KR20150089203A - 코스텔로 증후군의 유도-만능 줄기세포 모델 및 이의 용도 - Google Patents

코스텔로 증후군의 유도-만능 줄기세포 모델 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20150089203A
KR20150089203A KR1020140009531A KR20140009531A KR20150089203A KR 20150089203 A KR20150089203 A KR 20150089203A KR 1020140009531 A KR1020140009531 A KR 1020140009531A KR 20140009531 A KR20140009531 A KR 20140009531A KR 20150089203 A KR20150089203 A KR 20150089203A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ipsc
costello syndrome
cells
model
osteoblasts
Prior art date
Application number
KR1020140009531A
Other languages
English (en)
Inventor
한용만
강민용
Original Assignee
한국과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술원 filed Critical 한국과학기술원
Priority to KR1020140009531A priority Critical patent/KR20150089203A/ko
Publication of KR20150089203A publication Critical patent/KR20150089203A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8518—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic expressing industrially exogenous proteins, e.g. for pharmaceutical use, human insulin, blood factors, immunoglobulins, pseudoparticles

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 코스텔로 증후군(Costello syndrome, CS)의 유도-만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPSC) 모델, 이의 제조 방법, 및 상기 iPSC 모델을 코스텔로 증후군의 발병 연구 및 치료제 스크리닝 방법에 이용하는 용도에 관한 것으로, 구체적으로 코스텔로 증후군 환자의 섬유아세포로부터 코스텔로 증후군 유래의 iPSC의 발생 및, 배상체(embryoid body, EB), 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC) 및 조골세포(osteoblasts)의 분화를 유도하였으며, 상기 코스텔로 증후군의 iPSC 및 배상체는 다분화능 마커 유전자 및 단백질을 발현하였으며, 이를 조골세포로 분화한 결과, 상기 조골세포는 증식 가능성을 나타내나, 골광화(bone mineralization) 효과가 정상 세포에 비하여 현저하게 감소하여, 코스텔로 증후군 환자에서 나타나는 비정상적인 골격 표현형을 효과적으로 재현하므로, 상기 세포 모델은 코스텔로 증후군의 기전 분석 연구 및 치료제 스크리닝 방법을 위한 분석 연구에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

코스텔로 증후군의 유도-만능 줄기세포 모델 및 이의 용도{Costello syndrome induced pluripotent stem cell model and use thereof}
본 발명은 코스텔로 증후군(Costello syndrome, CS)의 유도-만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPSC) 모델, 이의 제조 방법, 및 상기 iPSC 모델을 코스텔로 증후군의 발병 연구 및 치료제 스크리닝 방법에 이용하는 용도에 관한 것이다.
코스텔로 증후군(Costello syndrome, CS)은 조잡한 얼굴(coarse face) 및 발달의 지연(developmental delay)을 나타내는 유전적 질병으로, 유두종(papillomas), 손목 및 손가락의 척골편향(Ulnar Deviation), 손바닥 및 발바닥의 깊은 주름, 비대형 심근증(hypertrophic cardiomyopathy) 또는 심방빈맥(atrial tachycardia), 및 악성 종양(malignant tumors) 등이 동반되는 것으로 알려져 있다. 최근 들어, 코스텔로 증후군의 분자구조적인 원인 유전자로서, HRAS 유전자의 12 또는 13번 글리신(glycine) 잔기의 변이가 보고된 바 있으나(Aoki Y et al., Nat Genet, 2005;37 :1038-1040), 자세한 병태생리학적 기전 및 이를 통한 치료제의 개발에 대하여는 보고된 바가 없다.
코스텔로 증후군은, 누난 증후군(Noonan syndrome), 제 1형 신경섬유종증 (neurofibromatosis type I), 심장-얼굴-피부 증후군(cardiofaciocutaneous syndrome, CFC 신드롬) 및 레오파드 증후군(LEOPARD syndrome)와 임상적인 증상이 유사하며, 상기 질병은 “RAS 관련 질병(RASopathies)”로 분류되고 있다. “RAS 관련 질병”에 대하여, 안면(craniofacial) 및 피부의(dermatologic) 증상은 RAS 관련 질병의 감별 진단적 신호(pathognomonic signs)로서 사용될 수 있으며, 근골격계의 이상(musculoskeletal abnormalities)은 저신장(short stature), 척추측만증(scoliosis), 골감소증(osteopenia)/골다공증(osteoporosis) 및 흉벽 장애(chest wall anomalies)를 포함하는 것으로 보고된 바 있다(Stevenson DA and Yang FC, AJMC C, 2011, 157(2): 90-103).
RAS 관련 질병을 이해하기 위해, NF1의 마우스 모델이 개발되어 다양한 방향에서 연구가 진행되고 있다. Ras의 조절장애(dysregulation)으로 인하여, 골질 재흡수 활동(bone resorptive activity)과 같은 파골세포 기능의 이상 뿐만 아니라, 비정상적인 조골계통 세포(osteolineage cell)의 증식 및 분화의 위험이 증가하는 것으로 보고되었다. 그러나, 상기 마우스 모델은 종 간의 차이로 인하여, 사람의 질환 표현형에 직접적으로 적용하는 것이 용이하지 않다는 한계를 나타내고 있다.
줄기세포(stem cell)는 조직을 구성하는 각 세포로 분화되기 전단계의 세포로서, 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있을 수 있으며, 미분화 상태에서 무한 증식이 가능한 자가증식능 및 특정 분화 자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재적 가능성인 다분화능을 가진 세포를 말한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며, 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation, expansion)하는 특성이 있으며, 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.
유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPS)를 포함하는 인간 다능성 줄기세포(Human pluripotent stem cells; hPSCs)는 다양한 특정 세포 종류로 분화할 수 있는 능력을 가져, iPS를 시험관 내의 분화 시스템을 사용하였을 때, 면역 거부반응의 낮은 위험도와 같은 치료 가능성(therapeutic potential) 뿐만 아니라, 기관 형성(organogenesis)의 초기 발달 동안에 복합적 질병의 메커니즘을 이해하는데 효과적인 평가자로 알려져 있다 Muotri, A. R. (2009) Epilepsy Behav 14 Suppl 1: 81-85; Marchetto, M. C., B. Winner, et al. (2010) Hum Mol Genet 19(R1): R71-76).
현재까지, 다양한 유전적 질병을 가지는 환자로부터 유래된 iPSC가 질병과-관련있는 세포 종류로 직접 분화되었을 때 질병-특이적인 표현형(phenotypes)을 나타내는 것에 관련되어 보고된 바 있다(Park, I. H. et al . Cell 134, 877-886 (2008); Tiscornia, G. et al. Nature medicine 17, 1570-1576 (2011)). 이러한 질병-특이적인 iPSC는 질병과 관련있는 세포 종류로 분화될 수 있으며, 이에 따라 질병의 구체적인 기작 또는 치료제 스크리닝 방법에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 여겨지고 있다.
따라서, 본 발명자들은 코스텔로 증후군을 연구하기 위한 질환 특이적 역분화 줄기세포 모델을 확립하기 위해 노력한 결과, 코스텔로 증후군 환자의 섬유아세포로부터 코스텔로 증후군 유래의 유도-만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPSC)주를 OCT4, SOX2, C-MYC, KLF4의 레트로바이러스 감염 방법(retroviral infection)을 통해 제작하였다. 상기 코스텔로 증후군의 iPSC는 환자의 섬유아세포와 동일한 HRAS 유전자 결함이 관찰되었고, 염색체는 정상임을 확인하였다. 다분화능 마커 유전자 및 단백질을 발현을 확인하였으며, 배상체로의 분화 및 생체 내(in vivo)에서 기형종(teratoma)의 형성을 확인함으로써, 생체 외(in vitro) 및 생체 내에서의 전분화능을 가지고 있음을 확인하였다. 상기 코스텔로 증후군 유래의 역분화 줄기세포를 이용한 질환 모델링을 수행하고자, Ras의 조절장애(dysregulation)로 인한 여러 질환 표현형 중, 특히 아직 인체 모델에서의 연구가 미진한 근골격계 이상에 대한 연구를 수행하고자 하였다. 근골격계의 이상(musculoskeletal abnormalities)은 저신장(short stature), 척추측만증(scoliosis), 골감소증(osteopenia)/골다공증(osteoporosis) 및 흉벽 장애(chest wall anomalies)를 포함하는 것으로 보고된 바 있다(Stevenson DA and Yang FC, AJMC C, 2011, 157(2): 90-103). 기존의 마우스 모델 연구를 통해 Ras 조절장애를 가진 여러 질환의 경우, 골질 재흡수 활동(bone resorptive activity)과 같은 파골세포 기능의 이상 뿐만 아니라, 비정상적인 조골계통 세포(osteolineage cell)의 증식 및 분화의 위험이 증가에 따라 근골격계 이상이 초래되는 것으로 보고되었다. 본 발명의 경우, 상기 코스텔로 증후군 환자 유래의 역분화 줄기세포를 이용하여 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC) 및 조골세포(osteoblasts)로의 분화를 유도하였으며, 조골세포로 분화시켰을 때, 골분화의 핵심 마커인 알칼리 포스파타아제(Alkaline phosphatase)의 발현 및 골광화(bone mineralization)가 정상 세포에 비하여 현저하게 감소함을 확인하였다. 따라서, 코스텔로 증후군 환자에서 나타나는 비정상적인 골격 표현형의 원인으로 조골세포의 분화능 감소를 실험적으로 확인할 수 있었으므로, 본 발명의 iPSC를 이용한 코스텔로 증후군의 세포 모델링 방법은 코스텔로 증후군의 병태생리 연구 및 치료제 후보물질 스크리닝 방법에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 코스텔로 증후군(Costello syndrome, CS) 환자의 세포와 동일한 특성을 유지하는 새로운 유도-만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPS)을 제공하여, 이를 코스텔로 증후군의 발병 연구 및 치료제 후보물질 스크리닝 방법을 위한 연구에 이용하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
i) 시험관 내(In vitro)에서 코스텔로 증후군(Costello syndrome) 환자로부터 분리된 섬유아세포(fibroblast)를 유도-만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cells; iPS)로 유도하는 단계; 및
ii) 상기 단계 i)에서 유도된 iPSC를 수득하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 코스텔로 증후군 iPSC 모델의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된, 코스텔로 증후군 iPSC 모델을 제공한다.
또한, 본 발명은
i) 상기 iPSC로부터 배상체(embryoid body, EB), 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC) 또는 조골세포(osteoblasts)로 분화를 유도하는 단계; 및
ii) 상기 단계 i)에서 유도된 배상체의 분화능, 중간엽 줄기세포의 분화능 또는 조골세포의 특성을 분석하는 단계를 포함하는, iPSC를 코스텔로 증후군의 모델로 사용하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
i) 상기 iPSC 모델에 피검 화합물 또는 피검 조성물을 처리하는 단계;
ii) 상기 iPSC의 분화능 또는 분화된 세포의 특성을 분석하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)의 분석한 결과를 무처리 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 코스텔로 증후군의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
i) 상기 iPSC 모델을 배상체(embryoid body), 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell) 및 조골세포(osteoblasts)로 분화를 유도하는 단계;
ii) 상기 단계 i)의 유도된 배상체, 중간엽 줄기세포 및 조골세포에 피검 화합물 또는 조성물을 처리하는 단계:
iii) 상기 단계 ii)의 처리된 배상체, 중간엽 줄기세포 및 조골세포의 특성을 분석하는 단계; 및
iv) 상기 단계 iii)의 분석한 결과를 무처리 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 코스텔로 증후군의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 코스텔로 증후군(Costello syndrome) 환자의 섬유아세포로부터 유래한 유도-만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPSCs)를 이용한 줄기 세포 모델은 배상체(embryoid body, EB), 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC) 및 조골세포(osteoblasts)의 분화될 수 있으며, 조골세포로 분화시켰을 때, 골분화의 핵심 마커인 알칼리 포스파타아제(Alkaline phosphatase)의 발현 및 골광화(bone mineralization)가 정상 세포에 비하여 현저하게 감소하므로, 상기 세포 모델은 코스텔로 증후군의 기전 분석 연구 및 치료제 스크리닝 방법을 위한 분석 연구에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 코스텔로 증후군(Costello syndrome) 환자로부터 유래된 유도-만능 줄기세포(induced puripotent stem cells, iPSC)를 나타낸다.
도 2는 코스텔로 증후군 유래의 iPSC(CS-iPSC)에서 코스텔로 증후군의 원인 유전자 변이를 확인을 나타낸다.
도 3은 CS-iPSC에서 정상적인 핵형을 나타내는 것을 확인을 나타낸다.
도 4는 미분화 여부를 확인하기 위한 CS-iPSC의 알칼리 포스파타아제 염색(Alkaline phosphatase staining, AP staining)을 확인을 나타낸다.
도 5는 CS-iPSC의 다분화능을 확인하기 위한 다분화능 마커 유전자 발현의 확인을 나타낸다.
도 6은 CS-iPSC에서 외인성(Exogenous)으로 유입된 리프로그래밍 인자(reprogrammiong factor)인 OCT4, SOX2, NANOG 및 C- MYC 유전자의 침묵(silencing)이 일어난 것을 나타낸다.
도 7은 코스텔로 증후군 유래의 iPSC인 CS-iPSC1에서 줄기세포성 마커인 OCT4, NANOG, SOX2, SSEA4, Tra-1-80 및 Tra-1-61 단백질의 발현 확인을 나타낸다.
도 8은 코스텔로 증후군 유래의 iPSC인 CS-iPSC2에서 줄기세포성 마커인 OCT4, NANOG, SOX2, SSEA4, Tra-1-80 및 Tra-1-61 단백질의 발현 확인을 나타낸다.
도 9는 CS-iPSC 유래의 배상체(embryoid body, EB)의 세포 형태를 나타낸다.
도 10은 코스텔로 증후군 환자 유래의 배상체(CS-ES)에서 외배엽(ectodermal), 내배엽(endodermal) 및 중배엽(mesodermal) 마커의 발현 확인을 나타낸다.
도 11은 면역 손상된 마우스에 주입(injection)된 CS-배상체의 조직 분석에서 세 가지 배엽층(germ layers)의 기형종(teratomas) 형성을 확인하였다.
도 12는 코스텔로 증후군 환자 유래의 조골세포(osteoblasts)에서 조골세포 주요 마커 유전자인 ALP, RUNX2, COL1A1 유전자 발현의 감소를 나타낸다.
도 13은 코스텔로 증후군 환자 유래의 조골세포(CS-OB)에서 조골세포 주요 마커 유전자인 OPN, RANKL 및 OPG 유전자 발현의 증가를 나타낸다.
도 14는 CS-OB의 증식 가능성 여부를 확인하기 위한 알칼리 포스파타아제 분석(alkaline phosphatase assay, ALP assay)을 나타낸다.
도 15는 CS-OB의 골광화 효과를 확인하기 위해 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM)의 알리자린 레드 에스 및 본-코사 염색(Alizarin red S and Von-Kossa staining)을 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
i) 시험관 내(In vitro)에서 코스텔로 증후군(Costello syndrome) 환자로부터 분리된 섬유아세포(fibroblast)를 유도-만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cells; iPS)로 유도하는 단계; 및
ii) 상기 단계 i)에서 유도된 iPSC를 수득하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 코스텔로 증후군 iPSC 모델의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된, 코스텔로 증후군 iPSC 모델을 제공한다.
상기 단계 i)의 유도는 OCT4, SOX2, KLF4 및 C-MYC를 포함하는 다분화능 마커(pluripotent marker)의 이소성 발현(ectopic expression)을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 iPSC는 하기 i) 내지 iii) 중 어느 하나 이상을 특징으로 하는 코스텔로 증후군 iPSC 모델;
i) 정상 세포의 iPSC 형태;
ii) OCT4, SOX2, NANOG, C- MYC, KLF4, REX1, ECAT15, GDF3 및 TERT로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 다분화능 마커 유전자의 발현; 및
iii) OCT4, NANOG, SOX2, SSEA4, Tra-1-80 및 Tra-1-61로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 줄기세포성 마커(stemness maeker) 단백질의 발현.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 코스텔로 증후군 환자로부터 유래된 iPSC(CS-iPSC)를 제조하여(도 1 참조), 원인유전자인 HRAS 유전자의 변이를 확인하였고(도 2 참조), 상기 CS-iPSC는 정상적인 핵형을 나타내며(도 3 참조), 미분화 상태에서 다분화능을 나타내는 것을 확인하였다(도 4 내지 도 8 참조).
따라서, 본 발명의 코스텔로 증후군 환자 유래의 iPSCs 모델은 코스텔로 증후군 환자 섬유아세포의 유전자 변이와 동일한 변이를 나타내면서 다분화능을 나타내므로, 상기 iPSCs 모델의 제조 방법은 코스텔로 증후군을 위한 분석 연구에 이용하는 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은
i) 제 3항의 iPSC로부터 배상체(embryoid body, EB), 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC) 또는 조골세포(osteoblasts)로 분화를 유도하는 단계; 및
ii) 상기 단계 i)에서 유도된 배상체의 분화능, 중간엽 줄기세포의 분화능 또는 조골세포의 특성을 분석하는 단계를 포함하는, iPSC를 코스텔로 증후군의 모델로 사용하는 방법을 제공한다.
상기 배상체는 외배엽(ectodermal) 마커인 TUJ1 및 NESTIN, 내배엽(endodermal) 마커인 SOX17 및 GATA4, 및 중배엽(mesodermal) 마커인 T 및 VIMENTIN로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 발현하는 것을 통해 분화능을 나타내는 여부를 확인하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 중간엽 줄기세포는 추가로 지방세포(adipocytes), 연골세포(chondrocytes) 또는 골세포(osteocyte) 중 어느 하나로 분화될 수 있는 분화능을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 조골세포의 특성은 하기 i) 내지 iv) 중 어느 하나 이상을 특성으로 하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
i) ALP, RUNX2 또는 COL1A1 유전자 발현의 감소;
ii) OPN, RANKL 또는 OPG 유전자 발현의 증가;
iii) 증식 가능성; 및
iv) 골광화(bone mineralization)에 대한 장애.
본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, CS-iPSC로부터 배상체(CS-배상체)로 분화를 유도한 결과, CS-배상체는 정상 세포의 배상체 형태를 나타내고(도 9 참조), 외배엽(ectodermal) 마커인 TUJ1 및 NESTIN, 내배엽(endodermal) 마커인 SOX17 및 GATA4, 및 중배엽(mesodermal) 마커인 T 및 VIMENTIN의 세 가지 배엽(germ layer) 마커를 모두 발현하여 다분화능을 나타내는 것을 확인하였으며(도 10 참조), 면역 손상된 마우스에 주입하였을 때, CS-배상체는 세 가지 배엽층에서 기형종(teratomas)을 형성하는 것을 확인하였다(도 11).
또한, 본 발명자들은 코스텔로 증후군 환자 유래의 iPSC로부터 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)로의 분화 확인한 결과, CS-iPSC로부터 유래된 중간엽 줄기세포를 수득하였으며, 상기 수득한 중간엽 줄기세포는 지방세포(adipocytes), 연골세포(chondrocytes), 골세포(osteocyte)로 분화될 수 있는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 코스텔로 증후군 유래의 iPSCs 모델은 배상체(embryoid body, EB), 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC) 및 조골세포(osteoblasts)의 분화될 수 있으며, 조골세포로 분화시켰을 때, 골분화의 핵심 마커인 알칼리 포스파타아제(Alkaline phosphatase)의 발현 및 골광화(bone mineralization)가 정상 세포에 비하여 현저하게 감소하여, 코스텔로 증후군 환자에서 나타나는 비정상적인 골격 표현형의 원인으로 조골세포의 분화능 감소를 실험적으로 확인할 수 있었으므로, 본 발명의 iPSC를 이용한 코스텔로 증후군의 세포 모델링 방법은 코스텔로 증후군의 병태생리 연구 및 치료제 후보물질 스크리닝 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은
i) 본 발명의 iPSC 모델에 피검 화합물 또는 피검 조성물을 처리하는 단계;
ii) 상기 iPSC의 분화능 또는 분화된 세포의 특성을 분석하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)의 분석한 결과를 무처리 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 코스텔로 증후군의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
i) 본 발명의 iPSC 모델을 배상체(embryoid body), 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell) 또는 조골세포(osteoblasts)로 분화를 유도하는 단계;
ii) 상기 단계 i)의 유도된 배상체, 중간엽 줄기세포 또는 조골세포에 피검 화합물 또는 조성물을 처리하는 단계:
iii) 상기 단계 ii)의 처리된 배상체, 중간엽 줄기세포 또는 조골세포의 특성을 분석하는 단계; 및
iv) 상기 단계 iii)의 분석한 결과를 무처리 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 코스텔로 증후군의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 배상체의 특성은 외배엽(ectodermal) 마커인 TUJ1 및 NESTIN, 내배엽(endodermal) 마커인 SOX17 및 GATA4, 및 중배엽(mesodermal) 마커인 T 및 VIMENTIN로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 발현하는 것을 통해 분화능을 나타내는 여부를 확인하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 중간엽 줄기세포의 특성은 추가로 지방세포(adipocytes), 연골세포(chondrocytes) 또는 골세포(osteocyte) 중 어느 하나로 분화될 수 있는 분화능을 갖는 것을 확인하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 조골세포의 특성은 하기 i) 내지 iv) 중 어느 하나 이상을 특성을 호가인하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
i) ALP, RUNX2 또는 COL1A1 유전자 발현의 감소;
ii) OPN, RANKL 또는 OPG 유전자 발현의 증가;
iii) 증식 가능성; 및
iv) 골광화(bone mineralization)에 대한 장애.
상기 코스텔로 증후군의 치료제 후보물질은, 본 발명의 iPSC 모델, 또는 이로부터 분화된 배상체, 중간엽 줄기세포 또는 조골세포의 특징을 분석함에 있어서 정상 대조군과 유사한 수준의 특성을 나타내도록 하는 물질로서 선별될 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 iPSC 모델로부터 분화 유도된 조골세포에서 골형성 및 골광화 수준을 정상 대조군과 유사한 수준으로 증가하도록 하는 물질인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 코스텔로 증후군 환자 유래의 iPSC의 골형성 장애 여부를 확인하기 위하여, CS-iPSC로부터 조골세포(CS-OB)의 분화를 유도한 결과, 골분화의 핵심 마커인 알칼리 포스파타아제의 발현 및 골광화(bone mineralization)가 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 15 참조).
따라서, 본 발명의 코스텔로 증후군 유래의 iPSCs 모델로부터 분화된 조골세포는 코스텔로 증후군에서 나타나는 비정상적인 골격 표현형을 재현할 수 있으므로, 상기 iPSC 모델은 코스텔로 증후군의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 코스텔로 증후군( Costello syndrome ) 환자로부터 유래된 유도-만능 줄기세포( induced puripotent stem cells, iPSC)의 제조
<1-1> 코스텔로 증후군 환자 유래의 iPSC 발생의 유도
본 발명의 실시예를 수행하기 위하여, 리프로그래밍 인자(reprogramming factor)인 OCT4, SOX2, KLF4 및 C-MYC를 이용한 이소성 발현(ectopic expression) 방법(Takahashi, K et al, Cell 131(5): 861-872, 2007)을 통해 코스텔로 증후군 환자의 섬유아세포로부터 코스텔로 증후군 유래의 iPSC(CS-iPSC)의 발생을 유도하였다.
구체적으로, 서울 아산병원(Asan medical center, 한국)에서 6 세 여성 코스텔로 증후군 환자가 연결되었고, 병원의 임상연구 윤리 심의위원회의 심사를 통과한 후, 환자와 법적 대리인의 동의를 얻어 국소 마취 후 펀치 생검법(punch biopsy method)으로 피부 조직 생검을 수행하여 코스텔로 증후군 환자로의 진피(dermal) 조직을 수득하였다. 그런 다음, 상기 수득한 진피 조직에서 섬유아세포를 분리하여 마이토마이신 C(mitomycin C, MMC)를 처리한 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts, MEF)에 유지하였다. 상기 분리한 섬유아세포는 20% 넉아웃 혈청 대체물(knockout serum replacement;Invitrogen 사, 미국), 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin, Pen Strep; Invitrogen 사, 미국), 1% 비필수 아미노산(nonessential amino acids, NEAA; Invitrogen 사, 미국), 2 mM L-글루타메이트(L-glutamate; Invitrogen 사, 미국) 및 0.1 mM β-머캅토에탄올(β-mercapto ethanol; Invitrogen 사, 미국)을 포함하는 영양소 혼합물 F-12(nutrient mixture F-12, DMEM/F12; Invitrogen 사, 미국) 배지인 둘베코 변이된 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle`s medium)에 10 ng/㎖ bFGF(Invitrogen 사, 미국)를 첨가하여 배양하였다. 그런 다음, OCT4, SOX2, KLF4 및 C- MYC 인자를 발현하는 레트로바이러스(retrovirus)의 형질도입(transduction)을 이용하는 공지된 기술(Takahashi, K et al, Cell 131(5): 861-872, 2007)을 사용하여 CS-iPSC의 발생을 발생을 유도하였다. 배양 중에는, 5 일 간격으로 상기 배양한 세포의 집락(colony)를 잘라 배양 접시(culture plate)에 옮기고, 10 ㎎/㎖ 콜라게나제 IV(collagenase IV)를 5 % 이산화탄소 조건에서 37℃에서 4 시간 동안 처리하여 상기 배양 접시에 부착하여 계대 배양을 수행하였다. 본 발명에서 정상 대조군으로 사용하기 위하여, 정상 인간 섬유아세포주인 CRL-2097 세포(cat No. CCD-1077Sk, ATCC 구입, 미국)로부터 상기와 동일한 방법을 수행하여 정상 섬유아세포 유래의 iPSC(CRL-iPSC)의 발생을 유도하였다.
그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이 코스텔로 증후군 환자 유래의 섬유아세포로부터 발생을 유도하여 20 계대 배양 후, 발생 유도된 CS-iPSC1 및 CS-iPSC2를 수득하였으며, 이는 정상 세포의 iPSC 형태를 나타내는 것을 확인하였다(도 1).
<1-2> 코스텔로 증후군 환자 유래의 iPSC 에서 원인 유전자 변이의 확인
코스텔로 증후군 환자로부터 유래한 CS-iPSC가 코스텔로 증후군의 원인 유전자 변이를 나타내는지 확인하기 위하여, CS-iPSC에서 HRAS 유전자 서열분석 및 핵형(karyotype) 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법을 수행하여 발생을 유도하여 수득한 CS-iPSC1 및 CS-iPSC2로부터 유전체 DNA(genomic DNA, gDNA)를 추출하고, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여 HRAS 유전자의 염기 서열을 확인하였다. 정상 대조군으로는 CRL-iPSC를 상기와 동일한 방법을 수행하여 HRAS 유전자의 염기 서열을 확인하여, 비교하였다. 또한, GenDix 사(한국)에서 유전체 진단(Genome Diagnosis)을 의뢰하여 CS-iPSC1 및 CS-iPSC2의 핵형을 분석하였다.
그 결과, 도 2 및 도 3에서 나타난 바와 같이 CS-iPSC의 11p15 염색체의 유전자에서 c34G>A 변이가 나타나, 상기 유전자에서 합성된 HRAS 단백질의 12 번째 글라이신(glycine, G) 잔기가 알라닌(alanine, A)잔기로 치환되는 변이체를 형성하는 것을 확인하였으며(도 2), CS-iPSC는 정상적인 핵형을 나타내는 것을 확인하였다(도 3).
<1-3> CS - iPSC 의 미분화 상태 확인
코스텔로 증후군 환자로부터 유래한 CS-iPSC가 미분화 상태인지 여부를 확인하기 위하여, CS-iPSC를 알칼리 포스파타아제 염색(Alkaline phosphatase staining, AP staining)하여 미분화 여부를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법을 수행하여 발생을 유도하여 수득한 CS-iPSC1 및 CS-iPSC2를 AP 염색 키트(카탈로그 번호: 86R-1KT; 시그마-알드리치 사, 미국)를 이용하여 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 AP 염색(AP staining)하여 확인하였다.
그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 CS-iPSC1 및 CS-iPSC2는 미분화 상태인 것을 확인하였다(도 4).
< 실시예 2> 코스텔로 증후군 환자 유래의 iPSC 의 다분화능 확인
<2-1> CS - iPSC 의 다분화능 유전자의 발현 확인
코스텔로 증후군 환자로부터 유래된 미분화 상태의 CS-iPSC가 다분화능을 나타내는지 확인하기 위하여, CS-iPSC에서 전환-유전자(trans-genes)에 해당하는 리프로그래밍 인자 유전자인 OCT4, SOX2, NANOG 및 C- MYC 유전자의 발현의 침묵(silencing)을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법을 수행하여 발생을 유도하여 수득한 CS-iPSC1 및 CS-iPSC2을 트리졸(TRIzol; Invitrogen, 미국)에 현탁하고 제조사의 프로토콜에 따라 CS-iPSC의 전체 RNA를 추출하였다. 그런 다음, 상기 추출한 RNA 1 ㎍을 M-MLV 역전사 합성효소(Moloney-murine leukemia virus reverse transcriptase; Enzynomics 사, 한국)를 올리고뉴클레오티드(oligo-dT), 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 혼합하여 사용하여 OCT4, SOX2, NANOG, C- MYC, KLF4, REX1, ECAT15, GDF3 및 TERT 유전자의 cDNA를 각각 합성하고, 이를 증폭하여 전기영동(electrophresis)로 상기 유전자의 발현을 mRNA 수준에서 확인하였다. 정상 대조군으로 사용하기 위하여, 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 CRL-2097 유래의 iPSC(SRL-iPSC) 및 정상 인간배아줄기세포주인 H9 세포주(H9 hESC)를 사용하고, 음성 대조군으로는 코스텔로 증후군 환자 유래의 섬유아세포(CS-fibroblast)를 사용하여, 상기와 동일한 방법을 통해 정상 줄기세포주에서 OCT4, SOX2, NANOG, C- MYC, KLF4, REX1, ECAT15, GDF3 및 TERT 유전자의 발현을 확인하였고, 발현 수준을 보정하기 위한 대조군으로는 GAPDH 유전자를 상기와 동일한 방법을 수행하여 발현량을 확인하였다.
그 결과, 도 5 및 도 6에서 나타난 바와 같이, 리프로그래밍 인자(reprogrammiong factor)를 억제하지 않았을 때의 CS-iPSC는 정상 대조군과 동일하게 다분화능 마커 유전자를 발현하는 것을 확인하였으며(도 5), 외인성(Exogenous)으로 유입된 리프로그래밍 인자 (reprogrammiong factor: OCT4, SOX2, NANOG 및 C- MYC ) 유전자의 발현이 감소하여, 침묵(silencing)이 일어났음을 확인하였다 (도 6).
<2-2> CS - iPSC 의 다분화능 마커 단백질의 발현 확인
코스텔로 증후군 환자로부터 유래된 미분화 상태의 CS-iPSC가 다분화능을 나타내는지 확인하기 위하여, CS-iPSC에서 줄기세포성 마커(stemness maeker) 단백질의 발현을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법을 수행하여 발생을 유도하여 수득한 CS-iPSC1 및 CS-iPSC2에 4% 포름알데히드(formaldehyde)를 포함하는 인산완충식염수 (phosphate buffered saline, PBS)를 처리하여 실온에서 15 분간 고정하고, 0.1% 트리톤 X-100(triton X-100)을 처리하여 세포막에 투과성(Permeability)를 부여하였다. 처리 후, 상기 처리한 세포를 4% 정상 당나귀 혈청(normal donkey serum)을 첨가하여 1 시간 동안 상온에서 차단(blocking)한 다음, 1차 항체로 항-OCT4 항체(1:300 희석, R&D Systems 사, 미국), 항-NANOG 항체(1:300 희석, Cell signaling technology 사, 미국), 항-SSEA-4 항체(1:300 희석, R&D Systems 사, 미국), 항-SOX2 토끼 항체(BD Transduction Laboratories, 미국), 항-Tra-1-81 항체(1:300 희석, Millipore 사, 미국) 또는 항-Tra-1-60 항체(1:300 희석, Millipore 사, 미국)를 각각 처리하여 4℃에서 밤새 배양하고, 0.1% 트윈-20(Tween-20)을 포함하는 PBS인 PBST로 수회 세척하였다. 세척 후, 알렉사 플루오르 488(Alexa Fluor 488) 또는 알렉사 플루오르 594(Alexa Fluor 594)가 결합된 2차 항체(Invitrogen, 미국)를 처리하여 1 시간 동안 배양하여 CS-iPSC를 면역형광염색하여, 형광 현미경(fluorescence microscope; olympus, 일본) 또는 자이스 LSM 510 공초점 현미경(Carl Zeiss, 독일)으로 관찰하여 OCT4, NANOG, SOX2, SSEA4, Tra-1-80 및 Tra-1-61 단백질의 발현을 확인하였다. 세포의 핵을 염색하기 위해, 4'6-디아미디노-2-페닐인돌(4'6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)을 처리하여 세포의 핵을 염색하여 비교하였다.
그 결과, 도 7 및 도 8에서 나타난 바와 같이, CS-iPSC에서 줄기세포성 마커인 OCT4, NANOG, SOX2, SSEA4, Tra-1-80 및 Tra-1-61 단백질이 정상 세포 수준으로 발현하는 것을 확인하였다(도 7 및 도 8).
< 실시예 3> 코스텔로 증후군 환자 유래의 배상체 ( embryoid body , EB ) 분화 유도
<3-1> CS - iPSC 로부터 배상체 분화 유도
시험관 내(in vitro)에서 CS-iPSC의 전분화능(pluripotency)를 확인하기 위하여, CS-iPSC로부터 배상체(EB)를 형성하도록 분화를 유도하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법을 수행하여 발생을 유도하여 수득한 CS-iPSC1 및 CS-iPSC2의 집락(colony)를 맥클래인 조직 절편기(McClain tissue chopper)를 사용하여 4 등분하였다. 상기 4 등분한 CS-iPSC는 초-저 부착 배지(ultra-low attachment dish)에 뿌려 10% 혈청 대체물(serum replacement, SR)을 포함하는 DMED/F12 배지인 배상체 분화 배지(embryoid body differentiation media) 5 ㎖에 재-현탁하고, 4 일간 현탁 배양하여 CS-iPSC 유래의 배상체(CS-배상체)로 분화를 유도하여, 분화된 배양체의 형태를 위상차 현미경으로 확인하였다.
그 결과, 도 9에서 나타난 바와 같이 CS-iPSC 유래의 배상체(CS-배상체)는 정상 세포의 배상체 형태를 나타내는 것을 확인하였다(도 9).
<3-2> 시험관 내에서( in vitro ) CS - 배상체의 분화능 확인
CS-배상체의 분화능을 확인하기 위하여, CS-배상체에서 외배엽(ectodermal) 마커인 TUJ1 및 NESTIN, 내배엽(endodermal) 마커인 SOX17 및 GATA4, 및 중배엽(mesodermal) 마커인 T 및 VIMENTIN의 세 가지 배엽(germ layer) 마커의 발현을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방법으로 분화를 유도한 CS-배상체를 상기 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 면역형광염색하여 TUJ1, NESTIN, SOX17, GATA4, T 또는 VIMENTIN 단백질의 발현을 확인하였다. 상기 면역형광염색을 위한 1차 항체로서 항-Tuj1 항체(1:100 희석, Millipore 사, 미국), 항-Nestin 항체(1:200 희석, Millipore 사, 미국), 항-SOX17 항체(1:100 희석, R&D Systems 사, 미국), 항-GATA4 항체(1:200, Santacruz technology 사), 항-Brachyury 항체(1:100 희석, R&D Systems 사, 미국) 또는 항-Vimentin 항체(1:100 희석, Abcam사, 미국)을 각각 사용하였고, 4'6-디아미디노-2-페닐인돌(4'6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)을 처리하여 세포의 핵을 염색하여 비교하였다.
그 결과, 도 10에서 나타난 바와 같이 CS-배상체는 TUJ1, NESTIN, SOX17, GATA4, T 및 VIMENTIN 단백질의 세 가지 형태의 배엽 마커를 모두 발현하여, 다분화능을 나타내는 것을 확인하였다(도 10).
<3-3> 생체 내( In vivo ))에서 CS - 배상체의 분화능 확인
생체 내에서 CS-배상체의 분화능을 확인하기 위하여, 면역 손상된 마우스 내에서 CS-배상체의 기형종(teratomas) 형성을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법을 수행하여 발생을 유도하여 수득한 CS-iPSC를 단일 세포로 분리(detach)한 후, 1X107 세포로 계수(counting)하여 매트리겔(matrigel) 100 ul과 혼합하였다. 상기 혼합한 매트리겔-세포 혼합물을, 4 내지 6 주령의 암컷 면역결핍 누드마우스의 우측 피하에, 23G 바늘이 달린 주사기(syringe)를 사용하여 마취하지 않은 상태에서 주입한 후, 마우스를 사육하였다. 1 개월 경과 후에, 상기 마우스를 경추탈골로 안락사 시키고, 우측 피하에 나타난 기형종을 절제(excision)하여 포르말린(formalin)에 1 일간 고정하였다. 그런 다음, H&E 염색을 통해 내배엽(endoderm), 외배엽(ectoderm) 및 중배엽(mesoderm)의 구조물 형성을 통해 기형종(teratoma)의 형성을 확인하였다.
그 결과, 도 13에서 나타난 바와 같이 조직 절편(histologic section)에서 세 가지 배엽층(germ layers)을 나타내는 기형종(teratomas)이 형성되는 것을 확인하여, 코스텔로 증후군 환자 유래의 iPSC가 생체 내에서도 다분화능을 나타내는 것을 확인하였다(도 13).
< 실시예 4> 코스텔로 증후군 환자 유래의 iPSC 로부터 중간엽 줄기세포( mesenchymal stem cell )로의 분화 확인
코스텔로 증후군 환자 유래의 iPSC를 코스텔로 증후군의 세포 모델로 사용할 수 있는지의 여부를 구체적으로 확인하기 위하하여, CS-iPSC를 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)로 분화되도록 유도하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법을 수행하여 발생을 유도하여 수득한 CS-iPSC1 및 CS-iPSC2를, 형질전환 생장인자-β 신호전달 경로(TGF-β signaling pathway)의 억제에 의한 공지된 방법을 통해 중간엽 줄기세포로 분화되도록 유도하였다(Mahmood A et al., J Bone Miner Res. 2010, 25(6):1216-1233). 그런 다음, 상기 유도한 중간엽 줄기세포에 어큐타제(Accutase; Innovative Cell Technologies 사, 미국)를 처리하여 37℃에서 10 분간 배양후 단일 세포를 탈착(detachment) 시켰다. 그런 다음, 상기 탈착 한 단일 세포를 FACS 완충용액에 현탁하여 300 ×g로 4℃에서 원심분리를 통해 2 회 세척한 후, MSC의 마커로 알려진 CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105, 및 비 MSC-마커인 CD31, CD34, CD45 및 CD106을 형광색소가 결합된 1차 항체를 이용하여, 얼음 위(4 도씨)에서 30 분간 반응하였다. 반응 후, FACS 완충용액으로 다시 2 회 세척한 다음,BD FACS 칼리버 유세포 분석기(BD FACS Calibur Flow cytometry)를 이용하여 위에서 상기 MSC-마커 및 비 MSC-마커의 발현 양상을 분석하였다.
그 결과, CS-iPSC로부터 유래된 중간엽 줄기세포를 수득하였으며, 상기 수득한 중간엽 줄기세포의 다분화능을 확인하기 위하여 지방세포(adipocytes), 연골세포(chondrocytes), 골세포(osteocyte)로 분화되도록 유도하였다.
< 실시예 5> 코스텔로 증후군 환자 유래의 iPSC 의 골형성 장애 여부 확인
<5-1> CS - iPSC 로부터 조골세포의 분화 유도
코스텔로 증후군 환자로부터 유래한 iPSC가 코스텔로 증후군에서 나타나는 비정상적인 골격 표현형(skeletal phenotype)을 재현하는지 확인하기 위하여, CS-iPSC를 MSC로 분화시킨후, 이를 조골세포( osteoblasts )로 분화되도록 유도하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법을 수행하여 발생을 유도하여 수득한 CS-iPSC1 및 CS-iPSC2를 STEMPRO 조골세포 분화 키트(STEMPRO osteogenesis differentiation kit; Invitrogen 사, 미국)을 사용하여 CS-iPSC로부터 유래된 조골세포(CS-OB)를 분화하였다(Tran NT et al., Stem Cells Dev. 2012, 1;21(7):1165-1175). 분화 중에는, 매 2 일 간격으로 새로운 배지로 바꾸어 배양하였다. 정상대조군으로 사용하기 위하여, 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 CRL-2097 유래의 iPSC(CRL-iPSC)를 상기와 동일한 방법을 수행하여, 정상 세포 유래의 조골세포(CRL-OB)로 분화되도록 유도하였다.
<5-2> CS - OB 의 조골세포 마커 유전자 발현 확인
코스텔로 증후군 환자로부터 유래한 조골세포(CS-OB)가 정상적으로 분화 유도되었는지 확인하기 위하여, CS-OB에서 조골세포 주요 마커 유전자인 ALP, RUNX2, COL1A1, 오스테오칼신(osteocalcin, OCN), 오스테오폰틴(osteopontin, OPN), RANKL, 오스테오프로테그린(Osteoprotegerin, OPG)의 발현을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <5-1>과 동일한 방법을 수행하여 분화를 유도한 CS-OB1 및 CS-OB2를 수득하여, 상기 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 전체 RNA를 추출하여, 조골세포의 주요 마커 유전자인 ALP, RUNX2, COL1A1, 오스테오칼신(osteocalcin, OCN), 오스테오폰틴(osteopontin, OPN), RANKL, 오스테오프로테그린(Osteoprotegerin, OPG) 유전자를 cDNA로 합성하였다. 그런 다음, 상기 합성한 cDNA를 주형으로 하고, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 각각 0.25 내지 0.5 pmole의 농도로 하여, 사이버그린(SybrGreen)을 사용하는 바이오-래드 CFX 매니저(Bio-Rad CFX manager; Bio-Rad Laboratories 사, 미국)로, 정량적인 real-time PCR(q-PCR)를 수행하여 상기 조골세포의 주요 마커 유전자인 ALP, RUNX2, COL1A1, OCN, OPN, RANKL, OPG의 발현을 mRNA 수준에서 확인하였다. 발현 수준을 보정하기 위한 대조군으로 GAPDH 유전자를 상기와 동일한 방법을 수행하여 발현량을 확인하였으며, 상기 조골세포의 주요 마커 유전자 각각의 △Ct 값은 GAPDH 및 각각의 유전자의 Ct값의 차이로 계산하였다. 정상 대조군으로는, 상기 실시예 <5-1>에서 분화를 유도한 CRL-OB에서 상기 유전자의 발현을 확인하고, 이를 CS-OB의 조골세포의 주요 마커 유전자의 발현량과 각각 비교하여 하기 [수학식 1]로 계산되는 발현 배수(fold change)로 표현하였다.
Figure pat00001
S△Ct: CFC-iPS에서 각각의 유전자의 △Ct 값; 및
C△Ct: WT-iPS에서 각각의 유전자의 △Ct 값.
그 결과, 도 12 및 도 13에서 나타난 바와 같이 CS-OB에서 ALP, RUNX2, COL1A1 유전자의 발현은 감소하나(도 12), OPN, RANKL 및 OPG 유전자의 발현은 현저히 증가하는 것을 확인하였다(도 13).
<5-3> CS - OB 의 증식 가능성 여부 확인
코스텔로 증후군 환자로부터 유래한 iPSC가 코스텔로 증후군에서 나타나는 비정상적인 골격 표현형을 재현하는지 확인하기 위하여, CS-OB의 증식 가능성 여부를 알칼리 포스파타아제 분석(alkaline phosphatase assay, AP assay)를 수행하여 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <5-1>과 동일한 방법을 수행하여 분화를 유도한 CS-OB1 및 CS-OB2를 수득하여, AP 염색 키트(카탈로그 번호: 86R-1KT; 시그마-알드리치 사, 미국)를 이용하여 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 AP 염색(AP staining)하여 확인하였다.
그 결과, 도 14에서 나타난 바와 같이 정상 세포 유래의 조골 세포에 비하여 CS-OB에서는 알칼리 포스파타아제의 발현량이 감소하는 것을 확인하였으며(도 14), 이는 코스텔로 증후군 환자 유래의 조골세포에서 골분화능이 감소됨을 시사한다.
<5-4> CS - OB 의 골광화 ( bone mineralization ) 효과 확인
코스텔로 증후군 환자로부터 유래한 iPSC가 코스텔로 증후군에서 나타나는 비정상적인 골격 표현형을 재현하는지 확인하기 위하여, CS-OB의 골광화 효과를 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM)을 알리자린 레드 에스 및 본-코사 염색(Alizarin red S and Von-Kossa staining)법으로 염색하여 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <5-1>과 동일한 방법을 수행하여 분화를 유도한 CS-OB1 및 CS-OB2을 배양한 웰에서 조심스럽게 배지만을 제거하고, 1X 2mL PBS 또는 행크의 균형 염용액(Hank's Balanced Salt Solution, HBSS)로 웰을 세척한 다음, 10% 포름알데하이드을 포함하는 고착액(fixative)을 처리하고 실온에서 15 분간 배양하여 세포를 고정하였다. 고정 후, 상기 고착액을 제거하고, 5 내지 10 분씩 총 3 회 세포를 증류수로 충분히 세척하였다. 세척한 세포는 1 ml/웰 알리자린 레드 염색 용액(Alizarin Red Stain Solution)을 첨가하여 실온에서 20 분간 배양하여 세포를 염색하여, 탈이온수로 4 회 세척하여 염색약을 제거하고, 건조되지 않도록 1 내지 1.5 mL의 물을 첨가하여, 알리자린 레드 염색된 세포를 수득하였다.
또한, 상기 실시예 <5-1>과 동일한 방법을 수행하여 분화를 유도한 CS-OB1 및 CS-OB2를 본 코사 염색(Von-Kossa staining)하기 위하여 증류수로 수회 세척한 다음, 글래스 커플린 자(glass coplin jar) 위에 상기 세포를 옮겨, 1% 질산은 용액(silver nitrate solution)을 첨가하고 자외선(ultraviolet light) 아래에서 20 분 간 배양하였다. 배양 후, 증류수로 수회 세척하여 질산은 용액을 제거하여, 5% 티오황산나트륨(sodium thiosulfate)을 처리하여 반응되지 않은 은을 제거하고 다시 증류수로 세척한 다음, 뉴클리어 패스트레드(nuclear fast red) 염색 용액을 첨가하여 5 분간 세포를 본 코사 염색하였다.
그 결과, 도 15에서 나타난 바와 같이 분화된 정상 iPSC 유래의 조골세포에 비래 환자 유래의 조골세포의 골광화가 저하되어 있는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 환자 특이적 역분화 줄기세포 및 이를 이용한 질환 모델링을 통해, 코스텔로 증후군에서 비정상적인 골형성이 일어나는 것에 대한 원인을 제시할 수 있는 단서가 됨을 확인하였다(도 15).

Claims (10)

  1. i) 시험관 내(In vitro)에서 코스텔로 증후군(Costello syndrome) 환자로부터 분리된 섬유아세포(fibroblast)를 유도-만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cells; iPSC)로 유도하는 단계; 및
    ii) 상기 단계 i)에서 유도된 iPSC를 수득하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 코스텔로 증후군 iPSC 모델의 제조 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 단계 i)의 유도는 다분화능 마커(pluripotent marker)의 이소성 발현(ectopic expression)을 사용하는 것을 특징으로 하는 시험관 내에서 코스텔로 증후군 iPSC 모델의 제조 방법.
  3. 제 1항의 방법으로 제조된, 코스텔로 증후군 iPSC 모델.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 iPSC는 하기 i) 내지 iii) 중 어느 하나 이상을 특징으로 하는 코스텔로 증후군 iPSC 모델;
    i) 정상 세포의 iPSC 형태;
    ii) OCT4, SOX2, NANOG, C- MYC, KLF4, REX1, ECAT15, GDF3 및 TERT로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 다분화능 마커 유전자의 발현; 및
    iii) OCT4, NANOG, SOX2, SSEA4, Tra-1-80 및 Tra-1-61로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 줄기세포성 마커(stemness maeker) 단백질의 발현.
  5. i) 제 3항의 iPSC로부터 배상체(embryoid body, EB), 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC) 또는 조골세포(osteoblasts)로 분화를 유도하는 단계; 및
    ii) 상기 단계 i)에서 유도된 배상체의 분화능, 중간엽 줄기세포의 분화능 또는 조골세포의 특성을 분석하는 단계를 포함하는, iPSC를 코스텔로 증후군의 모델로 사용하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 배상체는 외배엽(ectodermal) 마커인 TUJ1 및 NESTIN, 내배엽(endodermal) 마커인 SOX17 및 GATA4, 및 중배엽(mesodermal) 마커인 T 및 VIMENTIN로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 발현하는 것을 특징으로 하는 iPSC를 코스텔로 증후군의 모델로 사용하는 방법.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 추가로 지방세포(adipocytes), 연골세포(chondrocytes) 또는 골세포(osteocyte) 중 어느 하나로 분화될 수 있는 분화능을 갖는 것을 특징으로 하는 iPSC를 코스텔로 증후군의 모델로 사용하는 방법.
  8. 제 5항에 있어서, 상기 조골세포는 하기 i) 내지 iv) 중 어느 하나 이상을 특징으로 하는 iPSC를 코스텔로 증후군의 모델로 사용하는 방법:
    i) ALP, RUNX2 또는 COL1A1 유전자 발현의 감소;
    ii) OPN, RANKL 또는 OPG 유전자 발현의 증가;
    iii) 증식 가능성; 및
    iv) 골광화(bone mineralization)에 대한 장애.
  9. i) 제 3항의 iPSC 모델에 피검 화합물 또는 피검 조성물을 처리하는 단계;
    ii) 상기 iPSC의 분화능 또는 분화된 세포의 특성을 분석하는 단계; 및
    iii) 상기 단계 ii)의 분석한 결과를 무처리 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 코스텔로 증후군의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
  10. i) 제 3항의 iPSC 모델을 배상체(embryoid body), 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell) 또는 조골세포(osteoblasts)로 분화를 유도하는 단계;
    ii) 상기 단계 i)의 유도된 배상체, 중간엽 줄기세포 또는 조골세포에 피검 화합물 또는 조성물을 처리하는 단계:
    iii) 상기 단계 ii)의 처리된 배상체, 중간엽 줄기세포 또는 조골세포의 특성을 분석하는 단계; 및
    iv) 상기 단계 iii)의 분석한 결과를 무처리 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 코스텔로 증후군의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
KR1020140009531A 2014-01-27 2014-01-27 코스텔로 증후군의 유도-만능 줄기세포 모델 및 이의 용도 KR20150089203A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140009531A KR20150089203A (ko) 2014-01-27 2014-01-27 코스텔로 증후군의 유도-만능 줄기세포 모델 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140009531A KR20150089203A (ko) 2014-01-27 2014-01-27 코스텔로 증후군의 유도-만능 줄기세포 모델 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20150089203A true KR20150089203A (ko) 2015-08-05

Family

ID=53885697

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140009531A KR20150089203A (ko) 2014-01-27 2014-01-27 코스텔로 증후군의 유도-만능 줄기세포 모델 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20150089203A (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018026212A3 (ko) * 2016-08-05 2018-03-29 한국생명공학연구원 섬유증 질환 모델의 제조방법 및 섬유증 질환 모델의 용도
CN108324993A (zh) * 2018-01-15 2018-07-27 上海神因生物科技有限公司 一种诱导毛发再生的干细胞复合体、其制备方法及应用

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018026212A3 (ko) * 2016-08-05 2018-03-29 한국생명공학연구원 섬유증 질환 모델의 제조방법 및 섬유증 질환 모델의 용도
CN108324993A (zh) * 2018-01-15 2018-07-27 上海神因生物科技有限公司 一种诱导毛发再生的干细胞复合体、其制备方法及应用
CN108324993B (zh) * 2018-01-15 2020-11-03 朱剑虹 一种诱导毛发再生的干细胞复合体、其制备方法及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7134317B2 (ja) 生体組織から単離できる多能性幹細胞
Shaikh et al. Mouse bone marrow VSELs exhibit differentiation into three embryonic germ lineages and germ & hematopoietic cells in culture
Atari et al. Dental pulp of the third molar: a new source of pluripotent-like stem cells
Huang et al. Plasticity of stem cells derived from adult periodontal ligament
US11155782B2 (en) Method for preparing pluripotent stem cells
Jones et al. Ontological differences in first compared to third trimester human fetal placental chorionic stem cells
AU2021209278B2 (en) Methods and compositions to modulate hair growth
EP2665811B1 (en) Somatic cells with innate potential for pluripotency
Nakayama et al. The development of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem/stromal cells from normal human and RDEB epidermal keratinocytes
Coste et al. Human bone marrow harbors cells with neural crest-associated characteristics like human adipose and dermis tissues
Oh et al. Human-induced pluripotent stem cells generated from intervertebral disc cells improve neurologic functions in spinal cord injury
Hwang et al. Direct differentiation of insulin-producing cells from human urine-derived stem cells
Vojnits et al. Characterization of an injury induced population of muscle-derived stem cell-like cells
Li et al. Comparative study of periodontal differentiation propensity of induced pluripotent stem cells from different tissue origins
KR20150089203A (ko) 코스텔로 증후군의 유도-만능 줄기세포 모델 및 이의 용도
Sanz‐Serrano et al. Dental Stem Cells SV40, a new cell line developed in vitro from human stem cells of the apical papilla
Kuwar et al. Generation of induced pluripotent stem cells from rat fibroblasts and optimization of its differentiation into mature functional neurons
新戸部陽士郎 Neurotrophic Factor Secretion and Neural Differentiation Potential of Multilineage-differentiating Stress-enduring (Muse) Cells Derived From Mouse Adipose Tissue
Günther Generation of early human neuroepithelial progenitors from primary cells for biomedical applications
Souralova et al. and Irena Koutna
Vosough Abstracts of Royan International Twin Congress
AU2012207281A1 (en) Somatic cells with innate potential for pluripotency

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application