CN102160899B

CN102160899B - 聚乙二醇交联去细胞瓣多信号复合支架材料及其制备方法

Info

Publication number: CN102160899B
Application number: CN 201010118554
Authority: CN
Inventors: 董念国; 史嘉玮; 陈思; 洪昊; 邹明晖; 卢翠芬; 周建良
Original assignee: Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2010-02-13
Filing date: 2010-02-13
Publication date: 2013-10-30
Anticipated expiration: 2030-02-13
Also published as: CN102160899A

Abstract

本发明利用修饰后的枝化状PEG——双(3，5-二丙烯酰氧甲基)苯基聚乙二醇——交联去细胞瓣，增强去细胞瓣的胶原交联程度，改善其力学性能，同时将生物信号RGD肽、rhVEGF₁₆₅引入其中，能够召募体循环中内皮祖细胞(EPCs)，促进内皮祖细胞生长和新生细胞外基质合成，加速再内皮化，从而具有良好的力学性能和生物学性能。此外，该多信号复合支架材料中的生物活性分子释放更加缓慢，发挥生物效应的时间更长久。

Description

聚乙二醇交联去细胞瓣多信号复合支架材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种枝化状PEG交联去细胞瓣多信号复合支架材料及其制备方法。

技术背景

瓣膜置换术是治疗心脏瓣膜病主要手段。近年全世界心脏瓣膜手术达25万例/年，所需瓣膜替代物约30万枚，年增长速度超过6.9％，我国心脏瓣膜病患者达200万人以上，瓣膜替代物用量约2万枚/年，且以每年20％速度递增。临床常用的两种瓣膜替代物(机械瓣与生物瓣)均存在不可克服的缺陷：前者需终生抗凝，易致出血与栓塞；后者因钙化衰败，10-15年需再次手术。寻找和研制更理想的瓣膜替代物一直是广大心外科医生努力的方向，20世纪80年代后期出现的组织工程心脏瓣膜(TEHV)为实现这一梦想带来新的曙光。心脏瓣膜部位、功能特殊，机械强度和弹性要求较高，使近年TEHV研究较其他(骨、皮肤、血管等)组织工程滞后。

支架材料、种子细胞和二者间相互作用是构建TEHV三大基本要素，其中支架材料是仿生学模拟的主要靶点。高分子材料可控性强，便于化学修饰，但缺少生物信号位点；生物源性材料组织相容性好，但可修饰性差。而去细胞瓣作为一种天然天然材料组，其织结构接近人体正常瓣膜，而且保留了部分生物信号，获取较易，其优良的仿生性非高分子材料和其他生物材料所能媲美。本课题组研究发现猪主动脉瓣经去细胞处理后胶原交联减少，力学性能下降，可溶性基质成分丢失，生物信号减少。因此，改善去细胞瓣的理化性状，制备具有良好力学性能和生物信号的仿生支架材料，有望突破TEHV研究的瓶颈。

胶原是瓣膜的主要成分，控制胶原交联是影响去细胞瓣力学性能的关键因素。聚乙二醇(PEG)因高度亲水性、优良生物相容性和精确可控制性，近年在生物医用材料领域备受重视。PEG是一种长链大分子聚合物，以重复乙二醇氧化乙烯为基础结构，可呈线形、枝化形等。以往PEG多被用于制成水凝胶缓释生物活性分子，或者用于蛋白质或多肽的功能化修饰。新一代枝化状PEG可在分枝末端引入丙烯酰基或乙烯砜基等官能团，能够与医用生物材料或生物活性分子上半胱氨酸巯基共价结合，化学反应的专一性和修饰率很高，且条件温和。枝化状PEG分子量较小，易于渗入组织内，对细菌吸附和血小板黏附抵抗力强，且一个分子可携带多个官能团；丙烯酰基或乙烯砜基等官能团不仅无毒，且能与支架材料或生物活性分子上半胱氨酸巯基反应，已被用于多种生物医用材料的改性和细胞保护。利用丙烯酰基或乙烯砜基使枝化状PEG与去细胞瓣胶原螺旋内和螺旋间化学偶联，不仅增加交联密度，胶原蛋白更趋稳定，支架材料力学性能提高，同时可引入生物活性分子，增强支架材料生物学性能。

完整的内皮细胞层是防止瓣膜炎症反应和血栓形成的重要因素。近年构建TEHV倾向于将无细胞支架材料植入体内，期望通过机体自我修复机制和召募循环血内皮祖细胞(EPCs)来完成再内皮化。但裸支架直接植入，因生物活性分子不足，EPCs召募、黏附、生长无法有效实现，尤其在高速血流冲击下难以充分再内皮化。血管内皮生长因子(VEGF)是最重要的血管生成活性分子之一，不仅促进新生血管形成、保持毛细血管通透性，而且介导多种细胞增殖、迁移、分化(参见：Zisch AH，Lutolf MP，Hubbell JA.Biopolymeric delivery matrices for angiogenic growth factors.Cardiovasc Pathol.2003；12(6)：295-310)。其分子一般均由同源二聚体构成，每个单体含有121、 165、189或206个氨基酸序列。研究发现VEGF家族主要有VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、胎盘生长因子(PIGF)等成员，以VEGF-A最为重要。VEGF家族对细胞的刺激作用主要通过细胞表面特异性的VEGF受体来完成(酪氨酸激酶受体)，其中VEGF-A通过VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(KDR/Flk-1)介导目前几乎所有已知的细胞反应。目前普遍认为VEGFR-2是骨髓EPCs表面标志，外周血中VEGFR-2持续高表达(参见：Smadja DM，Bièche I，Helley D，et al.Increased VEGFR2 expression duringhuman late endothelial progenitor cells expansion enhances in vitro angiogenesiswith up-regulation of integrin alpha(6).J Cell Mol Med.2007Sep-Oct；11(5)：1149-61)。因此，VEGF可特异性与EPCs的VEGFR-2结合，促进EPCs动员、迁移、增殖、分化，加速内皮化进程。

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽(RGD肽)是天然细胞外基质(ECM)黏附蛋白功能序列，通过结合整合素促进细胞黏附(参见：Lutolf MP，Hubbell JA.Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments formorphogenesis in tissue engineering.Nat Biotechnol 2005；23(1)：47-55)。人工合成的含RGD序列短肽(如RGDS、RGDSP、GRGDSPC)性能稳定，可大量合成，且能有效介导细胞与ECM的黏附和激活，因而是目前应用最广泛且最有效的促黏附分子(参见：Patel ZS，Mikos AG.Angiogenesis withbiomaterial-based drug-and cell-delivery systems.J Biomater Sci Polym Ed 2004；15(6)：701-726)。去细胞瓣尽管残存少量促黏附序列，黏附能力仍有下降(参见：Shi JW，Dong NG，Sun ZQ.Immobilization of RGD peptides ontodecellularized valve scaffolds to promote cell adhesion.Journal of WuhanUniversity of Technology-Materals Science Edition 2007；22(4)：686-690)。

为了克服上述不足，本实验室利用修饰后的枝化状PEG——双(3，5-二丙烯酰氧甲基)苯基聚乙二醇——交联猪去细胞主动脉瓣，从而增强去细胞瓣胶原交联程度，改善其力学性能，同时将生物信号RGD肽、rhVEGF165引入到去细胞瓣，获得一种PEG交联去细胞瓣多信号复合支架材料。该多信号复合支架能够召募体循环中内皮祖细胞(EPCs)，促进EPCs在支架表面的生长，并在促进原有去细胞瓣降解的同时，合成新的细胞外基质，得到具有生长、代谢活性的新型支架。此外，PEG交联去细胞瓣多信号复合支架材料中的生物活性分子释放缓慢，发挥生物效应的时间更长久。

发明内容

本发明的目的是提供一种PEG交联去细胞瓣多信号复合支架材料及其制备方法。

实现本发明的技术方案是：本发明合成了枝化状PEG——双(3，5-二羟甲基)苯基聚乙二醇(见下图a)。本发明以该枝化状PEG为基础，将丙烯酰基引入到其羟基末端，制备一种新的枝化状PEG——双(3，5-二丙烯酰氧甲基)苯基聚乙二醇(下图b)。同时，本发明将生物信号RGD肽和rhVEGF₁₆₅连接到该聚乙二醇上，并通过该聚乙二醇与猪去细胞主动脉瓣交联，从而将生物信号RGD肽和rhVEGF₁₆₅引入到去细胞瓣支架上，同时改善了支架的力学性能和生物学性能，获得一种新型枝化状PEG交联去细胞瓣多信号复合支架材料。

其中：n＝40～400的整数，化合物a的分子量约为2000～20000。

本发明技术方案依次包括以下三个步骤：

第一步：猪去细胞瓣制备、巯基引入和巯基含量测定：

取新鲜猪心，裁剪其主动脉瓣，经酶和去污剂联合处理后，得到主要含胶原蛋白的去细胞瓣膜。将该去细胞瓣膜与N-丁二酸-S-乙酰基巯基乙二醇酯(SATA)在25～37℃、pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中反应2h，用盐酸羟胺水解液对乙酰化巯基去保护，得到含有巯基的去细胞瓣膜。其中，SATA的浓度范围为1-5mg/ml。去细胞瓣巯基含量的测定是通过去细胞瓣的巯基与5，5-二硫代双-2-硝基苯甲酸(DTNB Ellman’s试剂)反应，生成黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸，该物质在412nm处具有最大吸收峰，从而通过比色法计算出去细胞瓣中巯基的含量。

第二步：双(3，5-二羟甲基)苯基聚乙二醇的功能化修饰：

将市购的聚乙二醇单体(HO(CH₂CH₂O)nH，n为50～500的整数)溶于二氯甲烷中，加入甲基磺酰氯，反应得聚乙二醇甲基磺酸酯；将产物溶解于二甲基甲酰胺溶液，加入碳酸铯和5-羟基间苯二甲酸甲酯，反应后的产物，经氢化铝锂还原，得到本发明所用的枝化状PEG——双(3，5-二羟甲基)苯基聚乙二醇。取该枝化状PEG溶于无水二氯甲烷中，在氩气保护下加入三乙胺，再缓慢滴加丙烯酰氯，室温条件下，搅拌过夜(反应方程式如下)；反应后的溶液用饱和氯化钠水溶液洗涤三次，无水硫酸镁干燥，减压浓缩，冰乙醚重结晶，过滤，将过滤后的固体物质再用冰乙醚洗涤三次，真空干燥，得到白色粉末状物质。经红外光谱和¹H核磁共振检测，结果如下：IR(NaCl)：2883，1723，1467，1280，1112，946，842cm^-1；¹H NMR(CDCl₃)：3.51-3.86((OCH₂CH₂)n)，4.14(4H，CH₂OAr)，5.16(8H，CH₂-Ar)，5.88(4H，CH＝)，6.16(4H，CH₂＝)，6.44(4H，CH₂＝)，6.90-6.96(6H，Ar)；¹³C NMR(CDCl₃)：166.2，159.3，137.5，131.2，128.0，113.9，70.5。结果分析证实该白色粉末状物质为双(3，5-二丙烯酰氧甲基)苯基聚乙二醇(即化合物b)。

将上述制备的枝化状PEG——双(3，5-二丙烯酰氧甲基)苯基聚乙二醇——溶解于25～37℃、pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中，加入市购的RGDSP肽(Ac-GCGYGRGDSPG)(上海吉尔生化科技公司提供)和rhVEGF₁₆₅(sigma公司提供)，室温反应4h，得到携带有RGD肽和rhVEGF₁₆₅的双(3，5-二丙烯酰氧甲基)苯基聚乙二醇，并置于PBS中存储备用。其中，双(3，5-二丙烯酰氧甲基)苯基聚乙二醇活性官能团与RGD肽和rhVEGF₁₆₅的半胱氨酸巯基的物质的量的比例为10～50∶1。

第三步：修饰后的PEG与引入巯基后的去细胞瓣交联，得到多信号复合支架材料。

将已引入巯基的猪去细胞瓣加入到携带有RGD肽和rhVEGF₁₆₅分子的双(3，5-二丙烯酰氧甲基)苯基聚乙二醇溶液中，在25～37℃、pH7.4的条件下，反应2h，得到PEG交联去细胞瓣多信号复合支架材料。其中，双(3，5-二丙烯酰氧甲基)苯基聚乙二醇的活性官能团与去细胞瓣所含巯基的物质的量之比为1∶10～50。

本发明流程图见图8。

本发明利用修饰后的枝化状PEG——双(3，5-二丙烯酰氧甲基)苯基聚乙二醇——交联去细胞瓣，增强去细胞瓣的胶原交联程度，改善其力学性能，同时将生物信号RGD肽、rhVEGF₁₆₅引入其中，能够召募体循环中内皮祖细胞 (EPCs)，促进内皮祖细胞生长和新生细胞外基质合成，加速再内皮化，从而具有良好的力学性能和生物学性能。此外，该多信号复合支架材料中的生物活性分子释放更加缓慢，发挥生物效应的时间更长久。

附图说明

图1：a，c为正常瓣膜HE染色和扫面电镜，b，d为去细胞瓣膜HE染色和扫面电镜，显示细胞去除完全，细胞外基质保存完整。

图2：半胱氨酸标准曲线

图3：去细胞瓣引入巯基后巯基含量测定结果

图4：PEG交联前后单位质量瓣膜巯基含量的比较

图5：各组瓣膜力学性能的比较

图6：RGD肽和VEGF累计释放曲线

图7：PEG交联去细胞瓣多信号复合支架细胞黏附的比较

图8：PEG交联多信号复合支架材料制备流程图。

具体实施方式

通过以下实施例将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。

实施例1：猪去细胞主动脉瓣的制备

于当地屠宰场无菌条件下取新鲜完整家猪心脏，4℃生理盐水保存，30分钟内回实验室，裁剪猪主动脉瓣。瓣叶予冷PBS冲洗。4℃含抗生素高糖DMEM(青霉素、链霉素各200u/ml，二性霉素B10％(w/v))溶液浸泡12h，PBS冲洗5分钟，重复3次；37℃含0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA的PBS溶液振荡12h，PBS冲洗5分钟，重复3次；4℃1％TritonX-100溶液振荡48h，PBS冲洗5分钟，重复3次；37℃含20mg/L RNase和200mg/L DNase的PBS溶液振荡1h，PBS冲洗5分钟，重复3次，得到猪去细胞主动脉瓣，HE染色和扫面电镜证实，细胞去除完整，细胞外基质保存完好(图1)。将制备好的去细胞瓣于PBS中-80℃保存备用。

实施例2：去细胞瓣中引入巯基：

取去细胞瓣(干重2mg±0.1mg)20片，分为4组，分别浸泡于pH7.5磷酸盐缓冲液5ml(含1mM EDTA)中，依次加入N-丁二酸-S-乙酰基巯基乙二醇酯(SATA)2.5mg、5mg、25mg和50mg，25℃条件下，持续振荡，反应2h。PBS洗脱终止反应。加入5ml 0.5M盐酸羟胺水解液，25℃条件下反应2h，以对乙酰化巯基去保护。PBS冲洗5分钟，重复3次，除去残余盐酸羟胺。

实施例3：引入巯基后去细胞瓣巯基含量的检测

1)试剂的配制

配制Tris-HCl缓冲液(0.25M)：准确称取Tris碱(MW121.14)3.0285g加入双蒸水至90ml，用盐酸调节pH＝8.3，双蒸水定容至100ml。

配制半胱氨酸标准溶液(10mM)：准确称取L-半胱氨酸(MW121.16)0.1212g，加入甲酸1ml，双蒸水定容至100ml。

配制Na₂HPO₄溶液(50mM)：称取Na₂HPO₄·12H₂O(MW358.14)1.7907g，双蒸水定容至100ml。

配制盐酸羟胺(0.5M)溶液：称取盐酸羟胺(MW69.49)3.4745g，加双蒸水定容至100ml。

配制DTNB(Ellman’s试剂)标准溶液(10mM)：准确称取DTNB(MW396.35)0.39635g，加入已配制好的50mM Na₂HPO₄溶液100ml，存放于棕色瓶中，于暗处低温保存备用。

2)标准曲线的制作

25℃条件下，取上述半胱氨酸标准液0μl、25μl、50μl、75μl、100μl、125μl 分别加入到25℃恒温预热的DTNB标准溶液，用Tris-HCl缓冲液稀释定容至10mL，摇匀，静止15min，立即于波长412nm处测定吸光度值(A)。以半胱氨酸浓度为横坐标X，412nm吸光度值为纵坐标Y制作标准曲线，得线性方程(图2)：Y＝6.52X+0.0298，R²＝0.9999。

3)去细胞瓣中引入巯基含量测定

取已引入巯基的去细胞瓣，加入DTNB(Ellman’s试剂)标准溶液3ml，在25℃条件下振荡反应15min，立即于波长412nm处测定吸光度值。根据测得的去细胞瓣吸光度值Y，代入上述标准曲线方程，算出对应的巯基浓度X，并按照下列公式计算单位质量的瓣膜巯基含量。

N_SH＝(X*V)/M

其中，N表示单位质量瓣膜所含巯基的物质的量，V表示反应体积，M表示瓣膜质量。

测定结果(图3)显示，利用SATA试剂引入巯基，稳定可靠，巯基引入率高，其适宜浓度为(1-5)mg/ml。

实施例4：双(3，5-二丙烯酰氧甲基)苯基聚乙二醇(其中n＝75，其分子量约为3400)交联去细胞瓣多信号复合支架材料的制备

第一步：将0.58mg本实验室前期合成的双(3，5-二丙烯酰氧甲基)苯基聚乙二醇(含丙烯酰基官能团6.0×10^-7mol)溶解于25ml pH7.4的0.1M磷酸盐缓冲溶液(PBS)中。

第二步：加入市购的5.4μg含巯基约6.0×10^-8mol的RGDSP肽(Ac-GCGYGRGDSPG)(上海吉尔生化科技公司提供)和51μg含巯基约1.35×10^-9mol的rhVEGF₁₆₅(sigma公司提供)，室温反应4h。

第三步：将反应产物通过凝胶过滤脱盐，将脱盐后收集的混合溶液，进行超滤浓缩，去除未参加反应的PEG和小分子杂质，浓缩后的溶液上样于阴离子交换树脂，梯度浓度洗脱液洗脱，依次收集第一、第二、第三个峰，得到RGD和hVEGF₁₆₅与枝化状PEG的反应产物共64μg，在4℃条件下于pH7.4的50mM PBS中储存备用。

第四步：将4.6mg含巯基约1.03×10^-6mol的猪去细胞主动脉瓣浸泡于pH7.4的0.1M PBS 3ml中，加入上述RGD和hVEGF₁₆₅与枝化状PEG的反应产物50μg，室温下反应4h，PBS漂洗三次，得到枝化状PEG交联去细胞瓣多信号复合支架。

实施例5：双(3，5-二丙烯酰氧甲基)苯基聚乙二醇与去细胞瓣交联效率的检测

取实施例4制备的多信号复合支架材料(干重2mg，n＝5)，按照前述方法测定巯基吸光度值，并计算巯基含量及均值(图4)。以按照实施例3引入巯基后的瓣膜巯基含量均值为参考，并按照下列公式计算交联率：

交联率＝(N₁-N₂)/N₁*100％.

其中，N₁为交联前单位质量瓣膜的巯基的物质的量，N₂为交联后单位质量瓣膜的巯基的物质的量。

计算结果显示双(3，5-二丙烯酰氧甲基)苯基聚乙二醇交联去细胞瓣的交联率高达92.2％-93.1％左右。

实施例6：PEG交联去细胞瓣多信号复合支架的力学性能测试

取PEG交联后的去细胞瓣(n＝6)，沿其长轴方向剪成1.5×0.5cm²矩形条块，将其夹持在自制的两片细砂纸做成的框架中。将带瓣膜条块的砂纸框架两边夹于力学测试仪(Instron5848微观力学实验系统)，夹持间距为1cm。剪断两边的砂纸，夹子以5mm/min将瓣膜向两边拉伸，通过换能器记录瓣膜的应力-应变曲线。再通过图形计算最大负荷、最大应力、最大应变和弹性模量。取正常猪瓣膜及去细胞瓣为对照。实验结果见表1。

表1各组瓣膜力学性能的比较

结果显示，PEG交联去细胞瓣构成的复合支架与单纯去细胞瓣相比，其力学性能得到显著改善，与猪正常瓣膜相比，无显著性差别(p＝0.032)(图5)。

实施例7：VEGF或RGD肽累计释放的检测

按照实施例4制备PEG交联去细胞瓣多信号复合支架。取PEG交联去细胞瓣(n＝6)2mg置于3ml含基质金属蛋白酶1(MMP-1)0.01u/ml的PBS溶液。37℃持续振荡。取第1d后溶液1ml于EP管，-20℃保存。同时加入1ml含基质金属蛋白酶1(MMP-1)0.01u/ml的PBS溶液，保持总体积3ml。于2-15d按照上法分别取样1ml，-20℃保存。使用rhVEGF或RGD肽ELISA试剂盒，测定各样品中VEGF或RGD肽含量，并绘制VEGF或RGD肽累计释放曲线(图6)。

结果显示，PEG交联后的去细胞瓣，生物活性分子累计释放明显减慢，并持续15天以上。

实施例8：PEG交联去细胞瓣多信号复合支架的促细胞黏附功能检测

取上述实施例4制备的PEG交联去细胞瓣多信号复合支架0.5cm*0.5cm，置入6孔细胞培养板。加入150ul含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，并种植传代至第3-4代的内皮祖细胞于多信号复合支架上，细胞密度为2*10⁵/每孔。4h后，每孔加入上述高糖DMEM培养基1.5ml，37℃，5％CO₂恒温培养箱，分别于24h、48h和72h取出支架材料，进行免疫荧光染色，并应用激光扫描共聚焦显微镜进行荧光定量图像分析。根据荧光强度推算活细胞数目(图7)。以单纯去细胞瓣为对照组。

结果显示，PEG交联去细胞瓣多信号复合支架的促细胞黏附能力较单纯去细胞瓣组相比，有显著的增强。

Claims

1.一种聚乙二醇交联去细胞瓣多信号复合支架材料，它是以枝化状PEG——双(3，5-二羟甲基)苯基聚乙二醇为基础，将丙烯酰基引入到其羟基末端，制得枝化状PEG——双(3，5-二丙烯酰氧甲基)苯基聚乙二醇，再将生物信号RGD肽和rhVEGF₁₆₅连接到该双(3，5-二丙烯酰氧甲基)上后将其与猪去细胞主动脉瓣交联，从而将生物信号RGD肽和rhVEGF₁₆₅引入到去细胞瓣支架上而制得的枝化状PEG交联去细胞瓣多信号复合支架材料。

2.一种枝化状聚乙二醇交联去细胞瓣多信号复合支架材料的制备方法，其特征是将枝化状聚乙二醇——双(3，5-二羟甲基)苯基聚乙二醇——功能化修饰以后，交联猪去细胞主动脉瓣，增强胶原交联强度，改善其力学性能，同时导入生物信号RGD肽和rhVEGF₁₆₅，吸附体循环血中内皮祖细胞(EPCs)，促进细胞生长，改善支架生物学性能，获得一种枝化状PEG交联去细胞瓣多信号复合支架材料；它依次包括以下步骤：A.猪去细胞瓣制备、巯基引入和巯基含量测定；B.双(3，5-二羟甲基)苯基聚乙二醇的功能化修饰；C.修饰后的枝化状聚乙二醇与引入巯基后的去细胞瓣交联，得到多信号复合支架材料。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所采用的支架材料为猪主动脉瓣，经0.05％胰酶消化12h和1％TritonX-100处理48h后，得到主要含胶原蛋白的去细胞瓣膜，将该去细胞瓣膜与N-丁二酸-S-乙酰基巯基乙二醇酯(SATA)在25～37℃、pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中反应2h，中止反应后，加入2M盐酸羟胺水解液反应2h，对乙酰化巯基去保护，得到含有巯基的去细胞瓣膜，其中，SATA的浓度为1-5mg/ml。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，检测去细胞瓣巯基含量是通过5，5-二硫代双-2-硝基苯甲酸(DTNB Ellman’s试剂)来检测，该试剂易溶于水，在巯基化合物的存在下，无色的DTNB将被转变成黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸，在412nm处具有最大吸收。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，枝化状PEG的功能化修饰，是将双(3，5-二羟甲基)苯基聚乙二醇溶于无水二氯甲烷中，在氩气保护下加入三乙胺，再缓慢滴加丙烯酰氯，室温条件下，搅拌过夜，将反应后的溶液用饱和氯化钠水溶液洗涤三次，无水硫酸镁干燥，减压浓缩，冰乙醚重结晶，过滤，将过滤后的固体物质再用冰乙醚洗涤三次，真空干燥，得到新的枝化状PEG——双(3，5-二丙烯酰氧甲基)苯基聚乙二醇。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，枝化状PEG的功能化修饰，是将合成的双(3，5-二丙烯酰氧甲基)苯基聚乙二醇溶解于25～37℃、pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中，加入市购的RGDSP肽(Ac-GCGYGRGDSPG)和rhVEGF₁₆₅，室温反应4h，得到携带有RGDSP肽和rhVEGF₁₆₅的双(3，5-二丙烯酰氧甲基)苯基聚乙二醇，并置于PBS中存储备用，其中，双(3，5-二丙烯酰氧甲基)苯基聚乙二醇活性官能团与RGD肽和rhVEGF₁₆₅的半胱氨酸巯基的物质的量的比例为10～50：1。

7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，枝化状PEG交联去细胞瓣多信号复合支架材料的制备，是将已引入巯基的猪去细胞主动脉瓣加入到携带有RGD肽和rhVEGF₁₆₅分子的双(3，5-二丙烯酰氧甲基)苯基聚乙二醇溶液中，在25～37℃、pH7.4的条件下，反应2h，得到PEG交联去细胞瓣多信号复合支架材料，其中，双(3，5-二丙烯酰氧甲基)苯基聚乙二醇的活性官能团与去细胞瓣所含巯基的物质的量之比为1：10～50。