CN109125805A - 一种干细胞复合plga支架试剂盒及其应用 - Google Patents

一种干细胞复合plga支架试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于妇产科学领域，具体涉及一种用于修复宫腔粘连性子宫内膜损伤的干细胞复合PLGA支架试剂盒及其应用。所述试剂盒包括细胞浓度为5‑7×106个/mL人骨髓间充质干细胞和PLGA支架。本发明试剂盒中含合PLGA支架，PLGA支架的存在可为骨髓间充质干细胞提供附着位点，使定位于损伤部位的干细胞数量增多，有利于促进损伤子宫内膜的修复，提高了修复效果并降低了干细胞转移造成的风险；同时PLGA支架可促进干细胞分化，且其为合成的生物材料，与胶原等生物来源的材料相比，具有来源广泛、制备工艺简单、无传播病原风险等优点。

Description

一种干细胞复合PLGA支架试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于妇产科学领域，具体涉及一种用于修复宫腔粘连性子宫内膜损伤的干细胞复合PLGA支架试剂盒及其应用。
背景技术
子宫内膜对于维持女性生理特征和生育功能极其重要，在胚胎着床和维持妊娠中起关键作用。子宫内膜具有极强的再生能力，然而它又极易受流产、感染、内分泌等诸多因素的影响，各种原因导致的子宫内膜容受性显著降低，严重影响女性的生育能力。子宫内膜粘连(IUAs)是继发于子宫内膜损伤(例如创伤，刮宫，感染，子宫先天性异常和遗传易感性)的常见的获得性子宫内膜疾病。其主要病理特征是具有或不具有腺组织的无血管纤维结缔组织带。IUAs可以导致广泛的临床表现特征，包括月经流量减少、不孕症、复发性流产、闭经和胎盘积累等。IUAs的发病率近年来呈快速增长的态势，其中，90％的IUAs与宫内手术对子宫的损害有关。
随着宫腔镜检查技术的发展，宫腔镜下宫腔粘连分离术(transcervicalresection of adhesion,TCRA)已成为剥离粘连和恢复子宫腔形状的常规和标准化方法。然而，术后子宫内膜的恢复和预防复发性IUAs是临床实践中的两个挑战。TCRA后再粘连率高达62.5％，妊娠成功率仅22.5％～33.3％。目前，宫内节育器(IUD)安置和人工激素治疗与雌激素联合应用用于防止IUAs术后复发和促进子宫内膜的恢复和再生。雌激素治疗功效的有限性(其通常伴有不良反应)和IUD的低效率迫使我们寻找IUAs的替代治疗方法。
近年来，随着对干细胞研究的不断加深，逐渐认识到个体各个器官中都存在成体干细胞，成体干细胞参与了相应组织细胞的增生。干细胞治疗对于损伤疾病或病症是一种有前景的方法。
骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)因其在特定的诱导条件下可以向中胚层的成骨细胞、外胚层的神经细胞、内胚层的肝细胞分化，较易在体外培养、诱导和扩增，己成为生命科学领域研究的热点。
已有研究报告显示，BMSCs能替代潜能祖细胞分化为子宫内膜基质成纤维细胞。另外，移植的BMSCs诱导薄型子宫内膜中残存的子宫内膜干细胞分化为子宫内膜样细胞而进行自我修复。前面的研究中，干细胞移植的方式为子宫局部原位注射或者螺旋动脉推注。干细胞经子宫局部原位注射后在内膜损伤部位存活数量少，而经螺旋动脉推注移植后干细胞募集效率低，使得治疗后成功受孕率不理想。
聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)有良好的生物相容性和生物降解性能且降解速度可控。同时，体内及体外实验结果表明，PLGA支架可为干细胞提供附着位点同时可促进干细胞的分化，但是脱离了体内微环境，大部分多能干细胞在体外培养条件下生长时很容易发生凋亡，从而不利于干细胞的推广应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于修复宫腔粘连性子宫内膜损伤的干细胞复合PLGA支架试剂盒及其应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种干细胞复合PLGA支架试剂盒，所述试剂盒包括细胞浓度为5-7×106个/mL人骨髓间充质干细胞和PLGA支架(10cm×8cm)。
所述试剂盒还包括500-550ml低糖DMEM基础培养基、5-6ml双抗、50-55ml胎牛血清和5-6μmol Blebbistatin。
一种干细胞复合PLGA支架试剂盒的应用，所述试剂盒在修复宫腔粘连性子宫内膜损伤的干细胞复合中的应用。
所述修复在双侧子宫结部距离子宫角1/3处切开一个小切口植入所述试剂盒。
一种试剂盒修复宫腔粘连性子宫内膜损伤的方法，将经干细胞复合PLGA支架植入于子宫损伤部位进而对宫腔粘连性子宫内膜损伤的修复。
所述干细胞复合PLGA支架为将人骨髓间充质干细胞经含双抗、胎牛血清和Blebbistatin的低糖DMEM基础培养基中重悬、复苏得重悬细胞；培养重悬细胞，并用胰酶进行消化传代直至细胞活力、分裂性状稳定；将上述传代的人骨髓间充质干细胞滴加至经剪裁的PLGA支架表面，而后培养3-5小时得到用于修复宫腔粘连性子宫内膜损伤的干细胞复合PLGA支架。
进一步的说，将人骨髓间充质干细胞经其用3-5倍体积的含双抗、胎牛血清和Blebbistatin的低糖DMEM基础培养基重悬离心，弃上清，加入含双抗、胎牛血清和Blebbistatin的低糖DMEM基础培养基重悬细胞，接种培养，培养液每两天换一次，至细胞贴壁至80％融合度时，进行消化传代，弃培养基加入磷酸盐缓冲液冲洗吸弃磷酸盐缓冲液；加入胰酶，轻轻摇动使胰酶流遍所有细胞表面，加入含双抗、胎牛血清和Blebbistatin的低糖DMEM基础培养基终止消化，反复吹打瓶底及边缘的细胞使得贴壁的细胞完全脱离瓶底形成细胞悬液，离心弃上清，用含双抗、胎牛血清和Blebbistatin的低糖DMEM基础培养基调整细胞浓度3-5×105个细胞/mL于37℃、5％CO2、饱和湿度CO2培养箱中培养实现一次消化传代(即，细胞传代过程由磷酸盐缓冲液冲洗、胰酶消化、培养基终止消化、离心去上清、培养基重悬细胞直至接种培养，为一次消化传代过程)。
将PLGA支架剪裁置于6孔板中，用含双抗、胎牛血清和Blebbistatin的低糖DMEM基础培养基充分湿润，挤压去除内部空气，而后将经传代培养后的骨髓间充质干细胞整至浓度为3-5×105个/ml的细胞液均匀滴加到上述PLGA支架上，将6孔板放入培养箱中培养。
本发明与传统子宫内膜损伤后修复方法相比具有以下优点：
本发明试剂盒中含合PLGA支架，PLGA支架的存在可为骨髓间充质干细胞提供附着位点，使定位于损伤部位的干细胞数量增多，有利于促进损伤子宫内膜的修复，提高了修复效果并降低了干细胞转移造成的风险；同时PLGA支架可促进干细胞分化，且其为合成的生物材料，与胶原等生物来源的材料相比，具有来源广泛、制备工艺简单、无传播病原风险等优点。
本发明试剂盒在修复中在BMSCs复合PLGA支架培养时加入多能干细胞凋亡抑制剂blebbistatin抑制干细胞的凋亡，提高干细胞存活率。骨髓间充质干细直接分化为子宫内膜某种类型细胞或通过旁分泌途径分泌多种细胞因子来促进内膜再生，从而促进子宫内膜损伤后修复，进而重建子宫内膜。
进而本发明用于修复宫腔粘连性子宫内膜损伤的干细胞复合PLGA支架试剂盒，有利于促进损伤子宫内膜的修复，提高了修复效果并降低了干细胞转移造成的风险；同时PLGA支架为合成的生物材料，可降低生物来源类材料传播病原的风险。
附图说明
图1为本发明实施例提的实施例1术后30天、90天子宫外观图；
图2为本发明实施例提的实施例1损伤部位HE染色图；
图3为本发明实施例提的实施例1损伤部位子宫内膜间质细胞标记蛋白vimentin免疫组化染色图；
图4为本发明实施例提的实施例1损伤部位血管内皮细胞标记CD34标记免疫组化染色图；
图5为本发明实施例提的实施例2术后30天、90天子宫外观图；
图6为本发明实施例提的实施例2损伤部位HE染色图；
图7为本发明实施例提的实施例2损伤部位子宫内膜间质细胞标记蛋白vimentin免疫组化染色图；
图8为本发明实施例提的实施例2损伤部位血管内皮细胞标记CD34标记免疫组化染色图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明做进一步说明。
本发明提供了用于修复宫腔粘连性子宫内膜损伤的干细胞复合PLGA支架试剂盒，主要包含人骨髓间充质充质干细胞和PLGA支架。还提供了使用本试剂盒修复宫腔粘连性子宫内膜的方法：复苏、传代骨髓间充质干细胞，调整细胞密度为3-5×105/ml，PLGA支架搭载骨髓间充质干细胞进行复合培养3-5h，移植修复子宫内膜。PLGA支架为骨髓间充质干细胞的粘附提供附着点，使定位于子宫内膜损伤部位的干细胞数量增多，有利于促进损伤子宫内膜的修复，提高了修复效果并降低了干细胞转移造成的风险，同时PLGA支架可促进干细胞分化，且其为合成的生物材料，与胶原等生物来源的材料相比，具有来源广泛、制备工艺简单、无传播病原风险等优点，适合推广使用。
实施例1
配制完全培养基，然后复苏、传代人骨髓间充质干细胞，接着进行人骨髓间充质干细胞与PLGA支架复合培养，得到干细胞复合PLGA支架，然后手术植入修复子宫内膜。
步骤1，配制完全培养基：把5ml双抗、50ml胎牛血清和5μmol Blebbistatin加到500ml低糖DMEM基础培养基中，配成含10％胎牛血清、1％双抗、10μM blebbistatin的完全培养基。
步骤2，人骨髓间充质干细胞复苏：取出冻存的细胞，立即放入37℃水浴中，缓慢晃动，使细胞迅速解冻融化；然后将细胞悬液转移至15mL离心管，加入3倍体积完全培养基，用枪吹打混匀；离心(常温1000rpm，5min)，弃掉上清；加入含双抗、胎牛血清和Blebbistatin的低糖DMEM基础培养基重悬细胞，然后接种于培养瓶。
步骤3，人骨髓间充质干细胞传代：将上述培养液每两天换培养基一次，培养至细胞贴壁至80％融合度时，进行消化传代；消化传代过程为消化传代吸弃培养瓶内的培养基，并加入PBS(磷酸盐缓冲液)，轻轻摇动培养瓶，洗去残留的培养基，吸弃PBS；加入胰酶，轻轻晃动培养瓶，使胰酶与所有细胞充分接触；在倒置显微镜下观察，发现细胞回缩，形状变得透亮后，立即加入含双抗、胎牛血清和Blebbistatin的低糖DMEM基础培养基终止消化；反复吹打瓶底及边缘的细胞使得贴壁的细胞完全脱离瓶底形成细胞悬液；将细胞悬液吸进离心管，离心，弃上清；用含双抗、胎牛血清和Blebbistatin的低糖DMEM基础培养基调整细胞浓度3-5×105个细胞/mL于37℃、5％CO2、饱和湿度CO2培养箱中培养实现一次消化传代(即，细胞传代过程由磷酸盐缓冲液冲洗、胰酶消化、培养基终止消化、离心去上清、培养基重悬细胞直至接种培养，为一次消化传代过程)，而后按照上述传代过程传代3次，即得到细胞活力、分裂性能高的干细胞。
步骤4，PLGA支架剪裁成合适大小，置于6孔板中，用含双抗、胎牛血清和Blebbistatin的低糖DMEM基础培养基充分湿润，适当挤压去除内部空气，用无菌纱布将多余培养基吸干；取上述步骤3中第四代生长良好的骨髓间充质干细胞并加入胰酶进行消化，获得单细胞悬液，计数并用含双抗、胎牛血清和Blebbistatin的低糖DMEM基础培养基调整细胞浓度3-5×105个/ml，将上述调整浓度后单细胞悬液均匀滴加到上述处理后PLGA支架上，而后将6孔板放入37℃、5％CO2培养箱中培养30min。
步骤5，手术移植干细胞复合PLGA支架修复子宫内膜：依次切开腹部皮肤、肌肉和腹膜，暴露腹腔，然后将上述步骤4获得干细胞复合PLGA支架植入到子宫损伤部位，进行修复。
同时，试验分别做假手术组、自发愈合组、PLGA支架修复组、骨髓间充质干细胞复合PLGA支架修复组，进行对照试验(参见图1-4)，试验结果如下：
图1-4分别为术后30天、90天子宫外观；损伤部位HE染色；损伤部位子宫内膜间质细胞标记蛋白vimentin免疫组化染色观察；损伤部位血管内皮细胞标记CD34标记免疫组化染色观察。
图1中，A-D—术后30天；E-H—术后90天；其中，A、E—假手术组；B、F—自发愈合组；C、G—PLGA支架修复组；D、H—骨髓间充质干细胞复合PLGA支架修复组
图2中，A-D—术后30天；E-H—术后90天；其中，A、E—假手术组；B、F—自发愈合组；C、G—PLGA支架修复组；D、H—骨髓间充质干细胞复合PLGA支架修复组。A-H，20×，标尺长度为1000μm。
图3中，A-D—术后30天；E-H—术后90天；其中，A、E—假手术组；B、F—自发愈合组；C、G—PLGA支架修复组；D、H—骨髓间充质干细胞复合PLGA支架修复组。A-H，400×，标尺长度为1000μm。
图4中，A-D—术后30天；E-H—术后90天；其中，A、E—假手术组；B、F—自发愈合组；C、G—PLGA支架修复组；D、H—骨髓间充质干细胞复合PLGA支架修复组。A-H，400×，标尺长度为1000μm。
如图1子宫整体外观结果中，骨髓间充质干细胞复合PLGA支架修复组较自发愈合组及PLGA支架修复组完整，无瘢痕；图2HE染色结果中，骨髓间充质干细胞复合PLGA支架修复组较自发愈合组及PLGA支架修复组内膜厚度大、腺体数量多；图3内膜间质细胞标记蛋白vimentin免疫组化结果中，骨髓间充质干细胞复合PLGA支架修复组较自发愈合组及PLGA支架修复组内膜间质细胞数量多；图4血管内皮细胞标记CD34免疫组化结果中，骨髓间充质干细胞复合PLGA支架修复组较自发愈合组及PLGA支架修复组内膜血管密度大，综上，以上结果说明，骨髓间充质干细胞复合PLGA支架修复组较自发愈合组及PLGA支架修复组修复效果要好。
实施例2
配制完全培养基，然后复苏、传代人骨髓间充质干细胞，接着进行人骨髓间充质干细胞与PLGA支架复合培养，得到干细胞复合PLGA支架，然后手术植入修复子宫内膜。
步骤1，人骨髓间充质干细胞复苏：取出冻存的细胞，立即放入37℃水浴中，缓慢晃动，使细胞迅速解冻融化；然后将细胞悬液转移至15mL离心管，加入3倍体积含双抗、胎牛血清和Blebbistatin的低糖DMEM基础培养基，用枪吹打混匀；离心(常温1000rpm，5min)，弃掉上清；加入完全培养基重悬细胞，然后接种于培养瓶。
步骤2，人骨髓间充质干细胞传代：将上述培养液每两天换培养基一次，至细胞贴壁至80％融合度时，进行消化传代；吸弃培养瓶内的培养基；加入PBS(磷酸盐缓冲液)，轻轻摇动培养瓶，洗去残留的培养基，吸弃PBS；加入胰酶，轻轻晃动培养瓶，使胰酶与所有细胞充分接触；在倒置显微镜下观察，发现细胞回缩，形状变得透亮后，立即加入完全培养基终止消化；反复吹打瓶底及边缘的细胞使得贴壁的细胞完全脱离瓶底形成细胞悬液；将细胞悬液吸进离心管，离心，弃上清；用含双抗、胎牛血清和Blebbistatin的低糖DMEM基础培养基调整细胞浓度3-5×105个细胞/mL于37℃、5％CO2、饱和湿度CO2培养箱中培养实现一次消化传代(即，细胞传代过程由磷酸盐缓冲液冲洗、胰酶消化、培养基终止消化、离心去上清、培养基重悬细胞直至接种培养，为一次消化传代过程)，而后按照上述传代过程传代3次，即得到细胞活力、分裂性能高的干细胞。
步骤3，PLGA支架剪裁成合适大小，置于6孔板中，用完全培养基充分湿润，适当挤压去除内部空气；用无菌纱布将多余培养基吸干；取生长良好的第四代骨髓间充质干细胞，胰酶消化后制备单细胞悬液，计数并经培养基调整细胞浓度3-5×105个细胞/mL；取细胞悬液均匀滴加到PLGA支架上，将6孔板放入37℃、5％CO2培养箱中培养30min。
步骤4，手术移植干细胞复合PLGA支架修复子宫内膜：依次切开腹部皮肤、肌肉和腹膜，暴露腹腔，然后植入干细胞复合PLGA支架到子宫损伤部位，进行修复。
所述试验完全培养基为完全培养基a或完全培养基b；其中，完全培养基a配置为含10％胎牛血清、1％双抗且不含blebbistatin的完全培养基；
完全培养基b配置为含10％胎牛血清、1％双抗、10μM blebbistatin的完全培养基。
即，试验分为利用完全培养基a培养的人骨髓间充质干细胞复合PLGA支架组(a)与完全培养基b培养的人骨髓间充质干细胞复合PLGA支架组(b)(参见图5-8)，图5-8分别为术后90天子宫外观、损伤部位HE染色、损伤部位子宫内膜间质细胞标记蛋白vimentin免疫组化染色观察、损伤部位血管内皮细胞标记CD34标记免疫组化染色观察。
由图5子宫整体外观结果中，b组较a组完整，无瘢痕；图6HE染色结果中，b组较a组内膜厚度大、腺体数量多；图7内膜间质细胞标记蛋白vimentin免疫组化结果中，b组较a组内膜间质细胞数量多；图8血管内皮细胞标记CD34免疫组化结果中，b组较a组内膜血管密度大，综上，以上结果说明，本发明中的含10％胎牛血清、1％双抗、10μM blebbistatin的完全培养基养的人骨髓间充质干细胞复合PLGA支架组较含10％胎牛血清、1％双抗且不含blebbistatin的完全培养基培养的人骨髓间充质干细胞复合PLGA支架组修复效果要好。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (8)

1.一种干细胞复合PLGA支架试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括细胞浓度为5-7×106个/mL人骨髓间充质干细胞和PLGA支架。
2.按权利要求1所述的干细胞复合PLGA支架试剂盒，其特征在于，还包括500-550ml低糖DMEM基础培养基、5-6ml双抗、50-55ml胎牛血清和5-6μmol Blebbistatin(各成分烦请给出范围值)。
3.一种权利要求1所述的干细胞复合PLGA支架试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒在修复宫腔粘连性子宫内膜损伤的干细胞复合中的应用。
4.按权利要求1所述的干细胞复合PLGA支架试剂盒的应用，其特征在于，所述修复在双侧子宫结部距离子宫角1/3处切开一个小切口植入所述试剂盒。
5.一种权利要求1所述试剂盒修复宫腔粘连性子宫内膜损伤的方法，其特征在于，将经干细胞复合PLGA支架植入于子宫损伤部位进而对宫腔粘连性子宫内膜损伤的修复。
6.按权利要求5所述的修复宫腔粘连性子宫内膜损伤的方法，其特征在于，所述干细胞复合PLGA支架为将人骨髓间充质干细胞经含双抗、胎牛血清和Blebbistatin的低糖DMEM基础培养基中重悬、复苏得重悬细胞；培养重悬细胞，并用胰酶进行消化传代直至细胞活力、分裂性状稳定；将上述传代的人骨髓间充质干细胞滴加至经剪裁的PLGA支架表面，而后培养3-5小时得到用于修复宫腔粘连性子宫内膜损伤的干细胞复合PLGA支架。
7.按权利要求6所述的修复宫腔粘连性子宫内膜损伤的方法，其特征在于，将人骨髓间充质干细胞经其用3-5倍体积的含双抗、胎牛血清和Blebbistatin的低糖DMEM基础培养基重悬离心，弃上清，加入含双抗、胎牛血清和Blebbistatin的低糖DMEM基础培养基重悬细胞，接种培养，培养液每两天换一次，至细胞贴壁至80％融合度时，进行消化传代，弃培养基加入磷酸盐缓冲液冲洗吸弃磷酸盐缓冲液；加入胰酶，轻轻摇动使胰酶流遍所有细胞表面，加入含双抗、胎牛血清和Blebbistatin的低糖DMEM基础培养基终止消化，反复吹打瓶底及边缘的细胞使得贴壁的细胞完全脱离瓶底形成细胞悬液，离心弃上清，用含双抗、胎牛血清和Blebbistatin的低糖DMEM基础培养基调整细胞浓度3-5×105个/mL于37℃、5％CO2、饱和湿度CO2培养箱中培养实现一次消化传代。
8.按权利要求6所述的修复宫腔粘连性子宫内膜损伤的方法，其特征在于，将PLGA支架剪裁置于6孔板中，用含双抗、胎牛血清和Blebbistatin的低糖DMEM基础培养基充分湿润，挤压去除内部空气，而后将经传代培养后的骨髓间充质干细胞整至浓度为3-5×105个/ml的细胞液均匀滴加到上述PLGA支架上，将6孔板放入培养箱中培养。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110448539A (zh) * 2019-07-23 2019-11-15 天津大学 骨髓间充质干细胞膜包裹载microRNA的表面修饰氨基的介孔硅球
CN112294846A (zh) * 2020-10-22 2021-02-02 清华大学深圳国际研究生院 干细胞微球及其应用
CN114949361A (zh) * 2021-12-31 2022-08-30 浙江金时代生物技术有限公司 一种用于子宫内膜修复的聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架与人脐带间充质干细胞复合物的制备方法

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1416909A (zh) * 2002-11-27 2003-05-14 复旦大学附属妇产科医院 一种制备人工子宫内膜的方法
CN102558514A (zh) * 2011-12-29 2012-07-11 浙江宝诺生物科技有限公司 一种可生物降解术后防粘连膜材料、制备方法及用途
US20140004087A1 (en) * 2012-04-02 2014-01-02 Medistem, Inc. Endometrial regenerative cells for treatment of traumatic brain injury
CN103695367A (zh) * 2013-12-24 2014-04-02 湖南赛诺生物科技有限责任公司 一种改良的新生猪胰岛细胞培养基及其使用方法
CN103705984A (zh) * 2013-12-17 2014-04-09 南京大学医学院附属鼓楼医院 胶原支架复合骨髓间充质干细胞制备方法及应用
CN104364263A (zh) * 2011-09-22 2015-02-18 卡尔·特吕格瓦松 含有层粘连蛋白和钙粘蛋白的细胞培养基底
CN105670990A (zh) * 2014-08-22 2016-06-15 中国人民解放军第二军医大学 一种用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料的制备方法与应用
CN106730013A (zh) * 2016-12-06 2017-05-31 徐妍 用于预防宫腔粘连及子宫内膜损伤修复的细胞制剂及其制备方法
CN106880871A (zh) * 2017-01-18 2017-06-23 烟台正海生物科技股份有限公司 一种用于促进子宫内膜修复的胶原蛋白真皮材料及其制备方法
CN107537068A (zh) * 2017-09-04 2018-01-05 东华大学 一种用于促进损伤子宫恢复的PGS/BMSCs复合支架及其制备方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1416909A (zh) * 2002-11-27 2003-05-14 复旦大学附属妇产科医院 一种制备人工子宫内膜的方法
CN104364263A (zh) * 2011-09-22 2015-02-18 卡尔·特吕格瓦松 含有层粘连蛋白和钙粘蛋白的细胞培养基底
CN102558514A (zh) * 2011-12-29 2012-07-11 浙江宝诺生物科技有限公司 一种可生物降解术后防粘连膜材料、制备方法及用途
US20140004087A1 (en) * 2012-04-02 2014-01-02 Medistem, Inc. Endometrial regenerative cells for treatment of traumatic brain injury
CN103705984A (zh) * 2013-12-17 2014-04-09 南京大学医学院附属鼓楼医院 胶原支架复合骨髓间充质干细胞制备方法及应用
CN103695367A (zh) * 2013-12-24 2014-04-02 湖南赛诺生物科技有限责任公司 一种改良的新生猪胰岛细胞培养基及其使用方法
CN105670990A (zh) * 2014-08-22 2016-06-15 中国人民解放军第二军医大学 一种用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料的制备方法与应用
CN106730013A (zh) * 2016-12-06 2017-05-31 徐妍 用于预防宫腔粘连及子宫内膜损伤修复的细胞制剂及其制备方法
CN106880871A (zh) * 2017-01-18 2017-06-23 烟台正海生物科技股份有限公司 一种用于促进子宫内膜修复的胶原蛋白真皮材料及其制备方法
CN107537068A (zh) * 2017-09-04 2018-01-05 东华大学 一种用于促进损伤子宫恢复的PGS/BMSCs复合支架及其制备方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TINA ZAHEDI TEHRANI等: "Comparison of Cell Proliferation and Adhesion of Human Osteoblast Differentiated Cells on Electrospun and Freeze-Dried PLGA/Bioglass Scaffolds", 《ARCH NEUROSCI. 》 *
余元勋主编: "《中国分子神经病学》", 31 August 2015, 安徽科学技术出版社 *
徐洪璋等: "胎儿骨髓间充质干细胞复合 PLGA支架的形态学观察", 《中华创伤骨科杂志》 *
李光鹏等主编: "《动物解剖学、组织学与生殖生物学简明教程》", 30 September 2016, 内蒙古大学出版社 *
赵卫红等主编: "《细胞凋亡》", 31 December 1997, 河南医科大学出版社 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110448539A (zh) * 2019-07-23 2019-11-15 天津大学 骨髓间充质干细胞膜包裹载microRNA的表面修饰氨基的介孔硅球
CN110448539B (zh) * 2019-07-23 2021-06-04 天津大学 骨髓间充质干细胞膜包裹载microRNA的表面修饰氨基的介孔硅球
CN112294846A (zh) * 2020-10-22 2021-02-02 清华大学深圳国际研究生院 干细胞微球及其应用
CN112294846B (zh) * 2020-10-22 2023-03-21 清华大学深圳国际研究生院 干细胞微球及其应用
CN114949361A (zh) * 2021-12-31 2022-08-30 浙江金时代生物技术有限公司 一种用于子宫内膜修复的聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架与人脐带间充质干细胞复合物的制备方法

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