KR101744053B1 - 인장 자극을 이용한 유도만능 줄기세포의 생성 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인장 자극을 이용한 유도만능 줄기세포(induced Pluripotent Stem cells, iPS)의 생성 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인장 자극 하에서 성체세포를 배양하는 단계를 포함하는 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법에 관한 것이다.

Description

인장 자극을 이용한 유도만능 줄기세포의 생성 방법{METHOD FOR PRODUCING INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS USING UNIAXIAL TENSILE STRESS}

본 발명은 인장 자극을 이용한 유도만능 줄기세포(induced Pluripotent Stem cells, iPS)의 생성 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인장 자극 하에서 성체세포를 배양하는 단계를 포함하는 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법에 관한 것이다.

줄기세포(stem cells)는 무한히 자가 재생할 수 있으면서 신체 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 미분화 세포이다. 줄기세포 연구는 재생의학, 신약 개발과 같은 세포치료제의 개발, 인체 질환의 발병 원인 및 치료, 그리고 인체의 발생 과정을 연구하는 중요한 대상으로 각광받고 있는 연구 분야이다. 만능 줄기세포(totipotent stem cells)는 난자와 정자의 수정 이후 8 세포기까지의 세포를 말하며, 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생 가능하다. 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells)는 수정 4-5일 후 나타나는 배반포(blastocyte)의 안쪽에 위치한 내세포피(inner cell mass)에서 유래하며, 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있지만, 새로운 생명체를 형성하지는 못한다. 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)는 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포이다. 줄기세포 중 배아 줄기세포는 착상 전 배아의 내세포피(inner cell mass)로부터 만들어지며, 적절한 환경 하에서 200가지 이상의 세포로 분화할 수 있고, 기관 전체를 만들 수도 있다 (Nagy et al., Development, 110:815-821, 1990). 그러나 세포치료제로서 배아 줄기세포는 난자를 사용해서 만들어야 하고, 배아를 파괴해야 얻을 수 있다는 윤리적인 문제를 가지며, 또한 면역거부반응이 있어서 임상에 사용하기 어렵다는 것 등과 같은 여러 문제점을 가진다.

최근, 이에 대한 보완책으로 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells)가 보고되고 있다. 유도만능 줄기세포는 분화가 끝난 세포를 역분화시켜 전분화능(pluripotency)을 갖는 세포를 지칭하며, 배아 줄기세포와 유사하게 자가 재생할 수 있는 능력을 가지고 신체의 모든 타입의 세포로 분화할 수 있는 특징을 가진다. 현재까지 유도만능 줄기세포는 유전자 발현과 분화능에서 만능 줄기세포인 배아 줄기세포와 유전적, 후생학적 특성 및 분화능 등에서 매우 유사한 특성을 갖는 것으로 보고되고 있다(Takahashi and Yamanaka, Cell, 126:663-676, 2006). 현재까지 역분화 인자의 세포내 도입은 바이러스 벡터를 이용하여 세포 내 전달하는 방법이 현재까지 가장 효과적이다. 하지만 치료 목적을 위한 유도 만능 줄기세포 제작에 바이러스 유전체의 이용은 잠재적 위험성을 지니고 있다. 또한 세포내 유전체에 무작위로 매우 안정적으로 삽입되기 때문에 유전자의 변이와 같은 다양한 문제들을 항상 내재하고 있다. 또한, 역분화 줄기세포의 생성효율이 1% 미만으로 아주 낮고, 종양생성의 위험을 갖고 있다. 많은 연구팀에서, 이 같은 문제를 해결하기 위하여 보고된 논문에서는 발암유전자를 대체 또는, 리프로그래밍에 보다 유리한 세포 형태를 이용하여 리프로그래밍 인자를 줄이는 연구가 진행되고 있다. 그러나 이 역시 다양한 인자를 주입하거나, 특정 세포 종류를 분리(isolation) 해야 하는 단점을 가지고 있다.

역분화 줄기세포의 연구가 현재 세계적인 화두임에도 불구하고, 아직 국내에서는 리프로그래밍 방법에 대한 새로운 견해를 제시하거나 그 기전을 확인한 논문이 거의 보고 되어 있지 않고, 특히 일본이 역분화줄기세포 분야에 세계적 선구적 역할을 하고 있음은 물론이고, 최근 중국에서도 이와 관련하여 의미 있는 연구사례가 다수 보고되고 있으나 우리나라에선 그 연구가 미흡하여 세계적으로 뒤처지고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 세포를 효율적으로 리프로그래밍하여 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 기술에 대한 연구를 계속하던 중, 성체세포를 인장 자극을 가하여 배양하는 경우, 인장 자극을 가하지 않는 경우에 비해 역분화 효율이 2배 이상, 바람직하기는 4배 이상, 더욱 바람직하기는 6배 이상, 가장 바람직하기는 8배 이상 증가함을 확인하였다.

본 명세서에서 사용된 용어 “증가”는 일반적으로 통계학적으로 유의미한 양까지의 증가를 나타내는 것으로, 임의의 불확실성을 피하기 위하여 용어 “증가”는 참조 수준과 비교하여 약 2배 이상의 증가, 또는 3배 이상의 증가, 또는 4배 이상의 증가, 또는 5배 이상의 증가, 또는 6배 이상의 증가, 또는 7배 이상의 증가, 또는 8배 이상의 증가를 포함한다.

본 발명은 인장 자극을 이용한 유도만능 줄기세포의 생성 방법을 제공하고자 한다.

제1구현예에 따르면,

인장 자극 하에서 성체세포를 배양하는 단계를 포함하는 유도만능 줄기세포(induced Pluripotent Stem cells, iPS)로 역분화시키는 방법이 개시된다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 인장 자극은 3% 내지 10%의 힘으로 2시간 동안 25초 자극 및 125초 휴지 조건으로 4일 동안 수행될 수 있다. 바람직하기는, 상기 인장 자극은 8%의 힘으로 2시간 동안 25초 자극 및 125초 휴지 조건으로 4일 동안 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 성체세포는 역분화 인자가 형질도입된 것일 수 있다. 상기 역분화 인자는 Oct4, Sox2, KLF4, C-Myc, Nanog 및 Lin28로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 배양은 FBS (Fetal Bovine serum) 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 배지에서 성체세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.

제2구현예에 따르면,

상기 제1구현예에 의한 방법에 의하여 역분화된 유도만능 줄기세포가 개시된다.

제3구현예에 따르면,

상기 제2구현예에 의한 유도 만능 줄기세포를 포함하는 세포 치료제가 개시된다.

본 발명에 따른 인장 자극을 이용한 유도만능 줄기세포의 생성 방법은 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 효율이 우수하고, 유도만능 줄기세포를 용이하게 수득할 수 있다. 따라서, 상기 역분화된 유도만능 줄기세포를 세포치료제 개발 및 재생의학 분야의 연구 등에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 GFP-양성 유도만능 줄기세포 콜로니를 확인한 사진을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에 따른 유도만능 줄기세포 콜로니의 생성속도를 비교한 그래프를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에 따른 유도만능 줄기세포의 분화능을 나타낸다.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않은 한, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다. 본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사건이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용 가능하다. 비록 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법, 프로토콜 및 시약으로 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 달리 언급되지 않는 한, "또는"은 "및/또는"을 의미한다. 더욱이, 용어 "포함하는" 뿐만 아니라, 다른 형태, 예를 들어, "가지는", "이루어지는" 및 "구성되는"은 제한적이지 않다.

수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다. 본 명세서에 제공된 제목은 다양한 면 또는 전체적으로 명세서의 참조로서, 하기의 구현예를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.

본 발명은 인장 자극을 이용한 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법을 제공하고자 한다. 상기 인장 자극은 3% 내지 10%의 힘으로 2시간 동안 25초 자극 및 125초 휴지 조건으로 4일 동안 수행되는 것을 특징으로 한다. 바람직하기는, 상기 인장 자극은 8%의 힘으로 2시간 동안 25초 자극 및 125초 휴지 조건으로 4일 동안 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 사용된 용어 “줄기세포”는 여러 종류의 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포, 즉 미분화 세포이며 배아 줄기세포와 성체 줄기세포로 분류할 수 있다. “배아 줄기세포”는 분화능력을 가지고 있으나 아직 분화가 일어나지 않은 미분화 세포로, 이러한 미분화 상태에서 적절한 조건을 맞춰주면 다양한 조직세포로 분화가 가능한 만능 줄기세포성(pluripotency)을 가지는 세포를 의미하며, 넓은 의미로는 배아 줄기세포로부터 유래한 배아체(embryoid bodies)도 포함한다. “성체 줄기세포”는 모든 조직으로 분화할 수는 없으나 각 표적기관으로는 분화할 수 있는, 제한된 분화능을 가지는 세포를 의미한다. 더불어 “분화능”이란 생물의 초기 발생에서 배의 일부가 주어진 발생조건에 따라 각종 기관이나 조직으로 분화될 수 있는 능력을 말한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “유도만능 줄기세포(induced Pluripotent Stem cells, iPS)”란 분화가 끝난 세포를 역분화시켜 전분화능(pluripotency)을 갖는 세포를 지칭하며, 배아 줄기세포와 유사하게 자가재생할 수 있는 능력을 가지고 신체의 모든 타입의 세포로 분화할 수 있는 특징을 가진 것으로, “역분화 줄기세포”라고도 한다. 유도 만능 줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가지며, 구체적으로는 비슷한 세포 모양을 보여주며, 유전자, 단백질 발현 패턴이 유사하며, 인비트로(in vitro) 및 인비보(in vivo)에서 전분화능을 가지며, 테라토마(teratoma)를 형성하고, 생쥐의 배반포(blastocyst)에 삽입시켰을 때, 키메라(chimera) 생쥐를 형성하고, 유전자의 생식선 전이(germline transmission)가 가능하다.

본 명세서에서 사용된 용어 “성체세포”는 배아세포와 반대되는 용어로, 태어나서 생존하는 성체로부터 유래한 세포를 지칭한다.

본 발명에서 사용되는 성체세포의 유전적 배경에는 제한이 없으나, 개과 동물, 고양이과 동물, 멧돼지과 동물, 소과 동물, 사슴과 동물, 기린과 동물, 페커리과 동물, 낙타과 동물, 하마과 동물, 말과 동물, 맥과 동물, 코뿔소과 동물, 족제비과 동물, 토끼과 동물, 설치류 및 영장류로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상으로부터 유래일 수 있다.

상기 성체 세포는 자가(autologous), 동종(allogeneic) 또는 이종(xenogeneic)일 수 있으며, 지방세포, 섬유아세포, 섬유세포, 근육세포, 심장세포, 혈액 세포, 골수세포, 생식세포 등 그 종류에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 “역분화(dedifferentiation)”는 부분 또는 최종 분화된 세포를 만능 또는 다능과 같은 미분화 상태로 되돌려서, 새로운 분화 조직의 형성이 가능하도록 하는 후성학적인 역행 과정을 의미한다. 이러한 역분화 현상은 세포 유전체의 후성학적인 변형(epigenetic changes)들이 고정되어 있는 것이 아니라 지워지고 다시 형성될 수 있는 가역적인 과정이기 때문에 가능하다. 역분화는 “재프로그램화 (reprogramming)”라고도 불리우며, 부분 또는 최종 분화된 세포의 유전적 및 표현적 프로필을 배아줄기세포의 그것과 비슷하도록 변화시키는 과정에 관한 것이다. 예를 들면, 상기 변화는 메틸화 패턴의 변화, 줄기세포성 유전자의 발현율 변화 등을 포함한다. 인위적인 역분화 과정은 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터 이용, 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 역분화 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기세포 추출물, 화합물 등에 의한 역분화 과정을 포함하나, 본 발명에서는 레트로바이러스를 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 역분화 인자는 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog 및 Lin28이고, 바람직하게는 Oct4, Sox2, Klf4 및 C-Myc이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 재프로그램화를 위한 유도 만능 줄기세포의 형성을 위해서는, 역분화 유도인자를 체세포 내에 전달하는 단계를 필수적으로 거치게 되며, 구체적으로는, 레트로바이러스를 수송체로 사용하여 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 역분화 유도인자를 코딩하는 유전자들을 체세포에 전달하거나(Takahashi. K. et al, Cell,131:861-872, 2007), 또는 렌티바이러스들을 수송체로 사용하여 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 역분화 유도인자를 코딩하는 유전자를 체세포에 전달할 수 있다.

상기 Sox 패밀리 유전자들은 Oct4와 유사하게 만능성 유지에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 그러나 Oct4 유전자가 만능성 줄기세포에만 관여하고 있는 반면 Sox 패밀리 유전자들은 다능성 줄기세포나 단능성 줄기세포와도 관련되어 있다. Sox2(SRY-type high mobility group box 2) 전사인자는 Sox 패밀리 단백질 중 유일하게 배아줄기세포의 만능성 유지에 중요한 역할을 한다(Avilion et al., Genes Dev, 17:126-140, 2003). Oct4와 마찬가지로 생쥐의 배아줄기세포에서 Sox-2의 발현을 저해하면 분화가 유도된다(Ivanova et al., Nature, 442:533-538, 2006). 또한 여러 Sox2 하위 유전자의 프로모터 영역에서 발견되는 Sox-2 결합부위는 종종 Oct4와 Nanog 결합부위와 인접하게 존재한다(Boyer et al., Cell, 122:947-956, 2005). 그러므로 Sox2 전사인자와 Oct4 전사인자 사이의 상호작용이 유도 만능 줄기세포가 미분화 상태를 유지하고 배아줄기세포의 특성을 나타나게 하는데 기본적인 틀을 제공할 것으로 예상된다(Lewitzky and Yamanaka, Current Opinion in Biotechnology, 18:467-473, 2007).

상기 c-Myc는 세포 성장, 분화, 증식, 세포 예정사 및 암세포로의 형질 전환 등의 다양한 세포 내 기능을 수행하는 발암 유전자이다. 또한 만능성을 유지하는 주요 기작인 LIF(Leukemia Inhibitory Factor)/STAT3와 Wnt 신호전달 메커니즘의 하위 유전자로 밝혀졌다(Sears et al., Genes Dev, 14:2501-2514, 2000). c-Myc 전사인자는 유도 만능 줄기세포 내에서 세포의 증식을 저해하는 것을 막아주는 역할을 하는 것으로 예상되고 있다. 또한 c-Myc은 게놈 상에 존재하는 Myc 인식부위에 결합하는 것뿐만 아니라 염색질 구조를 변화시켜 Oct4와 Sox2 가 표적 유전자에 잘 결합할 수 있도록 도와주는 기능을 수행한다(Lewitzky and Yamanaka, Current Opinion in Biotechnology, 18:467-473, 2007).

상기 Klf4는 성장 억제에 관여하여 세포주기를 조절하는 역할을 한다. 최근 연구에 따르면 c-Myc과 유사하게 배아줄기세포에서 STAT3의 하위 유전자로 작용하며, 과발현시 Oct4 발현을 유지시켜 생쥐 배아줄기세포의 분화를 억제한다고 밝혀졌다 (Li et al., Blood, 105:635-637, 2005).

상기 Nanog는 배아 특이적인 유전인자로 Oct4나 Sox2와 마찬가지로 배아줄기세포의 만능성을 유지하는데 필요한 유전자이다. 또한 LIN28은 mRNA 결합 단백질로 배아줄기세포와 배아종양세포에서 발현되며 분화와 증식에 관여하고 있다고 알려져 있다(Yu et al., Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cell, Science New York, NY, 2007).

상기와 같이 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog 및 Lin28 유전자를 “역분화 유도인자(reprogramming-inducing gene)”라고 하며, 역분화 유도인자는 분화가 끝난 세포를 재프로그램화시킬 수 있는 유전자들을 의미한다. 특히 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 Yamanaka 인자라고 부른다.

본 발명에서 성체세포의 배양은 FBS (Fetal Bovine serum) 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 배지에서 성체세포를 배양할 수 있다.

상기 배지는 DMEM (Dulbecco`s Modified Eagle Medium)일 수 있으나, 이에 제한 되지 않는다. 5 내지 15% (v/v)의 FBS (Fetal Bovine serum), 바람직하게는 10 %의 FBS, 0.1 내지 5 % (v/v)의 페니실린/스트렙토마이신, 바람직하게는 1 %의 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 배지에서 성체세포를 배양할 수 있고, 상기 배양은 1 내지 25일, 바람직하게는 7일 동안 배양할 수 있다.

본 발명에 따른 유도만능 줄기세포는 세포치료제 개발 및 재생의학 분야의 연구 등에 유용하게 사용할 될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “세포 치료제(Cell Therapy Product)”는 세포의 조직과 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologus), 동종(allogenic), 또는 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품이다. 본 발명의 방법에 의하여 유도된 유도만능 줄기세포가 이용될 수 있는 세포 치료제의 분야는 제한이 없으며, 예를 들어, 종양, 퇴행성신경질환, 면역질환, 신경계질환, 물리적 장기손상, 신경손상, 당뇨, 뇌혈관질환, 척추손상, 골구시능 주전, 조혈기능 부전, 골관절염, 백혈구 삼수증 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 인장 자극을 이용한 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법은 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 효율이 우수하고, 유도만능 줄기세포를 용이하게 수득할 수 있다. 따라서, 상기 역분화된 유도만능 줄기세포를 세포치료제 개발 및 재생의학 분야의 연구 등에 유용하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<재료 및 방법>

1. DNA : pMXs-GFP, pMXs- OCT4, pMXs-SOX2, pMXs-KLF4, pMXs-c-Myc

2. Tranfection reagent : Lipofectanin Pluse(Life Technologies)

3. cell : plat-GP cell(Cell biolabs,INC), human dermal fibroblast(ATCC), STO(feeder cell,ATCC)

4. substrate : 6well plate(nunc culture plat) , BioFlex plate-collagen type 1(Flexcell international corporation)

5) equi-axial strain : 인장 25초, 휴지 125초, 총 2시간/ day

5) ES growth Media : DMED/F12, 5ml P/S, 5ml NEAA, 500ul b-mercaptoethanol/ 500ml 기준, 20%SR, 10ug/ul bFGF, gentamycin, 1000X plasmainhibitor

<실시예>

실시예 1. 인장 자극을 이용한 유도만능 줄기세포의 생성

day 0 역분화 인자(Oct4/Sox2/c-Myc/Klf4)가 도입된 레트로바이러스를 인간 섬유아세포(6well plate, BioFelx plate)에 처리하였다. day 1 상기와 동일한 방법으로 레트로바이러스를 처리하였다. 총 이틀 동안 바이러스를 처리하고 day 2 에 인간 섬유아세포 성장 배지(hDermal fibroblast growth media)로 교체하였다. day 3에서 day6까지 매일 새로운 성장 배지로 교체한 후, 매일 equi-axial 인장 자극을 총 4일간 인가하였다. 이때 인장 자극 조건은 3% 인장과 8% 인장을 가하고 인장 시간은 25초 휴지시간 125초 총 2시간 동안 인장을 가하였다. day 7일에 6well plate를 포함한 인장 자극을 주지 않은 그룹, 인장 자극을 준 모든 그룹에 세포를 trypsin-EDTA 로 때어낸 후 미리 준비된 Feeder cell에 올렸다. day 7부터 day 21까지 2주간 매일매일 ES 성장 배지로 교체하였다. day 21 ES-유사한 형태(morphology)를 가지는 iPS 세포가 생성되었다. 인장 자극를 인가한 경우와 그렇지 않은 경우의 AP 염색 결과, 세포 생성 속도, 및 유도만능 줄기세포로의 분화능을 확인한 결과를 각각 도 1 내지 3에 나타내었다.

도 1 내지 3에 나타낸 바와 같이, 인장 자극을 인가한 경우, 인장 자극을 인가하지 않은 세포와 비교하여 유도만능 줄기세포의 콜로니들이 빠르게 생성되는 것을 확인하였다. 특히, 인장 자극을 8%의 힘으로 인가한 경우, 인장 자극을 인가하지 않은 경우에 비해 약 8배 이상 및 인장 자극을 4%의 힘으로 인가한 경우에 비해 약 2배 빠르게 유도만능 줄기세포의 콜로니들이 생성되었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (8)

1. 인장 자극 하에서 성체세포를 배양하는 단계를 포함하는 유도만능 줄기세포(induced Pluripotent Stem cells, iPS)로 역분화시키는 방법으로,
   상기 인장 자극은 3% 내지 10%의 힘으로 2시간 동안 25초 자극 및 125초 휴지 조건으로 4일 동안 수행되는 것인, 방법.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 인장 자극은 8%의 힘으로 2시간 동안 25초 자극 및 125초 휴지 조건으로 4일 동안 수행되는 것인, 방법.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 성체세포는 역분화 인자가 형질도입된 것인, 방법.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 역분화 인자는 Oct4, Sox2, KLF4, C-Myc, Nanog 및 Lin28로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것인, 방법.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 배양은 FBS (Fetal Bovine serum) 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 배지에서 성체세포를 배양하는 것인, 방법.
   
7. 삭제
8. 삭제

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