CN111330082B - 构建含皮肤附属器的生物3d打印皮肤微单元模型的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种构建含皮肤附属器的生物3D打印皮肤微单元模型的方法，包括下述步骤：1)制备含有汗腺组织的种子细胞的生物3D打印胶块，将毛囊、皮脂腺悬滴种植于所述生物3D打印胶块上；2)在生物3D打印胶块上使用诱导培养基进行诱导培养；其中，所述诱导培养基包括汗腺诱导培养基、毛囊诱导培养基以及皮脂腺诱导培养基；3)诱导培养5‑10d后，在生物3D打印胶块表面加入表皮干细胞，进行气液平面培养，形成生物3D打印皮肤微单元。该方法制备的皮肤微单元模型实现皮肤真表皮和多种皮肤附属器同步再生。

Description

构建含皮肤附属器的生物3D打印皮肤微单元模型的制备方法

技术领域

本发明涉及医疗模型制造及应用领域，特别是涉及一种含皮肤附属器的生物3D打印皮肤微单元模型及其制备方法。

背景技术

皮肤损伤是常见的外科创伤形式之一，然而其修复过程往往是不完美修复。对大多数个体来说，皮肤修复仅能恢复皮肤的完整性，而皮肤附属器常不能得到再生。由于汗腺、毛囊、皮脂腺等皮肤附属器不仅在皮肤稳态的维持中起着十分重要的作用，还对人体的皮肤功能以及外形美观产生重大影响。因此，在皮肤创伤修复过程中如何同时诱导汗腺、毛囊等皮肤附属器的再生是当前再生医学和创伤外科领域所关注的重点问题之一。

汗腺、毛囊等皮肤附属器的再生是皮肤再生的难点之一。虽然汗腺和毛囊的单独再生已经在相关领域得到了重大突破，但是在体外却不能获得毛囊和汗腺同时诱导再生的良好方法。这主要是因为在同一细胞培养体系中，汗腺和毛囊的诱导往往是互相影响的，因此在皮肤附属器的再生过程中，必然存在不同附属器再生的先后顺序。既往研究表明，皮肤真表皮和皮肤附属器再生能力存在差异。这种再生能力的差异，不仅是由于细胞增殖分化的能力的差异，还由于再生的先后顺序。而真皮和表皮的再生能力强于皮肤附属器的再生能力，因此绝大多数的皮肤损伤修复在皮肤附属器还未发生再生时，真表皮的修复就已完成。目前技术制备的组织工程皮肤距理想的永久性皮肤替代物有一定差距，尚不能在组织工程皮肤中同时构建出皮肤的附属器结构，如皮脂腺、汗腺等，以及真表皮修复的同步进行。

近年来，通过生物3D打印技术构建组织工程皮肤已成为现实。通过生物3D打印技术，细胞与溶胶被同时置于打印机喷头中，由计算机控制含细胞液滴的沉积位置，在指定位置逐点打印，打印完一层继续打印另一层，层层叠加形成三维多细胞/凝胶体系，自组装形成组织或器官。目前虽然已经制备了一些3D打印的皮肤材料，但仍未能在皮肤材料中构建出完整的血管和毛囊等附属器官。

发明内容

本发明的目的在于提出一种构建含皮肤附属器的生物3D打印皮肤微单元模型的方法，该方法制备的皮肤微单元模型实现皮肤真表皮和多种皮肤附属器同步再生。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案：

一种构建含皮肤附属器的生物3D打印皮肤微单元模型的方法，包括下述步骤：

1)制备含有汗腺组织的种子细胞的生物3D打印胶块，将毛囊、皮脂腺悬滴种植于所述生物3D打印胶块上；

2)在生物3D打印胶块上使用诱导培养基进行诱导培养；其中，所述诱导培养基包括汗腺诱导培养基、毛囊诱导培养基以及皮脂腺诱导培养基；

3)诱导培养5-10d后，在生物3D打印胶块表面加入表皮干细胞，进行气液平面培养，形成生物3D打印皮肤微单元。

一个改进方案中，所述步骤1)中还包括对添加汗腺诱导培养基至含有汗腺重建种子细胞的生物3D打印胶块中，进行初次汗腺诱导。

进一步改进的技术方案中，所述步骤1)具体包括

1.1)收集含有汗腺组织的种子细胞，与打印材料混合均匀后制备生物3D打印墨水；

1.2)将生物3D打印墨水转移至生物3D打印机中，制备生物3D打印凝胶，并交联，制得生物3D打印胶块；

1.3)将步骤1.2)处理后的生物3D打印胶块转移至含有汗腺诱导培养基的培养皿中，进行诱导培养，将种子细胞诱导成为汗腺细胞；

1.4)分离成纤维细胞和角质形成细胞或其他皮肤干/祖细胞，并采用悬浮培养的方法制备毛囊、皮脂腺悬滴；

1.5)将悬滴种植在步骤1.3)完成诱导培养的生物3D打印胶块上，形成含有毛囊、皮脂腺和汗腺细胞的生物3D打印皮肤真皮微单元。

本发明构建含皮肤附属器的生物3D打印皮肤微单元模型的方法采用适宜种子细胞在生物3D打印中诱导成为汗腺细胞，再通过悬浮培养技术培养毛囊、汗腺组织，通过类器官种植的方法构建含有皮肤附属器的生物3D打印真皮，并结合表皮细胞，采用气液平培养的方法，构建含有皮肤附属器的生物3D打印皮肤微单元。本发明方法制备的皮肤微单元与正常人体组织的形态结构类似并含有丰富的皮肤附属器，为皮肤损伤完美修复、药物筛选和皮肤附属器再生的分子机制研究提供了模型，并突破了皮肤真表皮和多种皮肤附属器同步再生的难点。

附图说明

图1为本发明的实施例中皮肤微单元中汗腺和毛囊的共生的光镜图；

图2为本发明中毛囊类器官生物学标记的荧光图。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

实施例1

一种构建含皮肤附属器的生物3D打印皮肤微单元模型的方法，包括下述步骤：

1)制备含有汗腺组织的种子细胞的生物3D打印胶块，将毛囊、皮脂腺悬滴种植于所述生物3D打印胶块上；

2)在生物3D打印胶块上使用诱导培养基进行诱导培养；其中，所述诱导培养基包括汗腺诱导培养基、毛囊诱导培养基以及皮脂腺诱导培养基；

3)诱导培养5-10d后，在生物3D打印胶块表面加入表皮干细胞，进行气液平面培养，形成生物3D打印皮肤微单元。

其中，步骤1)中的所述种子细胞包括皮肤前体细胞、皮肤附属器前体细胞、成体干细胞或诱导多能干细胞中的一种或几种。所述皮肤前体细胞、皮肤附属器前体细胞、成体干细胞或诱导多能干细胞采用现有技术对皮肤组织进行分离培养获得。

一个具体示例中，皮肤组织的诱导多能干细胞的分离培养方法为：

用体积分数75％的乙醇浸泡皮肤组织，消毒除菌10min后，PBS洗3次，无菌条件下将组织剪碎，Hanks缓冲液冲洗3次，1g/L的胰蛋白酶37℃消化40-50min，加入含有体积分数10％FBS的培养基终止消化，移至离心管中配平后1500r/min离心去上清，筛网过滤去除大的组织块，Hanks缓冲液冲洗2次，离心，沉淀中加入含有体积分数10％FBS的培养基，用吸管反复吹打30-40次组织块使细胞分离，通过孔径为40μmol/L的筛网过滤，收集的细胞离心去上清，培养基重悬细胞，种植在培养瓶中培养。其中，培养基组分为：DMEM/F12(1:1)加入2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/mL的青霉素、100mg/L的链霉素、B27添加剂(1:50)、20μg/L碱性成纤维细胞生长因子和20μg/L表皮生长因子。细胞种植浓度为8×10⁶L^-1，每隔5-7d传代1次，传代时将悬浮的细胞离心后继续培养，贴壁的细胞用2.5g/L的胰蛋白酶/EDTA混合液37℃消化，离心、加入新的培养基。细胞稀释两三倍传至培养瓶中培养，每3天换液1次。

实施例2

制备生物3D打印胶块，包括下述步骤：

1.1)收集含有汗腺组织的种子细胞，与打印材料混合均匀后制备生物3D打印墨水；

其中，打印材料包括：乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚己内酯、消旋聚乳酸-聚散亚甲基碳酸酯共聚物、纳米beta-磷酸三钙、纳米羟基磷灰石、纳米磷酸钙、明胶、海藻酸钠水凝胶或I型胶原蛋白水凝胶中的一种或几种；

一个打印材料制备的示例：

称量3.8g乳酸-羟基乙酸共聚物，溶于10mg二氯甲烷中，搅拌2小时至乳酸-羟基乙酸共聚物完全溶解，形成乳酸-羟基乙酸共聚物溶液；称量3.8gbeta-磷酸三钙分散于乳酸-羟基乙酸共聚物溶液中并完全溶解，得初混溶液；称量50mg乳化剂溶于1.8mL去离子水并完全溶解形成乳化剂水溶液，将该乳化剂水溶液与初混溶液混合并通过超生分散获得复合油包水乳液；

称量10mL细胞培养基中，加入种子细胞并将细胞浓度调节为1×10⁶/mL；种子细胞溶液与复合油包水乳液混合后进行超声分散，使得种子细胞均匀分散在复合油包水乳液中。

1.2)将生物3D打印墨水转移至生物3D打印机中，制备生物3D打印凝胶，并交联，制得生物3D打印胶块；

将打印完成的凝胶体上滴加交联剂，使生物可降解材料交联，形成皮肤单元支架；一个示例中，在凝胶体上滴加入1ml 5％CaCl₂，使打印的支架交联，形成具有强度的水凝胶支架，交联时间2分钟后，用培养基洗涤3次，去除交联剂；

1.3)将步骤1.2)处理后的生物3D打印胶块转移至含有汗腺诱导培养基的培养皿中，进行诱导培养，将种子细胞诱导成为汗腺细胞；

将含有种子细胞的打印胶块用DMEM/F10％FBS培养，待细胞生长至40-60％融合时，加入汗腺诱导培养基，诱导分化2-4周；其中，所述汗腺诱导培养基包含下述组分：DMEM/F12、10％v/v的胎牛血清、10ng/ml的表皮生长因子、20ng/ml的三碘甲腺原氨酸、0.64ng/ml的氢化可的松、1％v/v的ITS；

1.4)分离成纤维细胞和角质形成细胞或其他皮肤干/祖细胞，并采用悬浮培养的方法制备毛囊、皮脂腺悬滴；

将成纤维细胞和角质分离后的细胞悬浮，得到细胞悬液，再将细胞悬液滴加在培养皿盖上，将滴加后的盖倒置在培养皿底上，培养，得到对应组织的悬滴；

悬浮培养采用毛囊诱导培养基、皮脂腺培养基1:1混合的培养基；其中，所述毛囊诱导培养基的包括下述组分：DMEM/F12(1:1)加入5％v/v的胎牛血清、20％v/v的ITS、0.2nM/ml的三碘甲腺原氨酸、20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、2nM氢化可的松、2nM的睾酮、2nM的雌二醇、2nM的黄体酮；

所述皮脂腺培养基包括下述组分：DMEM/F12(1:1)加入10％v/v的胎牛血清、5ug/ml的胰岛素、10ng/ml的表皮生长因子、500ng/ml的氢化可的松；

1.5)将悬滴种植在步骤1.3)完成诱导培养的生物3D打印胶块上，形成含有毛囊、皮脂腺和汗腺细胞的生物3D打印皮肤真皮微单元。

而在另一些示例中，制备生物3D打印胶块的步骤1.4)中悬浮培养的培养基还可采用上述毛囊诱导培养基或皮脂腺培养基中的一种。

实施例3

对实施例2制备的生物3D打印皮肤真皮微单元进行诱导培养；

将生物3D打印皮肤真皮微单元放入37℃的培养箱中培养5-10d，优选7d。其中的诱导培养基组分包括三种，具体为汗腺诱导培养基、毛囊诱导培养基以及皮脂腺诱导培养基，在该实施例中，诱导培养基采用等量的汗腺诱导培养基、毛囊诱导培养基以及皮脂腺诱导培养基。

具体的，诱导培养基的组分：

组分1、汗腺诱导培养基：DMEM/F12(1:1)加入10％v/v的胎牛血清、10ng/ml的表皮生长因子、20ng/ml的三碘甲腺原氨酸、0.64ng/ml的氢化可的松、1％v/v的ITS；

组分2、毛囊诱导培养基：DMEM/F12(1:1)加入5％v/v的胎牛血清、20％v/v的ITS、0.2nM/ml的三碘甲腺原氨酸、20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、2nM氢化可的松、2nM的睾酮、2nM的雌二醇、2nM的黄体酮；

组分3、皮脂腺培养基：DMEM/F12(1:1)加入10％v/v的胎牛血清、5ug/ml的胰岛素、10ng/ml的表皮生长因子、500ng/ml的氢化可的松。

实施例4

表皮干细胞的分离培养示例：

将皮肤组织分离皮下组织，用含青链霉素的PBS冲洗3次，切成小块后置于含2.5mg/ml DispaseII酶的DMEM培养基中4℃培养8-12h，然后分离表皮和真皮层，收集表皮皮片，37℃条件下0.25％胰蛋白酶消化15min，胎牛血清终止消化，200目筛过滤，收集细胞悬液，1000rpm离心5min，弃上清，加入新鲜培养液，重悬细胞，计数，调整细胞浓度至5×10⁵个/ml，种植于含有IV型胶原的培养瓶子37℃培养，每3天换1次液。

其中，所述新鲜培养液组分为：DMEM12/10％的FBS、10μg/L的表皮细胞生长因子、0.1mM的L-谷氨酰胺、0.1mM的非必需氨基酸。

实施例5

分离获得表皮干细胞，将表皮干细胞滴在生物3D真皮中央，进行气液平面培养；所述气液平面培养过程为将培养液仅没过生物3D打印皮肤微单元模型下层，上层则暴露于空气中。

所述气液平面培养的培养基采用以下培养基等量混合：

组分1、汗腺诱导培养基：DMEM/F12(1:1)加入10％v/v的胎牛血清、10ng/ml的表皮生长因子、20ng/ml的三碘甲腺原氨酸、0.64ng/ml的氢化可的松、1％v/v的ITS；

组分2、毛囊诱导培养基：DMEM/F12(1:1)加入5％v/v的胎牛血清、20％v/v的ITS、0.2nM/ml的三碘甲腺原氨酸、20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、2nM氢化可的松、2nM的睾酮、2nM的雌二醇、2nM的黄体酮；

组分3、皮脂腺培养基：DMEM/F12(1:1)加入10％v/v的胎牛血清、5ug/ml的胰岛素、10ng/ml的表皮生长因子、500ng/ml的氢化可的松。

而在另一些示例中，步骤3)中的气液培养采用上述汗腺诱导培养基、毛囊诱导培养基以及皮脂腺培养基中的一种或任意两种的等量混合。

试验例1皮肤微单元中汗腺和毛囊的共生的光镜检查

采用上述实施例1-5所述方法制备的生物3D打印皮肤微单元模型；

检查方法：

1.取含皮肤附属器的生物3D打印皮肤微单元模型，置于Leica倒置显微镜下观察；

2.调节显微镜至相差模式，调节焦距、光强等参数；

3.使用内置影像采集系统进行影像采集。

检查结果：图1为皮肤微单元实验光镜水平观察图，光镜下显示：皮肤的表皮和真皮结构完好，分界清楚，基底膜完整，网织层可见毛囊、皮脂腺、汗腺，汗腺和毛囊的共生状态良好，汗腺团和毛囊类器官同步存在。

试验例2毛囊类器官生物学标记检测

采用上述实施例1-5所述方法制备的生物3D打印皮肤微单元模型；

检测方法：

1.取培养的毛囊类器官，用PBS洗涤2-3次；

2.固定液固定12h以上，弃去固定液；

3.将毛囊类器官置于玻片上并压片使其黏附在玻片上，PBS洗涤2次；

4.0.5％Triton-100打孔10min，PBS洗涤2次；

5.5％山羊血清室温封闭1h；

6.一抗孵育，4℃过夜，其中一抗包括：兔抗鼠Krt8(1:300)、兔抗鼠Krt17(1:300)、兔抗鼠Krt19(1:300)和鼠抗鼠ATP1a1(1:300)，采用5％山羊血清稀释；

7.弃去一抗，PBS洗涤2次；

8.采用AF488山羊抗鼠IgG荧光抗体(1:200)和AF488山羊抗兔IgG荧光抗体(1:200)分别根据一抗种属孵育抗体，室温孵育2h，避光操作；

9.弃去抗体，PBS洗涤2次；

10.采用含有DAPI的封片剂封片；

11.Leica荧光倒置显微镜观察，其中细胞核显示为蓝色荧光，毛囊类器官因前期DiI染色显示为红色荧光，标记抗体显示为绿色荧光。

检测结果：荧光结果显示皮肤微单元中毛囊类器官表现了相应的生物学标记，说明毛囊类器官具有良好的生物学状态。

本发明皮肤微单元是传统组织工程皮肤的改进，其与传统组织工程皮肤相比，皮肤微单元不仅包含真表皮和皮肤附属器，还能极大节约种子细胞的使用量。在生理条件下皮肤组织的修复也是以单独的皮肤残存的真表皮生长点为起点进行修复；皮肤微单元正是利用了这种修复模式，从而实现皮肤损伤的完美修复。此外，皮肤微单元的形态结构与组成与人体皮肤类似，可用于创伤后皮肤瘢痕修复过程中皮肤附属器缺失的再生治疗、促进皮肤附属器再生的药物研究以及皮肤附属器再生医学的分子机制研究。

以上所述的实施方式，并不构成对该技术方案保护范围的限定。任何在上述实施方式的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在该技术方案的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种构建含皮肤附属器的生物3D打印皮肤微单元模型的方法，其特征在于，包括下述步骤：

1)制备含有汗腺组织的种子细胞的生物3D打印胶块，将毛囊、皮脂腺悬滴种植于所述生物3D打印胶块上；其中，添加汗腺诱导培养基至含有汗腺组织的种子细胞的生物3D打印胶块中，进行初次汗腺诱导；

2)在生物3D打印胶块上使用诱导培养基进行诱导培养；其中，所述诱导培养基包括汗腺诱导培养基、毛囊诱导培养基以及皮脂腺诱导培养基；

3)诱导培养5-10d后，在生物3D打印胶块表面加入表皮干细胞，进行气液平面培养，形成生物3D打印皮肤微单元；

其中，所述步骤1)具体包括

1.1)收集含有汗腺组织的种子细胞，与打印材料混合均匀后制备生物3D打印墨水；

1.2)将生物3D打印墨水转移至生物3D打印机中，制备生物3D打印凝胶，并交联，制得生物3D打印胶块；

1.3)将步骤1.2)处理后的生物3D打印胶块转移至含有汗腺诱导培养基的培养皿中，进行诱导培养，将种子细胞诱导成为汗腺细胞；

1.4)分离成纤维细胞和角质形成细胞或其他皮肤干/祖细胞，并采用悬浮培养的方法制备毛囊、皮脂腺悬滴；

1.5)将悬滴种植在步骤1.3)完成诱导培养的生物3D打印胶块上，形成含有毛囊、皮脂腺和汗腺细胞的生物3D打印皮肤真皮微单元。

2.如权利要求1所述的构建含皮肤附属器的生物3D打印皮肤微单元模型的方法，其特征在于，所述种子细胞包括皮肤前体细胞、皮肤附属器前体细胞、成体干细胞或诱导多能干细胞中的一种或几种。

3.如权利要求1所述的构建含皮肤附属器的生物3D打印皮肤微单元模型的方法，其特征在于，所述步骤1.1)种子细胞与打印材料混合后还进行超声分散；

所述步骤1.1)的打印材料包括：乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚己内酯、消旋聚乳酸-聚散亚甲基碳酸酯共聚物、明胶、海藻酸钠水凝胶或I型胶原蛋白水凝胶中的一种或几种；

或者，乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚己内酯、消旋聚乳酸-聚散亚甲基碳酸酯共聚物、明胶、海藻酸钠水凝胶或I型胶原蛋白水凝胶中的一种或几种以及纳米beta-磷酸三钙、纳米羟基磷灰石、纳米磷酸钙中的一种的组合。

4.如权利要求1所述的构建含皮肤附属器的生物3D打印皮肤微单元模型的方法，其特征在于，所述步骤1.3)的汗腺诱导培养基包含下述组分：DMEM/F12、10％v/v的胎牛血清、10ng/ml的表皮生长因子、20ng/ml的三碘甲腺原氨酸、0.64ng/ml的氢化可的松、1％v/v的ITS。

5.如权利要求1所述的构建含皮肤附属器的生物3D打印皮肤微单元模型的方法，其特征在于，所述步骤1.4)的悬浮培养具体为：将成纤维细胞和角质分离后的细胞悬浮，得到细胞悬液，再将细胞悬液滴加在培养皿盖上，将滴加后的盖倒置在培养皿底上，培养，得到对应组织的悬滴；

所述悬浮培养的培养基采用毛囊诱导培养基、皮脂腺培养基或两者1:1混合的培养基；其中，所述毛囊诱导培养基的包括下述组分：以体积比为1:1的比例混合的DMEM/F12培养液加入5％v/v的胎牛血清、20％v/v的ITS、0.2nM/ml的三碘甲腺原氨酸、20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、2nM/m氢化可的松、2nM/m的睾酮、2nM/m的雌二醇、2nM/m的黄体酮；

所述皮脂腺培养基包括下述组分：以体积比为1:1的比例混合的DMEM/F12培养液加入10％v/v的胎牛血清、5ug/ml的胰岛素、10ng/ml的表皮生长因子、500ng/ml的氢化可的松。

6.如权利要求1所述的构建含皮肤附属器的生物3D打印皮肤微单元模型的方法，其特征在于，所述步骤2)中的诱导培养基包含下述组分：

组分1、汗腺诱导培养基：以体积比为1:1的比例混合的DMEM/F12培养液加入10％v/v的胎牛血清、10ng/ml的表皮生长因子、20ng/ml的三碘甲腺原氨酸、0.64ng/ml的氢化可的松、1％v/v的ITS；

组分2、毛囊诱导培养基：以体积比为1:1的比例混合的DMEM/F12培养液加入5％v/v的胎牛血清、20％v/v的ITS、0.2nM/ml的三碘甲腺原氨酸、20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、2nM氢化可的松、2nM的睾酮、2nM的雌二醇、2nM的黄体酮；

组分3、皮脂腺培养基：以体积比为1:1的比例混合的DMEM/F12培养液加入10％v/v的胎牛血清、5ug/ml的胰岛素、10ng/ml的表皮生长因子、500ng/ml的氢化可的松。

7.如权利要求6所述的构建含皮肤附属器的生物3D打印皮肤微单元模型的方法，其特征在于，所述诱导培养基采用等量的汗腺诱导培养基、毛囊诱导培养基以及皮脂腺培养基混合而成。

8.如权利要求1所述的构建含皮肤附属器的生物3D打印皮肤微单元模型的方法，其特征在于，所述步骤3)包括：分离获得表皮干细胞，将表皮干细胞滴在生物3D打印胶块中央，进行气液平面培养。

9.如权利要求8所述的构建含皮肤附属器的生物3D打印皮肤微单元模型的方法，其特征在于，所述气液平面培养过程为将培养液仅没过生物3D打印皮肤微单元模型下层，上层则暴露于空气中；

所述气液平面培养的培养基采用以下培养基一种或多种培养基等量混合：

组分1、汗腺诱导培养基：以体积比为1:1的比例混合的DMEM/F12培养液加入10％v/v的胎牛血清、10ng/ml的表皮生长因子、20ng/ml的三碘甲腺原氨酸、0.64ng/ml的氢化可的松、1％v/v的ITS；

组分2、毛囊诱导培养基：以体积比为1:1的比例混合的DMEM/F12培养液加入5％v/v的胎牛血清、20％v/v的ITS、0.2nM/ml的三碘甲腺原氨酸、20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、2nM/m氢化可的松、2nM/m的睾酮、2nM/m的雌二醇、2nM/m的黄体酮；

组分3、皮脂腺培养基：以体积比为1:1的比例混合的DMEM/F12培养液加入10％v/v的胎牛血清、5ug/ml的胰岛素、10ng/ml的表皮生长因子、500ng/ml的氢化可的松。

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