CN114369565A - 高效生产细胞外囊泡的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了高效生产细胞外囊泡的方法。本申请所提供生产细胞外囊泡的方法包括以下步骤：取细胞与生物相容性材料混合，得到混合液；将混合液分散在生物惰性液中，形成生物相容性三维体；将生物相容性三维体置于细胞培养基中培养，收集上清得到细胞外囊泡。通过上述方法无损负载细胞形成三维体，构建良好的细胞通信微环境，有效提高细胞分泌细胞外囊泡的效率，达到细胞最大效用化利用。该方法普适性高、工艺简单、耗时短、均一性高，能够作为大规模生产细胞外囊泡的技术平台。能够保留细胞的原有形态、结构及功能，不会降低细胞活性、导致细胞凋亡或改变其表型，因此不会削弱细胞外囊泡的诊断、治疗等功能。

Description

高效生产细胞外囊泡的方法
技术领域
本申请涉及细胞技术领域，尤其是涉及高效生产细胞外囊泡的方法。
背景技术
随着国内外对细胞外囊泡(含外泌体)的研究逐渐增多，目前人们已提出多种提高细胞外囊泡产量的方法，包括利用生物反应器系统提供较大的表面积，方便细胞进行扩增，从而提高细胞外囊泡产量，但这种方式本身并不能够提高细胞分泌囊泡的效率，而且在规模化生产条件下，培养条件的同质性难以监测；还包括改变细胞培养条件的方法，例如通过施加机械刺激、改变细胞环境酸碱度、诱导细胞缺氧、升高细胞间离子霉素和钙离子含量等提高细胞外囊泡产量，但这种方式对于细胞完整性、细胞活性等有较为明显的影响，囊泡类型的同质性难以保证，并且有可能削弱细胞外囊泡的治疗潜力。
除此之外，研究人员尝试对细胞培养形式进行改进，通过悬滴培养细胞或悬浮培养细胞诱导细胞肌动蛋白解聚、利用微载体形成细胞微球为细胞生长提供高表面积与体积比等方法提高细胞外囊泡产量。然而，悬浮或悬滴培养的方式耗时较长、批次间异质性大。利用微载体形成细胞微球的方法需要复杂、繁琐的微载体制备工艺，而且细胞微球的形成需要复杂的装置与长时间的搅拌混合，需要精准控制细胞接种于微载体上的浓度与搅拌条件，防止细胞聚集体的早期形成损害细胞生长和特性。此外，不同的微载体表面底物会引起细胞表型的变化，如材料刚度、纳米形貌和局部曲率可能影响细胞增殖、蛋白表达水平降低等。因此，有必要提供一种更具普适性，能够保留细胞原有形态、结构及功能的高效生产细胞外囊泡的方法。
发明内容
本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种更具普适性，能够保留细胞原有形态、结构及功能的高效生产细胞外囊泡的方法。
本申请的第一方面，提供生产细胞外囊泡的方法，该方法包括以下步骤：
S1：取细胞与生物相容性材料混合，得到混合液；
S2：将混合液分散在生物惰性液中，形成生物相容性三维体，生物惰性液与生物相容性材料互不相溶；
S3：将生物相容性三维体置于细胞培养基中培养，收集上清得到细胞外囊泡。
根据本申请实施例的方法，至少具有如下有益效果：
本申请利用生物相容性三维体进行高效生产细胞外囊泡，通过上述方法无损负载细胞形成三维体，构建良好的细胞通信微环境，有效提高细胞分泌细胞外囊泡的效率，达到细胞最大效用化利用。该方法普适性高、工艺简单、耗时短、均一性高，能够作为大规模生产细胞外囊泡的技术平台。与传统二维贴壁细胞培养体系相比，可实现细胞分泌细胞外囊泡效率最大化，在有限细胞数量的条件下，提高细胞外囊泡产量。同时，通过生物相容性材料作为支架无损负载细胞形成三维体，能够保留细胞的原有形态、结构及功能，不会降低细胞活性、导致细胞凋亡或改变其表型，因此不会削弱细胞外囊泡的诊断、治疗等功能。
其中，混合液分散在不相溶中的生物惰性液中由于水油两相不相溶原理会形成独立的三维体。
可以理解的是，为了使三维体在细胞培养基中囊泡的分泌更加稳定高效，三维体可以均匀分散于细胞培养基中，保证不同位置的三维体中细胞的营养条件更为均一。同时，细胞培养基可以是本领域所知的任一种能够满足特定细胞培养和囊泡分泌条件的培养基。
在本申请的一些实施方式中，步骤S2中生物相容性三维体还经熟化作用固化形成。其中，经熟化作用固化的方法具体可以是加热固化，例如在适当的温度下孵育，从而将生物相容性三维体熟化，获得更好的支架载体性能，方便细胞的生长和细胞外囊泡的分泌。
在本申请的一些实施方式中，生物相容性三维体的大小为100～2000微米或生物相容性三维体的体积为0.0005～5微升。通过对生物相容性三维体大小的限制，使得细胞处于小微形态的三维体中，更有利于后续的分散和培养，从而能够在保证细胞生长增殖的同时提高其细胞外囊泡的分泌。
在本申请的一些实施方式中，生物相容性三维体中的细胞密度为每三维体100～100000个细胞。将三维体中的细胞密度限制在上述范围内，使得三维体中高密度排列的细胞间通信得到进一步改善，提高细胞外囊泡(含外泌体)的产量，最大化细胞利用率。
在本申请的一些实施方式中，三维体的形状可以是球形或近球形，同时根据工艺的不同，也可以形成棒状或其它可行的任意形状。当三维体为棒状时，其长径比介于0.1～1之间，以避免过于狭长或扁平的形状使得内部的细胞反而处于近于二维的培养环境，影响细胞的生长和细胞外囊泡分泌。
在本申请的一些实施方式中，细胞外囊泡的直径在50～300nm。该方法制备得到的细胞外囊泡包含微泡和外泌体两种细胞外囊泡，具备多种用途，如调节适应性和先天免疫反应、充当运送物质的载体(蛋白质和化疗药物等)、作为肿瘤标志物、治疗心血管疾病及神经系统疾病、组织修复与再生等。
在本申请的一些实施方式中，生物相容性材料为生物相容性较好、杨氏模量低于100kPa的多孔材料。其中，生物相容性好包括材料具有较好的组织相容性，其能够有利于细胞的吸附、不会出现抑制细胞生长或者诱发细胞的免疫反应等可能会影响细胞的正常生长和囊泡分泌的情况。杨氏模量则与材料的硬度有一定关系，杨氏模量过高可能会影响细胞的正常生长和分泌。
在本申请的一些实施方式中，多孔材料的孔径为0～100微米。
在本申请的一些实施方式中，生物相容性材料为明胶、基质胶以及诸如胶原蛋白等其他满足杨氏模量小于100kPa的生物相容性材料的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，生物惰性液为氟油。
在本申请的一些实施方式中，细胞选自干细胞、肿瘤细胞、纤维细胞(或成纤维细胞)、巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突状(DC)细胞、T细胞中的至少一种离体活细胞。其中，干细胞包括但不限于脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞等。
在本申请的一些实施方式中，生物相容性三维体在培养基中间隔分散排列，从而使不同位置的三维体都能够有接近的培养基环境，利于细胞外囊泡分泌的均一和稳定。
在本申请的一些实施方式中，步骤S3中生物相容性三维体置于细胞培养基中培养的方法为：将生物相容性三维体经气体喷射作用打入细胞培养基中培养至细胞密度为60～70％后，更换为无外泌体血清配制的培养基继续培养24～144h；优选的，培养48～96h。
在本申请的一些实施方式中，步骤S3中还包括从上清中纯化得到细胞外囊泡。纯化的方法包括超速离心、过滤离心、密度梯度离心、免疫磁珠、PS(磷脂酰丝氨酸)亲和、PEG-base沉淀等方法。
在本申请的一些实施方式中，纯化的方法为超速离心，包括低速离心去除死细胞和细胞碎片，再超高速离心除去蛋白质的步骤。具体包括：低速离心：1000～3000g离心10～30分钟后，取上清液8000～12000g离心10～30分钟，取上清液用0.22μm滤膜过滤；高速离心：100000～200000g离心30～90分钟，去除上清液，将沉淀重悬，再以100000～200000g离心30～90分钟，将沉淀重悬至适量PBS溶液中。
本申请的第二方面，提供一种细胞外囊泡组合物，该细胞外囊泡组合物采用上述的任一种方法收集得到。采用上述方法生产得到的细胞外囊泡具备多种用途，如调节适应性和先天免疫反应、充当运送物质的载体(蛋白质和化疗药物等)、作为肿瘤标志物、治疗心血管疾病及神经系统疾病、组织修复与再生等。
本申请的第二方面，提供上述的细胞外囊泡组合物在制备递送载体、药物、检测产品中的应用。其中，递送载体包括但不限于递送药物的载体，通过诸如内源性细胞外囊泡包装的机制等将待递送药物装载到囊泡中。药物可以是利用囊泡的生物学特性作为主要成分或辅助成分参与治疗，如心血管疾病、免疫疾病等。检测产品可以是利用诸如肿瘤患者中囊泡特异性成分作为标志物进行检测的相关产品。
本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。
附图说明
图1是本申请的实施例1的生产细胞外囊泡的方法中的部分步骤的示意图。
图2是本申请的实施例1的方法中生产得到的细胞外囊泡的透射电镜图(a)和尺寸分布(b)。
图3是本申请的实施例1和实施例2的方法生产的生物相容性三维体的照片。
图4是本申请的细胞外囊泡分泌实验的分泌数量结果比较。
图5是本申请的细胞增殖实验的结果，a为孵育48h后的细胞的荧光图像，从左到右为绿色荧光标记的囊泡、红色荧光标记的细胞以及不同尺度下的融合(Merge)图；b为不同浓度细胞外囊泡条件下孵育48h后的细胞的照片，从左到右为无囊泡、2.5μg/ml囊泡、5μg/ml囊泡。
具体实施方式
以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。
下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。
在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
实施例1
本实施例提供一种生产细胞外囊泡的方法，该方法包括以下步骤：
(1)生理盐水洗涤脐带，充分剪碎后，置入培养瓶中培养一周，换液，传代，胰酶消化，收集沉淀，生理盐水混匀，控制细胞密度为2×107个/mL，得到脐带间充质干细胞(UC-MSCs)溶液。取0.3mL的脐带间充质干细胞溶液与0.3mL的Matrigel基质胶在4℃条件下混合后，加入到1毫升注射器中，即为细胞-基质胶悬液。取6mL氟油(HFE-7000)在室温条件下加入到10毫升注射器中，即为油相，1毫升注射器与10毫升注射器分别连接三通装置形成两条进液液路，在三通装置中混合，Matrigel基质胶在氟油的分割下形成若干的内部包覆有干细胞的三维体。调节1毫升注射器和10毫升注射器的推进速度(即改变油相和细胞-基质胶悬液两者的流速比)，使得形成的三维体球的直径为100～2000微米左右，同时每个三维体球中的细胞数量控制在100～100000个不等。37℃下孵育20分钟使其熟化后，收集到离心管中。
(2)将收集到的干细胞的三维体球经气体喷射作用打入培养基中培养至细胞密度为60～70％，更换为无外泌体血清配制的培养基，培养96小时后，收集培养上清液。
(3)将收集的上清液转移至离心管中，在4℃下以转速2000g离心30分钟；取上清液转移至新离心管，在4℃下以转速10000g离心30分钟；取上清液，用0.22μm滤膜过滤后转移至新离心管，在4℃下以转速120000g离心70分钟，去除上清液，将沉淀重悬至PBS溶液，再以转速120000g离心70分钟，将沉淀重悬至适量PBS溶液中。
参考图1，为上述方法中的步骤2和步骤3的示意图，根据步骤1中的工艺的不同，例如调整油相和细胞-基质胶悬液两者的流速比，可以使得制备的三维体为球状、棒状或其它的不规则形状，将其打入培养基培养后，分泌出细胞外囊泡。
参考图2，为上述方法分泌的细胞外囊泡的电镜图和尺寸分布结果，从图中可以看出，分泌的细胞外囊泡在50～300nm不等，而通常在上述尺寸的细胞外囊泡包含微泡和外泌体两种细胞外囊泡，具备多种用途。
实施例2
本实施例提供一种生产细胞外囊泡的方法，与实施例1的区别在于，采用明胶代替Matrigel基质胶。
图3是实施例1和实施例2生产过程中的生物相容性三维体的照片，从图中可以看出，相比于实施例2中使用传统的硬质明胶，实施例1使用基质胶制备的三维体的杨氏模量较低，从而可以提供更好的细胞生长条件，圈出的三维体所示的空间内细胞扩增速率也更快。
细胞外囊泡分泌实验
分别采用实施例1～2以及对比例1～3的方法生产细胞外囊泡，采用相同的初始细胞数和相同培养时间后比较细胞外囊泡的分泌数量。对比例1～3设置如下：
对比例1：与实施例1的区别在于，脐带间充质干细胞采用传统的贴壁培养，具体过程如下：在10ml完全MSC培养基中以20×106细胞/ml的密度在T75培养瓶中培养细胞，并放置在37℃、5％CO2条件的加湿培养箱中静置孵育。待细胞贴壁生长，达到约80％的汇合并且正在积极增殖时，传代培养细胞。
对比例2：与实施例1的区别在于，脐带间充质干细胞采用块状Matrigel基质胶培养。
对比例3：与实施例2的区别在于，脐带间充质干细胞采用块状明胶培养。
结果如图4所示，从图中可以看出，与对比例1所示的传统二维贴壁细胞培养体系相比，实施例1或实施例2所形成的高密度生物相容性三维体具备更高的细胞外囊泡分泌效率。
将实施例2和实施例1进行比较可以发现，与硬质明胶材料相比，实施例1以基质胶作为支架材料由于材料较软，形成的细胞三维体具备更高的细胞外囊泡分泌效率，每细胞分泌细胞外囊泡数量是实施例2的6-10倍。
将对比例2和实施例1进行比较可以发现，基质胶形成的生物相容性三维体(分散相基质胶)与块状基质胶相比，分泌的细胞外囊泡数量明显更高，因此，实施例1所采用的生产方式是更能促进细胞分泌细胞外囊泡的培养形式。利用基质胶制备的高密度细胞三维体具备空间上的精准三维排列，为细胞生长、迁移创造良好外部环境，可改善细胞与细胞、细胞与基质之间的通信，从而可以达到更高的分泌效果。
细胞外囊泡性能实验
将实施例1生产出的细胞外囊泡与小鼠成肌细胞(C2C12)孵育48h，结果如图5所示，其中，a是PKH67标记的细胞外囊泡与C2C12的荧光图像，从图中可以看出，在细胞中可以观察到带荧光的囊泡，表明孵育48h后细胞外囊泡被C2C12细胞所摄取。b是不同浓度的细胞外囊泡与C2C12孵育48h后的生长结果，从图中可以看出，实施例1生产的细胞外囊泡可以促进成肌细胞的增殖，并且浓度越高，促进增殖的效果也就越明显。
实施例3
本实施例提供一种生产细胞外囊泡的方法，与实施例1的区别在于，采用纤维细胞进行生产。该方法能够达到与实施例1类似的高效分泌效率。
实施例4
本实施例提供一种生产细胞外囊泡的方法，与实施例1的区别在于，通过调节注射器的推进速度等条件，使得形成的三维体球的直径在2000微米左右。该方法能够达到与实施例1类似的高效分泌效率。
上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.生产细胞外囊泡的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：取细胞与生物相容性材料混合，得到混合液；
S2：将所述混合液分散在生物惰性液中，形成生物相容性三维体，所述生物惰性液与所述生物相容性材料互不相溶；
S3：将所述生物相容性三维体置于细胞培养基中培养，收集上清得到细胞外囊泡。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物相容性三维体的大小为100～2000微米或所述生物相容性三维体的体积为0.0005～5微升。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物相容性三维体中的细胞密度为每三维体100～100000个细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述生物相容性三维体经熟化作用固化形成。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞外囊泡的直径在50～300nm。
6.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，所述生物相容性材料的杨氏模量小于100kPa。
7.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，所述生物惰性液为氟油。
8.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞选自干细胞、肿瘤细胞、纤维细胞、巨噬细胞、NK细胞、DC细胞、T细胞中的至少一种。
9.细胞外囊泡组合物，采用权利要求1至8任一项所述的方法收集得到。
10.权利要求9所述的细胞外囊泡组合物在制备递送载体、药物、检测产品中的应用。
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