CN102369278A - 从人分化细胞源的多能干细胞衍生的胚胎体和/或神经干细胞的培养方法 - Google Patents

从人分化细胞源的多能干细胞衍生的胚胎体和/或神经干细胞的培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102369278A
CN102369278A CN2010800159751A CN201080015975A CN102369278A CN 102369278 A CN102369278 A CN 102369278A CN 2010800159751 A CN2010800159751 A CN 2010800159751A CN 201080015975 A CN201080015975 A CN 201080015975A CN 102369278 A CN102369278 A CN 102369278A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
nsc
lif
people
stem cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2010800159751A
Other languages
English (en)
Inventor
冈野荣之
冈田洋平
中村雅也
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Keio University
Original Assignee
Keio University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Keio University filed Critical Keio University
Publication of CN102369278A publication Critical patent/CN102369278A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0623—Stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/235—Leukemia inhibitory factor [LIF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

提供了一种用于使从人分化细胞源的多能干细胞分化成神经干细胞的方法，包括以下步骤：从所述人分化细胞源的多能干细胞制备胚胎体；并且在含有LIF的培养基中培养所述胚胎体以使其分化为神经干细胞，从而，当对所述神经干细胞进行多次传代培养之后使所述神经干细胞在体外分化时，其主要分化为神经元，但基本上不分化成胶质细胞。

Description

从人分化细胞源的多能干细胞衍生的胚胎体和/或神经干细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及从人分化细胞源的多能干细胞衍生的胚胎体和/或神经干细胞的培养方法。
背景技术
近年来，通过从已经引入并表达Oct3/4基因、Sox2基因、Klf4基因和c-myc基因的体细胞例如成纤维细胞中选择表达Fbxo15基因的细胞，已经有可能获得具有类似于胚胎干细胞(以下称为ES细胞)的多能性的细胞(国际专利申请公开WO2007/069666；Takahashi K，and Yamanaka S.(2006)Cell 126：663-676)。人们认为，如果将这样获得的从体细胞衍生的多能干细胞用于再生医学，那么可将患者的细胞移植至患者自身，从而排斥问题会比使用ES细胞时小。
尽管通过使用Fbxo15基因作为标志物建立的体细胞源的多能干细胞(以下称为诱导型多能干细胞或iPS细胞)就细胞形态学、增殖能力、分化能力等而言非常类似于胚胎干细胞，然而它们仍在某些特征例如基因表达和DNA甲基化模式上与ES细胞不同。因此，通过使用Nanog基因的表达作为标志物选择所述细胞，建立了具有更类似于ES细胞的多能性的iPS细胞(Okita K，Ichisaka T，and Yamanaka S.(2007)Nature448：313-317)。
后来，使用细胞形态学的变化代替Fbxo15基因或Nanog基因的表达作为标志物分离了iPS细胞(Meissner A，Wernig M，and Jaenisch R.(2007)Nat Biotechnol 25：1177-1181)。还通过使用N-myc代替c-myc建立了iPS细胞(Blelloch R，Venere M，Yen J，Ramalho-Santos M.(2007)Cell StemCell 1：245-247)。此外，除在人中以外，在小鼠中也通过引入Oct3/4、Sox2和Klf4三种基因而不使用c-myc基因建立了iPS细胞(Nakagawa M，Koyanagi M，Tanabe K，Takahashi K，Ichisaka T，Aoi T，Okita K，Mochiduki Y，Takizawa N，and Yamanaka S.(2008).Nat Biotechnol26：101-106；Wering M，Meissner A，Cassady JP，and Jaenisch R.(2008)Cell Stem Cell 2：10-12)。此外，除成纤维细胞以外，还从肝细胞和胃上皮细胞建立了iPS细胞(Aoi T，Nakagawa M，Ichisaka T，Okita K，TakahashiK，Chiba T，and Yamanaka S.(2008)Science(February14，2008)(在线发表))。
同时，还有发展中的使用人细胞的研究。通过向成纤维细胞中引入Oct3/4、Sox2、Nanog和lin28四种基因，建立人iPS细胞(Yu J，VodyanikMA，Smuga-Otto K，Antosiewicz-Bourget J，Frane JL，Tian S，Nie J，Jonsdottir GA，Ruotti V，Stewart R，Slukvin II，and Thomson JA.(2007)Science 318：1917-1920)，基因组合与建立小鼠iPS细胞所用的基因组合相同(即Oct3/4基因、Sox2基因、Klf4基因和c-myc基因)相同(TakahashiK，Tanabe K，Ohnuki M，Narita M，Ichisaka T，Tomoda K，and YamanakaS.(2007)Cell 131：861-872)。
由于iPS细胞可使用来源于待治疗的患者的细胞产生，因此在再生医学领域预期通过使用iPS细胞来产生避免排斥的人造器官等。
发明内容
技术问题
本发明的目的是开发从iPS细胞衍生的胚胎体和/或神经干细胞的培养条件，所述条件适合神经干细胞的神经元分化。
解决方案
在本发明的一个实施方案中，用于培养从人分化细胞源的多能干细胞衍生的胚胎体和/或从所述胚胎体衍生的神经干细胞的试剂含有LIF。
在本发明的另一个实施方案中，用于使从人分化细胞源的多能干细胞衍生的胚胎体分化成神经干细胞的方法包括以下步骤：在含有LIF的培养基中培养所述胚胎体以使其分化为神经干细胞。该方法还可包括在含有LIF的培养基中传代培养所述神经干细胞的步骤。
在本发明的另一个实施方案中，用于培养从人分化细胞源的多能干细胞衍生的神经干细胞的方法包括以下步骤：在含有LIF的培养基中培养所述神经干细胞。
在本发明的另一个实施方案中，一种制备用于治疗神经损伤的药物的方法包括以下步骤，所述药物包含从人分化细胞源的多能干细胞衍生的神经干细胞：在含有LIF的培养基中培养从人分化细胞源的多能干细胞衍生的胚胎体以使其分化为神经干细胞；并使用所述神经干细胞制备所述药物。该方法还可包括在含有LIF的培养基中传代培养所述神经干细胞的步骤。
在本发明的另一个实施方案中，一种制备用于治疗神经损伤的药物的方法包括以下步骤，所述药物含有从人分化细胞源的多能干细胞衍生的神经干细胞：在含有LIF的培养基中培养从人分化细胞源的多能干细胞衍生的神经干细胞；并使用所述神经干细胞制备所述药物。
在任一上述实施方案中，LIF浓度均优选10-100ng/ml。
＝＝相关申请的交叉引用＝＝
本申请要求2009年2月3号提交的美国临时专利申请60/206711的优先权，其以引用的方式纳入本文。
附图说明
图1A示出的显微照片显示在本发明的一个实施例中从人iPS细胞衍生的神经球的形态。
图1B示出的显微照片显示在本发明的一个实施例中从人iPS细胞衍生的神经球的分化能力。
图2示出了在本发明的一个实例中检查从人iPS细胞衍生的神经球中未分化细胞的存在的FACS分析的结果。红线表示阴性对照。
图3示出了由经移植小鼠的BBB得分评价的运动功能分析的结果。
图4示出的显微照片显示在本发明的一个实施例中，从用或不用LIF培养的人iPS细胞衍生的原代、二代和三代神经球的分化能力。
图5示出的显微照片显示在本发明的一个实施例中，从用或不用LIF培养的人iPS细胞衍生的原代、二代和三代神经球的形态。
图6示出的显微照片显示在本发明的一个实施例中，从用LIF培养的人iPS 201B7细胞衍生的三代神经球分化的神经元的亚型。
具体实施方式
＝＝人分化细胞源的多能干细胞＝＝
人分化细胞源的多能干细胞是指具有多能性和自繁殖能力的人细胞，其通过再编程分化细胞而不是生殖细胞(例如卵细胞、精子细胞及其前体细胞如卵原细胞和精原细胞)或从发育早期的胚胎衍生的未分化细胞(例如胚胎干细胞)而人工诱导。所述分化细胞可来源于胚胎、胎儿或成人。所述分化细胞的特征不受特别限制，只要所述细胞至少部分丧失受精卵或ES细胞具有的内在全能型。这类分化细胞的实例包括成纤维细胞、上皮细胞、肝细胞等。
再编程所述分化细胞的方法不受特别限制，但优选将核再编程因子引入所述细胞中以诱导所述再编程从而使其具有多能性和自繁殖能力。例如，Takahashi et al.(NPL 8)中所述的再编程方法可用于所述再编程。该公开文本以引用的方式纳入本文。
所述核再编程因子不受特别限制，但优选选自Oct基因家族、Klf基因家族和Sox基因家族的每个成员的基因的产物的组合。就建立iPS细胞的效率而言，更优选还含有myc基因家族一员的基因产物的组合。属于Oct基因家族的基因包括Oct3/4、Oct1A、Oct6等；属于Klf基因家族的基因包括Klf1、Klf2、Klf4、Klf5等；属于Sox基因家族的基因包括Sox1、Sox2、Sox3、Sox7、Sox15、Sox17、Sox18等；属于myc基因家族的基因包括c-myc、N-myc、L-myc等。在某些情况下，myc基因家族的基因产物可用细胞因子(例如SCF、bFGF)或者化合物(例如阿扎胞苷和丙戊酸钠(VPA))替换。
上述组合以外的核再编程因子的实例，除Oct基因家族基因和Sox基因家族基因以外，还包括含有Nanog基因和lin-28基因的组合。应注意，当将这类因子引入所述细胞时，除上述组合中的基因以外，还可引入另一种类型的基因产物。这类基因产物的实例包括永生化诱导因子例如TERT。
由于所有上述基因在脊椎动物中均高度保守，因此除非指出具体动物的名称，否则本文提及的基因包括其同源物和直系同源物。而且，也涵盖包括多形基因的突变基因，只要它们具有与野生型基因产物相当的功能。
＝＝制备人分化细胞源的多能干细胞的方法＝＝
为通过使用核再编程因子制备人分化细胞源的多能细胞，在所述核再编程因子是在细胞中有功能的蛋白的情况下，优选将编码所述蛋白的基因纳入表达载体中，并将所述表达载体引入至分化的靶细胞例如体细胞，使得所述蛋白在细胞内表达(基因转移法)。要使用的表达载体不受特别限制，但优选病毒载体，特别优选逆转录病毒载体或慢病毒载体，最优选Sendai病毒载体。可通过使被称为蛋白转导结构域(PTD)的肽结合于加入培养基中的所述再编程因子而将所述蛋白引入细胞(蛋白转导法)。在所述蛋白分泌到胞外的情况下，可在制备所述分化细胞源的多能干细胞过程中将所述因子加入所述分化细胞的培养基中。如果所述因子在要重编程细胞的分化细胞中表达，则不需将其从外面引入。此外，如果存在能够代替某一具体核再编程因子的功能的化合物，则可用其代替所述核再编程因子。所述化合物包括但不限于反苯环丙胺(Tranylcypromine)、CHIR99021、SB431542、PD0325901和thiazovivin。
因此，在已引入核再编程因子的分化细胞中，可选择并分离保持其未分化状态的细胞集落或表达未分化标志基因如Fbxo15基因或Nanog基因的细胞集落，同时保持所述细胞存活。或者，可将所述分化细胞用表达GFP(绿色荧光蛋白)或dsRed(红色荧光蛋白)作为标志物的逆转录病毒载体共转染，然后可选择所述标志物的表达被沉默的细胞集落。
通过使用任何上述标志物，可从已引入所述核再编程因子的人分化细胞中选择并分离被再编程并保持未分化状态的细胞，并可使用所建立的细胞群体作为人分化细胞源的多能细胞。
＝＝治疗神经损伤的药物＝＝
所述分化细胞源的多能细胞可用于制备治疗神经损伤的药物。用于制备治疗神经损伤的药物的试剂的方法可基于已开发的使用胚胎干细胞作为治疗神经损伤的试剂的方法，所述方法如Okada等人所述(Okada Y，Matsumoto A，Shimazaki T，Enoki R，Koizumi A，Ishii S，Itoyama Y，SobueG，Okano H.(2008)Stem Cells.vol.26，pp.3086-98)，该文献以引用的方式纳入本文。
除了人分化细胞源的多能细胞以外，治疗神经损伤的试剂还可含有另一种组分，例如含有盐和/或抗体的缓冲液。作为治疗靶标的神经组织不受特别限制，可以为中枢神经系统例如大脑或脊髓，也可为周围神经系统。此外，要治疗的疾病不限于任何具体症状，但包括创伤性疾病例如脊髓损伤；神经变性疾病例如肌萎缩侧索硬化、阿兹海默氏症、帕金森氏症、进行性核上性麻痹、亨廷顿病、多系统萎缩和脊髓小脑变性；脑梗塞引起的神经细胞坏死、脑溢血等，并且不限于任何具体原因，但包括与损伤、脑梗塞等有关的原发性原因，以及与感染、肿瘤等有关的继发性原因，只要该疾病是神经细胞遭受破坏的疾病或病理状态。
可将人分化细胞源的多能细胞原样地给予人，但是为了增强所述细胞分化为神经细胞的能力，可形成胚胎体(EB)然后给予所述胚胎体。所述EB优选含有神经干细胞。更优选在给予前在使神经干细胞生长的培养条件下扩增所述EB中的神经干细胞。
从人分化细胞源的多能细胞形成EB的培养所用的培养基不受限制，但可为含有KSR(敲除血清替代品(Knockout Serum Replacement))、NEAA(非必需氨基酸)和2-ME(2-巯基乙醇)的DMEM/F12培养基。KSR、NEAA和2-ME的浓度不限于但分别优选为5％或更低、0.1mM和0.1mM。形成的EB可在分化培养基例如添加有FGF-2(10-100ng/ml)的无血清培养基中培养以分化成神经球形式的神经干细胞。所述神经球的培养基不受限制，但同样的添加有FGF-2(10-100ng/ml)的无血清培养基可用于培养所述神经球。可通过将含有原代神经干细胞的原代神经球打散并重新铺板到培养皿上进行传代培养，从而使它们增殖以形成含有二代神经干细胞的二代神经球；并且可重复此传代培养过程以形成含有更高代神经干细胞的更高代神经球。可将这样形成的神经干细胞给予人，优选在打散所述神经球之后给予人。要给予的神经干细胞可具有也可不具有在体外分化成胶质细胞的能力。可将LIF加入所述EB或所述神经干细胞或者两者的培养基中，其合适的浓度可由技术人员确定，但优选1ng/ml或更高，更优选5ng/ml或更高，最优选10ng/ml或更高；优选1000ng/ml或更低，更优选500ng/ml或更低，最优选100ng/ml或更低；优选1-1000ng/ml，更优选5-500ng/ml，最优选10-100ng/ml。
当在无LIF的培养基中培养所述EB或所述神经干细胞时，所述神经干细胞获得了分化为神经元细胞和胶质细胞的潜能。然而，当在含有LIF的培养基中培养所述EB和所述神经干细胞时，所述神经干细胞具有主要分化为神经元细胞、但基本上不具有分化为胶质细胞的潜能。在含有LIF的培养条件下，即使在将所述神经干细胞传代培养许多次之后，所述神经干细胞仍保留有这样的分化潜能，即它们在体外可主要分化为神经元细胞，但基本上不分化成胶质细胞。已知神经干细胞在其在CNS中的发育过程中依次经过扩张期、神经形成期和胶质形成期(Temple，S.，Nature vol.414.p.112-117，2001)。因此，所述神经干细胞可通过在LIF的存在下培养而在体外保持其幼年期的分化潜能。此外，从这样获得的神经干细胞衍生的神经元细胞含有早生神经元例如TH阳性或Is1阳性的神经元，从无LIF培养的神经干细胞衍生的神经元细胞或者妊娠中期后的胎儿的神经元细胞通常不含这类神经元(Nature neurosci.vol.11，p.1014-1023，2008)。这与其可在LIF的存在下保持其幼年期的潜能的事实相符。此外，用LIF培养的神经干细胞比不用LIF培养的神经干细胞形成平均更大的神经球，这可能因为前者比后者生长的更好。
用于神经干细胞的体外分化的方法不受特别限制，并且所述神经球可以在任何已知的分化诱导培养基中培养，所述培养基的优选实例是添加有葡萄糖、谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、孕酮、腐胺和氯化硒的DMEM：F-12培养基(即无FGF和肝素的增殖神经干细胞的培养基)。其中可含有也可不含Sonic hedgehog蛋白。所述细胞优选在5％CO2、35-40℃的条件下孵育5-7天。
可直接或间接给予所述分化细胞源的多能细胞、所述EB细胞或所述神经干细胞。例如，对于直接给予，可将细胞移植到神经损伤的位置。对于间接给予，可将细胞进行静脉内或脊椎内注射并通过血液或脑脊液循环将其递送到受影响的位置。
实施例
＝＝细胞＝＝
在此实施例中，所述分化细胞源的多能细胞是通过将Oct3/4、Sox2和Klf4的组合作为核再编程因子引入人胚胎成纤维细胞而得到的细胞或者通过将Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的组合作为核再编程因子引入人胚胎成纤维细胞而得到的细胞(Yu J et al.(2007).Science 318：1917-1920；Nakagawa M et al.，(2008).Nat Biotechnol vol.26，p.101-106.)，所述细胞均由京都大学提供。使用了人ES细胞(KhES1)(Suemori H et al.，(2006)，Biochem.and Biophys.Res.Commun.vol.345，p.926-932.)作为对照。
实验1.神经干细胞的产生
为了增强这些细胞分化成神经细胞的能力，通过将所述分化细胞源的多能细胞在细菌培养皿中用添加有5％KSR的胚胎培养培养基悬浮培养30天来制备胚胎体(EB)。然后，将形成的EB在添加有FGF-2(20ng/ml)和LIF(10ng/ml)的无血清培养基中打散并培养。在12天，来源于所述EB的细胞形成神经球，其被称为原代神经球或iPS-PNS。分离这些iPS-PNS并反复在相同条件下再次制备所述神经球是可能的。在此说明书中，经传代培养至少一次的神经球总称为更高代神经球；具体地，传代培养(N-1)次的神经球称为N代神经球。
如显示在光学显微镜下观察到的神经球的显微图像的图1中所示，所形成的所述神经球为原代神经球，被传代培养两次后为三代神经球和被传代培养五次后为六代神经球。
将这样获得的原代到三代神经球通过用TrypLE Select(或胰蛋白酶溶液)处理和抽吸而打散，接种在以聚-L-鸟氨酸和纤连蛋白双包被的培养皿中并加入所述分化诱导培养基，并通过培养7-12天使其分化。对于所述分化诱导培养基，使用了添加2％B27补充物的含有葡萄糖、谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、孕酮、腐胺和氯化硒的DMEM：F-12培养基(即无FGF和肝素的用于增殖神经干细胞的培养基)，并将所述细胞在5％CO2、35-40℃的条件下孵育10天。然后将样本用抗βIII-微管蛋白的抗体(小鼠IgG，SIGMA T8660，1000倍稀释)——神经元标志物——(绿色荧光指示)和抗GFAP的抗体(兔IgG，DAKO ZO334，4000倍稀释)——星形细胞标志物——(红色荧光指示)免疫染色，并在荧光显微镜下观测细胞形态和染色情况。使用Hoechst 33258反染细胞核(蓝色荧光指示)。
如图1B所示，在原代到三代神经球中，基本只分化出了神经元而没有分化出胶质。人iPS细胞的这种特征与小鼠iPS细胞有显著不同。对于小鼠细胞，当将所述原代神经球在相同分化条件下培养时，像人细胞一样只分化出了神经元。然而，当将已经传代培养至少一次的更高代小鼠神经球置于相同分化条件下时，不仅分化出了神经元而且分化出了胶质细胞。
实验2.神经球中未分化细胞的存在情况
下文显示，在从人iPS细胞衍生的三代神经球(以下称为iPS-TNS)中没有发现未分化细胞。
所述三代神经球通过用TrypLE Select(或胰蛋白酶溶液)处理和抽吸而打散，并使用未分化细胞表达的抗细胞表面抗原的抗体(TRA-1-60、TRA-1-81、CD56或CD133)进行FACS分析。购自BD Inc.的抗体TRA-1-60-PE、TRA-1-81-PE和CD56-Alexa488的使用量，对于50μl中的1×106个细胞，是5μl，购自Milteny Biotech inc.的抗体CD133-APC的使用量，对于50μl中的1×106个细胞，是2μl。在图2所示的结果中，TRA-1-60和TRA-1-81的表达在从人iPS细胞如人ES细胞衍生的三代神经球中均未观测到。此外，几乎所有细胞都表达CD56，其是神经干细胞的标志物。
如前文所述，从人iPS细胞制备的更高代神经球根本不具有未分化细胞，或即使在存在污染的情况下也只有极少量，因此由于肿瘤发生风险降低可用于细胞移植。
实验3.脊髓损伤小鼠的制备，对其的细胞移植，以及对所述移植小鼠的分析。
在此实施例中，通过致使第10胸椎处脊神经的创伤性脊髓损伤建立了脊髓损伤模型小鼠，并使用该模型小鼠进行从人iPS细胞衍生的三代神经球的移植以证明恢复增强，如下文所述。
首先，将8到9周龄的NOD/SCID雌性小鼠(重20-22g)用氯胺酮(ketamine)(100mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)麻醉。在对第10胸椎进行椎板切除术之后，将硬脑膜的背侧面暴露，并使用Infinite HorizonImpactor(60kdyn；Precision Systems，Kentucky，IL)产生创伤性脊髓损伤。
为将细胞移植到所述受损伤的脊髓中，在所述损伤后第9天再次将所述损伤位置暴露。用装在立体定位注射器(KDS310，Muromachi-kikai，Tokyo，Japan)上的玻璃微量吸移管将5×1O5个细胞/2ul的细胞以0.5ul/min的速率引入损伤区域的中心。在此实施例中，使用iPS-TNS的253G1和201B7克隆和ES-SNS的KhES1克隆，并在它们移植前将它们各自的神经球部分分离。作为对照，以与进行所述细胞移植相同的方法注射PBS(载体)。
每7天用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)得分(NPL 12)评价后肢的运动功能，直至第42天。结果示于图3。
在全部4组中，小鼠在致使脊髓损伤后立即完全瘫痪，但它们均逐渐恢复。然而，在所述手术3周后，通过比较BBB得分在iPS-TNS和ES-SNS移植的两组中都观察到了相同程度的恢复，与只接受无细胞的培养基的组有显著区别。同时，在临床观察中，iPS-TNS移植的小鼠还表现出显著的撑足底踏(weight-supporting plantar stepping)的足够恢复。
总之，脊髓损伤的小鼠的神经损伤可通过移植从人iPS细胞衍生的神经球(即使处于在体外不分化为胶质细胞的状态下)而得到治疗。
实验4.用和不用LIF从EB分化的神经球之间的分化和增殖性质的比较
原代、二代和三代神经球形成，并使之分化为神经细胞，并根据实验1所述的方法对它们的细胞型进行分析。
如图4中所示的结果，在所有3种克隆中，由绿色荧光指示的神经元在有和没有LIF的情况下均分化出来，然而由红色荧光指示的星形细胞在没有LIF的情况下分化出来而在有LIF的情况下未分化出来。因此，通过在有LIF的培养基中培养EB和神经球，传代培养的神经球保持了这样的分化性质，即它们基本上只能分化为神经元但不能分化为胶质细胞。
应注意，神经球在有LIF的培养基中比在没有LIF的培养基中生长更快。使用201B7的实例示于图5。很明显，用LIF培养的神经球通常比不用LIF培养的神经球大。
实验5.从在含LIF的培养基中培养的更高代神经球分化的神经元的亚型
人iPS克隆201B7和人ES克隆KhES1(对照)的三代神经球形成，并使之分化成神经细胞，并根据实验1中所述的方法使用标志抗体分析分化出的神经元的亚型。此实验使用的抗体是：anti-Islet-1(39.4D5，小鼠IgG2b，1∶200，Developmental Studies of Hybridoma Bank：DSHB)、anti-βIII-微管蛋白(SIGMA T8660小鼠IgG2b，1∶1000)、anti-CNPase(SIGMA C5922，小鼠IgG1，1∶1000)、anti-GFAP(兔IgG，DAKO ZO334，兔IgG，1∶4000)和anti-TH-1(Chemicon AB152，兔IgG，1∶100)。CNPase和GFAP分别是少突细胞和星形细胞的胶质标志物。Islet-1和TH-1是早生神经元的标志物。
如图6所示，几乎所有所述分化细胞都是βIII-微管蛋白阳性的神经元细胞，并且从所述三代神经球未分化出CNPase或GFAP阳性的胶质细胞。对于所述神经元细胞的亚型，分化出了Islet-1或TH-1阳性的神经元，表明所分化的神经元是早生型神经元。
工业实用性
本发明开发了从人分化细胞源的多能干细胞衍生的胚胎体和/或神经干细胞的培养条件，该条件适合所述神经干细胞的神经元分化。

Claims (10)

1.一种用于培养从人分化细胞源的多能干细胞衍生的胚胎体和/或从所述胚胎体衍生的神经干细胞的试剂，其包含LIF。
2.权利要求1的试剂，其中所述LIF浓度为10-100ng/ml。
3.一种用于使从人分化细胞源的多能干细胞衍生的胚胎体分化成神经干细胞的方法，包括以下步骤：在含有LIF的培养基中培养所述胚胎体以使其分化为神经干细胞。
4.权利要求3的方法，还包括在含有LIF的培养基中传代培养所述神经干细胞的步骤。
5.一种用于培养从人分化细胞源的多能干细胞衍生的神经干细胞的方法，包括以下步骤：在含有LIF的培养基中培养所述神经干细胞。
6.权利要求3-5任一项的方法，其中所述LIF浓度为10-100ng/ml。
7.一种制备用于治疗神经损伤的药物的方法，所述药物包含从人分化细胞源的多能干细胞衍生的神经干细胞，所述方法包括以下步骤：
在含有LIF的培养基中培养从人分化细胞源的多能干细胞衍生的胚胎体以使其分化为神经干细胞；并且
使用所述神经干细胞制备所述药物。
8.权利要求7的方法，还包括在含有LIF的培养基中传代培养所述神经干细胞的步骤。
9.一种制备用于治疗神经损伤的药物的方法，所述药物包含从人分化细胞源的多能干细胞衍生的神经干细胞，所述方法包括以下步骤：
在含有LIF的培养基中培养从人分化细胞源的多能干细胞衍生的神经干细胞；并且
使用所述神经干细胞制备所述药物。
10.权利要求7-9任一项的方法，其中所述LIF浓度为10-100ng/ml。
CN2010800159751A 2009-02-03 2010-02-03 从人分化细胞源的多能干细胞衍生的胚胎体和/或神经干细胞的培养方法 Pending CN102369278A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20671109P 2009-02-03 2009-02-03
US61/206,711 2009-02-03
PCT/JP2010/000640 WO2010090007A1 (en) 2009-02-03 2010-02-03 Culture method of embryoid bodies and/or neural stem cells derived from human differentiated cell-derived pluripotent stem cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102369278A true CN102369278A (zh) 2012-03-07

Family

ID=42541916

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010800159751A Pending CN102369278A (zh) 2009-02-03 2010-02-03 从人分化细胞源的多能干细胞衍生的胚胎体和/或神经干细胞的培养方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US10041040B2 (zh)
EP (1) EP2393918A4 (zh)
JP (1) JP6099867B2 (zh)
KR (1) KR20110106468A (zh)
CN (1) CN102369278A (zh)
CA (1) CA2756283A1 (zh)
WO (1) WO2010090007A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103710310A (zh) * 2013-12-26 2014-04-09 东北农业大学 一种诱导小鼠诱导型多能干细胞骨向分化的方法及其培养基

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101636966B1 (ko) * 2013-10-31 2016-07-11 대한민국 배아줄기세포로부터 신경교전구세포, 성상세포 및 희소돌기 아교세포로의 분화방법
JP6458801B2 (ja) * 2014-06-27 2019-01-30 ソニー株式会社 半導体装置およびその製造方法
EP3190176A1 (en) 2016-01-11 2017-07-12 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Method for tissue culture development on scaffold and differentiated tissue culture

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6103530A (en) * 1997-09-05 2000-08-15 Cytotherapeutics, Inc. Cultures of human CNS neural stem cells
WO2005089420A2 (en) * 2004-03-16 2005-09-29 Theradigm, Inc. Expansion of neural stem cells with lif

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001293586A1 (en) 2000-09-29 2002-04-08 Vincent Tropepe Primitive neural stem cells and method for differentiation of stem cells to neural cells
US20030036195A1 (en) * 2001-04-20 2003-02-20 Lorenz Studer Generation of differentiated tissue from nuclear transfer embryonic stem cells and methods of use
JP2003189847A (ja) 2001-12-26 2003-07-08 Kainosu:Kk 多分化能神経幹細胞の分取方法
AU2004213714A1 (en) 2003-02-20 2004-09-02 Bios Research Institute Inc. Human salivary gland-origin stem cell
JP4543212B2 (ja) 2004-08-20 2010-09-15 独立行政法人産業技術総合研究所 細胞培養容器及び培養方法
PT1970446E (pt) 2005-12-13 2011-09-01 Univ Kyoto Factor de reprogramação nuclear

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6103530A (en) * 1997-09-05 2000-08-15 Cytotherapeutics, Inc. Cultures of human CNS neural stem cells
WO2005089420A2 (en) * 2004-03-16 2005-09-29 Theradigm, Inc. Expansion of neural stem cells with lif

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PITMAN M ET AL: "LIF RECEPTOR SIGNALING MODULATES NEURAL STEM CELL RENEWAL", 《MOLECULAR AND CELLULAR NEUROSCIENCES》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103710310A (zh) * 2013-12-26 2014-04-09 东北农业大学 一种诱导小鼠诱导型多能干细胞骨向分化的方法及其培养基

Also Published As

Publication number Publication date
US10041040B2 (en) 2018-08-07
JP2012516675A (ja) 2012-07-26
EP2393918A1 (en) 2011-12-14
CA2756283A1 (en) 2010-08-12
JP6099867B2 (ja) 2017-03-22
WO2010090007A1 (en) 2010-08-12
US20120009157A1 (en) 2012-01-12
KR20110106468A (ko) 2011-09-28
EP2393918A4 (en) 2013-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6894941B2 (ja) ミエリン障害の治療のための誘導多能性細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞
CN102272293B (zh) 生产神经干细胞的方法
EP2263705A1 (en) Therapeutic agent for nerve injury and method for treating nerve injury
CN104540936A (zh) 干细胞培养基和使用它培养干细胞的方法
WO2019017491A1 (ja) 神経組織の保存方法
CN102369278A (zh) 从人分化细胞源的多能干细胞衍生的胚胎体和/或神经干细胞的培养方法
CN102985535A (zh) 人类神经前体细胞向多巴胺神经元的分化方法及用于分化的培养基
JP4576545B2 (ja) 羊膜由来因子による胚性幹細胞の培養方法
JPWO2006028049A1 (ja) アストロサイト様細胞馴化培地の製造方法
Sareen et al. Human neural progenitor cells generated from induced pluripotent stem cells can survive, migrate, and integrate in the rodent spinal cord
US20090208465A1 (en) Method of treating neural defects
Islam A review on successful approaches of converting adult somatic cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs)
AU2004248001B2 (en) Process for producing tissue cell from pluripotent stem cell derived from iris pigment epithelial cell of animal and tissue cell obtained by the process
KR101744053B1 (ko) 인장 자극을 이용한 유도만능 줄기세포의 생성 방법
Gagliardi Neural differentiation and reprogramming of rhesus cells

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20120307