CN108324993A - 一种诱导毛发再生的干细胞复合体、其制备方法及应用 - Google Patents
一种诱导毛发再生的干细胞复合体、其制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种诱导毛发再生的干细胞复合体、其制备方法及应用，该干细胞复合体由细胞培养支架和干细胞组成，所述细胞培养支架的主体为胶原蛋白凝胶悬滴，干细胞置于胶原蛋白凝胶悬滴内部，还包括一端伸出胶原蛋白凝胶表面的可吸收缝合线。本发明的干细胞复合体中，干细胞在诱导分化条件下可以定向分化为类似于器官组织的前体干细胞系，这种方法过模拟了毛囊发育的上皮细胞和间充质细胞之间的相互作用的过程，移植后能够产生功能完整的毛发，使干细胞移植更类似于组织器官移植。
Description
技术领域
本发明属于干细胞领域，具体涉及一种诱导毛发再生的干细胞复合体、其制备方法及应用。
背景技术
毛发的存在是哺乳动物的特征，其所承担的作用十分广泛，包括物理防护、隔热、掩护、分散汗液和脂肪、感觉和触觉功能以及社会意义上的相互作用。
健康成人头发总数平均有5～15万根，其生长受年龄、气候、环境及健康状况等多种因素影响，但调控毛发周期性生长的主要结构为毛囊细胞。毛囊呈周期性、有规律地自我再生，在人体内终生不断。但是，因雄激素退化或突变、斑秃发、脂溢性皮、外伤等会造成秃发，即指长毛部位的毛发出现脱落、变小、退化或脆性增加。
秃发在世界范围内有很高的患病率，在我国男性的患病率为21.3％，女性患病率为6.0％。在人类精神社会中毛发有着不可替代的重要性，秃发会给患者产生非常严重的精神、心理、人格问题，而且，随着现代人对自身形象更加关注，对科研工作者们提出了毛发再生这一亟待解决的难题。
目前，针对于毛发脱失的治疗主要有药物治疗和手术治疗。药物治疗仅能延缓秃发的过程，无法从根本上解决秃发的困扰。而手术治疗以自体毛发移植为主，虽然从某种程度上解决了秃发的外观，但由于无法再生出新的毛囊，对于供区不足的患者难于实施。由此，不少学者致力于毛发再生方面的研究，并取得了一定的进展。
目前，毛发再生的研究主要围绕如何通过调控毛囊干细胞的增殖分化而进行毛囊干细胞移植。1990年Cotsarelis等人在毛囊隆突部发现毛囊干细胞，而随后科研人员分离单个毛囊干细胞就可以体外大量增殖，并能够在体内分化为表皮、皮脂腺和毛囊，所以，毛囊干细胞是治疗大面积皮肤损伤、秃发的重要种子细胞。因此，毛囊干细胞为皮肤再生研究提供了一个新的思考方向，为治疗秃发提供了非常可观的医学应用前景。
最初临床上将毛囊单株或毛囊单位进行毛囊移植，但这种方法需分离自体头皮毛囊，操作复杂繁琐，而且无法再生新的毛囊，对于供区不足的患者难以实施。而随着胞培养技术和组织工程技术的发展，以毛囊干细胞再生为理论基础而设计的毛囊干细胞的三维培养体系已经得到进一步完善。
但是，研究发现，毛囊干细胞移植后虽然能够形成毛囊类似物，但毛干不能长出皮肤表，而且体外长时间培养易失去诱导毛囊形成的能力。这是因为毛发再生并非是单一胚层单一种类细胞的再生，毛发再生是毛发生长区域内的表皮和间充质组织相互作用、支持的结果，涉及到多胚层细胞的再生问题。
毛囊主要由上皮和真皮两部分结构组成，毛囊干细胞位于上皮部的隆突部，而间充质干细胞位于真皮乳头部，两种干细胞对于毛发再生均有着重要的作用。毛发的再生需要与周围组织如血管、汗腺、竖毛肌、结缔组织等发生功能联系才能发育成熟，故单纯的毛囊干细胞移植不能产生全能的毛发，即毛囊可以成功与周围组织发生功能联系并维持理想的毛发生长周期。
此外目前的干细胞和三维组织工程的方法主要围绕改善干细胞生存微环境、提高干细胞的存活率和调控定向转化而展开的，但仍无法避免移植后的致瘤问题。其产生的主要原因是移植后存在未分化的干细胞，而移植受体组织内干细胞的增殖和分化的失控可导致畸胎瘤的产生。
而且，干细胞移植后其组织发生顺序及解剖位置并没有具体引导信号参与。如果将这种胚胎干细胞在体外自发分化后获得的细胞不经过任何筛选，直接移植入动物体内，结果将不可避免地产生畸胎瘤。虽然可以通过流式细胞技术去处未分化细胞，但是目前仍缺乏特异性非常高的细胞标记分子，而且筛选效率不高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诱导毛发再生的干细胞复合体、其制备方法及应用，该干细胞复合体具有能够模拟表皮层与真皮层细胞相互作用诱导毛发再生的生理过程的特点，可以产生类似于皮肤毛发器官的毛囊干细胞系，移植后可以产生功能完整的毛发。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种诱导毛发再生的干细胞复合体，其由细胞培养支架和干细胞组成，所述细胞培养支架的主体为胶原蛋白凝胶悬滴，干细胞置于胶原蛋白凝胶悬滴内部；可吸收缝合线埋于胶原蛋白凝胶悬滴内部，贯穿于干细胞间，一端伸出胶原蛋白凝胶表面。
进一步，所述干细胞至少有两种，其在胶原蛋白凝胶悬滴内部形成表皮分化层和真皮分化层，其中，表皮分化层位于真皮分化层上层，表皮分化层与真皮分化层中的干细胞密度比例为1：2～4。
进一步，形成表皮分化层的干细胞选自人毛囊干细胞或表皮干细胞，形成真皮分化层的干细胞选自间充质干细胞。
又，所述干细胞是以拟胚体形式存在的，30～48个拟胚体单位接种于胶原蛋白凝胶悬滴中。
优选地，所述胶原蛋白凝胶悬滴的制备过程为：将α-MEM基质、缓冲液、酸性胶原蛋白以体积比1：1-1.5：8-10的比例混合均匀，取30-40μl混合液离心8-10min，再孵育1-1.5h，形成胶状悬滴；其中，所述缓冲液中含有NaOH 0.075-0.085mol/L和HEPES 180-220mmol/L，所述酸性胶原蛋白浓度为2-3.5mg/ml，pH3.0-3.5。
本发明所述诱导毛发再生的干细胞复合体的制备方法，包括如下步骤：
1)制作细胞培养支架
将α-MEM基质、缓冲液、酸性胶原蛋白以体积比1：1：8-10的比例混合均匀，取30-40μl混合液离心8-10min，再孵育1-1.5h，形成胶状悬滴；其中，所述缓冲液中含有NaOH0.075-0.085mol/L和HEPES 180-220mmol/L，所述酸性胶原蛋白浓度为2-3.5mg/ml，pH3.0-3.5；
2)组装干细胞
将干细胞悬浮液或者拟胚体置入胶原蛋白凝胶悬滴内，操作完成后再将含干细胞悬浮液或者拟胚体的胶原蛋白凝胶悬滴孵育15-20min，完成干细胞的组装；
3)插入可吸收缝合线
将长度5-8mm的可吸收缝合线插入胶原蛋白凝胶悬滴中，贯穿干细胞间，一端伸出胶原蛋白凝胶表面，获得所述诱导毛发再生的干细胞复合体。
所述干细胞复合体应用在诱导毛发再生中。
进一步，将所述干细胞复合体在培养基中诱导分化培养，其中，所述培养基中含有：DMEM/F12培养基，去血清置换液，L-谷氨酸2mM，非必需氨基酸0.1mM、β-巯基乙醇0.1mM、青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml、bFGF 10-15ng mg/ml，其中，DMEM/F12培养基和去血清置换液的体积比为80-90：10-20。
进一步，所述诱导分化步骤中，诱导分化培养时间为21天，每天更换培养基，培养基中添加生长因子的方案如下：
第1天，加入TGF-β2 45-55ng/ml；
第2天，加入RA1-1.5ng/ml；
第3天，更换新鲜培养基后加入RA 1-1.5ng/ml、TGF-β2 45-55ng/ml、EGF 15-25ng/ml，腺苷25-35mg/ml；
第6天，更换新鲜培养基后加入Wint 10b 450-550ng/ml、Wint 3a90-110ng/ml、腺苷25-35mg/ml和PFI-3 2-2.5mmol/L；
第10-21天，更换新鲜培养基后加入Wint 10b 500-600ng/ml、Wint 3a100-120ng/ml和腺苷25-35mg/ml。
本发明的干细胞复合体中，可由两种以上干细胞构成表皮分化层和真皮分化层，其中，表皮干细胞或者毛囊干细胞构成表皮分化层，间充质干细胞构成真皮分化层，在细胞支架内进行组装，参考图1，这种形式可以模拟毛囊发育过程中表皮细胞和间充质细胞的相互作用和相互联系，共同诱导毛发再生的生理过程，形成的表皮分化层为毛囊干细胞隆突部发生部位，真皮分化层是毛囊干的真皮乳头部发生部位，间充质干细胞可以发生为毛发的真皮乳头，且可以分化为血管、竖毛肌、汗腺等组织，对毛发的发生起到促进和支持作用。
本发明的干细胞复合体中，干细胞可为拟胚体，拟胚体为三胚层干细胞系，其为具有分化为各胚层潜力的干细胞系，在特定的分化条件下可以分化为类器官组织，在本发明特定的分化条件下可以分化为毛发器官，包括了毛囊、血管、竖毛肌、汗腺等多胚层分化结构，可以克服单一干细胞分化后不能与周围组织发生联系，继而不能分化为成熟的毛发器官的障碍。此外，多种干细胞在同种诱导分化条件下具有分化同步性，不同干细胞相互联系，避免了干细胞移植后分化不同步的而导致的成瘤风险。
本发明中的细胞培养支架具有模拟毛发组织发生的生物力学特性，包括组织粘性、硬度等物理信号，促进定向分化；可以促进干细胞定向分化，适于多种干细胞重组装。
本发明利用转化生长因子Wint10b、Wint 3a对所述干细胞复合体进行诱导，定向分化，并使用TGF-β2、腺苷、PFI-3等多种生长因子提高分化效率。
本发明克服了表皮干细胞移植不易形成完整功能的毛发的缺点，避免了单纯分离头皮毛囊干细胞时带来的的供区不足和移植操作技术复杂繁琐的问题，针对潜在的致瘤因素制定优化的定向分化方案。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的干细胞复合体中，含有不同种类的干细胞，将其进行分化后，多种干细胞可以定向分化为类似于器官组织的前体干细胞系，移植后能够产生功能完整的毛发，使干细胞移植更类似于组织器官移植，而不同于单种干细胞移植，更真实贴近毛发再生的自然发育过程，是干细胞移植观念的一个重大转变，使干细胞的临床应用更加容易实现，为临床上治疗秃发和头皮缺失的提供了一个新的思路。
附图说明
图1为本发明干细胞复合体之一的结构示意图。
图2为本发明实施例1的干细胞复合体的组装示意图。
图3为本发明实施例1中类毛发器官移植35天时毛发生长情况。
图4为本发明实施例2的干细胞复合体的组装示意图
图5为本发明实施例3的干细胞复合体的组装示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明中，PBS为磷酸缓冲液；DMEM/F12为DMEM与F12以1∶1混合的细胞培养基；EDTA为乙二胺四乙酸；bFGF为碱性成纤维细胞生长因子；EGF为表皮细胞生长因子；HBSS为Hank’s平衡盐溶液；HiPSC为人诱导多潜能干细胞；TGF-β2为生长因子-β；RA为维甲酸；HFSC为人毛囊干细胞；DP为真皮乳头细胞；HFSC和人毛囊干细胞源间充质干细胞来自于华山医院皮肤科细胞冻存库。
实施例1一种诱导毛发再生的干细胞复合体的制备及应用，包括如下步骤：
1)制作细胞培养支架
使用αMEM基质、缓冲液、酸性胶原蛋白三种材料配制胶原蛋白凝胶混合液：100μL十倍浓缩的αMEM基质、100μL缓冲液(NaOH 0.08M，HEPES 200mM)、800μL酸性胶原蛋白溶液(3mg/ml，pH3.0)。
将上述混合液加入无菌EP管内，使用无菌枪头上下吹打混匀，使用枪头吸取30-40μl滴于皿上或者24孔板上，在4℃下300g离心10分钟，以防止在凝胶中形成气泡，然后置于37℃下孵育平板1小时，以促进凝胶形成胶状悬滴。
获得的胶原蛋白凝胶悬滴的生物力学范围：起始弹性模量为13-18KPa，最大拉伸应力100-500KPa，应力松弛时间域为3,300–70s to1,300–40s，应力-应变β值2.2-2.8，应力-应变伸长比值0.28-0.31，蠕变斜率0.022-0.024。
2)准备并组装干细胞
将HFSC和人间充质干细胞分别进行复苏和传代。将冻存细胞加入4ml培养基重悬，200g离心5min。弃上清，用10ml培养基重悬细胞沉淀，接种于1个T75培养瓶，摇匀后，置37℃，5％CO2饱和湿度培养箱内培养。细胞培养瓶从培养箱中取出后加9ml培养基终止消化，将细胞接种至1个T225培养瓶中，补加20ml培养基，摇匀后，继续置37℃，5％CO2饱和湿度培养箱内培养，当T225瓶中细胞汇合度达到80-90％，即可用于细胞支架内组装。
准备硅化涂层的35mm皮氏培养皿和1.5-mL的硅脂包被的试管，将30μL的胶原蛋白悬滴置于35mm的硅脂铺层的组织培养皿上，然后将HFSC与间充质干细胞进行组装，HFSC位于上层，间充质干细胞位于下层，两种干细胞接种密度1：4，将细胞悬浮液转移至试管内，600g离心3min，用微型吸管吸去上清液，用0.1–10-μL的显微细胞吸管在显微镜下吸取0.05-μL细胞，并轻轻地置入胶原蛋白悬滴内，同一悬滴内置入30个左右细胞团，并将一长约5-8mm的8号胶原蛋白手术缝合线置入悬滴中央，获得所述干细胞复合体，参见图2。
3)诱导分化
将吸附干细胞复合体的培养皿放置在37℃孵育箱内孵育40min后，用显微镊将干细胞复合体转移至6孔板的培养基内继续培养。
培养条件为：37℃，5％CO2饱和湿度，每日更换培养基，换液方法为：吸除2/3-3/4并更换新的培养基，连续培养21天，培养成类毛发器官，即毛囊干细胞和间充质干细胞移植复合体。
培养基配方为：80％ DMEM/F12(1：1)，20％去血清置换液，2mM L-谷氨酸，1×10-4M非必需氨基酸、1×10-4Mβ-巯基乙醇，青霉素(100U/ml)，链霉素(100μg/ml)、bFGF 10-15ng/ml。
诱导分化步骤，培养基中添加转化生长因子的方案：第1天，加入TGF-β2 50ng/ml；第2天，加入RA1ng/ml；第3天，更换新鲜培养基后加入RA 1ng/ml、TGF-β2 50ng/ml、EGF20ng/ml，腺苷30mg/ml；第6天，更换新鲜培养基后加入Wint 10b 500ng/ml、Wint 3a100ng/ml、腺苷30mg/ml、PFI-3 2m mol/L；第10-21天，更换新鲜培养基后加入Wint10b500ng/ml、Wint 3a 100ng/ml、腺苷30mg/ml。
4)移植
干细胞复合体诱导定向分化21天后，取6周龄免疫缺陷型裸鼠，麻醉后确定好移植部位，局部以碘酊和70％酒精消毒，20G茅型手术刀近平行于皮肤表面刺破皮肤，将类毛发器官植入裸鼠背部皮下创口内，并用医用胶布固定手术线和创缘皮肤，观察并记录毛发生长的情况，移植25-65天可见毛发再生，图3为移植35天时毛发生长情况，可产生功能完整的毛发，接近毛发再生的自然发育过程。
实施例2
除步骤2)中准备并组装干细胞步骤与实施例1不同外，其余操作同实施例1。
本实施例中准备并组装干细胞步骤如下：
取冻存HiPSC复苏。
首先将胰酶在37℃水浴中加温，取复苏的HiPSC用PBS洗涤2次，加入胰酶(0.25％胰酶：0.4％EDTA＝1：1)，然后置于37℃，CO2饱和湿度为5％的孵育箱内孵育1min，加入1-2ml的胎牛血清中止胰酶，用吸管搔刮培养板底部并吹打克隆，然后将细胞悬液转移到10ml锥形离心管内，用吸管在离心管底部打碎克隆，直至看不到细胞团块并形成比较均匀的细胞悬液为止。
用1400r/min离心5min，移出上清，用10ml分化培养基重悬细胞，然后将细胞悬液转移到预先以0.1％明胶铺底的T75培养瓶中，孵育在37℃，5％CO2 1h，以分离悬液中部分成纤维细胞，使之帖附在培养瓶表面。收集未帖附细胞的培养基，以1000r/min离心5min，弃培养基，加入1ml分化培养基重悬细胞并吹打，以获得比较均匀的细胞悬液。
用细胞计数器计数细胞，将HiPSCs以90个/30μl，将其接种至Nunclon圆底96孔板内，每孔板内加入30μl的15％胎牛血清的DMEM培养基培养。
连续培养6天后，加入表面抗体标记物，PBS洗涤后，分别利用流式细胞仪对表皮干细胞和间充质干细胞进行分选，分选CD34+、CD49f+、PKH67+的表皮干细胞，SOX2+、PKH67+的间充质干细胞，将分选后的表皮干细胞和间充质干细胞用于同细胞支架进行组装。
准备硅化涂层的35mm皮氏培养皿和1.5-mL的硅脂包被的试管，将30μL的胶原蛋白悬滴置于35mm的硅脂铺层的组织培养皿上，然后将表皮干细胞和间充质干细胞进行组装，表皮干细胞位于上层，间充质干细胞位于下层，两种干细胞接种密度1：2，将细胞悬浮液转移至试管内，600g离心3min，用微型吸管吸去上清液，用0.1–10-μL的显微细胞吸管在显微镜下吸取0.05-μL细胞，并轻轻地置入胶原蛋白悬滴内，同一悬滴内置入30个左右细胞团，并将一8号胶原蛋白手术缝合线置入悬滴中央，获得所述干细胞复合体，参见图4。
将吸附胶原蛋白悬滴的培养皿放置在37℃孵育箱内孵育40min后，用显微镊将悬滴转移至6孔板的培养基内继续培养。培养条件为37℃，5％CO2饱和湿度，培养基每日更换，连续培养21天。
移植后移植后可产生功能完整的毛发，干细胞移植类似于组织器官移植，贴近毛发再生的自然发育过程。
实施例3
除步骤2)外，其余操作同实施例2。
准备并组装干细胞步骤如下：
取冻存HiPSC复苏后，将HiPSC以90个/30μl接种至Nunclon圆底96孔板内，每孔板内加入30μl的15％胎牛血清的DMEM培养基培养，第三天可见拟胚体形成，继续培养至第6天，获得拟胚体。
其中，培养基中，day1加入TGF-β2 50ng/ml；day2加入RA1ng/ml，day3更换新鲜培养基后加入RA 1ng/ml、TGF-β2 50ng/ml、EGF 20ng/ml，腺苷30mg/ml，day6天更换新鲜培养基后加入Wint 10b 500ng/ml、Wint 3a 100ng/ml、腺苷30mg/ml、PFI-3 2m mol/L。
准备硅化涂层的35mm皮氏培养皿和1.5-mL的硅脂包被的试管，将30μL的胶原蛋白悬滴置于35mm的硅脂铺层的组织培养皿上，将拟胚体单位转移至试管内，600g离心3min，用微型吸管吸去上清液，用0.1–10-μL的显微细胞吸管在显微镜下吸取拟胚体，并轻轻地置入胶原蛋白悬滴内，同一悬滴内置入30个左右细胞团，并将一8号胶原蛋白手术缝合线置入悬滴中央，获得所述干细胞复合体，参见图5。
将吸附胶原蛋白悬滴的培养皿放置在37℃孵育箱内孵育40min后，用显微镊将悬滴转移至6孔板的培养基内继续培养。培养条件为37℃，5％CO2饱和湿度，培养基每日更换，连续培养21天得到移植前复合体。
移植后可产生功能完整的毛发，干细胞移植类似于组织器官移植，贴近毛发再生的自然发育过程。
Claims (11)
1.一种诱导毛发再生的干细胞复合体，其由细胞培养支架和干细胞组成，所述细胞培养支架的主体为胶原蛋白凝胶悬滴，干细胞置于胶原蛋白凝胶悬滴内部；可吸收缝合线埋于胶原蛋白凝胶悬滴内部，贯穿于干细胞间，一端伸出胶原蛋白凝胶表面。
2.根据权利要求1所述诱导毛发再生的干细胞复合体，其特征在于，所述干细胞至少有两种，其在胶原蛋白凝胶悬滴内部形成表皮分化层和真皮分化层，其中，表皮分化层位于真皮分化层上层，表皮分化层与真皮分化层中的干细胞密度比例为1：2～4。
3.根据权利要求2所述诱导毛发再生的干细胞复合体，其特征在于，形成表皮分化层的干细胞为人毛囊干细胞或表皮干细胞。
4.根据权利要求2所述诱导毛发再生的干细胞复合体，其特征在于，形成真皮层的干细胞选自间充质干细胞。
5.根据权利要求1所述诱导毛发再生的干细胞复合体，其特征在于，所述干细胞是以拟胚体形式存在的，30～48个拟胚体单位接种于胶原蛋白凝胶悬滴中。
6.根据权利要求1所述诱导毛发再生的干细胞复合体，其特征在于，所述胶原蛋白凝胶悬滴的制备过程为：将α-MEM基质、缓冲液、酸性胶原蛋白以体积比1：1-1.5：8-10的比例混合均匀，取30-40μl混合液离心8-10min，再孵育1-1.5h，形成胶状悬滴；其中，所述缓冲液中含有NaOH 0.075-0.085mol/L和HEPES 180-220mmol/L，所述酸性胶原蛋白浓度为2-3.5mg/ml，pH 3.0-3.5。
7.如权利要求1或2或5所述诱导毛发再生的干细胞复合体的制备方法，包括如下步骤：
1)制作细胞培养支架
将α-MEM基质、缓冲液、酸性胶原蛋白以体积比1：1：8-10的比例混合均匀，取30-40μl混合液离心8-10min，再孵育1-1.5h，形成胶状悬滴；其中，所述缓冲液中含有NaOH 0.075-0.085mol/L和HEPES 180-220mmol/L，所述酸性胶原蛋白浓度为2-3.5mg/ml，pH 3.0-3.5；
2)组装干细胞
将干细胞悬浮液或者拟胚体置入胶原蛋白凝胶悬滴内，操作完成后再将含干细胞悬浮液或者拟胚体的胶原蛋白凝胶悬滴孵育15-20min，完成干细胞的组装；
3)插入可吸收缝合线
将长度5-8mm的可吸收缝合线插入胶原蛋白凝胶悬滴中，贯穿干细胞间，一端伸出胶原蛋白凝胶表面，获得所述诱导毛发再生的干细胞复合体。
8.如权利要求1所述干细胞复合体在诱导毛发再生中的应用。
9.权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述干细胞复合体在培养基中诱导分化培养，每天更换培养基；
其中，所述培养基中含有DMEM/F12培养基，去血清置换液，L-谷氨酸2mM，非必需氨基酸0.1mM、β-巯基乙醇0.1mM、青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml、bFGF 10-15ng/ml，其中，DMEM/F12培养基和去血清置换液的体积比为80-90：10-20。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述培养基中含有生长因子。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述诱导分化步骤中，诱导分化培养时间为21天，培养基中添加生长因子的方案如下：
第1天，加入TGF-β2 45-55ng/ml；
第2天，加入RA 1-1.5ng/ml；
第3天，更换新鲜培养基后加入RA 1-1.5ng/ml、TGF-β2 45-55ng/ml、EGF 15-25ng/ml，腺苷25-35mg/ml；
第6天，更换新鲜培养基后加入Wint 10b 450-550ng/ml、Wint 3a 90-110ng/ml、腺苷25-35mg/ml和PFI-3 2-2.5mmol/L；
第10-21天，更换新鲜培养基后加入Wint 10b 500-600ng/ml、Wint 3a 100-120ng/ml和腺苷25-35mg/ml。
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