CN103710310A - 一种诱导小鼠诱导型多能干细胞骨向分化的方法及其培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导小鼠诱导型多能干细胞骨向分化的方法及其培养基。本发明提供的方法是将小鼠多能干细胞接种到分化培养基I中形成间质细胞富集的拟胚体，再分离拟胚体并在分化培养基II中培养获得成骨细胞。本发明公开的分化培养基I是在成纤维细胞培养基基础上添加全反式维甲酸和碱性成纤维细胞生长因子，分化培养基II是在成骨细胞培养基的基础上降低D-葡萄糖含量，并添加BMP4或BMP7。本发明提供方法和培养基能够显著促进小鼠多能干细胞的骨向分化，具备周期短、分化率高、效果稳定等特点，具有广阔的应用前景和实用价值。

Description

一种诱导小鼠诱导型多能干细胞骨向分化的方法及其培养基

技术领域

本发明涉及了一种诱导小鼠诱导型多能干细胞骨向分化的方法及其培养基，属于生物技术领域。

技术背景

多能性干细胞是指具有形成动物个体所有类型细胞的多向分化潜能，并能够不断自我更新的一类细胞。它们一方面通过细胞分裂维持自身群体的大小或扩增，另一方面可以进一步分化为特异的细胞类型。由于多能性干细胞的上述特性，使其在细胞替代治疗、基因治疗、发育生物学、药理学等领域发挥着独特的作用和优势。目前，多能性干细胞根据其来源分为三类：来源于胚胎囊胚内细胞团的胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）、来源于胚胎生殖嵴原始生殖细胞的胚胎生殖细胞(embryonic germ cell，EGC)和通过体细胞重编程而获得的诱导型多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPS）。由于ES和EG细胞来源于发育期的胚胎，它们的获得，特别是人类ES及EG细胞的获得引发了许多伦理学上的争议。另外，将ES及EG细胞应用到人类临床治疗还面临着免疫排斥的风险。这两点限制了ES及EG细胞在临床医学及基础科学领域的应用。

2006年，Yamanaka等首次将Oct4、Sox2、Klf4及c-myc导入小鼠皮肤成纤维细胞获得了类似于小鼠ES细胞的iPS细胞系（Takahashi and Yamanaka,2006），经证实，这类细胞能够参与正常胚胎发育和组织器官的形成，并获得了生殖系嵌合的小鼠（Zhao et al.，2009）。2007年，Thomson实验室和Yamanaka实验室几乎同时宣布了人类iPS细胞系的建立（Yu et al.,2007；Takahashi et al.,2007）。此后，iPS细胞的研究得到了迅速发展，到目前为止，小鼠、大鼠、兔、狗、猪、猴、人等物种的iPS细胞系都已成功建立，并且它们在形态学、表观遗传学、全基因组表达图谱及分化能力等方面均表现出与其ES细胞相似的特性。iPS技术的建立，使最初基于胚胎和卵母细胞的“治疗性克隆”的设想在体细胞上得到了实现-通过体外建立、扩增及定向诱导iPS细胞可以获得足够数量的目标细胞用于细胞移植治疗和基因治疗，并且这一系列操作均不受伦理学上的限制。另外，获得病人特异的iPS细胞也可以避免外源移植引起的免疫排斥、交叉感染的风险。这一思路为许多细胞缺损性疾病的治疗带来了新的希望，例如：进行性肌营养不良、老年痴呆症、糖尿病、骨质疏松症、心肌梗死等。

现已证明，iPS细胞在适当的培养条件下可以分化为多种细胞类型，如：肌肉细胞（Zhanget al.,2009）、脂肪细胞（Tashiro et al.,2009）、胰腺细胞（Tateishi et al.,2008）、造血细胞（Chioet al.,2009）、神经细胞（Chamber et al.,2009）、成骨细胞等（Pepoo et al.,2009；Tashiro et al.,2009）。但现有的定向诱导技术普遍存在着培养基成分不明确、分化细胞纯度低的问题。此外，要想达到临床标准，研究者们在优化培养体系的同时，还应该对移植细胞的致瘤性、有效性进行评价，而这些检测显然不能在人类上进行。作为最常用的模式动物，现代医学中90%的亚临床试验实是在小鼠中开展的。小鼠生长周期短、谱系明确，其发育机制普遍通用于哺乳动物。所以，通过对小鼠iPS细胞骨诱导条件的优化，一方面有利于后期检测中自体移植试验的开展，另一方面将为人类细胞骨诱导条件的优化和骨再生医学的研究提供有益参考。

发明内容

本发明提供了一种诱导小鼠诱导型多能干细胞骨向分化的培养基，采用的技术方案如下：

一种诱导小鼠iPS细胞骨向分化的培养基由分化培养基I和分化培养基II组成，其中分化培养基I是在成纤维细胞培养基基础上添加全反式维甲酸和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）制得，分化培养基II是在成骨细胞培养基的基础上降低D-葡萄糖含量，并添加BMP4或BMP7制得。

优选地，所述培养基由以下两种培养基组成：

分化培养基I是在成纤维细胞培养基的基础上添加10^-8-10^-7mol/L的全反式维甲酸（美国Sigma公司）和3-10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（美国Peprotech公司），pH7.0-7.4；

分化培养基II是在成骨细胞培养基的基础上降低D-葡萄糖含量为原浓度的20-40%，并添加60-120ng/mL BMP4（美国Peprotech公司）或40-120ng/mL BMP7（美国Peprotech公司），pH7.0-7.4。

所述成纤维细胞培养基为含有10%胎牛血清，1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基（美国Hyclone公司）。

进一步地，所述成骨细胞培养基为含有10%FBS、1%青霉素-链霉素、50mg/L抗坏血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、10^-8mol/L地塞米松的高糖DMEM培养基。

进一步地，所述分化培养基I是添加5×10^-8mol/mL的全反式维甲酸和10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子，含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基，pH7.0-7.4；分化培养基II是添加100ng/mL BMP4或100ng/mL BMP7，含有10%FBS、1%青霉素-链霉素、50mg/L抗坏血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、10^-8mol/L地塞米松，葡萄糖含量为原浓度25%的高糖DMEM培养基，pH7.0-7.4。

本发明的另一目的是提供了一种诱导小鼠iPS细胞分化为成骨细胞的方法，步骤如下：

1）将小鼠诱导型多能干细胞接种到超低粘附培养皿中，加入分化培养基I，培养3-6天，形成拟胚体；

所述分化培养基I组成为：是在成纤维细胞培养基的基础上添加10^-8-10^-7mol/L的全反式维甲酸和3-10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子，pH7.0-7.4；

2）将步骤1)所得拟胚体离心分离后，收集拟胚体并添加分化培养基II，吹打后接入到明胶铺底的培养皿中，补充分化培养基II，培养并隔天更换培养基，培养7-14天，得成骨细胞；

所述分化培养基II组成为：是在成骨细胞培养基的基础上降低D-葡萄糖含量为原浓度的20-40%，并添加60-120ng/mL BMP4或40-120ng/mLBMP7，pH7.0-7.4。

所述方法步骤1）中，培养时间5天。

所述方法步骤2）中，培养时间14天，且第一次更换培养基时，用37℃温浴的PBS清洗1-3次。

所述方法步骤1）和步骤2）中分化培养基培养的温度为37℃，含有5%CO₂。

所述方法的具体步骤如下：

1）间质细胞富集的拟胚体的诱导：利用差速贴壁法去除饲养层细胞，获得纯净的小鼠诱导型多能干细胞，将所得到的小鼠诱导型多能干细胞以2×10⁵个/mL的密度接种到超低粘附培养皿中，加入分化培养基I，于37℃、5%CO₂条件下培养，从第2天起，每天摇动培养基2次，从第3天开始，每天补加10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子，培养5天形成拟胚体；

所述分化培养基I组成为：是在成纤维细胞培养基的基础上添加5×10^-8mol/L的全反式维甲酸和10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子，pH7.0-7.4；

2）成骨细胞的诱导：将步骤1）所得拟胚体于1200rpm下离心1min，收集拟胚体并添加少量分化培养基，机械吹打为小细胞团块后接种到明胶铺底的培养皿中，补充分化培养基II，于37℃、5%CO₂条件下培养并隔天更换培养基，培养14天，获得成骨细胞；

所述分化培养基II组成为：是在成骨细胞培养基的基础上降低D-葡萄糖含量为原浓度的25%，并添加100ng/mL BMP4或100ng/mLBMP7，pH7.0-7.4。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种诱导小鼠iPS细胞定向分化为成骨细胞的方法及其培养基。所使用的分化培养基I中添加的全反式维甲酸可以促进拟胚体形成的同时间质类型细胞的富集。在动物胚胎发育过程中，形成的间质细胞可以进一步分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等类型。培养基I中添加的bFGF一方面可以通过激活ERK信号通路抑制细胞的成脂分化，另一方面可以抑制细胞凋亡。该步骤无需换液，若培养时间超过3天，仅需每天补充bFGF即可。检测结果证明，培养基I中形成的拟胚体中，间质细胞特异性基因的表达水平髙于自发分化形成的拟胚体（图3）。所使用的培养基II中添加的BMP可以提高细胞骨向分化的效率并促进成骨细胞的进一步成熟，在此基础上降低培养液中D-葡萄糖的含量可以起到促进细胞分化的作用，鉴于分化细胞的代谢水平远低于增殖期细胞。检测结果显示，培养基II中形成的分化细胞的矿化水平及成骨基因Rux2、osteocalcin的表达水平均得到显提高（图4-5）。

本发明所采用的骨诱导方法力求模拟动物体内的成骨模式，因而是一种比较合理的诱导方案。用本发明及其专用培养基诱导小鼠iPS细胞分化为成骨细胞只需两步完成，具有周期短、分化率高、效果稳定等特点。小鼠作为最常用的模式动物，对其骨诱导条件的优化一方面为人类胚胎发育机制的探索提供了良好的实验材料，另一方面将为人类再生医学的研究提供有益参考，具有广阔的应用前景和实用价值。

附图说明

图1为诱导小鼠iPS细胞分化为成骨细胞的技术流程图。

图2为对小鼠iPS细胞的鉴定。

图3为对培养基I中培养3天后形成的拟胚体进行中胚层分化基因表达检测的结果。

图4为对培养基II中培养14天后的细胞进行茜素红染色的结果。

图5为对培养基II中培养14天后的细胞进行成骨基因Runx2和osteocalcin表达水平检测的结果。

具体实施方式

下面结合具体实例来进一步阐述本发明，下述实例是对本发明的说明而非限定本发明的试用范围，实例中若无特别说明均为常规方法。

实施例1小鼠iPS细胞的培养及鉴定

获得并维持具有良好的多能性及分化能力的小鼠iPS细胞系是后期开展细胞定向诱导分化的基础。本实例为对本发明所使用的小鼠iPS细胞进行的培养、鉴定操作过程的描述。

一、小鼠iPS细胞的培养

本实例采用的小鼠iPS细胞系p14-2-2由中国科学院干细胞库提供。

丝裂霉素C工作液：2mg丝裂霉素C溶于200mL含10%胎牛血清的高糖DMEM中，过滤除菌。

0.1%明胶：0.1g明胶粉末溶解于100mL双蒸水中，高压灭菌。

成纤维细胞培养液：内含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的高糖DMEM。

LN培养液：内含48%DMEM/F12、48%Neurobasal、1000U/mL LIF、0.5%N2、1%B27、0.5mg/mLBSA、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。

1、饲养层细胞的制备

取13.5天的孕鼠，断颈处死后，取出子宫置于盛有PBS的培养皿中；分离胎鼠，去其头、尾和内脏；PBS清洗数次后充分剪碎，加入0.05%的胰酶/EDTA，吹打2分钟后加入成纤维细胞培养液终止消化；离心、弃上清，加入成纤维细胞培养液重悬细胞后接种于培养皿中，记为原代。

取上述3-5代的细胞，去除培养液加入终浓度为10ug/mL丝裂霉素C工作液；37℃培养3小时后去除丝裂霉素C工作液，PBS充分清洗；0.05%胰酶/EDTA处理后，加入成纤维细胞培养液终止消化；离心、弃上清，按照7×10⁴个细胞/ml接种于0.1%明胶包被的培养皿中；37℃培养12-24小时，得到用以培养小鼠iPS细胞的饲养层。

2、小鼠iPS细胞的常规培养

饲养层使用前用PBS清洗3次，将小鼠iPS细胞接种于饲养层铺底的培养皿中，加入LN培养液，摇匀后置于37℃、5.0%CO₂饱和湿度的培养箱中培养。每天换液，每3天以Tryple酶消化传代一次，如若发现克隆密度或面积过大应及时传代。图2A左图为传代34代的小鼠iPS细胞形态，从图中可见克隆呈岛状或鸟巢状，边界清晰，细胞间界限不明显。

二、小鼠iPS细胞的鉴定

1、核型鉴定

小鼠iPS细胞经过34次传代后，向培养皿中加入秋水仙素，终浓度为0.4ug/mL；2.5小时后收集细胞，接种于明胶包被的培养皿中用以除去饲养层细胞，10分钟后收集细胞悬液，并在37℃下于低渗液中孵育15分钟；配置新鲜的固定液（甲醇：冰醋酸=3:1（V/V）），将细胞于室温固定5分钟后，离心、弃上清；向沉淀中加入冰冷的固定液，并置于冰上固定20分钟；重复上述步骤一次后离心，向沉淀中加入200μl冷固定液，滴片（载玻片在冻箱中预冷，滴片要迅速，以免载玻片回温或干燥）；载玻片干燥后进行吉姆萨染色，5分钟后可以镜检。图2A右图为34代的小鼠iPS细胞核型，小鼠iPS细胞经过多次传代后其染色体的数目、形态未见明显异常。

2、免疫荧光鉴定多能性基因表达

除去细胞培养液，PBS清洗3次后，4%多聚甲醛室温固定30分钟；PBS清洗3次，加入0.1%Triton-100在37℃透膜1小时；PBS清洗3次后，室温下用含0.1%BSA的封闭液孵育细胞30分钟；此后，分别加入封闭液稀释的抗Oct-4、Sox2、SSEA1或Nanog的一抗在4℃下孵育过夜；PBS震荡清洗细胞3次后，加入二抗，37℃下避光孵育1小时；Hochest33342染色液染核10分钟；PBS震荡清洗后加入防荧光淬灭剂，显微镜下观察并拍照。如图2B（小鼠iPS细胞多能性基因表达检测结果）所示，本实例条件下培养的小鼠iPS细胞，多能性基因Oct4、Sox2、Nanog、SSEA1均呈阳性表达，证明本发明所使用的小鼠iPS细胞具有良好的多能性。

3、小鼠iPS细胞分化能力检测

除去细胞培养液，收集细胞，并用明胶贴壁法去掉饲养层细胞；将纯化的小鼠iPS细胞以10⁷/ml注入6周龄裸鼠大腿内侧；3周后处死小鼠，取畸胎瘤样本固定；按照标准的石蜡切片制作及HE染色步骤操作，封片后观察三胚层的形成情况。结果显示（图2C小鼠iPS细胞形成的畸胎瘤切片HE染色情况），本实例所使用的小鼠iPS细胞在体内具有良好的分化潜能，形成的畸胎瘤具有三胚层来源的典型结构，包括神经组织（外胚层，图2C左）、脂肪组织（中胚层，图2C中）、分泌腺管样组织（内胚层，图2C右）。

实施例2小鼠iPS细胞的骨向诱导分化

在本发明中，小鼠iPS细胞的骨向诱导分化是通过两步完成的：第一步是在适当地培养条件下获得间质细胞富集的拟胚体；再经过第二步定向诱导分化获得成骨细胞。操作流程参见图1。

一、拟胚体的制备

分化培养基I：成纤维细胞培养液中添加5×10^-8mol/L全反式维甲酸和10ng/mL的bFGF，pH为7.0-7.4。其中，成纤维细胞培养液为含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的高糖DMEM。

该步骤的操作过程包括：参照实例1，明胶贴壁法去除饲养层细胞并收集悬浮细胞；调整细胞密度为2×10⁵个细胞/mL，将细胞接种到超低粘附培养皿中；加入分化培养基I，于37℃、5%CO₂条件下培养5天，可见拟胚体形成。从第2天开始，每天摇动培养皿2次，每次间隔12小时；从第3天开始，每天补加10ng/mL的bFGF。

诱导5天后，采用免疫荧光法检测拟胚体中分化基因的表达情况。结果如图3所示，分化培养基I中形成的拟胚体，其前段中胚层标志分子Brachyury、PDGFRa的表达水平低于未添加全反式维甲酸和bFGF的成纤维细胞培养液中形成的拟胚体，而间质细胞标志分子CD105、CD133的表达水平显著高于后者，可见培养基I促进了构成拟胚体的细胞向间质细胞方向分化。

二、细胞的骨向诱导分化

分化培养基II：将成骨细胞培养基的D-Glucose含量降低为原浓度的25%，并添加100ng/mL BMP4或100ng/mL BMP7，pH为7.0-7.4。其中，成骨细胞培养基为含10%FBS、1%青霉素-链霉素、50mg/L抗坏血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、10^-8mol/L地塞米松的高糖DMEM。

该步骤的操作过程如下：

1、分化培养基II的准备：将高糖DMEM和无糖DMEM以1:3的比例混合均匀，在此基础上添加1%青霉素-链霉素、50mg/L抗坏血酸、10^-3mol/Lβ-甘油磷酸钠和10^-8mol/L地塞米松备用，pH为7.0-7.4。使用前加入10%FBS和100ng/mL BMP4或100ng/mL BMP7。

2、细胞的骨向诱导分化：将实例2步骤一所获得的拟胚体经1200转/分钟离心1分钟，收集沉淀并添加少量分化培养基II重悬，机械吹打为小细胞团块后接种到明胶铺底的培养皿中。补充培养基II，于37℃、5%CO₂条件下培养14天。隔天更换一次培养基，第一次换液时，用37℃温浴的PBS清洗3次。

实施例3成骨分化细胞的鉴定

一、钙沉积水平检测

1%茜素红S：0.1M的tris-Hcl100mL（pH8.3），加入0.1g茜素红S，4℃保存。

本实例中，茜素红染色法被用于检测分化细胞的钙沉积水平，其步骤包括：将经过分化培养基I诱导5天（实例2步骤一）和分化培养基II诱导14天（实例2步骤二）的细胞除去培养液，用PBS清洗3次；95%乙醇在室温下固定细胞10分钟后，PBS清洗3遍，加入1%茜素红S染液，37℃孵育30分钟；PBS清洗细胞3遍，于倒置显微镜下观察拍照。

染色结果如图4所示（其中，A为对照组；B为成骨细胞培养基组；C为分化培养基II组（BMP4）；D为分化培养基II组（BMP7）），在分化培养基II中诱导14天后，细胞中有大量钙结节产生，茜素红阳性细胞比例大于70%（图4C-D）；成骨细胞培养基组有少量钙结节产生，茜素红阳性细胞比例仅为30%（图4B）；此外，作为对照的成纤维细胞培养基组未见明显的钙结节形成（图4A）。结果表明，分化培养基II能够促进经分化培养基I诱导形成的拟胚体细胞骨向分化，其诱导效率较现有成骨细胞培养液高出一倍。

二、成骨基因表达水平检测

Runx2和osteocalcin是成骨分化过程中的两个重要的基因。本实例中，real-time PCR法被用于检测分化细胞中Runx2和osteocalcin的表达水平。其操作步骤如下：

1、参照Trizol Reagant说明书提取细胞的mRNA。

2、参照TaKaRa SYBR PrimeScriptTM Kit说明书将提取的mRNA反转录为cDNA。

3、采用real-time PCR检测成骨基因Runx2和osteocalcin表达水平，β-actin为内参。

引物序列为：

osteocalcin-F：TCTGACAAAGCCTTCATGTCC，

osteocalcin-R：AAATAGTGATACCGTAGATGCG；

Runx2-F：CCTGAACTCTGCACCAAGTC，

Runx2-R：GAGGTGGCAGTGTCATCATC；

β-actin-F：GACGGCCAGGTCATCACTATTG，

β-actin-R：CCACAGGATTCCATACCCAAGA

检测结果如图5所示（对于同一基因（Runx2或osteocalcin），上标不同代表差异显著（P<0.05）），作为对照的成纤维细胞培养基组中，Runx2和osteocalcin均不表达，而添加BMP4的分化培养基II组的Runx2和osteocalcin的表达水平均显著高于成骨细胞培养基组，尽管添加BMP7的分化培养基II组的osteocalcin的表达水平与成骨细胞培养基组无显著区别，但Runx2的表达水平显著高于成骨细胞培养基组。该结果从分子水平上证实了分化培养基II能够促进细胞的成骨分化，尽管添加不同的细胞因子效果略有不同。

以上检测结果显示，本发明所提供的骨诱导培养液可以有效地促进小鼠iPS细胞的成骨分化，所采用的“鸡尾酒”式的分步诱导方法符合动物体内的成骨模式，能够提高小鼠iPS细胞的体外成骨效率。

Claims (10)

1.一种诱导小鼠诱导型多能干细胞骨向分化的培养基，其特征在于，由分化培养基I和分化培养基II组成，其中分化培养基I是在成纤维细胞培养基基础上添加全反式维甲酸和碱性成纤维细胞生长因子制得，分化培养基II是在成骨细胞培养基的基础上降低D-葡萄糖含量，并添加BMP4或BMP7制得。

2.权利要求1所述培养基，其特征在于，所述分化培养基I是在成纤维细胞培养基的基础上添加10^-8-10^-7mol/L的全反式维甲酸和3-10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子，pH7.0-7.4；所述分化培养基II是在成骨细胞培养基的基础上降低D-葡萄糖含量为原浓度的20-40%，并添加60-120ng/mL BMP4或40-120ng/mL BMP7，pH7.0-7.4。

3.权利要求1所述培养基，其特征在于，所述成纤维细胞培养基为含有10%胎牛血清，1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基。

4.权利要求1所述培养基，其特征在于，所述成骨细胞培养基为含有10%FBS、1%青霉素-链霉素、50mg/L抗坏血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、10^-8mol/L地塞米松的高糖DMEM培养基。

5.权利要求1所述培养基，其特征在于，分化培养基I是添加5×10^-8mol/mL的全反式维甲酸和10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子，含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基，pH7.0-7.4；分化培养基II是添加100ng/mL BMP4或100ng/mL BMP7，含有10%FBS、1%青霉素-链霉素、50mg/L抗坏血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、10^-8mol/L地塞米松，葡萄糖含量为原浓度25%的高糖DMEM培养基，pH7.0-7.4。

6.一种诱导小鼠诱导型多能干细胞分化为成骨细胞的方法，其特征在于，步骤如下：

1）将小鼠诱导型多能干细胞接种到超低粘附培养皿中，加入分化培养基I，培养3-6天，形成间质细胞富集的拟胚体；

所述分化培养基I组成为：是在成纤维细胞培养基的基础上添加10^-8-10^-7mol/L的全反式维甲酸和3-10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子，pH7.0-7.4；

2）将步骤1)所得拟胚体离心分离后，收集拟胚体并添加分化培养基II，吹打后接入到明胶铺底的培养皿中，补充分化培养基II，培养并隔天更换培养基，培养7-14天，得成骨细胞；

所述分化培养基II组成为：是在成骨细胞培养基的基础上降低D-葡萄糖含量为原浓度的20-40%，并添加60-120ng/mL BMP4或40-120ng/mLBMP7，pH7.0-7.4。

7.权利要求5所述方法，其特征在于，所述步骤1）中，培养时间5天。

8.权利要求5所述方法，其特征在于，所述步骤2）中，培养时间14天，且第一次更换培养基时，用37℃温浴的PBS清洗1-3次。

9.权利要求5所述方法，其特征在于，步骤1）和步骤2）中分化培养基培养的温度为37℃，含有5%CO₂。

10.权利要求5所述方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）间质细胞富集的拟胚体的诱导：利用差速贴壁法去除饲养层细胞，获得纯净的小鼠诱导型多能干细胞，将所得到的小鼠诱导型多能干细胞以2×10⁵个/mL的密度接种到超低粘附培养皿中，加入分化培养基I，于37℃、5%CO₂条件下培养，从第2天起，每天摇动培养基2次，从第3天开始，每天补加10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子，培养5天形成拟胚体；

所述分化培养基I组成为：是在成纤维细胞培养基的基础上添加5×10^-8mol/L的全反式维甲酸和10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子，pH7.0-7.4；

2）成骨细胞的诱导：将步骤1）所得拟胚体于1200rpm下离心1min，收集拟胚体并添加少量分化培养基，机械吹打为小细胞团块后接种到明胶铺底的培养皿中，补充分化培养基II，于37℃、5%CO₂条件下培养并隔天更换培养基，培养14天，获得成骨细胞；所述分化培养基II组成为：是在成骨细胞培养基的基础上降低D-葡萄糖含量为原浓度的25%，并添加100ng/mL BMP4或100ng/mLBMP7，pH7.0-7.4。

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