CN115537387B - 一种无支架3d微组织及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于再生医学及组织工程技术领域，涉及一种无支架3D微组织及其构建方法，所述方法包括如下步骤：1)将人源间充质干细胞体外衍生的脱细胞细胞外基质颗粒化作为微载体与干细胞的细胞悬液混合，静止孵育至所述细胞深入所述微载体的内部；2)将静止孵育后的细胞与微载体进行旋转共培养，得到所述3D微组织。本发明在整个培养过程中不涉及细胞与外源性支架的复合问题，细胞种植密度均匀，不存在细胞与支架生物相容性的问题，对人体安全，操作简单，临床可采用注射方式应用于多场景缺损的治疗或修复。

Description

一种无支架3D微组织及其构建方法
技术领域
本发明属于再生医学及组织工程技术领域，涉及一种无支架3D微组织及其构建方法。
背景技术
3D微组织构建属于三维培养方式。三维培养方式分为依赖支架材料的培养(支架材料如PLGA等高分子聚合物，壳聚糖、胶原等)和无支架材料的三维培养。无支架材料的三维培养主要是通过细胞-细胞间相互作用，分泌、保留细胞外基质形成的三维多细胞培养物。无支架材料的三维培养相比于同体积的依赖支架材料的培养具有更高的细胞负载量，更好的细胞投送效率，与宿主组织更好结合，且不存在支架材料不降解或降解过程与组织再生过程不匹配，支架材料或其代谢产物产生免疫反应等负面效应。
无支架材料的三维培养目前大家认为包括细胞膜片(cell sheet)和微组织(microtussue)。细胞膜片实质属于多层细胞的二维培养，培养过程中由于营养物质渗透问题，会有大量死细胞的存在，进而影响应用效果。同时目前在实际高质量细胞膜片获得过程中往往需要特殊的培养条件，操作过程较为复杂、要求高。微组织是指直径在100～500微米之间的，在受控培养条件下，由分散的细胞依赖其自组装特性产生的细胞聚集体。常见制备方法包括悬滴法、微流控法、超低吸附培养法、生物反应器法等，这些方法均需要特殊的培养设备和条件支持，无法克服微组织构建过程中细胞类型高度依赖的问题，难以解决构建的三维培养物后续调控生长分化及进程。
发明内容
本发明目的在于提供一种无支架3D微组织及其构建方法。
针对上述实际问题，本发明采用人源间充质干细胞体外衍生的脱细胞细胞外基质作为有型支架，作为载体型培养基，接种细胞进行培养，该支架具有细胞外基质的结构和功能，不仅可以根据外在定型维持微组织形态，还可以通过调控细胞分布迁移，生长分化，而影响微组织的再生修复能力；同时作为生物降解型组织诱导性生物材料，该有型支架反过来受到所接种细胞的生物学调控，从而将有型内化为无型，与细胞合为一个有机整体，成为微组织的一部分。
一方面，本发明提供了一种无支架3D微组织的构建方法，包括如下步骤：
1)将人源间充质干细胞体外衍生的脱细胞细胞外基质颗粒化作为微载体与干细胞的细胞悬液混合，静止孵育至所述细胞深入所述微载体的内部；
2)将静止孵育后的细胞与微载体进行旋转共培养，得到所述3D微组织。
在一些实施方案中，所述微载体的粒径大小为50～1000um；优选地，所述微载体的粒径为100～200um。
在一些实施方案中，所述微载体通过将所述脱细胞细胞外基质于液氮下研磨成粉，过筛，Co60照射灭菌得到；优选地，所述微载体通过将所述脱细胞细胞外基质于液氮下研磨成粉，分别过200um网筛和100微米网筛，收集100～200um的颗粒，Co60照射灭菌后得到。
在一些实施方案中，以微载体的干重及细胞悬液的体积计，所述微载体与细胞悬液的混合比例为：1～5mg的微载体/5～200ul的细胞悬液，所述细胞悬液中的干细胞浓度为1×103～10×103/ul；优选地，所述微载体与细胞悬液的混合比例为：2～3mg的微载体/40～60ul的细胞悬液，所述细胞悬液中的干细胞浓度为5×103～10×103/ul；优选地，所述微载体与细胞悬液的混合比例为：2mg的微载体/50ul的细胞悬液，所述细胞悬液中的干细胞浓度为8×103/ul。
在一些实施方案中，所述静止孵育的条件为：37℃，5％CO2的培养箱中孵育10～60分钟；优选地，所述静止孵育的条件为：37℃，5％CO2的培养箱中孵育25～35分钟。
在一些实施方案中，所述旋转共培养包括如下步骤：
向孵育完成后的含有细胞的微载体悬液中加入培养液，混匀；
将混匀后的悬液转移至悬浮培养生物反应器内继续培养。
在一些实施方案中，所述悬浮培养生物反应器选自：3D
Figure GDA0004259344510000021
miniSPIN生物反应。
在一些实施方案中，所述培养液包括：含10％胎牛血清的DMEM。
在一些实施方案中，所述培养的条件为：将旋转的起始速度控制为12转/分钟，旋转培养30分钟后，休息30分钟，再重复上述操作2次之后将旋转速度改为30转/分钟，每持续旋转三天换一次培养液，持续培养13～15天。
在一些实施方案中，所述人源间充质干细胞可以包括：骨髓来源间充质干细胞、脂肪来源间充质干细胞，脐带来源间充质干细胞中的任意一种；优选地，所述人源间充质干细胞包括：人脐带间充质干细胞。
在一些实施方案中，所述细胞悬液中的干细胞可以包括：胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、各种类型成体干细胞、各种类型终末细胞；优选地，所述干细胞包括：人脐带间充质干细胞。
在一些实施方案中，所述脱细胞细胞外基质为将人源间充质干细胞培养制备成细胞膜片，经脱细胞化、冷冻干燥处理后得到。
在一些实施方案中，所述细胞膜片为将融合度达60％～90％、传代数为4～10代的人源间充质干细胞通过交替更换细胞培养液一和细胞培养液二培养得到，所述培养的条件为：每隔3～5天，更换一次培养液，连续培养13～15天。
在一些实施方案中，所述细胞培养液一包括：基础培养基和添加物，所述添加物包括：抗坏血酸以及人血清白蛋白、L-谷氨酰胺、非必须氨基酸、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、bFGF、PDGF-BB、IGF-1、地塞米松或TGF-β中的一种或任意多种组合。
在一些实施方案中，所述添加物包括：人血清白蛋白1～5％、L-谷氨酰胺1～5mM、非必须氨基酸0.1～1mg/mL，胰岛素1～10ug/mL、转铁蛋白5～20ug/L，亚硒酸钠1～50ug/L，EGF 0.1～10ng/mL、bFGF 0.1～5ng/mL、PDGF-BB 1～10ug/mL、IGF-11～10ug/mL、地塞米松2～50nM，TGF-β0～5ng/mL、抗坏血酸10～100ug/mL；优选地，所述添加物包括：人血清白蛋白2％、L-谷氨酰胺2mM、非必须氨基酸0.2mg/mL、胰岛素10ug/mL、转铁蛋白20mg/mL、亚硒酸钠10mg/mL、EGF 10ng/mL、bFGF 1ng/mL、PDGF-BB 2ug/mL、IGF-11ug/mL、地塞米松5nM、TGF-β1ng/mL、抗坏血酸50ug/mL。
在一些实施方案中，所述基础培养基包括：a-MEM、DMEM或IMDM、Knock out DMEM/F12中任意一种；优选地，所述基础培养基包括：a-MEM。
在一些实施方案中，所述细胞培养液二包括：基础培养基和添加物，所述添加物包括：人血清白蛋白、L-谷氨酰胺、非必须氨基酸、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、bFGF、PDGF-BB、IGF-1、地塞米松或TGF-β中的一种或任意多种组合。
在一些实施方案中，所述添加物包括：人血清白蛋白1～5％、L-谷氨酰胺1～5mM、非必须氨基酸0.1～1mg/mL，胰岛素1～10ug/mL、转铁蛋白5～20ug/L，亚硒酸钠1～50ug/L，EGF 0.1～10ng/mL、bFGF 0.1～5ng/mL、PDGF-BB 1～10ug/mL、IGF-11～10ug/mL、地塞米松2～50nM，TGF-β0.1～5ng/mL；优选地，所述添加物包括：人血清白蛋白2％、L-谷氨酰胺2mM、非必须氨基酸0.2mg/mL、胰岛素10ug/mL、转铁蛋白20mg/mL、亚硒酸钠10mg/mL、EGF 10ng/mL、bFGF 1ng/mL、PDGF-BB 2ug/mL、IGF-11ug/mL、地塞米松5nM、TGF-β1ng/mL。
优选地，所述基础培养基包括：a-MEM、DMEM或IMDM、Knock out DMEM/F12中任意一种；优选地，所述基础培养基包括：a-MEM。
相较于现有技术，本发明将含有抗坏血酸与不含抗坏血酸的两种细胞培养液交替更换培养制备细胞膜片，进而将得到的细胞膜片进行脱细胞化、冷冻干燥处理后的脱细胞细胞外基质作为微载体与细胞混合共培养制备得到的可注射无支架的3D微组织，具有更高效的分化潜能、更强的免疫抑制活性和更高的促血管生成活性等性能；且本发明将含有抗坏血酸与不含抗坏血酸的两种细胞培养液交替更换培养制备细胞膜片，得到的细胞膜片的薄厚均匀，而当仅采用不含抗坏血酸的细胞培养液更换培养制备得到的细胞膜片不能成膜，本发明选择将含有抗坏血酸与不含抗坏血酸的两种细胞培养液交替更换培养制备所得到的细胞膜片既能成膜，还能节约成本。且本发明选择通过上述培养基配方对人源间充质干细胞进行培养制备细胞膜片，进而制备得到的人源间充质干细胞体外衍生的脱细胞细胞外基质3D微载体，对人源间充质干细胞还具有较好的成骨诱导分化能力，具备较高的促骨生成活性。
另一方面，本发明还提供了一种通过所述的方法构建得到的3D微组织。
再另一方面，本发明还提供了一种所述的方法或者所述的3D微组织在制备修复材料中的应用。
综上所述，本申请至少具有一项如下有益效果：
(1)本发明将人源间充质干细胞体外衍生的脱细胞细胞外基质进行微米级别颗粒化，形成人源间充质干细胞细胞体外衍生的脱细胞细胞外基质微载体；再将细胞与微载体混合后静止孵育至细胞深入载体内部，人源间充质干细胞体外衍生的脱细胞细胞外基质微载体孵育细胞，形成疏松的细胞3D类组织；将粘附有细胞的微载体在悬浮培养生物反应器内继续培养1～3周，疏松的细胞3D微组织在力学的刺激下，细胞继续增殖，并分泌基质，形成更大的组织团块，组织变得致密、光滑而具有光泽，构建得到了可注射的无支架3D微组织。经细胞学、组织学、转录组学和动物实验结果显示，本发明所构建的3D微组织具有正常人脐带间充质干细胞细胞表型及比2D环境培养的人脐带间充质干细胞更高效的分化潜能、强免疫抑制活性和高促血管生成活性等特点。
(2)本发明所提供的对人源间充质干细胞进行培养制备细胞膜片的培养基配方，使得制备得到的人源间充质干细胞体外衍生的脱细胞细胞外基质3D微载体，对人源间充质干细胞具有较优秀的成骨诱导分化能力，具备较高的促骨生成活性。
(3)本发明在整个培养过程中不涉及细胞与外源性支架的复合问题，细胞种植密度均匀，不存在细胞与支架生物相容性的问题，对人体安全，操作简单，临床可采用注射方式应用于多场景缺损的治疗或修复。
附图说明
图1为本发明实施例制备得到的人脐带间充质干细胞体外衍生的脱细胞细胞外基质微颗粒载体；
图2为本发明实施例构建所得到的人脐带间充质干细胞3D微组织的细胞活性展示图；
图3为本发明实施例所制备的3D微颗粒载体接种人脐带MSCs共培养，将细胞与微颗粒进行静止孵育后，再在生物反应器中进行旋转共培养和直接将细胞与微颗粒混合后放入生物反应器中进行培养的DAPI染色对比图；图3(A)为直接将细胞与微颗粒混合后放入生物反应器中进行培养的DAPI染色图；图3(B)为将细胞与微颗粒进行静止孵育后，再在生物反应器中进行旋转共培养图；
图4为本发明实施例所制备的3D微颗粒载体接种人脐带MSCs共培养与已公开方法构建的软骨细胞外基质源性微载体接种人脐带MSCs共培养后的HE染色对比图；图4(A)为已公开方法构建的软骨细胞外基质源性微载体接种人脐带MSCs共培养后的HE染色图；图4(B)为本发明实施例所制备的3D微颗粒载体接种人脐带MSCs共培养后的HE染色图；
图5为本发明实施例所构建的人脐带间充质干细胞3D微组织中的细胞表型图；
图6为本发明实施例所构建的人脐带间充质干细胞3D微组织中的细胞核型分析图；
图7为本发明实施例所构建的人脐带间充质干细胞3D微组织中的细胞单克隆形成实验结果图；
图8为本发明实施例所构建的人脐带间充质干细胞3D微组织中的细胞免疫调节GOterm分析结果图；
图9为本发明实施例所构建的人成骨细胞3D微组织的活性检测结果图；
图10为本发明实施例所构建的人成骨细胞3D微组织的表型检测结果图；
图11为经本发明实施例所构建的3D微载体成骨诱导分化液浸提液成骨诱导14天茜素红染色。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
本发明实施例所使用的材料与试剂具体信息如下：
PE-CD73、PE-CD90、PE-CD105、PE-HLA-DR、FITC-31、FITC-CD34、及FITC-IgG1和PE-IgG1抗体购买自：Miltenyi Biotec GmbH，Germany；DMEM培养基(dulbecco’smodifiedEagle’smedium，DMEM)、PBS、胰酶、LIVE/DEADTMCell Imaging Kit购买自：Invitrogen公司，USA；重组人血清白蛋白购买自：武汉禾元生物科技股份有限公司，中国；青霉素、链霉素购买自：华北制药有限公司，中国；人成纤维细胞生长因子(human fibroblast growthfactor，hFGF)购买自：Stemcell，加拿大；I型胶原酶购买自：Stemcell，USA；人脐带MSC成骨分化培养基购买自：赛业生物技术有限公司，中国；Trizol Reagent购买自：Invitrogen公司，USA；碱性磷酸酶染色试剂盒，茜素红染色试剂盒购买自：北京索莱宝生物技术有限公司，中国。
本发明实施例所使用的实验设备具体信息如下：CO2培养箱(Hereus B5060型，Germany)；倒置相差光学显微镜及成像系统(OLYMPUS，IX70，Japan)及光学显微镜及成像系统(OLYMPUS，BX51，Japan)；流式细胞仪(BD公司，USA)；3D
Figure GDA0004259344510000061
miniSPIN生物反应器(北京华龛生物科技有限公司，中国)。
关于本发明实施例中所使用的各培养基及成分的具体信息如下：
Figure GDA0004259344510000062
Figure GDA0004259344510000071
实施例1人脐带间充质干细胞3D微组织的制备
一、人脐带间充质干细胞体外衍生的脱细胞细胞外基质的制备
(1)取第四代人脐带充质干细胞(MSCs)置于特定细胞培养液中，在37℃、5％CO2的培养箱内进行培养，细胞培养液包括：基础培养基和添加物，基础培养基为a-MEM，添加物包括2％人血清白蛋白、2mM L-谷氨酰胺、0.2mg/mL非必须氨基酸、10ug/mL胰岛素、20mg/mL转铁蛋白、10mg/mL亚硒酸钠、10ng/mL EGF、1ng/mL bFGF、2ug/mL PDGF-BB、1ug/mL IGF-1、5nM地塞米松、1ng/mL TGF-β、含有50ug/mL抗坏血酸或者不含有50ug/mL抗坏血酸的共两种细胞培养液；将含有50ug/mL抗坏血酸与不含有50ug/mL抗坏血酸的细胞培养液进行交替换液，每3天换液一次，交替换液2次，可见培养后的人脐带MSCs迅速结成膜状。
(2)结成膜状的细胞膜片随着培养时间的延长，膜的边缘掀起，将所形成的细胞膜片用枪头挑起，移至15ml离心管，放-80度冰箱24小时，然后37度融化1小时，如此反复循环3次；放置蒸馏水中振荡洗涤3次，每次30分钟；1000-2000rpm的条件下离心10min，弃去上清，放-80度冰箱24小时后冷冻干燥，得到冷冻干燥后的脱细胞细胞外基质。
(3)将冷冻干燥后的脱细胞细胞外基质于液氮下研磨成粉，分别过100um网筛和200微米网筛，收集100-200um大小颗粒至50ml离心管，Co60照射灭菌，得到人脐带间充质干细胞体外衍生的脱细胞细胞外基质微颗粒，如图1所示。
二、人脐带间充质干细胞3D微组织的构建
(1)用DMEM(5％人血清白蛋白)加入5ng/ml hFGF的间充质干细胞培养基将人脐带间充质干细胞重悬，得到浓度为5*106细胞/ml的人脐带间充质干细胞悬液；
(2)无菌称取实施例1制备得到的微颗粒2mg放入1.5ml EP管，加入含有5*106细胞的100ul人脐带间充质干细胞悬液，将细胞悬液与微颗粒混合，放入37℃、5％CO2的培养箱内静止孵育30分钟至细胞深入微颗粒的内部。
(2)取出步骤(2)孵育完成后的EP管，加入400ul培养液(DMEM含10％胎牛血清)，用1ml移液枪头混匀后，将含有细胞的颗粒悬液移入3D
Figure GDA0004259344510000081
miniSPIN生物反应器中继续培养，转速按照如下方式分步进行调整：将旋转的起始速度控制为12转/分钟，旋转培养30分钟后，休息30分钟，再重复上述操作2次之后将旋转速度改为30转/分钟，每持续旋转三天换一次培养液，持续培养14天左右，构建得到人脐带间充质干细胞3D微组织。
对比例1
作为对比，该对比例与本发明实施例1中的不同之处仅在于，该对比例不包括步骤将细胞与微颗粒混合，放入37℃、5％CO2的培养箱内静止孵育30分钟至细胞深入微颗粒的内部，直接将细胞悬液与微颗粒混合后进行旋转共培养得到3D微组织，将该对比例培养得到的3D微组织与本发明实施例1培养得到的3D微组织进行DAPI染色，结果如图3所示，该对比例得到的3D微组织细胞主要在颗粒外围生长，而通过本发明实施例1的方法得到的预静止混合组细胞深入颗粒内部生长，更似真正的组织细胞生长方式。
对比例2
作为对比，将本发明实施例中所使用的人脐带间充质干细胞衍生的脱细胞细胞外基质微载体替换成现有技术公开的软骨细胞外基质源性微载体(授权公告号CN 105288737B)，该对比例为向软骨细胞外基质源性微载体中加入人脐带间充质干细胞的细胞悬液进行培养，该对比例除细胞外基质微载体来源不同之外，其他培养条件与本发明实施例1均一致。
培养所得到的结果如图4所示，在除细胞外基质微载体来源不同之外，其他培养条件与本发明实施例均一致的情况下，人脐带间充质干细胞在软骨细胞外基质源性微载体环境下相比于本发明实施例中所选择的人脐带间充质干细胞衍生的脱细胞细胞外基质微载体环境中增殖较为缓慢，不适于用于构建3D微组织。
对比例3
作为对比，该对比例与实施例1的不同之处在于，将本发明实施例1中的将含有50ug/mL抗坏血酸与不含有50ug/mL抗坏血酸的细胞培养液进行交替换液培养细胞膜片替换为将不含有抗坏血酸的细胞培养液培养，即除了所使用的细胞培养液不同，其他培养条件与实施例1均一样，结果培养所得到的细胞膜片不成膜状。
效果例1
一、人脐带间充质干细胞3D微组织的活性鉴定
按照说明书配制2x Live/dead染液(LIVE/DEADTMCell Imaging Kit，invitrogen)，加入等体积培养基，充分混匀，配制为1x工作液。将培养基更换为配制好的1x工作液，培养箱中继续培养2小时后，在20-25℃环境下继续孵育15分钟，体式荧光显微镜下观察拍照。活细胞可被染为绿色，死细胞可被染为红色，Live/dead染色可以大致判断细胞在3D载体的生命状态、分布、密度及形态。结果如图2所示：体式荧光显微镜下未见有染成红色的死细胞，绿色荧光细胞形态清晰可见，细胞成短梭形；随着培养时间的增加，细胞增殖，细胞与细胞间可见有丝状物连接，细胞状态良好。
二、对人脐带间充质干细胞3D微组织的细胞表面分子标记物进行鉴定
(1)收集培养后的人脐带间充质干细胞3D微组织，在I型胶原酶37℃磁力搅拌器作用下消化。将消化后的含细胞消化液用PBS清洗、1000r/min，离心10min，离心3遍后，将收集的细胞分别加入造血干细胞标志抗体：FITC-CD34、FITC-CD31；MSCs标志抗体：PE-CD73、PE-CD105和PE-CD90；主要组织相容性抗原复合物(major histocompability complex，MHC)标志抗体：PE-HLA-DR；观察人脐带干细胞造血标志抗体、MSCs标志抗体和MHC标志抗体表达情况，同时采用PE-IgG1和FITC-IgG1作为同行对照。人脐带干细胞与相应抗体在4℃冰箱中孵育30min，PBS洗涤并调整细胞浓度为1×16/ml，流式细胞仪检测。结果如图5所示，MSCs标志抗体：PE-CD73、PE-CD90和PE-CD105呈阳性；造血干细胞标志抗体：FITC-CD34和FITC-CD31呈阴性；MHC标志抗体：PE-HLA-DR呈阴性。
(2)收集培养后的人脐带间充质干细胞3D微组织，I型胶原酶37℃磁力搅拌器作用下消化。将消化后的含细胞消化液用PBS清洗、1000r/min，离心10min，离心3遍后，将收集的细胞种植于培养液为DMEM(5％人血清白蛋白)，加入5纳克/毫升hFGF的培养瓶中，37℃、5％CO2培养，培养至80-90％密度下，进行核型分析，结果如图6所示，核型分析结果显示核型正常46，xx。
三、对人脐带间充质干细胞3D微组织的相关功能进行鉴定
(1)收集培养后的人脐带间充质干细胞3D微组织，I型胶原酶37℃磁力搅拌器作用下消化。将消化后的含细胞消化液用PBS清洗、1000r/min，离心10min，离心3遍后，进行细胞单克隆形成实验，结果如图7所示，结果显示构建所得到的人脐带间充质干细胞3D微组织中的间充质干细胞具有更强的单克隆形成能力，更活跃的细胞增殖能力。
(2)收集培养后的人脐带间充质干细胞3D微组织，进行转录组学测序，测序结果如图8所示，结果表明本发明构建所得到的人脐带间充质干细胞3D微组织具有更高效的分化潜能、强免疫抑制活性和高促血管生成活性等特点。
实施例2人成骨细胞3D微组织的制备
一、人源间充质干细胞体外衍生的脱细胞细胞外基质制备：同实施例1；
二、人成骨细胞3D微组织的构建
(1)无菌称取微颗粒2mg放入1.5ml EP管，加入100ul含有5*105脐带间充质干细胞的悬液，放入37℃、5％CO2的培养箱内静止孵育30分钟。
(2)取出EP管，加入400ul培养液(含有5％人血清白蛋白的DMEM中加入5ng/mlhFGF)，用1ml移液枪头混匀后，将含有细胞的颗粒悬液移入3D
Figure GDA0004259344510000101
miniSPIN生物反应器。转速分步进行调整：将旋转的起始速度控制为12转/分钟，旋转培养30分钟后，休息30分钟，再重复上述操作2次之后将旋转速度改为30转/分钟，每持续旋转三天换成骨诱导培养液(人脐带MSC成骨分化培养基，赛业生物技术有限公司)一次，持续培养14天左右。
效果例2对人成骨细胞3D微组织进行鉴定
(1)人成骨细胞3D微组织的活性鉴定：同效果例1中的活性鉴定方法，按照说明书配制2x Live/dead染液(LIVE/DEADTMCell Imaging Kit，invitrogen)，加入等体积培养基，充分混匀，配制为1x工作液。将培养基更换为配制好的1x工作液，培养箱中继续培养2小时后，在20-25℃环境下继续孵育15分钟，体式荧光显微镜下观察拍照。活细胞可被染为绿色，死细胞可被染为红色，Live/dead染色可以大致判断细胞在3D载体的生命状态、分布、密度及形态，结果如图9所示：体式荧光显微镜下细胞形态清晰可见，生长状态良好，鲜有死细胞；分化7天时，细胞多为梭形、锥形；14天时，细胞比7天时密度增加，增殖明细，细胞多形态扁平、呈长方形，提示随着培养天数的增加，成骨细胞逐渐趋于成熟。
(2)人成骨细胞3D微组织的表型特征检测
收集诱导后的人成骨细胞3D微组织，4％多聚甲醛固定，进行组织形态学分析。茜素红染色：将组织切成5μm薄片，脱蜡复水，然后按照茜素红染色试剂盒说明书操作(茜素红染色试剂盒，索莱宝，中国)，并用奥林帕斯光学成像系统拍照。碱性磷酸酶染色：将组织切成5μm薄片，脱蜡复水，然后按照碱性磷酸酶染色试剂盒说明书操作(碱性磷酸酶染色试剂盒，索莱宝，中国)，并用奥林帕斯光学成像系统拍照，结果如图10所示：组织切片染色结果显示3D载体培养环境下，MSC更容易诱导成骨，诱导7天时，也有广泛深蓝褐色碱性磷酸酶和橘红色的茜素红和钙螯合物显示显示，提示3D载体诱导7天时，已有较成熟的骨生成，并且生成的骨细胞具有良好生物学功能。在骨形成早期，成骨细胞活性增强，大量分泌骨碱性磷酸酶,其活性越高，说明前成骨细胞向成熟的成骨细胞分化的越显然。碱性磷酸酶的活性是反应成骨细胞分化程度和功能状态的优秀指标。钙沉积则是骨细胞成熟的标志事件之一，茜素红与钙螯合形成橘红色复合物，常用来反应间充质干细胞体外诱导分化成骨的分化程度。
对比例4
作为对比，该对比例设置如下实验组：
A、直接使用成骨诱导分化培养基(人脐带MSC成骨分化培养基，赛业生物技术有限公司)直接诱导人脐带间充质干细胞进行成骨分化；
B、将通过发明实施例1中的方法制备得到脱细胞细胞外基质3D微颗粒(微载体)；通过3D微颗粒提取得到3D微颗粒成骨诱导分化培养基浸提液；使用得到的3D微颗粒成骨诱导分化培养基浸提液诱导人脐带间充质干细胞进行成骨分化；
C、该实验组与实验组B不同之处在于，培养细胞膜片所使用的细胞培养液不同，该实验组C为将实施例1中培养制备细胞膜片的细胞培养液中成分TGF-β去掉，其他条件均与实施例相同，制备得到通过不含有成分TGF-β的细胞培养液培养制备细胞膜片进而得到的脱细胞细胞外基质3D微颗粒(微载体)；通过3D微颗粒提取得到3D微颗粒成骨诱导分化培养基浸提液；使用得到的3D微颗粒成骨诱导分化培养基浸提液诱导人脐带间充质干细胞进行成骨分化；
上述实验组中，实验组B与实验组C中将3D微颗粒提取得到成骨诱导分化培养基浸提液的方法如下：准确称取0.5g 3D微颗粒材料放入15ml离心管内，加入5ml成骨诱导分化培养基，旋紧螺盖儿；37℃孵育72±2h；800g离心5分钟，吸取上清于新的无菌15ml离心管内，4℃保存备用，不超过2周。
通过体外诱导人脐带间充质干细胞的分化成骨效率检测上述实验组A、B、C中所使用的不同成骨分化培养基的促骨生成活性。结果如图11所示，在通过实验组B，即包含有TGF-β的细胞培养液培养所得到的3D微颗粒经提取得到的3D微颗粒成骨诱导分化培养基浸提液的培养诱导下，在成骨诱导分化14天时，茜素红染色广泛、颗粒粗大、颜色更深，即，成骨诱导分化14天时茜素红染色结果显示，含有成分TGF-β的细胞培养液培养所得到的3D微颗粒，其浸提液具有更优秀的成骨分化能力。
在此有必要指出的是，以上实施例和试验例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，使得本领域技术人员能够更加准确地理解本发明的发明思路以及操作方案，并不是对本发明的进一步限制，本领域技术人员在此基础上作出的非突出的实质性特征和非显著进步的改进，均属于本发明的保护范畴。

Claims (19)

1.一种无支架3D微组织的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）将人源间充质干细胞体外衍生的脱细胞细胞外基质颗粒化作为微载体与干细胞的细胞悬液混合，静止孵育至所述细胞深入所述微载体的内部；
2）将静止孵育后的细胞与微载体进行旋转共培养，得到所述3D微组织；
所述人源间充质干细胞为人脐带间充质干细胞；所述干细胞为人脐带间充质干细胞；
所述脱细胞细胞外基质为将人源间充质干细胞培养制备成细胞膜片，经脱细胞化、冷冻干燥处理后得到；所述细胞膜片为将融合度达60%~90%、传代数为4~10代的人源间充质干细胞通过交替更换细胞培养液一和细胞培养液二培养得到；
所述细胞培养液一包括：基础培养基和添加物，所述添加物包括：人血清白蛋白1~5%、L—谷氨酰胺 1~5mM、非必须氨基酸 0.1~1mg/mL，胰岛素 1~10ug/mL、转铁蛋白 5~20ug/L，亚硒酸钠 1~50ug/L，EGF 0.1~10 ng/mL、FGF 0.1~5 ng/mL、PDGF—BB 1~10ug/mL、IGF—11~10ug/mL、地塞米松 2~50nM，TGF—β 0~5 ng/mL、抗坏血酸 10~100 ug/mL；
所述细胞培养液二包括：基础培养基和添加物，所述添加物包括：人血清白蛋白 1~5%、L—谷氨酰胺 1~5mM、非必须氨基酸 0.1~1mg/mL，胰岛素 1~10ug/mL、转铁蛋白 5~20ug/L，亚硒酸钠 1~50ug/L，EGF 0.1~10 ng/mL、FGF 0.1~5 ng/mL、PDGF—BB 1~10ug/mL、IGF—11~10ug/mL、地塞米松 2~50nM，TGF—β 0.1~5 ng/mL；
所述步骤2）中，所述旋转共培养包括如下步骤：
向孵育完成后的含有细胞的微载体悬液中加入培养液，混匀；
将混匀后的悬液转移至悬浮培养生物反应器内继续培养；
所述继续培养所使用的成骨诱导分化培养基为通过所述微载体提取得到的微载体成骨诱导分化培养基浸提液，所述浸提液通过如下方法获取得到：准确称取0.5g 所述微载体放入15ml离心管内，加入5ml成骨诱导分化培养基，旋紧螺盖儿；37℃孵育72±2h；800g离心5分钟，吸取上清，得到所述浸提液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微载体的粒径大小为50~1000 um。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微载体的粒径为100~200 um。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微载体通过将所述脱细胞细胞外基质于液氮下研磨成粉，过筛，Co60照射灭菌得到。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以微载体的干重及细胞悬液的体积计，所述微载体与细胞悬液的混合比例为：1~5mg的微载体/5～200ul的细胞悬液，所述细胞悬液中的细胞浓度为1×103~10×103/ul。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微载体与细胞悬液的混合比例为：2~3mg的微载体/40~60ul的细胞悬液，所述细胞悬液中的细胞浓度为4×103~6×103/ul。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述静止孵育的条件为：37℃，5% CO2的培养箱中孵育10~60分钟。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述静止孵育的条件为：37℃，5% CO2的培养箱中孵育25~35分钟。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中，所述旋转共培养中所使用的培养液的添加量为所述微载体悬液的3~5倍。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述悬浮培养生物反应器选自：3D FloTrix® miniSPIN 生物反应器。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中，所述旋转共培养中所使用的培养液包括：含10%胎牛血清的DMEM、或者含有5％人血清白蛋白的DMEM中加入5ng/mlhFGF。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中，所述旋转共培养中继续培养的条件为：将旋转的起始速度控制为12转/分钟，旋转培养30分钟后，休息30分钟，再重复上述操作2次之后将旋转速度改为30转/分钟，每持续旋转三天换一次所述成骨诱导分化培养基，持续培养13~15天。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞膜片的培养条件为：每隔3~5天，更换一次培养液，连续培养13~15天。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞培养液一中的所述基础培养基包括：a—MEM、DMEM或IMDM、Knock out DMEM/F12中任意一种。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞培养液一中的所述基础培养基为：a—MEM。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞培养液二中的所述基础培养基包括：a—MEM、DMEM或IMDM、Knock out DMEM/F12中任意一种。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞培养液二中的所述基础培养基为：a—MEM。
18.一种通过如权利要求1-17任一所述的方法构建得到的3D微组织。
19.一种如权利要求1-17任一所述的方法或者如权利要求18所述的3D微组织在制备骨修复材料中的应用。
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