
本实验结果是在华南理工大学分析测试中心所得，所用仪器为日本的AG-IC50kN型号电子万能试验机。检测壳聚糖-玉米醇溶蛋白支架样品。
二、实验结果
如图8所示，为本研究的支架力学机械性能表征结果，位于左侧的是支架的拉伸性能结果，位于右侧的是支架的压缩性能结果。
左图中数据显示，样品组数据呈现为不规则现象，并且趋势曲线的最高点说明支架的抗拉伸能力最大为8.82N，0.11MPa，趋势曲线的最低点说明支架的抗拉伸能力最小为1.69N，0.03MPa，其他测量位点都在区间之内，证明支架的抗拉伸能力在2-8N之间。
右图中数据显示，三组样品测得的数据相对集中，途中显示最大的抗压缩能力为16.60N，0.44MPa，最小的抗压缩能力为7.92N，0.23MPa，证明支架的抗压缩能力在8-16N之间，且最大形变量都在9％处，说明本支架承受的最大压缩形变量应为9％左右。
综上所述，本支架的抗拉伸能力稍差，抗压缩能力稍好，即支架的力学性能可以满足细胞在支架上的正常生长、增值及分化活动所需的机械强度要求。
实施例9热水溶失率分析支架在体内质量变化
一、实验方法
支架材料的热水溶失率可以显示支架在人体内温度条件下的溶失速率以及溶失率，从而可以简单的推测出支架在体内的存在时间，降解速率等表现项目，与热稳定性实验以及吸水膨胀率互相弥补。
使用纯水分析壳聚糖-玉米蛋白支架(CS-Zein支架)在热水中降解情况。设置5组实验组，每组5个样品，将支架置于37℃纯水中分别处理4d，并使用真空干燥机干燥，测量剩余重量
热水溶蚀率R计算使用下面公式计算：
R＝(m4-m1)/m1
其中，m1为支架的干重，m4为支架在37℃纯水中处理4d后支架剩余干重，每组选取5个样品测定热水溶蚀率取平均值并计算方差ρ，并用壳聚糖支架进行平行试验作为对照进行分析。
二、实验结果
结果如图9所示，数据显示支架材料的热水溶失率普遍位于0.1％～0.2％之间，这一现象说明CS-Zein支架于热水(37℃)中的稳定性较为良好，降解度较低，可以在体内稳定存在；实验一组的数据变化较为突出，可能是因为支架处理时不到位，干燥不彻底导致支架上有些许水分残留，从而改变了支架的热水溶失率结果显示。其余实验数据呈现轻微波动，皆在实验误差范围之内，证明本研究支架的在体内温度情况下的热水溶失率较为稳定，总体呈现横向不增加不减少的趋势，且热水溶失率均低于1％，最高的一个实验组可达到0.3％对于支架整体的质量和体积可忽略，而相对于吸水膨胀率的结果数据呈现更为稳定。
实施例10吸水膨胀率的检测
一、实验方法
支架材料的吸水膨胀率可以显示支架材料在体内，尤其是当支架材料需要与体内各种体液或组织液接触时的吸水情况及支架材料的体积变化情况。
使用纯水分析壳聚糖-玉米蛋白支架(CS-Zein支架)体积变化情况。设置5组实验组，每组5个样品，将支架置于4℃纯水中分别处理4d吸水膨胀率Q计算使用下面公式计算：
Q＝(V2-V1)/V1
其中，V1为支架未吸水时的体积，V2为支架吸饱4℃纯水后的体积，选取5个样品测定吸水膨胀率取平均值并计算方差ρ，并用壳聚糖支架进行平行试验作为对照进行分析。
二、实验结果
本实验结果是在本实验室的研究条件下完成的。结果如图10所示，数据显示支架材料的热水溶失率普遍位于0.1％～0.2％之间，这一现象说明CS-Zein支架于热水(37℃)中的稳定性较为良好，降解度较低，可以在体内稳定存在；而吸水膨胀率则表现出随时间增加而逐渐上升的趋势，期间有小型波动，但总体趋势为上升趋势，此现象可能是由于支架内部孔隙率过高，且支架吸水性能良好，造成支架吸水膨胀，膨胀率在0.1％左右，最高可达0.3％。支架孔隙率虽然满足细胞增长的最适范围，但可能会对支架吸水膨胀率造成一定的影响，但合适的内部孔隙率才能够为细胞生长分化代谢提供充足空间，
实施例11体液模拟分析
一、实验方法
模拟体液(Simulated Body Fluid，SBF)实验可用于模拟生物材料在人体内发生降解、吸附，因此是评定材料生物活性的简便体外实验方法。将合成好的支架经预处理后放入SBF中浸泡，以探讨支架在SBF中的降解性能，为实现以壳聚糖为基体的生物支架材料的体内降解或体内存在时间提供依据。
使用PBS溶液作为模拟体液分析壳聚糖-玉米蛋白支架在体内的降解情况。设置8组实验组，每组5个样品，将支架置于37℃PBS中分别处理1、2、3、4、5、6、7、14d，并使用真空干燥机干燥，测量剩余重量。
体外降解率Sn＝(mn-m0)/m0
其中，m0为支架的干重，mn为支架在37℃PBS中处理相应时间后支架剩余干重，每组选取5个样品测定孔隙率取平均值并计算方差ρ，并用壳聚糖支架进行平行试验作为对照进行分析。选取5个样品测定孔隙率取平均值并计算方差ρ，并用壳聚糖支架进行平行试验作为对照进行分析。
二、实验结果
结果如图11所示，本研究的支架材料的体液模拟实验中，CS支架在10天之前保持相对稳定的情况，尽管在第六天的时候出现了轻微的降解差距，但在实验误差范围之内可以接受，在第十天之后出现了下滑的趋势，即讲解率降低。CS-Zein支架在十五天范围内的所有实验数据皆保持在一个横向平稳的情况，说明CS-Zein支架在体液环境下保持有一个相当可靠的稳定性，且相对于CS支架更稳定，从而可以得出结论，本研究所制备的几种支架材料都可以在体液环境下稳定存在很久，足够支撑接种在支架上的种子细胞依附支架上生成一个完整的组织或器官。
实施例12细胞培养和接种
大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)，显微镜下观察BMSCs的形态应为梭形星状。用无菌的PBS缓冲液洗去贴壁不牢的细胞，用含胰蛋白酶和EDTA的PBS溶液消化2min左右，加入等量低糖含血清DMEM培养液用灭过菌的滴管轻轻吹打，收集细胞悬液至无菌的离心管。1000r/min离心5min。弃去上清，接种至培养瓶中。放于37℃，5％CO2的培养箱中培养。当细胞融合达80％左右时，即可以1：2～1：3比例传代。
骨髓间充质干细胞的体外培养(在温度37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养)，将生长状况良好的细胞接种在孔板上，用含有100μmol/L三丁基过氧化氢的DMEM低糖培养基培养细胞40mins，构建bMSCs的衰老模型；
选择增生旺盛、活力良好的细胞，按20×103/cm2接种，用0.01mol/L PBS洗涤两次后给予诱导，每两天换液1次，于诱导的21d收集将支架用紫外线消毒15min后置于24孔板中，先向每孔中加入40μL的bMSCs。
将实施例1制备的CS-Zein-bFGF支架制备成适当的大小，酒精浸泡消毒后放进12孔板或24孔板中，放在紫外光下照射消毒备用。取生长至培养瓶底部面积70～80％的BMSCs(生长对数期的细胞)，常规消化，用培养基调整细胞浓度为104个/μL；按100μL/孔接种于支架上，即将含有细胞的细胞培养液加到含有支架的孔板上，使培养液能没过2/3或3/4高度支架，然后将孔板放进培养箱进行常规培养。
实施例13 DAPI染色免疫荧光
一、实验方法
24孔板中的细胞培养后，PBS溶液摇床清洗3次，每次5min后，采用4％多聚甲醛固定30min，PBS清洗后，将实验组一分为二：直接进行染色或消化细胞后制成细胞涂片(涂片方法：胰酶浸泡样本4min后，含血清培养液终止消化，滴管吹打支架，2500rpm/min离心收集细胞，涂布于载破片上)。0.2％Triton X-100透化20min；PBS再次清洗后，避光孵育荧光抗体Rb-PE(IF8，SCBT)和/或p53-FITC(DO-7，SCBT)，2h，DAPI染液孵育3min。PBS清洗，镜检。
二、实验结果
图12所示结果为细胞接种支架培养后的DAPI染色结果，拍摄仪器为本实验室Nicon ECLIPSE Ti荧光倒置显微镜。
如图12所示，上方是支架表面的DAPI染色拍摄照片，从左到右依次为壳聚糖支架(CS支架)、壳聚糖-玉米醇溶蛋白支架(CS-Zein支架)和壳聚糖-玉米醇溶蛋白-生长因子支架(CS-Zein-bFGF支架)；下方是支架断裂处DAPI染色拍摄照片，从左到右依次为壳聚糖支架(CS支架)、壳聚糖-玉米醇溶蛋白(CS-Zein支架)支架和壳聚糖-玉米醇溶蛋白-生长因子支架(CS-Zein-bFGF支架)。
从DAPI染色的结果来看空白组与实验组的细胞皆生长状况良好，细胞核都没有发生异变。在不同视野下都可以发现培养三天后，壳聚糖-玉米醇溶蛋白-生长因子支架(CS-Zein-bFGF支架)组上生长增殖的细胞远远多于壳聚糖-玉米醇溶蛋白支架(CS-Zein支架)组以及壳聚糖支架(CS支架)组，且支架断裂处生长增殖的细胞稍多于光滑支架表面处生长增殖的细胞，说明加载有玉米醇溶蛋白和bFGF的支架会使其上的细胞增多，而且在壳聚糖-玉米醇溶蛋白-生长因子支架(CS-Zein-bFGF支架)中可以发现细胞更倾向与集结成团生长，结合扫描电镜结果可以猜测，这与bFGF在支架表面是点状分布有关，有大量玉米醇溶蛋白和bFGF集结的区域对细胞有更强的吸附能力或促进增殖能力。
实施例14支架对细胞增殖的影响
一、实验方法
本实施例所用的细胞计数板为每个小方格的面积为1/400mm，采用的规则为计数时“记上不记下，记左不记右”，充分的记录显微镜下视野中的所有细胞，预测整体细胞的数量。
细胞目视计数法的计算公式如下：细胞数(RBCs)/L＝N/5×25×10×106×200
二、实验结果
如图13所示，CS支架对照组的细胞计数板，在支架表面以及支架断裂处计算得到的细胞数量大约为20/45，CS-Zein支架实验组的细胞计数板在支架表面以及支架断裂处计算得到的细胞数量大约为60/100，CS-Zein-bFGF支架实验组支架的细胞计数板在支架表面以及支架断裂处计算得到的细胞数量大约为130/160，从这些数据可以看出，交联了玉米醇溶蛋白的壳聚糖支架(CS-Zein支架)比单独的壳聚糖支架(CS支架)的细胞粘附能力以及促进细胞增殖能力要好，而接枝了bFGF的支架材料的细胞粘附能力以及促进细胞增殖能力比未接枝bFGF的支架更加强大，由此可得结论，本实验所制备的最终实验组支架材料CS-Zein-bFGF组支架的促进细胞增殖能力和粘附细胞能力很强大。
实施例15 CCK-8染色
一、实验方法
在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养一段时间(37℃，5％CO2)。向每孔加入10μL CCK-8溶液，添加过程注意不要在孔中生成气泡，会影响OD值的读数，将培养板在培养箱内孵育4～8小时。用酶标仪测定在450nm处的吸光度。若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCL溶液或者1％w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
二、实验结果
如上图14所示，从左到右依次空白组、骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞接种于壳聚糖空白支架(CS支架)组、骨髓间充质干细胞接种于壳聚糖-玉米醇溶蛋白支架(CS-Zein支架)组、骨髓间充质干细胞接种于壳聚糖-玉米醇溶蛋白-bFGF支架(CS-Zein-bFGF支架)组的CCK-8染色的结果。
从图中可以看出，空白组与BMSC组的差距很小，且平行组之间波动较小，证明本实验中所用的孔板以及细胞无问题；BMSC接种于CS空白支架(CS-Zein支架)组的细胞活性相对于空白组以及BMSC细胞组相对较低但差距不大，可能是由于接板细胞的数量误差导致；BMSC接种于CS-Zein支架组的细胞活性及细胞数量明显多于前三组，说明Zein有助于增强细胞活性以及有促进细胞增殖的作用，且相对于其他实验组以及对照组来说，误差相对较大，但是在合理范围之内；最后一组实验组为BMSC接种于CS-Zein-bFGF支架组，相对于之前的所有组比较，细胞活性有较大的提升，细胞数量有较明显的增加，证明实验组CS-Zein-bFGF支架有助于提高细胞活性，增加细胞数量。
实施例16 CV染色
一、实验方法
使用结晶紫染液与PBS配置结晶紫染色工作液，定容至最终浓度为0.1％。将在原接种细胞的支架所在的24孔板中培养14d的细胞使用胰酶消化，并取适量细胞悬液转移到新的96孔板中，每孔100μl的细胞悬液并在37℃，5％CO2的条件下培养箱中孵育4～8h,PBS洗去培养基三次，每次5min。后使用结晶紫染色工作液染色15min，用33％醋酸脱色。洗脱液在酶标仪上570nm测其OD值。
二、实验结果
结果如上图15所示，从左到右依次是空白组、骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞接种于壳聚糖空白支架(CS支架)组、骨髓间充质干细胞接种于壳聚糖-玉米醇溶蛋白支架(CS-Zein支架)组、骨髓间充质干细胞接种于壳聚糖-玉米醇溶蛋白-碱性成纤维细胞生长因子支架(CS-Zein-bFGF支架)组的CV结晶紫染色的结果。
从图中可以看出，空白组与BMSC组的差距很小，且平行组之间波动较小，证明本实验中所用的孔板以及细胞无问题；BMSC接枝CS空白支架(CS支架)组的各平行组中细胞数量差距较大，加入去除误差较大的平行组，与之前的CCK-8结果比较吻合，造成原因可能是由于在支架上的细胞消化不完全；BMSC接枝CS-Zein支架组的细胞数量稍多于前三组，说明Zein有促进BMSC细胞增殖的作用，误差在合理范围之内；最后一组实验组为BMSC接枝CS-Zein-bFGF支架组，相对于之前的所有组比较，细胞数量有较明显的提升，证明我们实验组CS-Zein-bFGF支架有助于增加细胞数量。

Claims (6)

1.一种接枝有碱性成纤维细胞生长因子bFGF的肝组织工程支架，其特征在于，所述肝组织工程为接枝有碱性成纤维细胞生长因子bFGF的肝组织工程支架，所述肝组织工程支架以氧化蔗糖作为交联剂将玉米醇溶蛋白交联在聚糖水凝胶中，
其制备方法为：以氧化蔗糖作为交联剂将玉米醇溶蛋白交联在聚糖水凝胶，冷冻干燥之后得到，具体地包括以下步骤：
S1.1～2％质量浓度戊二醛溶液与含有20～30g/L的壳聚糖的质量浓度为1～2％的醋酸溶液混合，50～60℃恒温0.5～1h，冷冻干燥，得到壳聚糖支架固体；
S2.壳聚糖支架浸泡于玉米醇溶蛋白充分接触后，于氧化蔗糖水溶液中，浸泡0.5～1h；
再浸入无水甲醇和氢氧化钠的混合液5～10min，去除液体，继续浸入含50～75mmol/L的EDC、10～20mmol/L的NHS的体积分数90～95％乙醇水溶液中，去离子水冲洗，冻干即得。
2.根据权利要求1所述的肝组织工程支架，其特征在于，氧化蔗糖的制备方法为将蔗糖、高碘酸钠和去离子水充分混匀，溶解，充分反应，然后加入氯化钡，充分沉淀，固液分离，保留上清。
3.一种接枝有碱性成纤维细胞生长因子bFGF的肝组织工程支架的制备方法，其特征在于，将肝组织工程支架接枝碱性成纤维细胞生长因子bFGF，
接枝的方法为：所述的肝组织工程支架和bFGF分别活化羧基，之后进行紫外光接枝；
所述肝组织工程支架以氧化蔗糖作为交联剂将玉米醇溶蛋白交联在聚糖水凝胶中，
其制备方法为：以氧化蔗糖作为交联剂将玉米醇溶蛋白交联在聚糖水凝胶，冷冻干燥之后得到，具体地包括以下步骤：
S1.1～2％质量浓度戊二醛溶液与含有20～30g/L的壳聚糖的质量浓度为1～2％的醋酸溶液混合，50～60℃恒温0.5～1h，冷冻干燥，得到壳聚糖支架固体；
S2.壳聚糖支架浸泡于玉米醇溶蛋白充分接触后，于氧化蔗糖水溶液中，浸泡0.5～1h；
再浸入无水甲醇和氢氧化钠的混合液5～10min，去除液体，继续浸入含50～75mmol/L的EDC、10～20mmol/L的NHS的体积分数90～95％乙醇水溶液中，去离子水冲洗，冻干即得。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，氧化蔗糖的制备方法为将蔗糖、高碘酸钠和去离子水充分混匀，溶解，充分反应，然后加入氯化钡，充分沉淀，固液分离，保留上清。
5.权利要求1或2任一所述的肝组织工程支架在细胞培养中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肝组织工程支架促进细胞增殖和/或增强细胞活性。
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