CN113846050A - 一种组织类器官的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种组织类器官的制备方法，该制备方法包括以下步骤：步骤1、采用细胞外基质构建生物墨水；步骤2、向步骤1获得的生物墨水中加入细胞悬液，获得含有细胞悬液的生物墨水；步骤3、将步骤2获得的含有细胞悬液的生物墨水置于37℃恒温培养箱中预培养1‑3天，获得预培养生物墨水；步骤4、将预培养生物墨水转移至3D生物打印机进行打印，获得3D打印块；步骤5、将3D打印块在室温下进行交联，再放置于培养箱中培养，即得组织类器官；本发明通过调整生物墨水比例与细胞浓度并进行预培养，形成初步细胞微球并进行打印，为含细胞3D生物打印中，形成功能性及异质性类器官提供了良好的方法。
Description
技术领域
本发明涉及医疗模型制造及应用领域，特别涉及一种组织类器官的制备方法。
背景技术
当前，用于治疗软组织器官损伤，退行性病变等疾病，最常见的方法是使用自体或者异体器官移植。器官移植最大的局限性在于，供体器官数量非常有限，即使是自体组织细胞移植，在大面积组织损伤(例如大面积深度皮肤烧伤，多处肌腱损伤，大血管缺损等)时，也无法提供足够的移植器官。
近年来，随着生物材料和机械技术的进步与更新，含细胞3D生物打印技术已经成为领域内一个热门话题与技术，基于多种生物材料具有温度，压力或者紫外线响应效果，种子细胞可以在打印前，与液态的生物材料混合，通过3D生物打印机，打印出理想的三维立体结构，在构建体外器官促进组织再生方面具有巨大潜力。
目前生物3D打印技术在临床的应用主要为通过打印模型辅助手术、打印支架诱导细胞分化或者促进组织修复等，在构建器官方面一直是近年来再生领域需要攻克的重点和难点。挤压式打印难以达到构建器官需要的精度，但是可以多种细胞混合，形成组织异质性；立体光刻打印可以形成精微的结构，但是不能将多种细胞混合在一起，具有单一性的限制；但是这两种打印方式都难以达到组织中高密度的细胞结构以及形成特定的功能，这对于3D生物打印技术而言，是其在未来应用和后期推广的一大障碍。
预先在体外形成具有一定组织特异性及细胞密度的细胞微球并用于生物3D打印是解决这一问题的重要方法，目前细胞微球形成的方式有悬滴培养及U型底细胞培养板培养等方法，其形成过程需要时间长且用于打印的过程中需要复杂精细的仪器辅助，成本太高，不适于临床推广普及。
发明内容
为了解决传统生物打印细胞密度低、功能性不完全，以及目前微球打印需要精密仪器、耗时长等问题，本发明的目的是提供一种组织类器官的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
步骤1、采用细胞外基质构建生物墨水；
步骤2、向步骤1获得的生物墨水中加入细胞悬液，获得含有细胞悬液的生物墨水；
步骤3、将步骤2获得的含有细胞悬液的生物墨水置于37℃恒温培养箱中预培养1-3天，获得预培养生物墨水；
步骤4、将预培养生物墨水转移至3D生物打印机进行打印，获得3D打印块；
步骤5、将3D打印块在室温下进行交联，再放置于培养箱中培养，即得组织类器官；
所述细胞外基质包含海藻酸钠、A型明胶、B型明胶、甲基丙烯酸化水凝胶、壳聚糖、透明质酸、胶原、琼脂糖以及合成性生物材料PLGA及其修饰物中的任意一种或多种。
进一步地，步骤1所述生物墨水包括浓度为1％-4％的海藻酸钠溶液和浓度为3％-5％的明胶溶液。
进一步地，生物墨水的制备方法如下：将海藻酸钠粉末使用去离子水配制成海藻酸钠溶液，将明胶粉末使用去离子水配制成明胶溶液，储存于4℃冰箱待用。
进一步地，步骤2所述细胞悬液由组织固有细胞或具有增殖分化作用的干细胞以及具有旁分泌、分泌囊泡和释放外泌体功能的干细胞制得。
进一步地，组织固有细胞包括成纤维细胞、上皮角质细胞、神经元细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞、小肠上皮细胞、肝细胞、肺上皮细胞中的任意一种；所述具有增殖分化作用的干细胞以及具有旁分泌、分泌囊泡和释放外泌体功能的干细胞包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞、表皮干细胞、神经干细胞、肌肉干细胞、小肠隐窝细胞中的任意一种。
进一步地，步骤2所述细胞悬液中的细胞在生物墨水中的最终浓度为0.5*106/mL-1*107/mL；所述向步骤1获得的生物墨水中加入细胞悬液具体为：将生物墨水用37℃水浴中充分融化呈液态，融化时间≥1小时，再加入细胞悬液，并充分混匀。
进一步地，步骤4所述将预培养生物墨水转移至3D生物打印机进行打印具体包括以下步骤：将预培养生物墨水转移到3D生物打印机中，将打印筒放入4℃冰箱中静置，待预培养生物墨水转变为胶状时，用喷嘴进行打印获得3D打印块。
进一步地，3D生物打印机的打印参数设置为：平台温度为10℃，打印筒温度为15℃，打印速度为10mm/s，压力为70kPa-100kPa。
进一步地，步骤5包括以下步骤：
步骤5.1、将3D打印块用CaCl2溶液在室温下交联，吸去残留的CaCl2溶液，用完全培养基洗两次；
步骤5.2、加入完全培养基直至没过3D打印块，放入培养箱培养中培养，每2天换一次培养基，制得组织类器官。
进一步地，步骤5.2所述放入培养箱中培养，培养时间为3天。
本发明提供的组织类器官的制备方法具有以下优点：
含细胞生物打印，一直以来存在着，但是在构建功能性类器官用于再生医学应用还有巨大的鸿沟；本发明通过调整生物墨水比例与细胞浓度并进行预培养，形成初步细胞微球并进行打印，为含细胞3D生物打印中，形成功能性及异质性类器官提供了良好的方法；本发明在国内外尚属首创，填补了细胞微球生物3D打印优化的空白，为这一方法的普及提供新的策略；该成果从时空可控性，成本可行性的角度出发，使得微球打印得到优化，为该体系生物墨水在3D生物打印用于临床再生医学的后期应用，转化，深入研究和进一步优化提供思路和方案。
附图说明
图1为实施例1的制备方法的示意图；
图2为各实施例的预培养生物墨水和对照例的含细胞悬液的生物墨水的显微镜下图，放大倍数为200倍；
图3为各实施例的预培养生物墨水和对照例的含细胞悬液的生物墨水的流变学机械性能图，横坐标为时间，纵坐标为储能/损耗模量；
图4为各实施例和对照例的3D打印块用活死细胞染色液染色后的荧光显微镜下图，放大倍数为200倍；
图5为各实施例和对照例的3D打印块内部的孔隙率与材料表面微结构的电子显微镜下图，放大倍数为200倍；
图6为各实施例和对照例的3D打印块内部的内部细胞形态的电子显微镜下图和荧光显微镜下图，上方为电子显微镜下图，下方为倒置荧光显微镜下图，放大倍数为800倍；
图7为各实施例和对照例的3D打印块三维结构的荧光显微镜下图，放大倍数为200倍；
图8为各实施例和对照例的3D打印块进行纤维化标记物免疫荧光染色的荧光显微镜下图，放大倍数为200倍。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围；本发明中所使用的设备，如无特殊规定，均为本领域内常用的设备；本发明中所使用的方法，如无特殊规定，均为本领域内常用的方法。
实施例1
本实施例提供了一种组织类器官的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤1、采用细胞外基质构建生物墨水：将用去离子水配制的质量体积分数为1％的海藻酸钠溶液和用去离子水配制的质量体积分数为3％的明胶溶液在巴氏消毒灭菌后混合均匀，制得生物墨水；
步骤2、向步骤1获得的生物墨水中加入细胞悬液，获得含有细胞悬液的生物墨水：将成纤维细胞重悬于500ulDMEM培养基中，再与10ml的生物墨水(1％海藻酸钠溶液和3％明胶溶液)混合，得到含有细胞悬液的生物墨水，成纤维细胞在生物墨水中的最终浓度为5×106个细胞/ml；
步骤3、将步骤2获得的含有细胞悬液的生物墨水加载到20ml的注射器中置于37℃、5％CO2恒温培养箱中预培养1天，获得预培养生物墨水；
步骤4、将预培养生物墨水转移至3D生物打印机进行打印，获得3D打印块：将预培养生物墨水转移到3D生物打印机中，将打印筒放入4℃冰箱中静置，待生物墨水转变为胶状时，用喷嘴进行打印；选择打印参数为：3D生物打印机的平台温度为10℃，打印筒温度为15℃，打印速度为10mm/s，压力为70kPa-100kPa；
步骤5、将3D打印块用2％(w/v)的CaCl2溶液在室温下交联10min，吸去残留的CaCl2溶液，用完全培养基洗两次，加入完全培养基直至没过3D打印块，放入培养箱培养3天，培养条件是37℃、5％的CO2，每2天换一次培养基，制得组织类器官；
细胞悬液的制备方法如下：取出生后24h内小鼠一只，75％酒精浸泡10min消毒并致死；用PBS洗一下小鼠表面酒精，剪去四肢和尾巴，用剪刀从尾部中间剪开，直到头部，用镊子小心撕下整张皮肤；将撕下的皮肤展开，真皮向下平铺在60mm培养皿中，放置5min使其干燥；在60mm培养皿中加入8ml 0.25％胰酶，将展开的皮肤移入胰酶中，保持其展开的形态，不得让表皮浸入胰酶中，以免损伤表皮干细胞活性；胰酶浸泡4度过夜；用镊子将真皮表皮分离，真皮放在50ml离心管中，用2mg/ml I型胶原酶37度水浴消化45min，每隔5分钟拿出离心管颠倒摇晃数次；吸取上清用40um细胞筛过滤，收集过滤液1500rpm离心5分钟；细胞沉淀重悬用DMEM完全培养基培养；
将成纤维细胞种植于直径为10cm的培养皿中，放置于37℃，5％CO2培养箱中进行培养，培养基为含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，培养基每2-3天更换一次,待细胞生长率在80-85％时，胰酶(Gibco)消化常规离心收集备用，即得细胞悬液；
各实施例和对照例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品；
在本发明中，具体使用的材料和仪器的厂家及型号或来源如下：
DMEM高糖培养基、胎牛血清购自Gibco；
海藻酸钠(180947)和明胶(V900863)购自Sigma；
生物3D打印机购自杭州捷诺飞公司。
实施例2
本实施例提供了一种组织类器官的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤1、采用细胞外基质构建生物墨水：将用去离子水配制的质量体积分数为2％的海藻酸钠溶液和用去离子水配制的质量体积分数为4％的明胶溶液在巴氏消毒灭菌后混合均匀，制得生物墨水；
步骤2、向步骤1获得的生物墨水中加入细胞悬液，获得含有细胞悬液的生物墨水：将成纤维细胞重悬于500ulDMEM培养基中，再与10ml的生物墨水(2％海藻酸钠溶液和4％明胶溶液)混合，得到含有细胞悬液的生物墨水，成纤维细胞在生物墨水中的最终浓度为0.5×106个细胞/ml；
步骤3、将步骤2获得的含有细胞悬液的生物墨水加载到20ml的注射器中置于37℃、5％CO2恒温培养箱中预培养2天，获得预培养生物墨水；
步骤4、将预培养生物墨水转移至3D生物打印机进行打印，获得3D打印块：将预培养生物墨水转移到3D生物打印机中，将打印筒放入4℃冰箱中静置，待生物墨水转变为胶状时，用喷嘴进行打印；选择打印参数为：3D生物打印机的平台温度为10℃，打印筒温度为15℃，打印速度为10mm/s，压力为70kPa-100kPa；
步骤5、将3D打印块用2％(w/v)的CaCl2溶液在室温下交联10min，吸去残留的CaCl2溶液，用完全培养基洗两次，加入完全培养基直至没过3D打印块，放入培养箱培养3天，培养条件是37℃、5％的CO2，每2天换一次培养基，制得组织类器官；
细胞悬液的制备方法如下：取出生后24h内小鼠一只，75％酒精浸泡10min消毒并致死；用PBS洗一下小鼠表面酒精，剪去四肢和尾巴，用剪刀从尾部中间剪开，直到头部，用镊子小心撕下整张皮肤；将撕下的皮肤展开，真皮向下平铺在60mm培养皿中，放置5min使其干燥；在60mm培养皿中加入8ml 0.25％胰酶，将展开的皮肤移入胰酶中，保持其展开的形态，不得让表皮浸入胰酶中，以免损伤表皮干细胞活性；胰酶浸泡4度过夜；用镊子将真皮表皮分离，真皮放在50ml离心管中，用2mg/ml I型胶原酶37度水浴消化45min，每隔5分钟拿出离心管颠倒摇晃数次；吸取上清用40um细胞筛过滤，收集过滤液1500rpm离心5分钟；细胞沉淀重悬用DMEM完全培养基培养；
将成纤维细胞种植于10cm培养皿中，放置于37℃，5％CO2培养箱中进行培养，培养基为含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，培养基每2-3天更换一次,待细胞生长率在80-85％时，胰酶(Gibco)消化常规离心收集备用，即得细胞悬液。
实施例3
本实施例提供了一种组织类器官的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤1、采用细胞外基质构建生物墨水：将用去离子水配制的质量体积分数为4％的海藻酸钠溶液和用去离子水配制的质量体积分数为5％的明胶溶液在巴氏消毒灭菌后混合均匀，制得生物墨水；
步骤2、向步骤1获得的生物墨水中加入细胞悬液，获得含有细胞悬液的生物墨水：将成纤维细胞重悬于500ulDMEM培养基中，再与10ml的生物墨水(1％海藻酸钠溶液和3％明胶溶液)混合，得到含有细胞悬液的生物墨水，成纤维细胞在生物墨水中的最终浓度为1×107个细胞/ml；
步骤3、将步骤2获得的含有细胞悬液的生物墨水加载到20ml的注射器中置于37℃、5％CO2恒温培养箱中预培养3天，获得预培养生物墨水；
步骤4、将预培养生物墨水转移至3D生物打印机进行打印，获得3D打印块：将预培养生物墨水转移到3D生物打印机中，将打印筒放入4℃冰箱中静置，待生物墨水转变为胶状时，用喷嘴进行打印；选择打印参数为：3D生物打印机的平台温度为10℃，打印筒温度为15℃，打印速度为10mm/s，压力为70kPa-100kPa；
步骤5、将3D打印块用2％(w/v)的CaCl2溶液在室温下交联10min，吸去残留的CaCl2溶液，用完全培养基洗两次，加入完全培养基直至没过3D打印块，放入培养箱培养3天，培养条件是37℃、5％的CO2，每2天换一次培养基，制得组织类器官；
细胞悬液的制备方法如下：取出生后24h内小鼠一只，75％酒精浸泡10min消毒并致死；用PBS洗一下小鼠表面酒精，剪去四肢和尾巴，用剪刀从尾部中间剪开，直到头部，用镊子小心撕下整张皮肤；将撕下的皮肤展开，真皮向下平铺在60mm培养皿中，放置5min使其干燥；在60mm培养皿中加入8ml 0.25％胰酶，将展开的皮肤移入胰酶中，保持其展开的形态，不得让表皮浸入胰酶中，以免损伤表皮干细胞活性；胰酶浸泡4度过夜；用镊子将真皮表皮分离，真皮放在50ml离心管中，用2mg/ml I型胶原酶37度水浴消化45min，每隔5分钟拿出离心管颠倒摇晃数次；吸取上清用40um细胞筛过滤，收集过滤液1500rpm离心5分钟；细胞沉淀重悬用DMEM完全培养基培养；
将成纤维细胞种植于10cm培养皿中，放置于37℃，5％CO2培养箱中进行培养，培养基为含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，培养基每2-3天更换一次,待细胞生长率在80-85％时，胰酶(Gibco)消化常规离心收集备用，即得细胞悬液。
对照例1
本对照例提供了一种组织类器官的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、采用细胞外基质构建生物墨水：将用去离子水配制的质量体积分数为1％的海藻酸钠溶液和用去离子水配制的质量体积分数为3％的明胶溶液在巴氏消毒灭菌后混合均匀，制得生物墨水；
步骤2、向步骤1获得的生物墨水中加入细胞悬液，获得含有细胞悬液的生物墨水：将成纤维细胞重悬于500ulDMEM培养基中，再与10ml的生物墨水(1％海藻酸钠溶液和3％明胶溶液)混合，得到含有细胞悬液生物墨水，成纤维细胞在生物墨水中的最终浓度为5×106个细胞/ml；
步骤3、将含有细胞悬液的生物墨水转移至3D生物打印机进行打印，获得3D打印块：将含有细胞悬液的生物墨水转移到3D生物打印机中，将打印筒放入4℃冰箱中静置，待生物墨水转变为胶状时，用喷嘴进行打印；选择打印参数为：3D生物打印机的平台温度为10℃，打印筒温度为15℃，打印速度为10mm/s，压力为70kPa-100kPa；
步骤5、将3D打印块用2％(w/v)的CaCl2溶液在室温下交联10min，吸去残留的CaCl2溶液，用完全培养基洗两次，加入完全培养基直至没过3D打印块，放入培养箱培养3天，培养条件是37℃、5％的CO2，每2天换一次培养基，制得组织类器官；
其中，细胞悬液的制备方法与实施例1相同。
试验例1微细胞结构观察
取实施例1-3的预培养生物墨水和对照例1的含有细胞悬液的生物墨水，分别利用倒置显微镜观察其中的细胞状态，结果见图2，可见未经预培养的生物墨水(对照例1)中细胞呈单个分散状态，而实施例1-3经预培养1天后，生物墨水中细胞形成一定数量的细胞微球，直径从50-180um不等。
试验例2生物墨水流变性能检测
取实施例1-3的预培养生物墨水和对照例1的含有细胞悬液的生物墨水，利用流变仪检测其流变学机械性能，结果见图3，由图3可知，两种方法处理的生物墨水流变性能无明显差异，都具有良好的打印性。
试验例3细胞活性检测
取实施例1-3和对照例1的3D打印块进行活死细胞染色，活死细胞染色液(购买自Invitrogen，MP03224)，将3D打印块中的培养基吸出，PBS洗两遍，加入活死染色液染色45分钟，采用倒置荧光显微镜进行拍摄，其中绿色荧光为活细胞，红色荧光为死细胞，结果见图4，由图4可知，两种方法形成的3D打印块，细胞活性均在90％以上。
试验例4 3D打印块孔隙率与材料表面微结构观察
取实施例1-3和对照例1的3D打印块进行冻干，扫描电子显微镜观察其内部孔隙率与材料的表面结构，结果见图5，对照例1的方法制备的打印块与实施例1-3的方法制备的打印块，其内部孔隙率无明显差别；实施例1-3制备的打印块中，其材料的表面微结构呈现规则的线性排列，其符合纤维化结构的特征。
试验例5细胞伸展观察
取实施例1-3和对照例1中培养3天后的3D打印块，冻干后用扫描电子显微镜观察其内部细胞形态；或者进行细胞骨架蛋白免疫荧光染色，首先利用4％多聚甲醛固定15分钟；然后PBS洗两次，每次3分钟；0.1％Triton打孔15分钟，然后PBS洗两次，每次3分钟；5％山羊血清封闭1小时；加入β-actin一抗(1:300)4度过夜，PBS洗4次，每次5分钟；加入绿色荧光二抗，室温2小时，PBS洗4次，每次5分钟；DAPI封片，倒置荧光显微镜拍摄，结果见图6，电镜图片和免疫荧光结果显示，两种制备方法的打印块中细胞伸展良好。
试验例6细胞自组织发生形态观察
取实施例1-3和对照例1中培养3天后的3D打印块，采用倒置显微镜观察细胞在其中的三维结构，结果见图7，对照例1的方法制备的打印块中细胞多为球形细胞或细胞团，而实施例1的方法制备的打印块中细胞微球相互结合，形成更大的纤维样组织结构。
试验例7组织类器官功能检测
取实施例1-3和对照例1中培养3天后的3D打印块，进行纤维化标记物免疫荧光染色，首先利用4％多聚甲醛固定15分钟；然后PBS洗两次，每次3分钟；0.1％Triton打孔15分钟，然后PBS洗两次，每次3分钟；5％山羊血清封闭1小时；加入α-SMA一抗(1:300)4度过夜，PBS洗4次，每次5分钟；加入绿色荧光二抗，室温2小时，PBS洗4次，每次5分钟；DAPI封片，采用倒置荧光显微镜拍摄，结果见图8，可知对照例1的方法制备的打印块中细胞不表达或者表达α-SMA较弱，而实施例1的方法制备的打印块中细胞呈线性排列且α-SMA表达增强。
最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种组织类器官的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
步骤1、采用细胞外基质构建生物墨水；
步骤2、向步骤1获得的生物墨水中加入细胞悬液，获得含有细胞悬液的生物墨水；
步骤3、将步骤2获得的含有细胞悬液的生物墨水置于37℃恒温培养箱中预培养1-3天，获得预培养生物墨水；
步骤4、将预培养生物墨水转移至3D生物打印机进行打印，获得3D打印块；
步骤5、将3D打印块在室温下进行交联，再放置于培养箱中培养，即得组织类器官；
所述细胞外基质包含海藻酸钠、A型明胶、B型明胶、甲基丙烯酸化水凝胶、壳聚糖、透明质酸、胶原、琼脂糖以及合成性生物材料PLGA及其修饰物中的任意一种或多种。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1所述生物墨水包括浓度为1％-4％的海藻酸钠溶液和浓度为3％-5％的明胶溶液。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述生物墨水的制备方法如下：将海藻酸钠粉末使用去离子水配制成海藻酸钠溶液，将明胶粉末使用去离子水配制成明胶溶液，储存于4℃冰箱待用。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述细胞悬液由组织固有细胞或具有增殖分化作用的干细胞以及具有旁分泌、分泌囊泡和释放外泌体功能的干细胞制得。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述组织固有细胞包括成纤维细胞、上皮角质细胞、神经元细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞、小肠上皮细胞、肝细胞、肺上皮细胞中的任意一种；所述具有增殖分化作用的干细胞以及具有旁分泌、分泌囊泡和释放外泌体功能的干细胞包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞、表皮干细胞、神经干细胞、肌肉干细胞、小肠隐窝细胞中的任意一种。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述细胞悬液中的细胞在生物墨水中的最终浓度为0.5*106个细胞/mL-1*107个细胞/mL；所述向步骤1获得的生物墨水中加入细胞悬液具体为：将生物墨水用37℃水浴中充分融化呈液态，融化时间≥1小时，再加入细胞悬液，并充分混匀。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4所述将预培养生物墨水转移至3D生物打印机进行打印具体包括以下步骤：将预培养生物墨水转移到3D生物打印机中，将打印筒放入4℃冰箱中静置，待预培养生物墨水转变为胶状时，用喷嘴进行打印获得3D打印块。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述3D生物打印机的打印参数设置为：平台温度为10℃，打印筒温度为15℃，打印速度为10mm/s，压力为70kPa-100kPa。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5包括以下步骤：
步骤5.1、将3D打印块用CaCl2溶液在室温下交联，吸去残留的CaCl2溶液，用完全培养基洗两次；
步骤5.2、加入完全培养基直至没过3D打印块，放入培养箱培养中培养，每2天换一次培养基，制得组织类器官。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5.2所述放入培养箱中培养，培养时间为3天。
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