CN112294846B

CN112294846B - 干细胞微球及其应用

Info

Publication number: CN112294846B
Application number: CN202011137300.6A
Authority: CN
Inventors: 马少华; 徐冰; 胡志伟; 曹远雄; 邢新会
Original assignee: Shenzhen International Graduate School of Tsinghua University
Current assignee: Shenzhen International Graduate School of Tsinghua University
Priority date: 2020-10-22
Filing date: 2020-10-22
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2040-10-22
Also published as: CN112294846A

Abstract

本发明公开了干细胞微球及其应用。该干细胞微球包括生物相容性胶体球和分散在生物相容性胶体球内的干细胞。根据本发明实施例的干细胞微球，至少具有如下有益效果：该干细胞微球在干细胞外包覆生物相容性胶质形成生物相容性胶体球，使其兼具流动性和粘附性，不受限于移植条件和空间限制，可适应不同移植环境。在通过无创形式移植进入受试者患处后，干细胞的保有率大幅提高。

Description

干细胞微球及其应用

技术领域

本发明涉及干细胞领域，尤其是涉及一种干细胞微球及其应用。

背景技术

子宫内膜损伤常见于人为的流后手术或刮宫操作，使得子宫内膜基底层受到损伤，伴有周围纤维组织增生和粘连形成。损伤可能伴随的局部感染和炎症会造成细胞再生修复障碍，血管形成减少，致密纤维组织形成。子宫内膜损伤修复受阻会导致薄型子宫内膜，从而引起月经减少或闭经、不孕或反复流产，严重影响育龄期妇女患者的生育能力。

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSC)来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞最初在骨髓中发现，具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控等多种功能，主要存在于子宫内膜、脂肪和骨髓中。间充质干细胞在体内或体外的诱导下，可以分化为脂肪、骨、神经等多种组织细胞，连续传代培养仍具有多向分化潜能，免疫原性低、移植后能够形成稳定嵌合，可以作为一种理想的供异体移植的细胞。目前的间充质干细胞产品大多以支架复合物或直接注射的形式进行使用。采用胶原支架的方式虽然可以促进子宫内膜组织再生，实现功能性修复，但通常需要经过手术植入，对患者的身体负担较大。直接注射治疗的方式虽然无需另行植入手术，但注射的间充质干细胞的细胞保有率低。因此，有必要提供一种无需手术植入且具有较高保有率的干细胞产品。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种干细胞微球，该干细胞微球在使用时无需手术植入且具有较高的保有率。

本发明还提出一种上述干细胞微球的制备方法以及包含上述干细胞微球的产品。

本发明的第一方面，提供干细胞微球，该干细胞微球包括生物相容性胶体球和分散在生物相容性胶体球内的干细胞。

根据本发明实施例的干细胞微球，至少具有如下有益效果：

该干细胞微球在干细胞外包覆生物相容性胶质形成生物相容性胶体球，使其兼具流动性和粘附性，不受限于移植条件和空间限制，可适应不同移植环境。在通过无创形式移植进入受试者患处后，干细胞的保有率大幅提高。

根据本发明的一些实施例，生物相容性胶体球的杨氏模量不大于1000Pa。杨氏模量越高，干细胞微球越硬，对于其内部的细胞的生长就越不利。生物相容性胶体球的杨氏模量不大于1000Pa时，干细胞微球兼具良好的流动性和支撑性，为分散在其中的干细胞提供良好的三维生长微环境。

根据本发明的一些实施例，生物相容性胶体球的材料为Matrigel基质。Matrigel基质是一种天然水凝胶材料，采用Matrigel基质作为生物相容性胶体球的材料使用，其所具有的3D结构能够有效促进干细胞在微球内部生长；同时，通过基质的交联固化作用，适宜于细胞在其中均匀分散而封装和固定；另外，Matrigel基质与肿瘤细胞基质的性质更加相似，更能够模拟干细胞在体内的生存环境，从而进一步提高干细胞微球的损伤修复及其它一些作用和持效性。

根据本发明的一些实施例，干细胞为间充质干细胞。间充质干细胞的多向分化潜能较强，制备得到的干细胞微球能够起到较好的损伤修复效果。

根据本发明的一些实施例，间充质干细胞为脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞中的至少一种。

根据本发明的一些实施例，间充质干细胞为原代细胞或原代细胞在传代10代以内的传代细胞。传代10代以内的干细胞可以保证细胞正常的遗传基础不发生较大的改变，包括损伤修复在内的生理功能维持在相对稳定的水平。

本发明的第二方面，提供干细胞微球的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

(1)将干细胞与生物相容性材料混合，得到混合液；

(2)将混合液分散在生物惰性液中，形成生物相容性胶体球；

其中，生物惰性液与生物相容性材料互不相溶。

根据本发明实施例的制备方法，至少具有如下有益效果：

利用与生物相容性材料互不相溶的生物惰性液体，使分散到其中的生物相容性材料集聚成球形，从而得到包含干细胞的干细胞微球。

根据本发明的一些实施例，混合液中，干细胞的浓度为1×10⁶～1×10⁸个/mL。该干细胞微球中干细胞数量处在较为合适的比例，能够起到较好的损伤修复作用。

根据本发明的一些实施例，生物惰性液为氟油。

本发明的第三方面，提供干细胞制剂，该干细胞制剂包括上述的干细胞微球。

根据本发明的一些实施例，该干细胞制剂还包括缓冲液，干细胞微球分散于缓冲液；缓冲液优选为磷酸盐缓冲液。

本发明的第四方面，提供子宫内膜损伤修复产品，该子宫内膜损伤修复产品包括上述的干细胞微球或上述的干细胞制剂。子宫内膜损伤修复产品的形式包括但不限于药物、医疗器械等。

本发明的第五方面，提供上述的干细胞微球或上述的干细胞制剂在制备子宫内膜损伤修复产品中的应用。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例的动物模型验证实验的实验过程示意图。

图2为本发明实施例的大鼠受孕后的胚胎个数的结果，A为假手术组的照片，B为模型组的照片，C为对照组的照片，D为实验组照片，E为胚胎个数统计结果。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。

本发明的描述中，除非另有明确的限定，设置、安装、连接等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本发明中的具体含义。

本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

本发明的描述中，参考术语“生物相容性胶体球”是指主要由生物相容性材料制备而成，具有球形或近球形的形状的胶体球。其中的“生物相容性”是指材料与宿主(主要是人体，也包括其它动物体)之间的相容性。材料对特定的生物组织、生物组织对材料产生恰当的相互影响和作用。这种生物相容性材料可以包括但不限于：人白蛋白、生物工程人白蛋白、聚氨基酸、海藻糖、壳聚糖、海藻酸盐等。

本发明的描述中，参考术语“Matrigel基质”是一种来源于EHS小鼠肉瘤的基底膜基质，其中含有约60％层粘连蛋白、30％IV胶原和8％的巢蛋白，以及基底膜聚糖、TGF-β、表皮生长因子、类胰岛素生长因子、组织纤溶酶原及其他生长因子。

本发明的描述中，参考术语“生物惰性液”是指由生物惰性材料形成的液相介质。其中，生物惰性材料是指在生物环境中能够保持稳定，不发生或仅发生微弱化学反应的生物医学材料。考虑到与上述的生物相容性材料互不相溶，这种生物惰性材料可以包括但不限于氟油或其它惰性亲油性液体。

实施例1

本实施例提供一种干细胞微球，该干细胞微球的制备方法如下：

步骤1：生理盐水洗涤脐带，充分剪碎后，置入培养瓶中培养一周，换液，传代，胰酶消化，收集沉淀，生理盐水混匀，控制细胞密度为2×10⁷个/mL，得到脐带间充质干细胞(UC-MSCs)溶液。

步骤2：取0.3mL的脐带间充质干细胞溶液与0.3mL的Matrigel基质胶在4℃条件下混合后，加入到1毫升注射器中。

步骤3：取6mL氟油(HFE-7000)在室温条件下加入到10毫升注射器中，1毫升注射器与10毫升注射器分别连接三通装置形成两条进液液路，在三通装置中混合，Matrigel基质胶在氟油的分割下形成若干的内部包覆有干细胞的微球。其中，1毫升注射器的推进速度为20μL/分钟，10毫升注射器的推进速度为200μL/分钟。

步骤4：形成的干细胞微球37℃的条件下孵育约20分钟，从三通装置的输出管收集到离心管中或重悬到磷酸盐缓冲液中。

实施例2

动物模型验证

图1是本实施例的动物模型验证实验的过程的示意图。参考图1，该验证实验包括以下步骤：

1.大鼠子宫内膜损伤模型的建立

利用宫腔导管贯穿大鼠Y型宫腔的一侧，给予95％无水乙醇经5min损伤大鼠子宫内膜组织，使其子宫内膜损伤。

用明胶(浓度为6％)、谷氨酰胺转胺酶的饱和溶液按体积比2.5:1充分混合后，置于注射器中，涂抹于子宫内膜受损部位，约待5分钟后凝固，抑制子宫内膜上皮的再生，防止受损部位发生粘连，从而建立大鼠子宫内膜损伤模型。

2.干细胞移植

60只雌性大鼠采用单纯随机抽样方法，分为假手术组、模型组、对照组和实验组，其中，假手术组仅行开关腹，模型组在模型建立后不进行其它处理，对照组在模型建立后注入Matrigel基质胶0.1mL，实验组在模型建立后注入实施例1收集到的干细胞微球0.1mL。

术后当天将雌性大鼠与雄性大鼠同笼，次日发现大鼠阴栓作为受孕第1天，受孕10天后，麻醉下开腹观察大鼠双侧子宫角的胚胎个数。

结果如图2所示，图2是本实施例的大鼠受孕后的胚胎个数的结果，A为假手术组的照片，B为模型组的照片，C为对照组的照片，D为实验组照片，E为胚胎个数统计结果。从上述结果可以看出，假手术组的胚胎数量最多，而且没有死胎现象；模型组的子宫角的胚胎数量稀疏，且有明显的死胎现象；对照组的子宫角的胚胎数与模型组相差不大，但胚胎生长状况良好；而实验组的子宫角的胚胎数低于假手术组但明显高于对照组和模型组，同时，胚胎生长状况良好，死胎现象较少。该结果表明，采用本发明实施例所提供的干细胞微球有效提高了干细胞存活率，在受损子宫内膜的功能修复中具有明显效果，妊娠率显著提高。因而，可以用作制备子宫内膜损伤修复产品。

本发明实施例所提供的干细胞微球在制备时可以灵活控制干细胞在微球中的比例，使干细胞微球兼具流动性和粘附性，不受限于移植条件和空间限制，从而能够适应于不同移植环境。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims

1.干细胞微球在制备子宫内膜损伤修复产品中的应用，其特征在于，所述干细胞微球包括生物相容性胶体球和分散在所述生物相容性胶体球内的干细胞，所述干细胞微球通过以下方法制得：

（1）将干细胞与生物相容性材料混合，得到混合液，所述混合液中所述干细胞的浓度为1×10⁶~1×10⁸个/mL；

（2）将所述混合液分散在生物惰性液中，形成生物相容性胶体球；

其中，所述生物惰性液与所述生物相容性材料互不相溶；

所述生物相容性胶体球的杨氏模量不大于1000Pa，所述生物相容性胶体球的材料为Matrigel基质，所述干细胞为间充质干细胞，所述生物惰性液为氟油。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞中的至少一种。