CN101318032B - 小口径组织工程学人工血管及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小口径组织工程学人工血管，其是以离体的脱细胞脐血管为支架，该支架空隙部分填补有平滑肌细胞和成纤维细胞；所述离体的脱细胞脐血管内壁表面植有内皮祖细胞或间充质干细胞。本发明具有良好的生物相容性，并具有引导、支持和维持细胞功能的能力，减少了种间病毒的相互感染，本发明制成的人工血管克服由于自体血管移植物的提供受限问题以及合成的移植物因血栓形成和/或内膜增生引起的失败问题，提高了小口径人工血管植入人体内的长期通畅率，使患者避免了二次手术。本发明人工血管原材料易得，制备方法简便，成本低廉，易于被普通患者接受，有广阔的社会效益和经济效益。

Description

小口径组织工程学人工血管及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种人工血管，具体地说是一种小口径组织工程学人工血管及其制备方法，属于组织工程学领域。 

背景技术

冠状动脉旁路移植术(简称：冠脉搭桥术)的桥血管在大部分患者(手术总数的95％以上)使用自体静脉桥，其15年静脉桥的通畅率约60％左右，在接受第一次手术后的患者，约10％～40％患者需要接受二次和多次搭桥手术，此时已无自体血管可用。当前，临床所有小口径人工血管(直径≤5mm)，因与人自体血管作吻合时的非生理性接触面，人工血管与自体血管顺应性不匹配，导致人工血管植入后动物实验和临床实验结果非常不理想，故目前在冠心外科临床无人工血管可用。因此，上述大部分患者一定会面临缺乏搭桥用自体血管材料的问题。同时，在临床上也会常有首次需要搭桥的患者，由于血管条件不良出现缺乏搭桥用材料的局面。另外，周围血管疾病患者，先心病做大动脉间的桥接(B-T Shunt)，同样需要小口径人工血管，也会面临缺乏血管材料的问题。因此，研究开发出一种可靠的小口径人工血管材料以解决上述问题，可以应用于冠心病外科治疗，婴幼儿复杂先天性心脏病的治疗和外周血管疾病的治疗，可以挽救许多患者的生命，提高患者的生存质量，延长患者寿命，有很大的社会效益和经济效益。 

目前最有希望在人工血管制备方面有突破的是组织工程学人工血管。 

组织工程学方法的关键点之一是选择人工血管的三维支架(scalfold)。理想的组织工程人工血管支架应有良好的生物相容性，能复制自体血管的机械特征，并具有引导、支持和维持细胞功能的能力。目前常用支架材料可分为可降解支架和不可降解支架。可降解支架可分3类：1、合成材料，主要有聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、PLA和PGA的共聚物(PLGA)等。它们仍存在一些问题：(1)亲水 性不足，细胞粘附力较弱；(2)会引起无菌性炎症；(3)机械强度不足；(4)血管生成因子等生物活性物质容易滤出；(5)价格较贵，合成有一定的可能，来源不易。2、天然材料，包括大分子生物材料，脱细胞纤维组织结构，如脱细胞心包基质、脱细胞小肠粘膜下层基质及脱细胞真皮基质等。这些物质提取困难，或价格贵，不适合大规模的生产和应用。3、合成材料和天然材料的复合物。 

非降解的基质材料主要包括：1、膨体聚四氟乙烯(ePTFE)，目前应用于远端肢体旁路移植，但来源不易，价格贵，不适合在中国大规模使用。2、Dacron材料，使用时常以明胶甚至血液预涂腔内膜以防止渗血，从而限制了其在小口径组织工程血管的进一步研究和应用。3、聚乙烯。对水解不敏感而对氧化敏感，无降解性。4、聚亚安酯(PU)：顺应性较好，被用于模拟血管材料。 

但上述人工血管所需的非血管来源材料，或来源不易，或制作复杂，价格贵，因此不适合在我国的大规模应用。而血管来源的支架，具有提供细胞生长基质的天然优势。 

内皮种子细胞的来源有多种。1、内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cell，EPC)，是目前最有前途的种子细胞。EPC可以从骨髓血、外周血和脐带血中分离并可发育成内皮细胞培养物，可作为血管移植物种植的细胞来源和基因治疗。2、自体动静脉，来源受到限制。3、微血管内皮细胞(MVEC)，是指来源于网膜血管内皮细胞或脂肪。但需要费用昂贵的percoll液进行分离和较长时间的低温高速离心，操作复杂。且使用脂肪抽吸还存在EC被污染的可能。4、间皮细胞(MC)，在狗的体内实验中却没有显示出任何用MC覆盖的移植物具有抗血栓形成的或纤溶酶原的特性。同种异体内皮细胞植入人体后有强烈的免疫排斥反应，因此在人工血管内植入EPC细胞是解决免疫的重要手段。 

使用上述材料，研制小口径组织工程人工血管，经典的制作方式大致有三种模式。第一种是在生物可降解的多聚物血管支架上植入细胞，制成人工血管。血管支架主要是PGA，PLGA。据我们的研究，经过一定时间的降解后，PLGA强度大 幅下降，且目前国内使用PGA(PLGA)制作高强度的薄壁人工血管支架在工艺上相差甚远。第二种模式是基于胶原模式。人工血管由外膜的成纤维细胞层，中层的平滑肌细胞层和内表面的内皮细胞层组成。但其外需用Dacron袖套以增加对生理压力耐受能力。第三种是自我组装模式。细胞先在血管片上培育以形成一血管片和细胞外基质，然后包裹在一有渗透性的固体棒上，最后植入内皮细胞。他们都具有足够的机械强度。但由于种子细胞的选择不合适，操作复杂，远期效果不理想而没有进一步研究下去。 

利用活细胞和组织去构造小口径血管移植物(即组织工程血管)可以提供内皮化的优势以及生物相容性的好处。克服由于自体血管移植物的提供受限以及合成的移植物因血栓形成和/或内膜增生引起的失败。 

发明内容

本发明的目的在于解决和弥补现有技术的缺陷，提出一种小口径抗张力强度大、应用范围广的组织工程学人工血管。 

本发明的另一目的在于，提供上述小口径组织工程学人工血管的制备方法。 

本发明的发明思路为：研制理想的组织工程人工血管的另一个关键点是种子细胞的选择。血管移植物随访研究表明，在血管移植物内种植内皮细胞，其通畅率远较而非内皮细胞覆盖的人工血管为高。因此，小口径人工血管必须有有效的足够多的内皮细胞(EC)作衬里，其作用于血液和移植物表面。平滑肌细胞和成纤维细胞可为内皮细胞的粘附提供一个优秀的平台。内皮祖细胞(EndothelialProgenitor Cell，EPC)，是目前最有前途的种子细胞。EPC可以从骨髓血、外周血和脐带血中分离并可发育成内皮细胞培养物，可作为血管移植物种植的细胞来源和基因治疗。 

发明人经长期反复实验得出采用的脱细胞的脐血管作为新的血管支架，除具有良好的生物相容性，能复制自体血管的机械特征，并具有引导、支持和维持细胞功能的能力，而且来源容易，管径和冠状动脉内径相仿，其结构和形态与自然 血管相似，其同种移植物的来源，减少了种间病毒的相互感染，更易于被内皮细胞粘附和以后的再塑(remodeling)，同时也不会分解或降解为潜在的可能会对身体有害的物质。只要处理得当，是最理想的人工血管支架之一。 

本发明实现发明目的的方案为以两种脱细胞试剂联合脱掉脐带动脉或静脉细胞，然后以脱细胞的脐动脉或静脉为支架，将成纤维细胞、平滑肌细胞种植填补于血管内腔空隙，再于此血管支架内表面种植从离体骨髓血中提取并培养、扩增、提纯的内皮祖细胞，最终获得本发明所述的小口径的组织工程学人工血管。 

为实现本发明的发明目的，本发明采用如下具体技术方案： 

一种小口径组织工程学人工血管，其是以离体的脱细胞脐血管为支架，该支架空隙部分填补有平滑肌细胞和成纤维细胞；所述离体的脱细胞脐血管内壁表面植有内皮祖细胞。 

上述的一种小口径组织工程学人工血管，其中，所述的脱细胞脐血管为脐静脉或脐动脉。 

制备上述小口径组织工程学人工血管的方法，其具体制备步骤为： 

(1)脱细胞脐血管支架的制备： 

选择离体脐带备用；从该脐带上截取15cm长的脐血管置于0～4℃肝素生理盐水中保存备用；然后将外径为4～6mm的玻璃棒插入该脐血管管腔内；修剪该血管外膜，使所述外膜厚度为650μm～800μm；将该脐血管置于0.25％胰蛋白酶中4℃保存24小时，PBS液冲洗3次，然后置于1％SDS液中24小时；PBS液冲洗3次后置于青链霉素双抗中12小时；最后再使用PBS冲洗3次备用； 

(2)平滑肌细胞的制备： 

取离体无菌脐血管于生理盐水中漂洗至血污清除干净为止；后用D-Hanks液冲洗清除血细胞；游离出脐动脉：将一根直径为2～3mm的玻璃棒插入脐动脉内腔，清除该游离出的脐动脉外周脂肪组织；然后用0.25％胰蛋白酶溶液消化该 脐动脉血管壁内皮细胞后，剪开血管壁，采用贴壁法接种平滑肌细胞于培养皿中；当原代细胞生长成致密单层细胞时，倾去瓶中培养液；加入0.25％胰蛋白酶在室温作用3分钟，在倒置显微镜下观察见细胞收缩，边缘清楚时停止消化；倒去消化液加入含10％小牛血清培养液，用吸管吹打细胞制成细胞悬液；取二分之一细胞悬液接种到新的培养瓶中每3天换液1次，当细胞铺满瓶壁时用同法进行传代；培养至第3～4代，进行HE染色，免疫组织化学检查和细胞计数，备用； 

(3)成纤维细胞的制备： 

取离体真皮组织，用经HBSS平衡的Hanks冲洗并切碎。然后在含0.25％胰蛋白酶的RPMR 1640完全培养基中培养1～12小时；离心，细胞种植培养；培养过程中首先贴壁的细胞为成纤维细胞，选择具有典型的成纤维细胞形态的细胞，加入含10％FBS和100U/mL青霉素、链霉素的RPMR 1640的完全培养液中，放入含5％CO₂、37℃孵箱中培养；12小时后更换培养液，以后每3～4天更换1次完全培养液，当细胞长成梭形，融合至约85％，将细胞用胰蛋白酶消化传代，备用； 

(4)内皮祖细胞的制备： 

取离体骨髓血0.5～1.5毫升；采用Ficoll密度梯度离心法从该骨髓血中提取单核细胞；使用内皮细胞培养液(endothelial basal medium)作为培养液，加入所提单核细胞，并加入20％的小牛血清；细胞以5×10⁵～7×10⁵cell/mm²的密度种于35毫米fibronectin包被的培养皿中，经过3天的培养，用PBS将未贴壁的细胞清洗2次并弃去；之后每3天还培养液一次；共培养2-3周，备用； 

(5)平滑肌细胞和成纤维细胞的植入： 

在37℃、5％的二氧化碳培养箱中，将步骤(1)所获得的脱细胞血管支架固定在一个密闭的博动回路中；取步骤(2)和步骤(3)制备的对数生长期的平滑肌细胞和成纤维细胞，种植于脱细胞血管支架内，置于含20％小牛血清M199培养液的培养箱的博动回路中，于37℃、5％的二氧化碳培养箱中培养，2～3天更换培养液1次；培养2～4周后，用γ射线照射嵌入平滑肌细胞和成纤维细胞 的脐血管，一分钟1000rads，共3分钟，总照射剂量3000rads；取材一部份进行病理，免疫组织化学和电镜检查，备用； 

(6)内皮祖细胞的植入： 

将步骤(4)制备的含内皮组细胞的培养液置入步骤(5)的博动回路中，并置于含20％小牛血清的M199培养液的培养皿中，37℃、5％的二氧化碳培养箱中培养，2～3天换液一次；每次换液时均向培养液中加入肝素和VEGF，使培养液中肝素浓度为1‰，VEGF浓度为10ng/ml；2～4周后取材一部分，进行病理，放射免疫和电镜检查；倒置显微镜显示内皮祖细胞覆盖于血管内壁表面形成完整细胞层。 

上述的一种小口径组织工程学人工血管的制备方法，其中，步骤(1)所述的脐血管为脐动脉或脐静脉。 

上述的小口径组织工程学人工血管的制备方法，其中，步骤(1)所述的离体脐带选择离体10分钟内置入0～4℃肝素生理盐水中保存24小时以内最佳。 

本发明小口径组织工程学人工血管的用途：可以作为冠心病搭桥的桥血管使用，也可作为婴幼儿复杂先天性心脏病搭桥使用和外周血管疾病的应用。 

本发明小口径人工血管的平均管径为：离体血管支架若为脐动脉则管径为3～5mm，离体血管支架若为脐静脉则管径为4～6mm。 

本发明人工血管的原材料来源容易，本领域技术人员可以经过购买或者自行按照标准采集得到。 

本发明的优点与效益：本发明使用离体脱细胞脐血管作为人工血管支架，具有良好的生物相容性能复制自体血管的机械特征，并具有引导、支持和维持细胞功能的能力，而且来源容易，管径和冠状动脉内径相仿，其结构和形态与自然血管相似，同种移植物的来源，减少了种间病毒相互感染，更易被内皮细胞粘附和以后再塑(remodeling)，同时也不会分解或降解为潜在可能会对身体有害物质。同种异体内皮细胞植入人体后有强烈免疫排斥反应，因此在人工血管内植入内皮 祖细胞很好的解决了该问题。现有小口径人工血管尚不能应用于临床，主要是因为血管移植后的血栓形成和再狭窄问题，本发明制成的人工血管克服由于自体血管移植物的提供受限问题以及合成的移植物因血栓形成和/或内膜增生引起的失败问题，克服目前小口径人工血管与人自体血管作吻合时的非生理性接触面所带来的一系列问题，克服人工血管与自体血管顺应性不匹配，最终提高了小口径人工血管植入人体内的长期通畅率，使患者避免了二次手术。本发明人工血管原材料易得，制备方法简便，成本低廉，易于被普通患者接受，有广阔的社会效益和经济效益。 

下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本发明可以实施的保护范围，因此凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于对本发明的侵犯。 

附图说明

图1为本发明小口径组织工程人工血管结构示意图； 

图2为培养的内皮祖细胞的显微镜下照片。 

具体实施方式

以下实施例所用材料和试剂来源： 

1、离体脐带：选用标准：孕周37～40周的脐带，离体后24小时内应用。 

2、SDS液：厂家浓度北京奇华盛生物技术发展中心粉剂应用时配制成1％浓度。 

3、青链霉素双抗：厂家浓度杭州浩仁生物科技有限公司100u/ml 

4、无菌脐血管：来源，取材来源于北京安贞医院孕龄37～40周产妇，顺产或剖腹产后立即将采集的脐带置于无菌肝素生理盐水中，然后在无菌条件下手工分离，血管壁厚度控制在650～800微米。 

本发明所用立体无菌脐带只要符合上述采集标准即应用于本发明，可无任 何随机性。 

5、D-Hanks液：厂家，浓度Hanks液是常见的平衡盐溶液(BSS)之一。D-Hanks液则是无钙镁离子的Hanks液。D-Hanks液是实验室常用平衡盐溶液，配制NaCl 8.0g/l、NaHCO₃0.35g/l、Na₂HPO₄·12H₂O 0.132g/l、D-葡萄糖1.0g/l、酚红1ml。以此加入上述试剂于800ml蒸馏水中，滴定至1000ml即可。 

6、离体真皮组织来源：具体取材标准来源于北京安贞医院健康正常自愿行包皮环切术者术后包皮组织；手术后30分钟内剪成1mm³左右的小块备用。 

8、含胰蛋白酶(trypsin)的RPMR 1640的完全培养基：北京众磊生物科技发展有限公司 

9、含10％FBS和100U/mL青霉素、链霉素的RPMR 1640：北京众磊生物科技发展有限公司 

10、骨髓血：来源，来源于北京安贞医院小儿心脏科手术中采集的6岁以下幼儿，具体采集标准为手术矫正当日由术者无菌操作由胸骨柄采集骨髓，每份0.5～1.5毫升。 

11、内皮细胞培养液endothelial basal medium(EBM-2Mv)：瑞士Lonza公司 

12、fibronectin：纤维粘连蛋白，大连泛邦化工技术开发有限公司 

13、M199培养液：北京塞驰生物科技有限公司，常用培养液，主要含多种氨基酸和维生素。购买产品以Invitrogen的M199培养基为原料配制，为液体，含Earle’s混合盐；每升含谷氨酰胺0.1g，碳酸氢钠2.2g。 

14、肝素：医用普通肝素钠注射液2ml：12500单位 

15、VEGF(血管内皮细胞生长因子)：厂家瑞士Lonza公司 

16、搏动回路：应用电子蠕动泵实现的搏动培养流动回路，电子蠕动泵厂家：(中美合资)保定兰格恒流泵有限公司 型号：BT100-1/YZ1515X 

17、二氧化碳培养箱：厂家，型号厂家Jouan型号IGO-150 

如图1所示，本实施例制备的一种小口径组织工程学人工血管的具体结构为：其是以离体的脱细胞脐血管为支架1，该支架1空隙部分填补有混合的平滑肌细胞和成纤维细胞3；所述离体的脱细胞血管内壁表面植有内皮祖细胞2。 

上述的离体脱细胞脐血管在本实施例中为脐静脉。脐动脉和脐静脉的制备方法一致，在此不一一赘述。 

制备本实施例所述的小口径组织工程学人工血管具体制备步骤为： 

(1)脱细胞脐静脉支架的制备： 

选择离体10分钟内置入0～4℃肝素生理盐水中保存24小时以内的离体脐带备用；然后从该脐带上截取15cm长的脐静脉；将外径为4～6mm的玻璃棒插入该脐静脉管腔内；修剪该脐静脉外膜，使所述外膜厚度为750μm左右；将该脐静脉置于0.25％胰蛋白酶中4℃保存24小时，PBS液冲洗3次，然后置于1％SDS液中24小时；PBS液冲洗3次后置于青链霉素双抗中12小时；最后再使用PBS冲洗3次备用；最终得到长度15cm左右的脐静脉，外观呈乳白色，质地柔软，表面光滑。 

(2)平滑肌细胞的制备： 

取离体无菌脐血管于生理盐水中漂洗，多次清洗至清除血污干净为止后用D-Hanks液冲洗清除血细胞；游离脐动脉：将一根直径为2～3mm的玻璃棒插入脐动脉内腔，剪除脐带周围脐带组织，清除该脐动脉外周的脂肪组织；然后用0.25％胰蛋白酶溶液消化该脐动脉血管壁内皮细胞后，(消化时间：30分钟)剪开动脉壁，采用贴壁法接种平滑肌细胞于培养皿中；当细胞生长旺盛时即当原代细胞生长成致密单层细胞时，倾去瓶中培养液；加入0.25％胰蛋白酶在室温作用3分钟，在倒置显微镜下观察见细胞收缩，边缘清楚时停止消化；倒去消化液加入含10％小牛血清培养液，用吸管吹打细胞制成细胞悬液；取二分之一细胞悬液接种到新的培养瓶中每3天换液1次，当细胞铺满瓶壁时用同法进行传代；培养至第3～4代，进行HE染色，免疫组织化学检查和细胞计数，备用； 

标准：经检查平滑肌细胞呈现典型的峰谷状结构特征，且采用α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体表达免疫组化学染色，具体步骤为：PBS冲洗3次共5分钟，10％正常兔血清孵育10分钟，滴加单克隆抗体抗α-SMA，4℃过夜。标本用PBS冲洗，滴加生物素标记的兔抗鼠lgG二抗，室温孵育1小时。再次PBS洗，滴加卵白素-生物素-过氧化酶混合剂(ABC)，室温孵育1小时，DAB显色。电镜下见细胞浆内着色呈棕黄色。(α-SMA呈阳性表达)。 

(3)成纤维细胞的制备： 

取离体真皮组织，用经HBSS平衡的Hanks冲洗并切碎；然后在含0.25％胰蛋白酶RPMR 1640的完全培养基中培养1～12小时；离心，细胞种植培养；培养过程中首先贴壁的细胞为成纤维细胞，选择具有典型的成纤维细胞形态的细胞培养：加入含10％FBS和100U/mL青霉素、链霉素的RPMR 1640的完全培养基中，放入含5％CO₂、37℃孵箱中培养；12小时后更换培养液，以后每3～4天更换1次完全培养液，当细胞长成梭形，融合至约85％，将细胞用胰蛋白酶消化传代，备用； 

标准：明场及相差显微镜下观察可见，贴壁的成年原代成纤维细胞胞体呈梭形或三角形，有2～3个长短不一的突起，胞核椭圆形，位于胞体中间，无异常核分裂相；细胞汇合后，排列紧密，呈典型成纤维细胞形态。经酶消化法培养细胞用小鼠抗人成纤维细胞抗体的染色荧光阳性，所制备成纤维细胞纯度达99％。 

(4)内皮祖细胞的制备： 

取离体骨髓血0.5～1.5毫升；采用Ficoll密度梯度离心法从该骨髓血中提取单核细胞；使用内皮细胞培养液(endothelial basal mediumEBM-2)作为培养液，加入所提单核细胞，并加入20％的小牛血清；细胞以5×10⁵～7×10⁵cell/mm²的密度种于35毫米fibronectin包被的培养皿中，经过3天的培养，用PBS将未贴壁的细胞清洗2次并弃去；之后每3天还培养液一次；共培养2～3周，备用； 

标准：刚分离的细胞呈圆形，贴壁后呈梭型、三角形或多角形。内贴壁细胞(早期贴壁细胞)和后贴壁细胞(晚期贴壁细胞)形态不同。早期贴壁细胞胞浆较少，长梭形，细胞核显得很大细胞融合后呈现纤维细胞群落表现，即呈漩涡样和放射状。而晚期贴壁细胞以短梭型为主，间有多角形、三角形细胞。细胞克隆有呈血岛样结构出现，首次传代后仍有类似克隆出现。细胞胞浆多，细胞饱满，细胞核大。培养2～3周后细胞形态均一，主要以梭型为主，如图2所示，选取该培养2～3周的细胞备用； 

(5)平滑肌细胞和成纤维细胞的植入： 

在37℃、5％的二氧化碳培养箱中，将步骤(1)所获得的脐静脉固定在一个密闭的博动回路中；取步骤(2)和步骤(3)制备的对数生长期的平滑肌细胞和成纤维细胞至于含脱细胞血管支架的密闭的博动回路中，种植于脐静脉内；置于含20％小牛血清M199(为本领域公知培养基，该培养基含丰富的氨基酸、维生素、生长激素、核酸衍生物等)培养液的培养箱的博动回路中，于37℃、5％的二氧化碳培养箱中培养，2～3天更换培养液1次；培养2～4周后，用γ射线照射嵌入平滑肌细胞和成纤维细胞的脐血管，一分钟1000rads，共3分钟，总照射剂量3000rads；取材一部份进行病理，免疫组织化学和电镜检查，备用； 

观察标准：倒置显微镜观察平滑肌细胞和成纤维细胞与支架材料共同培养48小时后，细胞在支架表面贴附并生长。培养液在一两天内ph值下降，细胞生长旺盛。细胞开始生长后沿支架表面爬行，并向基底层浸润。待2～4周平滑肌细胞和成纤维细胞在细胞内壁覆盖完全后，射线照射完后再种植内皮祖细胞。 

(6)内皮祖细胞的植入： 

将步骤(4)制备的含内皮组细胞的培养液置入步骤(5)的博动回路中，并置于含20％小牛血清的M199培养液的培养皿中，37℃、5％的二氧化碳培养箱中培养，2～3天换液一次；每次换液时均向培养液中加入肝素和VEGF，使培养液中肝素浓度为1‰，VEGF浓度为10ng/ml；2～4周后取材一部分，进行病理， 放射免疫和电镜检查； 

标准：倒置显微镜显示内皮祖细胞覆盖于血管内壁表面形成完整细胞层即最终制备完成了本发明小口径组织工程学人工血管。 

本发明所述制备方法每步骤均有统一标准，只要按照标准选择制备材料均可完成本发明所述的小口径组织工程学人工血管，不存在任何随机性。 

实施例2 小口径组织工程学人工血管生物学检测——抗张力强度的实验 

取实施例1制备的小口径组织工程学人工血管置于实验台上，在250mmHg压力24小时后，取材一部分，抗张力实验显示血管爆破压＞300毫米汞柱。 

从上述抗张力强度实验可以看出，本发明人工血管的抗张力性能很好，适合人体使用。 

实施例3 本发明小口径组织工程学人工血管本发明动物学实验 

选材和方法：大鼠雌雄不限，体重在250克左右，即将大鼠腹主动脉切除1cm左右，将人工血管以端—端吻合方式，置于切除的腹主动脉处，以6-Oprolene线连续缝合，完成动物实验。 

取实施例1制备的小口径组织工程人工血管和现有GORE-TEX人工血管，长度均为3～5mm，分别植入不同SD大鼠的腹主动脉，实验方法见上述；术后每隔1天、2天、4天、8天、16天、30天观察的人工血管及人工血管与冠状动脉吻合口情况。观察结果：本发明小口径组织工程人工血管观察期间始终保持通畅；现有GORE-TEX人工血管植入后不到30天即有堵塞现象，说明本发明小口径组织工程学人工血管与现有小口径GORE-TEX人工血管比较克服了非生理性接触面所带来的一系列问题，克服人工血管与自体血管顺应性不匹配的问题，最终提高了小口径人工血管植入人体内的长期通畅率，不易形成血栓。 

Claims (4)

1.一种小口径组织工程学人工血管的制备方法，其特征在于，其是由下列步骤制备而成：

(1)脱细胞脐血管支架的制备：

选择离体脐带备用；从该脐带上截取15cm长的脐血管置于0～4℃肝素生理盐水中保存备用；然后将外径为4～6mm的玻璃棒插入该脐血管管腔内；修剪该血管外膜，使所述外膜厚度为650μm～800μm；将该脐血管置于0.25％胰蛋白酶中4℃保存24小时，PBS液冲洗3次，然后置于1％SDS液中24小时；PBS液冲洗3次后置于青链霉素双抗中12小时；最后再使用PBS冲洗3次备用；

(2)平滑肌细胞的制备：

取离体无菌脐血管于生理盐水中漂洗至血污清除干净为止；后用D-Hanks液冲洗清除血细胞；游离出脐动脉：将一根直径为2～3mm的玻璃棒插入脐动脉内腔，清除该游离出的脐动脉外周脂肪组织；然后用0.25％胰蛋白酶溶液消化该脐动脉血管壁内皮细胞后，剪开血管壁，采用贴壁法接种平滑肌细胞于培养皿中；当原代细胞生长成致密单层细胞时，倾去瓶中培养液；加入0.25％胰蛋白酶在室温作用3分钟，在倒置显微镜下观察见细胞收缩，边缘清楚时停止消化；倒去消化液加入含10％小牛血清培养液，用吸管吹打细胞制成细胞悬液；取二分之一细胞悬液接种到新的培养瓶中每3天换液1次，当细胞铺满瓶壁时用同法进行传代；培养至第3～4代，进行HE染色，免疫组织化学检查和细胞计数，备用；

(3)成纤维细胞的制备：

取离体真皮组织，用经HBSS平衡的Hanks冲洗并切碎；然后在含0.25％胰蛋白酶的RPMR 1640完全培养基中培养1～12小时；离心，细胞种植培养；培养过程中首先贴壁的细胞为成纤维细胞，选择具有典型的成纤维细胞形态的细胞，加入含10％FBS和100U/mL青霉素、链霉素的RPMR 1640的完全培养液中，放入含5％CO₂、37℃孵箱中培养；12小时后更换培养液，以后每3～4天更换1次完全培养液，当细胞长成梭形，融合至85％，将细胞用胰蛋白酶消化传代，备用；

(4)内皮祖细胞或间充质干细胞的制备：

取离体骨髓血0.5～1.5毫升；采用Ficoll密度梯度离心法从该骨髓血中提取单核细胞；使用内皮细胞培养液作为培养液，加入所提单核细胞，并加入20％的小牛血清；细胞以5×10⁵～7×10⁵cell/mm²的密度种于35毫米fibronectin包被的培养皿中，经过3天的培养，用PBS将未贴壁的细胞清洗2次并弃去；之后每3天还培养液一次；共培养2～3周，备用；

(5)平滑肌细胞和成纤维细胞的植入：

在37℃、5％的二氧化碳培养箱中，将步骤(1)所获得的脱细胞血管支架固定在一个密闭的博动回路中；取步骤(2)和步骤(3)制备的对数生长期的平滑肌细胞和成纤维细胞至于含脱细胞血管支架的密闭的博动回路中，种植于脱细胞血管支架内；置于含20％小牛血清M199培养液的培养箱的博动回路中，于37℃、5％的二氧化碳培养箱中培养，2～3天更换培养液1次；培养2～4周后，用γ射线照射嵌入平滑肌细胞和成纤维细胞的脐血管，一分钟1000rads，共3分钟，总照射剂量3000rads；取材一部份进行病理，免疫组织化学和电镜检查，备用；

(6)内皮祖细胞的植入：

将步骤(4)制备的含内皮组细胞的培养液置入步骤(5)的博动回路中，并置于含20％小牛血清的M199培养液的培养皿中，37℃、5％的二氧化碳培养箱中培养，2～3天换液一次；每次换液时均向培养液中加入肝素和VEGF，使培养液中肝素浓度为1‰，VEGF浓度为10ng/ml；2～4周后取材一部分，进行病理，放射免疫和电镜检查；倒置显微镜显示内皮祖细胞覆盖于血管内壁表面形成完整细胞层。

2.根据权利要求1所述的一种小口径组织工程学人工血管的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的脐血管为脐动脉或脐静脉。

3.根据权利要求2所述的一种小口径组织工程学人工血管的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的脐血管为脐静脉。

4.根据权利要求1所述的一种小口径组织工程学人工血管的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的离体脐带为离体10分钟内置入0～4℃肝素生理盐水中保存24小时以内的。

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