CN113201525B - 干细胞微球组及干细胞的体外扩增方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了干细胞微球组及干细胞的体外扩增方法和应用。本申请的第一方面，提供干细胞微球组，该干细胞微球组包括：第一微球，第一微球包括基质球体和分散在基质球体内的干细胞，基于第一微球的总体积，干细胞的体积为2％以上；培养基质，第一微球分散于培养基质。当第一微球内的干细胞所占体积在2％以上时，第一微球内的高密度干细胞表现出较为明显的高增殖和高迁移率特性，在这种情况下，将第一微球分散于培养基质中，得到相应的干细胞微球组，第一微球之间的间隙可以为其中的干细胞的生长、迁移创造良好的外部环境，实现干细胞微球的扩增效用最大化，在有限数量干细胞的情况下，达到更好的扩增效果。

Description

干细胞微球组及干细胞的体外扩增方法和应用
技术领域
本申请涉及干细胞技术领域，尤其是涉及干细胞微球组及干细胞的体外扩增方法和应用。
背景技术
干细胞产业链大致可以分为上游的干细胞库、中游的干细胞增殖及其研究以及下游的干细胞治疗三个部分。其中，中游的干细胞增殖是干细胞产业链中最重要的一环，其原因在于：人体内能够分离出的干细胞的数量有限，往往难以达到临床应用所需的数量级要求，必须经过体外的扩增培养获得大量的高质量干细胞。干细胞体外扩增方法中目前常用的是通过细胞因子的添加来实现，虽然目前已有较多的组合尝试，但扩增的数量均不乐观。因此，有必要寻找一种能够更高效扩增干细胞的方法。
发明内容
本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种具有良好扩增效果的干细胞体外扩增方法。
本申请还提出一种具有良好扩增效果的干细胞微球组。
本申请还提出一种上述干细胞微球组的应用。
本申请的第一方面，提供干细胞微球组，该干细胞微球组包括：
第一微球，第一微球包括基质球体和分散在基质球体内的干细胞，基于第一微球的总体积，干细胞的体积为2％以上；
培养基质，第一微球分散于培养基质。
根据本申请实施例的干细胞微球组，至少具有如下有益效果：
当第一微球内的干细胞所占体积在2％以上时，第一微球内的高密度干细胞表现出较为明显的高增殖和高迁移率特性，在这种情况下，将第一微球分散于培养基质中，得到相应的干细胞微球组，第一微球之间的间隙可以为其中的干细胞的生长、迁移创造良好的外部环境，实现干细胞微球的扩增效用最大化，在有限数量干细胞的情况下，达到更好的扩增效果。
其中，基质球体是指由具有良好生物相容性的生物功能材料制备得到的微球，生物相容性是指材料与宿主(例如人体)之间的相容性，生物功能材料的非限制实例包括天然和/或人工的能够支持干细胞生长的基质材料，例如人白蛋白、生物工程人白蛋白、聚氨基酸、海藻糖、壳聚糖、海藻酸盐、明胶等材料中的至少一种；进一步还可以是Matrigel基质胶，Matrigel基质胶是一种来源于EHS小鼠肉瘤的基底膜基质，其中含有约60％层粘连蛋白、30％IV胶原和8％的巢蛋白，以及基底膜聚糖、TGF-β、表皮生长因子、类胰岛素生长因子、组织纤溶酶原及其他生长因子。Matrigel基质胶所具有的3D结构能够有效促进干细胞在微球内部的生长；同时，基质的交联固化作用，适宜于干细胞在微球中均匀分散；另外，Matrigel基质胶能够较好地模拟干细胞在体内的生存环境，从而使得第一微球中扩增后的干细胞的生理特质进一步拟合天然干细胞。培养基质是指任选能够实现干细胞生长和增殖的培养的培养基材料。
在本申请的一些实施方式中，第一微球按照预设的分散方式定点分散于培养基质中。为了实现更好的分散效果，方便后续培养过程中干细胞的生长和增殖，第一微球优选以特定的方式分散在培养基质中。其中，预设的分散方式定点分散是指培养基质中第一微球呈现出一定的分布规律，例如可以是任意相邻的第一微球在至少一个维度上呈现等间距分布的方式或其它规律分布方式。
在本申请的一些实施方式中，第一微球的直径为100～1000微米，第一微球内干细胞的密度为100～10000个/球。当第一微球的体积和第一微球内干细胞的密度在上述范围时，第一微球内的高密度干细胞表现出更加明显的高增殖和高迁移率特性，能够使得干细胞微球组在培养时具有更高的扩增效率。
在本申请的一些实施方式中，培养基质形成第二微球，第一微球和第二微球相互堆叠形成干细胞微球组。相互堆叠是指在干细胞微球组中，第一微球和第二微球存在至少一部分相互交错排列，从而使得至少一个维度上存在第一微球彼此间隔设置的情形。另外，堆叠并不限定形成的干细胞微球组为三维的立体结构，而同样可以是指在一维或二维上堆叠形成的线结构或面结构。通过将培养基质固化为微球形式，从而更方便干细胞微球组中第一微球的分散和固定。
在本申请的一些实施方式中，任意两个第一微球之间间隔有若干个第二微球。任意的第一微球之间都通过至少一个第二微球进行间隔，从而为干细胞微球组中的所有干细胞提供合适的生长、迁移空间。
在本申请的一些实施方式中，第一微球中的干细胞为间充质干细胞。间充质干细胞的多向分化潜能较强，制备得到的干细胞微球组具有良好的损伤修复效果。其中，间充质干细胞进一步可以是脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞等间充质干细胞中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，第一微球和第二微球的基质球体所选择的材料对于其杨氏模量有一定要求，从而使微球兼具良好的流动性和支撑性，为分散在其中的干细胞提供良好的三维生长微环境。
本申请的第二方面，提供上述的干细胞微球组的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
制备第一微球和第二微球；
使第一微球和第二微球按照预设方式相互堆叠形成干细胞微球组。
根据本申请实施例的制备方法，至少具有如下有益效果：
本申请实施例的制备方法通过间隔的堆叠方法将包含干细胞的第一微球间隔开，为其中的干细胞提供相应的空间环境，使第一微球内高密度干细胞的高增殖和高迁移率特性能够充分发挥，从而有效提高干细胞微球组内的干细胞的扩增速率。
在本申请的一些实施方式中，相互堆叠的方法为：将第一微球和第二微球在微管道内间隔排列，随后将第一微球和第二微球由微管道内排出，按照预设方式相互堆叠。利用微管道进行打印，将第一微球和第二微球采用预设方式在微管道内间隔排列，从微管道内排出后按照预设方式相互堆叠，形成针对特定使用环境的干细胞微球组预设的结构。
在本申请的一些实施方式中，第一微球和第二微球的制备方法包括以下步骤：制备第一液滴和第二液滴，熟化后获得第一微球和第二微球。其中，熟化是指将液滴固化为相应的微球，具体的熟化方式包括但不限于对微球的环境温度、微球中的离子浓度、微球所处的光照等参数进行调节或引入大分子链或酶等，从而使得液滴中的原料发生交联反应而固化。
在本申请的一些实施方式中，第一微球的制备利用水油两相不相溶和周期性流动剪切原理，干细胞与水相基质混合后，利用与水相基质互不相溶的油相使其形成包含干细胞的液滴，并通过熟化作用形成对应的微球。
本申请的第三方面，提供干细胞的体外扩增方法，该体外扩增方法包括以下步骤：
制备第一微球，第一微球包括基质球体和分散在基质球体内的干细胞，基于第一微球的总体积，干细胞的体积为2％以上；
将第一微球分散于培养基质进行培养。
根据本申请实施例的体外扩增方法，至少具有如下有益效果：
当第一微球内的干细胞所占体积在2％以上时，第一微球内的高密度干细胞表现出较为明显的高增殖和高迁移率特性，在这种情况下，将第一微球分散于培养基质中，第一微球之间的间隙可以为其中的干细胞的生长、迁移创造良好的外部环境，实现干细胞微球的扩增效用最大化，在有限数量干细胞的情况下，达到更好的扩增效果。
其中，培养可以是本领域熟知的给予上述的干细胞微球组任选的合适温湿度、pH等条件下进行培养。
在本申请的一些实施方式中，第一微球按照预设的分散方式定点分散于培养基质中。其中，预设的分散方式定点分散是指培养基质中第一微球呈现出一定的分布规律，例如可以是任意相邻的第一微球在至少一个维度上呈现等间距分布的方式或其它规律分布方式。
在本申请的一些实施方式中，第一微球按照预设的分散方式定点分散于培养基质中的方式可以是通过将培养基质调整为对应的第二微球，使第一微球和第二微球按照预设方式相互堆叠实现定点分散。
在本申请的一些实施方式中，相互堆叠的方法为：将第一微球和第二微球在微管道内间隔排列，随后将第一微球和第二微球由微管道内排出，按照预设方式相互堆叠。利用微管道进行打印，将第一微球和第二微球采用预设方式在微管道内间隔排列，从微管道内排出后按照预设方式相互堆叠，形成针对特定使用环境的干细胞微球组预设的结构。
在本申请的一些实施方式中，培养时间为5天以上。优选的，培养时间在7天以上。
本申请的第四方面，提供按照上述的体外扩增方法获得的扩增产物。按照上述方法扩展得到的扩增产物中干细胞的数量有了较为明显的上升，因此，扩增产物相对的效用也更高。
本申请的第五方面，提供上述的干细胞微球组或扩增产物在制备干细胞修复产品中的应用。上述干细胞微球组或扩增产物表现出良好的干细胞扩增效率，能够应用到需要干细胞进行修复的相关产品中，其非限制性实例包括创伤修复(如皮肤损伤、心肌损伤、烧伤、脏器损伤等)、整形(如皮肤和脂肪移植)等相应的修复产品。
本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。
附图说明
图1是本申请的一种干细胞微球组的制备方法的部分过程的示意图。
图2是本申请的对比实验中实施例和对比例的干细胞物料的设置方法示意图。
图3是本申请的对比实验的干细胞体外扩增结果。
附图标记：第一微球111、第二微球112、氟油113、压缩空气114、第一管道121、第二管道122、培养基质200、第三微球210、块状胶220。
具体实施方式
以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。
下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。
在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
实施例1
本实施例提供一种干细胞微球组，该干细胞微球组的制备方法如下：
1.第一微球的制备
步骤1：生理盐水洗涤脐带，充分剪碎后，置入培养瓶中培养一周，换液，传代，胰酶消化，收集沉淀，生理盐水混匀，控制细胞密度为2×107个/mL，得到脐带间充质干细胞(UC-MSCs)溶液。
步骤2：取0.3mL的脐带间充质干细胞溶液与0.3mL的Matrigel基质胶在4℃条件下混合后，加入到1mL注射器中。
步骤3：取6mL氟油(HFE-7000)在室温条件下加入到10mL注射器中，1mL注射器与10mL注射器分别连接三通装置形成两条进液液路，在三通装置中混合，Matrigel基质胶在氟油的分割下形成若干的内部包覆有干细胞的微液滴。其中，1毫升注射器的推进速度为20μL/分钟，10毫升注射器的推进速度为200μL/分钟。
步骤4：形成的干细胞微液滴37℃的条件下孵育约20分钟，得到熟化后的第一微球。
制备得到的第一微球的直径为100～1000微米，其中干细胞的密度为100～10000个/球，第一微球中干细胞的体积在2％以上。
2.第二微球的制备
采用与上述第一微球的制备过程类似的方法将Matrigel基质胶单独直接制备得到第二微球。
3.干细胞微球组的制备
参考图1，为干细胞微球组制备方法的部分过程的示意图，所用的微管道为三通管道，包括横向的第一管道121和竖向的第二管道122，第一管道121左侧开口，右侧与第二管道122相连通，而第二管道122的上下两侧均有开口。第一微球111、第二微球112以及用于分散第一微球111和第二微球112的分散相的氟油113均由第一管道121的左侧开口输入并向右侧移动，运动到第一管道121和第二管道122的交汇处后，在第二管道122上侧输入的压缩空气114的作用下向下排出第二管道122，随着第一微球111和第二微球112的排出移动三通管道，从而相互堆叠形成干细胞微球组。
其中，第一管道121内，相邻的两个第一微球111之间以若干个第二微球112等间距分散、间隔排列。
对比实验
按照实施例1中的方法制备第一微球，以及干细胞密度和体积占比更低的第三微球，另外还制备含有一定数量相同干细胞的Matrigel基质块状胶。
在12孔板内加入3mL培养基(DMEM F12培养基+10％胎牛血清+1％双抗)，随后注入三维空间上定点排布的第一微球作为实施例2、注入三维空间上定点排布的第二微球作为对比例1、注入块状胶作为对比例2，保持每个孔内的初始干细胞数量在4万左右，实施例2、对比例1和对比例2每组3个重复，37℃培养箱(5％CO2)恒温培养。
注入方式参考图2，为实施例和对比例注入后的局部示意图。其中，A为实施例2，B为对比例1，C为对比例2。从图中可以看到，实施例2中在培养基质200中均匀等间距分布有第一微球111，对比例1中培养基质200中均匀等间距分布有干细胞密度较低的第三微球210，第三微球210的分布密度要高于实施例2中的第一微球111，而在对比例2中，仅有干细胞总数量和干细胞占比与实施例2相类似的块状胶220分布在培养基质200中。
培养过程中分别记录细胞数量，结果如图3所示，其中，A为干细胞增殖的计数结果，B为不同生长时间的干细胞的照片。从图3中可以看出，第0天各个组别中干细胞数量相同；第三天，对比例1中干细胞的扩增量略高于对比例2以及实施例1；但在第三天以后到第七天这一时间段内，实施例1的干细胞的扩增效率有了明显提高，最终扩增得到的干细胞的数量相比于对比例1或对比例2约为两倍左右。
上述结果表明，在初始细胞数相同的情况下，采用高密度干细胞微球在基质中的点阵分布所表现出的增殖能力显著优于低密度的干细胞微球或块状胶，高密度干细胞微球之间基质所提供的间隙能够为干细胞的生长、迁移创造更好的外部环境，从而实现更好的干细胞扩增效果，有利于对扩增得到的产物进行进一步使用，能够应用到多种损伤情况下，如肌肉、皮肤、烧伤、肝脏、整形(皮肤、脂肪等)等多种用途的干细胞修复产品中。
基于上述对比实验结果，本申请进一步提供以培养基质形成的第二微球作为替代的干细胞微球组，更具刚性的第二微球代替液态或凝胶态的培养基质对第一微球进行分散，保证第一微球以更加固定的方式分散在其中，能够更稳定持效性保持其分散效果，从而维持其中干细胞的高增殖和高迁移率特性，稳固其扩增效率。
上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (6)

1.干细胞微球组，其特征在于，包括：
第一微球，所述第一微球包括基质球体和分散在所述基质球体内的干细胞，基于所述第一微球的总体积，所述干细胞的体积为2%以上，所述第一微球的直径为100~1000微米，所述第一微球内所述干细胞的密度为100~10000个/球，所述基质球体是由Matrigel基质胶或明胶中的至少一种制备得到的微球；
培养基质，所述培养基质形成第二微球，所述培养基质为Matrigel基质胶或明胶中的至少一种；
其中，所述第一微球与所述第二微球按照预设方式相互堆叠实现定点分散，使所述第一微球分散于所述培养基质形成干细胞微球组；
所述相互堆叠为将所述第一微球和所述第二微球在微管道内间隔排列，随后将所述第一微球和所述第二微球由所述微管道内排出，按照预设方式相互堆叠。
2.权利要求1所述的干细胞微球组的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备第一微球和第二微球；
使所述第一微球和所述第二微球按照预设方式相互堆叠形成所述干细胞微球组；
所述相互堆叠的方法为：将所述第一微球和所述第二微球在微管道内间隔排列，随后将所述第一微球和所述第二微球由所述微管道内排出，按照预设方式相互堆叠。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一微球和所述第二微球的制备方法包括以下步骤：
将干细胞与水相基质混合，利用与水相基质互不相溶的油相使其形成包含干细胞的第一液滴，通过熟化作用使得液滴中的原料发生交联反应而固化，形成第一微球；
利用与水相基质互不相溶的油相使水相基质形成第二液滴，通过熟化作用使得液滴中的原料发生交联反应而固化，形成第二微球；
所述水相基质为Matrigel基质胶或明胶中的至少一种。
4.干细胞的体外扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备第一微球，所述第一微球包括基质球体和分散在所述基质球体内的干细胞，基于所述第一微球的总体积，所述干细胞的体积为2%以上，所述第一微球的直径为100~1000微米，所述第一微球内所述干细胞的密度为100~10000个/球，所述基质球体是由Matrigel基质胶或明胶中的至少一种制备得到的微球；
将所述第一微球分散于所述培养基质的第二微球中相互堆叠形成干细胞微球组，进行培养，所述培养基质为Matrigel基质胶或明胶中的至少一种，所述相互堆叠为将所述第一微球和所述第二微球在微管道内间隔排列，随后将所述第一微球和所述第二微球由所述微管道内排出，按照预设方式相互堆叠。
5.按照权利要求4所述的体外扩增方法获得的扩增产物。
6.权利要求1所述的干细胞微球组或权利要求5所述的扩增产物在制备干细胞修复产品中的应用。
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