CN105670990B - 一种用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料的制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学工程技术领域，具体涉及一种用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料的制备方法及其应用。本发明的制备方法为：将骨髓间充质干细胞移植到PLGA支架，通过控制骨髓间充质干细胞种植的时间、浓度、方式以及支架材料的大小、形状等探索出适合骨髓间充质干细胞定向分化的最适条件，观察骨髓间充质干细胞和PLGA支架的生物相容性、诱导过程细胞形态变化、胰岛β细胞诱导液对细胞增殖的影响以及诱导分化细胞特异性基因、蛋白和功能的获得。本发明在最适条件下将骨髓间充质干细胞种植在PLGA支架上，经胰岛β细胞诱导液培养后分化获取了一种具有高糖反应性、可用于治疗移植的胰岛β细胞，为治疗糖尿病带来了希望。

Description

一种用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料的 制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医学工程技术领域，具体涉及一种用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料的制备方法，及其应用。

背景技术

糖尿病是危害人类身心健康的主要慢性疾病之一，重建糖尿病患者体内的功能性胰岛细胞功能是治疗糖尿病的理想目标。恢复糖尿病患者体内胰岛功能的主要有3种途径：胰腺移植、胰岛移植及干细胞移植。由于供体来源缺乏、移植后排斥反应等不足，胰腺移植和胰岛移植方案在临床上的推广应用受到限制，使干细胞移植成为替代治疗的研究重点。骨髓间充质干细胞因具有多向分化潜能、免疫原性弱、不存在伦理争议等优势，成为干细胞移植治疗糖尿病的一种理想细胞来源。

国内外学者均采用骨髓间充质干细胞定向分化成胰岛β细胞对1型糖尿病患者进行了探索性的治疗研究，发现在治疗后患者的胰岛细胞功能有显著提高。然而，目前的干细胞定向分化仍然存在几大问题：其一是分化效率较低，无法产生足够数量的胰岛素分泌细胞；其二诱导分化形成的胰岛素分泌细胞寿命较短；其三是胰岛素分泌细胞没有高糖反应性，即血糖升高时，胰岛素分泌细胞无法反应性增加胰岛素的分泌。

随着组织工程学的发展，将干细胞与可降解的生物材料相结合，最终形成模拟胰腺功能的替代组织成为了可能。目前组织工程的研究仍处于初级阶段，还有很多问题需要解决：首先是材料的筛选，即如何筛选出适合胰腺组织构建的理想的生物材料；再次是生物材料与干细胞结合后，干细胞正常生理特性的维持。其中材料问题是首先要解决的基本问题。

目前国内外关于干细胞与生物材料相结合诱导分化形成胰岛素分泌细胞的文献报道甚少。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料及其制备方法，本发明的另一目的在于提供该组织工程材料在促进骨髓间充质干细胞定向分化胰岛细胞中的应用。

本发明的主要技术方案是在聚乳酸羟基乙酸(Poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)支架上诱导分化骨髓间充质干细胞定向分化形成胰岛β细胞，为治疗糖尿病提供合适移植来源。

本发明选用一种能够支持细胞的增殖、分化和生物合成的PLGA支架，具有生物可降解性、良好的生物相容性、可加工性等优点。PLGA是一种可降解的生物支架材料，但在体外培养条件下随着培养环境的改变和时间的推移会逐渐的萎缩和降解。而且骨髓间充质干细胞在PLGA上的生长是否良好亦受种植的时间、浓度、方式很大的影响。因此，控制骨髓间充质干细胞种植的时间、浓度、方式以及支架材料的大小、形状等，是应用PLGA支架诱导分化形成胰岛β细胞的关键。

本发明的第一方面，是提供一种用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

用NaCl颗粒制孔或浸出法制备多孔PLGA支架，具体步骤如下：

将聚乳酸羟基乙酸(Poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)，其中聚乳酸(PLA):聚羟基乙酸(PGA)体积比为85:15，溶于1,4二氧六环溶液中,配制成PLGA浓度为10％(w/v)的溶液，PLGA的分子量15KD。向上述浓度为10％w/v的聚乳酸羟基乙酸溶液中加入粒径大小为100～250μm，比例为25％-75％(w/w)的NaCl颗粒，优选粒径为150～200μm，比例为50％(w/w)的NaCl颗粒，搅拌后得到均匀悬液,倒入尺寸为8cm×8cm的培养皿。室温下干燥24小时以上(最佳为48h),冷冻干燥24小时以上(最佳为48h)。脱模后用蒸馏水滤去多孔膜中的NaCl，室温干燥24小时以上(最佳为48h),搅拌烧杯中的去离子水可加速NaCl颗粒的溶出，待NaCl颗粒完全溶出后干燥薄膜，密封保存，得到可用于骨髓间充质干细胞培养的多孔PLGA支架。

经实验证明，大鼠骨髓间充质在不同孔径和孔径率PLGA支架上向胰岛β的诱导分化，扫描电镜观察支架和细胞形态、实时定量PCR检测Ins1基因的表达，得出适应骨髓间充质干细胞培养的PLGA支架。

本发明的第二方面，是提供根据上述的制备方法制备得到的用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料。

本发明的第三方面，是提供了上述的组织工程材料在促进骨髓间充质干细胞定向分化胰岛细胞中的应用。

该应用包括：

利用上述的组织工程材料促进骨髓间充质干细胞定向分化胰岛β细胞的方法；

本发明还提供了一种利用上述的组织工程材料(即多孔PLAG支架)诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化成胰岛β细胞的方法，具体方法如下：

A.大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

全骨髓贴壁培养法分离法获取大鼠骨髓间充质干细胞。(具体方法参见SoleimaniM,Nadri S.A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells frommouse bone marrow.Nat Protoc.2009；4:102–106.)，具体步骤为：将大鼠麻醉后处死，置于75％酒精中浸泡15min。分离股骨和胫骨，PBS冲洗后，剪去干骺端，2ml医用注射器吸取培养基冲洗骨髓腔。将悬液过滤后，2000rpm/min×5min离心，沉淀吹打混匀后种于培养瓶中培养。骨髓间充质干细胞贴壁率达到70％后传代。

传至第三代(P3)后对培养获取的骨髓间充质干细胞分别进行形态学、表面标志物、功能鉴定。

B.大鼠骨髓间充质干细胞在多孔PLAG支架表面进行诱导分化

取P3代大鼠骨髓间充质干细胞，将细胞接种到上述制备方法得到的已消毒的多孔PLGA支架表面，细胞接种密度为2.5×10⁵个/24孔大小支架或4.5×10⁴个/96孔大小支架，24小时后将普通培养液(αMEM+10％FBS)换为胰岛β细胞诱导液，胰岛β细胞诱导液A(1mL培养基/24孔板或者0.1mL培养基/96孔板)诱导10天后更换胰岛β细胞诱导液B(1mL培养基/24孔板或者0.1mL培养基/96孔板)继续诱导10天，每3天换液一次；其中胰岛β细胞诱导液A：含有10％FBS，1％非必需氨基酸，30ng/ml表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)，3％B27，30ng/ml成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，3mmol/L L-谷氨酰胺(L-glutamine)的αMEM。胰岛β细胞诱导液B：含10％FBS，10ng/mlβ-动物纤维素(β-cellulin)，10ng/ml激活素A(activin A)，2％B27，10mmol/L尼克酰胺和30ng/ml成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的αMEM(以上百分比均为体积百分比)。

其中步骤B中的普通培养基为αMEM+10％FBS(完全培养基组分参见Soleimani M,Nadri S.A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells frommouse bone marrow.Nat Protoc.2009；4:102–106.)。

其中24孔板每孔加入的普通培养液的量为1mL，96孔板每孔加入的普通培养液的量为0.1mL。

通过大鼠骨髓间充质干细胞-PLGA支架冰冻切片、扫描电镜观察、RT-PCR、免疫荧光检测insulin表达检测诱导分化结果。

本发明合成了可用于干细胞培养的PLGA支架，将骨髓间充质干细胞移植到PLGA支架后，通过胰岛β细胞诱导液培养后分化获取了一种具有高糖反应性、可用于治疗移植的胰岛β细胞，为治疗糖尿病带来了希望。

附图说明

图1：不同孔径PLGA支架的制备。NaCl颗粒比例为50％，粒径范围分别为100～150μm(图1A)、150～200μm(图1B)和200～250μm(图1C)PLGA支架纵切面的扫描电镜结果。

图2：支架孔径大小对大鼠骨髓间充质干细胞向胰岛β分化的影响。粒径范围分别为100～150μm(图2A)、150～200μm(图2B)和200～250μm(图2C)PLGA支架纵切面的扫描电镜结果。

图3：骨髓间充质干细胞在粒径范围分别为100～150μm、150～200μm和200～250μmPLGA支架上定向分化后Ins1实时定量PCR结果。

图4：不同孔径率PLGA支架的制备。NaCl粒径为150～200μm，25％(图4A)、50％(图4B)、75％(图4C)NaCl颗粒比例制备的PLGA支架纵切面的扫描电镜结果。

图5：支架孔径率对大鼠骨髓间充质干细胞向胰岛β分化的影响。NaCl颗粒比例为25％(图5A)、50％(图5B)、75％(图5C)的PLGA支架纵切面的扫描电镜结果。

图6：骨髓间充质干细胞在NaCl粒径为150～200μm，25％、50％、75％NaCl颗粒比例制备的PLGA支架Ins1基因的表达最高。

图7：CCK8法检测诱导过程细胞增殖情况。将大鼠间充质干细胞以相同的细胞密度同时接种到96孔培养板和96孔大小的PLGA支架表面，细胞接种密度为1×104个细胞/孔，然后分别用胰腺β诱导液和普通培养液(10％FBS/αMEM)进行培养，于接种后1天、3天、5天、7天、14天和21天时分别进行CCK8检测，检测方法为将10μl CCK8加到100μl培养液中，37℃孵育4小时，然后在450nm处检测其吸光值，OD值反映细胞数量的多少。

图8：扫描电镜观察大鼠骨髓间充质干细胞在支架表面的粘附和生长。图A，B，C，D分别为诱导分化后第0，5，10，15天扫描电镜图像。(标尺为150μm)图9：RT-PCR法检测胰岛β细胞特异性基因的表达。RT-PCR及其产物的半定量分析PDX1，Ngn3，Glucagon，insulin，glucose transporter 2(Glut2)。

图10：免疫荧光检测insulin表达。图中1、2为DAPI染色，呈蓝色，为细胞核。3为免疫荧光染色，呈绿色，代表insulin。

图11：insulin释放试验。PLGA支架诱导分化组高糖孵育后胰岛素分泌量是低糖孵育胰岛素分泌量的2倍。而单层培养诱导分化组在高糖孵育和低糖孵育两种状态下胰岛素分泌量大致相同。

具体实施方式

现结合实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

实施例1：多孔PLGA支架的制备

将0.5g PLGA(分子量15KD)(PLA:PGA为85:15购自山东省医疗器械研究所)原料溶于1,4二氧六环溶液中,配制成PLGA浓度为10％(w/v)的溶液。向上述浓度为10％w/v的聚乳酸羟基乙酸溶液中加入粒径大小为150～200μm、比例为50％(w/w)的NaCl颗粒，搅拌后得到均匀悬液,倒入尺寸为8cm×8cm的培养皿。室温下干燥48h,冷冻干燥48h。脱模后用蒸馏水滤去多孔膜中的NaCl，室温干燥48h,搅拌烧杯中的去离子水可加速NaCl颗粒的溶出，待NaCl颗粒完全溶出后干燥薄膜，密封保存。

实施例2：多孔PLGA支架的制备

将0.5g PLGA(分子量15KD)(PLA:PGA为85:15购自山东省医疗器械研究所)原料溶于1,4二氧六环溶液中,配制成PLGA浓度为10％(w/v)的溶液。向上述浓度为10％w/v的聚乳酸羟基乙酸溶液中加入粒径大小为150～200μm、比例为25％(w/w)的NaCl颗粒，搅拌后得到均匀悬液,倒入尺寸为8cm×8cm的培养皿。室温下干燥48h,冷冻干燥48h。脱模后用蒸馏水滤去多孔膜中的NaCl，室温干燥48h,搅拌烧杯中的去离子水可加速NaCl颗粒的溶出，待NaCl颗粒完全溶出后干燥薄膜，密封保存。本实施例与实施例1差别在于PLGA制备过程中加入NaCl颗粒的比例不相同。

实施例3：多孔PLGA支架的制备

将0.5g PLGA(分子量15KD)(PLA:PGA为85:15购自山东省医疗器械研究所)原料溶于1,4二氧六环溶液中,配制成PLGA浓度为10％(w/v)的溶液。向上述浓度为10％w/v的聚乳酸羟基乙酸溶液中加入粒径大小为150～200μm、比例为75％(w/w)的NaCl颗粒，搅拌后得到均匀悬液,倒入尺寸为8cm×8cm的培养皿。室温下干燥48h,冷冻干燥48h。脱模后用蒸馏水滤去多孔膜中的NaCl，室温干燥48h,搅拌烧杯中的去离子水可加速NaCl颗粒的溶出，待NaCl颗粒完全溶出后干燥薄膜，密封保存。本实施例与实施例1差别在于PLGA制备过程中加入NaCl颗粒的比例不相同。

实施例4：多孔PLGA支架的制备

将0.5g PLGA(分子量15KD)(PLA:PGA为85:15购自山东省医疗器械研究所)原料溶于1,4二氧六环溶液中,配制成PLGA浓度为10％(w/v)的溶液。向上述浓度为10％w/v的聚乳酸羟基乙酸溶液中加入粒径大小为100～150μm，比例为50％(w/w)的NaCl颗粒，搅拌后得到均匀悬液,倒入尺寸为8cm×8cm的培养皿。室温下干燥48h,冷冻干燥48h。脱模后用蒸馏水滤去多孔膜中的NaCl，室温干燥48h,搅拌烧杯中的去离子水可加速NaCl颗粒的溶出，待NaCl颗粒完全溶出后干燥薄膜，密封保存。本实施例与实施例1差别在于PLGA制备过程中加入NaCl颗粒的粒径不相同。

实施例5：多孔PLGA支架的制备

将0.5g PLGA(分子量15KD)(PLA:PGA为85:15购自山东省医疗器械研究所)原料溶于1,4二氧六环溶液中,配制成PLGA浓度为10％(w/v)的溶液。向上述浓度为10％w/v的聚乳酸羟基乙酸溶液中加入粒径大小为200～250μm，比例为50％(w/w)的NaCl颗粒，搅拌后得到均匀悬液,倒入尺寸为8cm×8cm的培养皿。室温下干燥48h,冷冻干燥48h。脱模后用蒸馏水滤去多孔膜中的NaCl，室温干燥48h,搅拌烧杯中的去离子水可加速NaCl颗粒的溶出，待NaCl颗粒完全溶出后干燥薄膜，密封保存。本实施例与实施例1差别在于PLGA制备过程中加入NaCl颗粒的粒径不相同。

试验例1：大鼠骨髓间充质干细胞在不同孔径PLGA支架上向胰岛β的诱导分化

1.过程：制备不同孔径的PLGA支架：向浓度为10％(w/v)的PLGA中加入比例为50％，粒径范围分别为100～150μm、150～200μm和200～250μm的NaCl颗粒(图1)(即实施例4、1、5，分别为图中A、B、C)。取P3代大鼠骨髓间充质干细胞，将细胞接种到上述制备方法得到的已消毒的多孔PLGA支架表面，细胞接种密度为2.5×105个/24孔大小支架或4.5×104个/96孔大小支架，24小时后将普通培养液(αMEM+10％FBS)换为胰岛β细胞诱导液，胰岛β细胞诱导液A诱导10天后更换胰岛β细胞诱导液B继续诱导10天，每3天换液一次。胰岛β细胞诱导液A：含有10％FBS，1％非必需氨基酸，30ng/ml表皮生长因子(Epidermal GrowthFactor,EGF)，3％B27，30ng/ml成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，3mmol/L L-谷氨酰胺(L-glutamine)的αMEM。胰岛β细胞诱导液B：含10％FBS，10ng/mlβ-动物纤维素(β-cellulin)，10ng/ml激活素A(activin A)，2％B27，10mmol/L尼克酰胺和30ng/ml成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的αMEM。

2.结果：大鼠骨髓间充质干细胞向胰岛β诱导分化时细胞会向多角形改变，扫描电镜观察结果显示大鼠骨髓间充质干细胞在不同孔径大小的PLGA支架上用胰岛β诱导液诱导14d后细胞形态明显不同，实施例1的PLGA支架细胞多角化程度最高(图2B)，实施例4、5PLGA支架细胞多角化程度差(图2A,C)。与上述形态学变化相一致，实时定量PCR结果也显示大鼠骨髓间充质干细胞NaCl颗粒粒径范围为150～200μm的实施例PLGA支架Ins1基因的表达最高(图3)，显著高于粒径范围分别为100～150μm和200～250μm的NaCl颗粒的PLGA支架(图3)(均为P﹤0.01)。

试验例2：大鼠骨髓间充质干细胞在不同孔径率PLGA支架上向胰岛β的诱导分化

1.向浓度为10％(w/v)的PLGA中加入粒径范围为150～200μm，NaCl比例分别为25％、50％和75％的NaCl颗粒(图4，即实施例2、1、3，分别为图中A，B，C的纵切面的扫描电镜结果)。取P3代大鼠骨髓间充质干细胞，将细胞接种到上述制备方法得到的已消毒的多孔PLGA支架表面，细胞接种密度为2.5×105个/24孔大小支架或4.5×104个/96孔大小支架，24小时后将普通培养液(αMEM+10％FBS)换为胰岛β细胞诱导液，胰岛β细胞诱导液A诱导10天后更换胰岛β细胞诱导液B继续诱导10天，每3天换液一次。胰岛β细胞诱导液A：含有10％FBS，1％非必需氨基酸，30ng/ml表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)，3％B27，30ng/ml成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，3mmol/L L-谷氨酰胺(L-glutamine)的αMEM。胰岛β细胞诱导液B：含10％FBS，10ng/mlβ-cellulin，10ng/mlactivin A，2％B27，10mmol/L尼克酰胺和30ng/ml成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor，bFGF)的αMEM。

2.结果：扫描电镜观察结果显示大鼠骨髓间充质干细胞在不同孔径率的PLGA支架上用胰岛β诱导液诱导14d后细胞形态也有所不同，实施例1的PLGA支架细胞多角化呈度最高(图5B，实施例1)。对照例中，NaCl比例为25％(即图5A，实施例2)时，PLGA支架细胞多角化程度稍差，NaCl比例为75％(即图5C，实施例3)的PLGA支架细胞多角化程度最差，且可以看出此时支架的韧性明显减弱，脆性明显增强(图5)。与上述形态学变化相一致，实时定量PCR结果也显示NaCl颗粒50％(即实施例1)的中大鼠骨髓间充质干细胞在PLGA支架上Ins1基因的表达最高，高于NaCl颗粒25％(实施例2)和75％(实施例3)的PLGA支架(图6)。

实施例6：大鼠骨髓间充质干细胞在PLGA支架上向胰岛β细胞分化

1.大鼠骨髓间充质干细胞在PLGA支架表面向胰岛β细胞的诱导

取P3代大鼠骨髓间充质干细胞，将细胞接种到实施例1得到的多孔PLGA支架表面，细胞接种密度为2.5×10⁵个/24孔大小支架或4.5×10⁴个/96孔大小支架，24小时后将普通培养液(αMEM+10％FBS)换为胰岛β细胞诱导液，胰岛β细胞诱导液A诱导10天后更换胰岛β细胞诱导液B继续诱导10天，每3天换液一次。胰岛β细胞诱导液A：含有10％FBS，1％非必需氨基酸，30ng/ml表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)，3％B27，30ng/ml成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，3mmol/L L-谷氨酰胺(L-glutamine)的αMEM。胰岛β细胞诱导液B：含10％FBS，10ng/mlβ-动物纤维素(β-cellulin)，10ng/ml激活素A(activin A)，2％B27，10mmol/L尼克酰胺和30ng/ml成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的αMEM。

2.CCK8法检测诱导过程细胞增殖情况

将大鼠间充质干细胞以相同的细胞密度同时接种到96孔培养板和96孔大小的PLGA支架表面，细胞接种密度为1×104个细胞/孔，然后分别用胰腺β诱导液和普通培养液(10％FBS/αMEM)进行培养，于接种后1天、3天、5天、7天、14天和21天时分别进行CCK8检测，检测方法为将10μl CCK8加到100μl培养液中，37℃孵育4小时，然后在450nm处检测其吸光值，OD值反映细胞数量的多少(图7)。CCK8检测结果显示，在单层培养体系下，从培养3天到培养21天，大鼠骨髓间充质干细胞用胰岛β细胞诱导液培养组细胞增殖均显著高于用普通培养液培养组(p﹤0.05)。在普通培养液培养条件下，培养3天和培养14天时，接种在PLGA支架上的人大鼠骨髓间充质干细胞增殖显著高于接种于单层培养体系的大鼠骨髓间充质干细胞(p﹤0.05)。从培养3天到培养21天，接种于PLGA支架用胰岛β细胞诱导液培养的大鼠骨髓间充质干细胞细胞增殖均显著高于接种在PLGA支架上用普通培养基培养和接种在单层培养体系用胰岛β细胞诱导液培养的细胞(p﹤0.05)。结果表明接种于PLGA支架的大鼠骨髓间充质干细胞其细胞增殖趋势和接种于普通培养板的大鼠骨髓间充质干细胞相似，均为在胰岛β细胞诱导液培养条件下细胞增殖速度显著高于普通培养液的培养条件；且在胰岛β细胞诱导液培养条件下，接种于PLGA支架的大鼠骨髓间充质干细胞其细胞数目显著多于接种在普通培养板的大鼠骨髓间充质干细胞。证明加入NaCl颗粒粒径大小为150～200μm、比例为50％(w/w)制备的PLGA支架与骨髓间充质干细胞有很好的生物相容性。

3.扫描电镜观察大鼠骨髓间充质干细胞在支架表面的粘附和生长

将大鼠骨髓间充质干细胞接种到96孔大小PLGA支架表面，用胰岛β细胞诱导液进行诱导，分别于诱导后5天、10天和15天收集细胞-支架复合物样品进行扫描电镜观察，扫描电镜标本制备过程为3％戊二醛4℃固定4小时、0.1M二甲砷酸钠清洗三次、锇酸固定、酒精梯度脱水、临界点干燥12小时后真空镀金，标本制成后用扫描电镜观察细胞和支架形态并照相。未接种细胞的PLGA支架作为对照(图8)。

扫描电镜结果显示NaCl颗粒致孔法合成的PLGA支架有良好的微孔结构，很多小孔均匀分布，小孔之间互相连接无封闭空间(图8，A)。细胞外基质分泌逐渐增多，诱导5天的细胞其细胞外基质的分泌明显增多(图8，B)。诱导10天后，细胞数目明显增多，在支架表面融合形成一细胞单层，支架被细胞覆盖，细胞向多角形改变(图8，C)。诱导15天后，很多细胞伸出细胞突触在细胞单层上面互相连接，细胞增殖、分化成三维组织样结构(图8，D)。NaCl颗粒粒径大小为150～200μm、比例为50％(w/w)制备的PLGA支架比单层培养体系有更多的表面积供细胞粘附并为细胞克隆的扩增和增殖提供更加充足的空间有关。

4.RT-PCR及其产物的半定量分析PDX1，Ngn3，胰高血糖素(Glucagon)，胰岛素(insulin)，葡萄糖转运蛋白2(glucose transporter 2，Glut2)

结果显示接种在PLGA支架的大鼠骨髓间充质干细胞用胰岛β细胞诱导液诱导7d后表达胰岛β细胞特异性基因较单层细胞培养组显著增高(P<0.01)(图9)。表明NaCl颗粒粒径大小为150～200μm、比例为50％(w/w)制备的PLGA支架能够更好地模拟体内微环境，PLGA支架的三维结构可能比单层培养体系更利于大鼠骨髓间充质干细胞向胰岛β细胞的诱导分化。

5.免疫荧光检测胰岛素(insulin)表达

将大鼠骨髓间充质干细胞接种到PLGA支架表面，用胰岛β细胞诱导液诱导14天后制成冰冻切片，取冰冻切片用PBS缓冲液冲洗三次，每次5min；用0.1％Triton孵育10min以增加细胞膜的通透性；PBS缓冲液洗涤，用5％BSA/PBS于37℃孵育30min以封闭非特异性结合位点；倾去血清直接加入小鼠抗大鼠insulin单克隆抗体工作液，阴性对照用PBS代替抗体，置于湿盒中，4℃过夜；PBS缓冲液洗涤，加入山羊抗鼠IgG-TRITC工作液，于37℃孵育30min；PBS缓冲液洗涤，用DAPI对细胞核进行衬染；PBS缓冲液洗涤后用荧光显微镜进行观察(图10)。免疫荧光显示，与对照组相比,PLGA支架组胰岛素分泌量明显增加。表明加入NaCl颗粒粒径大小为150～200μm、比例为50％(w/w)制备的PLGA支架可能比单层培养体系更好地模拟体内微环境，PLGA支架的三维结构更利于胰岛β细胞分泌胰岛素。

6.insulin释放试验

将单层培养诱导分化组细胞和PLGA支架诱导分化组分别用PBS洗三次，无糖Krebs-Ringer缓冲液预孵育1个小时。PBS冲洗后，用低糖KR缓冲液(5.6mM葡萄糖)和高糖KR缓冲液(23mM葡萄糖)分别孵育1个小时。收集培养液表层，用电化学发光法(ECL)测定胰岛素含量。PLGA支架诱导分化组高糖孵育后胰岛素分泌量是低糖孵育胰岛素分泌量的2倍。而单层培养诱导分化组在高糖孵育和低糖孵育两种状态下胰岛素分泌量大致相同(图11)。表明NaCl颗粒粒径大小为150～200μm、比例为50％(w/w)制备的PLGA支架更好地模拟体内微环境，PLGA支架的三维结构可能比单层培养体系更利于使诱导分化形成胰岛β细胞具有高糖反应性。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (4)

1.一种利用组织工程材料诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化成胰岛β细胞的方法，具体方法如下：

A．大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

全骨髓贴壁培养法分离获取大鼠骨髓间充质干细胞，传至第三代P3后对培养获取的骨髓间充质干细胞分别进行形态学、表面标志物、功能鉴定；

B.大鼠骨髓间充质干细胞在多孔PLAG支架表面进行诱导分化

取P3代大鼠骨髓间充质干细胞，将细胞接种到已消毒的多孔 PLGA 支架表面，细胞接种密度为2.5×10⁵个/24 孔大小支架或 4.5×10⁴个/96 孔大小支架，24小时后将普通培养液αMEM+10% FBS换为胰岛β细胞诱导液，胰岛β细胞诱导液A诱导10天后更换胰岛β细胞诱导液B继续诱导10天，每3天换液一次，

其中，胰岛β细胞诱导液A的组分为：含有10%FBS，1%非必需氨基酸，30ng/ml表皮生长因子，3% B27，30ng/ml 成纤维细胞生长因子，3mmol/L L-谷氨酰胺的αMEM；胰岛β细胞诱导液B的组分为：含10%FBS，10ng/ml β-动物纤维素，10ng/ml激活素A，2%B27，10mmol/L 尼克酰胺和30ng/ml成纤维细胞生长因子的αMEM，以上百分比均为体积百分比，

所述多孔 PLGA 支架的制备方法如下：

将聚乳酸羟基乙酸溶于1,4二氧六环溶液中，配制成聚乳酸羟基乙酸浓度为10% w/v的溶液，所述聚乳酸羟基乙酸的分子量为15KD，其中聚乳酸与聚羟基乙酸的体积比为85:15；

向上述聚乳酸羟基乙酸溶液中加入粒径大小为100~250μm，比例为25%-75%w/w的NaCl颗粒，搅拌后得到均匀悬液；将悬液倒入尺寸为8cm×8cm 的培养皿，室温下干燥24小时以上，冷冻干燥24小时以上；脱模后用蒸馏水滤去多孔膜中的NaCl，室温干燥24小时以上，搅拌烧杯中的去离子水可加速NaCl 颗粒的溶出，待NaCl 颗粒完全溶出后干燥薄膜，密封保存，得到所述多孔PLGA支架。

2.根据权利要求1所述的组织工程材料诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化成胰岛β细胞的方法，其特征在于步骤A中全骨髓贴壁培养法分离获取大鼠骨髓间充质干细胞的具体步骤为：将大鼠麻醉后处死，置于75%酒精中浸泡15min；分离股骨和胫骨，PBS冲洗后，剪去干骺端，2ml医用注射器吸取培养基冲洗骨髓腔；将悬液过滤后，2000rpm离心5min，沉淀吹打混匀后接种于培养瓶中培养；骨髓间充质干细胞贴壁率达到70%后传代。

3.根据权利要求1所述的组织工程材料诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化成胰岛β细胞的方法，其特征在于，步骤B中胰岛β细胞诱导液A在24孔板上每孔加入1mL培养基，96孔板上每孔加入0.1mL培养基；换胰岛β细胞诱导液B在24孔板上每孔加入1mL培养基，96孔板上每孔加入0.1mL培养基。

4.根据权利要求1所述的组织工程材料诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化成胰岛β细胞的方法，其特征在于，所述的加入NaCl 颗粒的粒径为150~200μm，占浓度为10% w/v的聚乳酸羟基乙酸溶液的比例为50%w/w。