KR102196422B1 - 포피라334를 이용한 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법 - Google Patents

포피라334를 이용한 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포피라334(Porphyra334)를 이용한 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법은 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 효율이 우수하고, 유도만능 줄기세포를 용이하게 수득할 수 있다. 또한, 상기 방법으로 제조된 유도만능 줄기세포는 역분화 인자의 발현양이 높고, 전분화능을 갖고 있다. 따라서, 상기 역분화된 유도만능 줄기세포를 세포치료제 개발 및 재생의학 분야의 연구 등에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

포피라334를 이용한 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법{Method of cell reprogramming adult cell to induced pluripotent stem cell using Porphyra334}
본 발명은 포피라334를 이용한, 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 역분화 인자가 도입된 성체세포를 포피라334를 처리하여 배양하는 단계를 포함하는, 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법에 관한 것이다.
줄기세포 (stemcell) 는 무한히 자가 재생을 할 수 있는 능력을 갖고 있으며, 또한 모든 성체세포로 분화를 할수 있는 능력을 지닌 세포이다. 줄기세포연구는 재생의학분야 뿐 아니라 신약개발, 세포치료제의 개발과 같은 연구에도 중요한 대상으로 각광받고 있는 분야이다. 줄기세포중 배아 줄기세포는 착상 전 배아의 내세포피 (inner cell mass)로부터 만들어지며, 적절한 환경 하에서 200가지 이상의 세포로 분화할 수 있고, 기관 전체를 만드는 것이 가능하다. 하지만 배아줄기세포는 난자를 사용해서 만들어야하고, 배아를 파괴해야 얻을 수 있다는 윤리적인 문제를 가지고 있으며 면역 거부반응이 있어서 임상에 사용하기 어렵다는 것 등과 같은 여러 가지 문제점들이 제기되어져 왔다.
최근, 이에 대한 보완책으로 유도 만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cells)가 보고되고 있다. 유도 만능 줄기세포는 분화가 끝난 세포를 역으로 분화시켜 전분화능 (pluripotency)을 갖는 세포를 지칭하며, 배아 줄기세포와 유사하게 자가 재생할 수 있는 능력을 가지고 신체의 모든 종류의 세포로 분화할수 있는 특징을 가진다. 현재까지 유도 만능 줄기세포는 유전자 발현과 분화능에서 만능 줄기세포인 배아 줄기세포와 유전적, 후생물학적 특성 등에서 매우 유사한 특성을 갖는 것으로 보고되고 있다. 하지만 치료 목적을 위한 유도 만능 줄기세포 제작에 바이러스 유전체의 이용은 위험성을 지니고 있다. 또한 세포내 유전체에 무작위로 매우 안정적으로 삽입되기 때문에 유전자 변이와 같은 다양한 문제들을 항상 내재하고 있다.
유도만능 줄기세포 연구는 재생의학, 신약 개발과 같은 세포치료제의 개발, 인체질환의 발병 원인 및 치료, 또한 생명의 발생과정을 연구하는 중요한 대상체로 각광을 받고 있다. 타깃 유전자를 이용한 세포 치료에 있어서, 세포 리프로그래밍을 통한 새로운 치료 방법들이 다양하게 등장되어져 왔으며, 이러한 해결책으로는 배아줄기세포 리프로그래밍 및 직접교차분화 리프로그래밍 등을 이용하여 환자 특이적 치료용 세포를 만들어 투여함으로써 질환을 치료하는 여러 가지 방법이 연구되어져 왔다. 하지만 현저히 낮은 리프로그래밍 효율 (<1%) 및 종양생성 가능성 등 안정성 이슈로 인해서 현재 임상에 유도만능 줄기세포를 적용하기에는 미비한 실정이다. 많은 연구자들이 상기의 문제를 해결하기 위한 수단으로, 발암유전자를 대체, small molecule을 이용한 reprogramming 효율 증가 등과 같은 연구가 진행되고 있다.
한편, MAAs(Mycosporine-like amino acids, 미코스포린 유사 아미노산)는 남조류, 균류, 미세조류 및 해조류 등 대부분의 광합성 식물에서 합성되는 자외선 흡수물질로(대한민국등록특허 10-1552010), 약 40여종의 MAAs가 존재하는 것으로 알려져 있다. 대표적인 MAAs로, 시노린, 팔리틴, 팔리티놀, 우수지렌, 팔리텐, 미코스포린-글리신, 포피라334 등이 있는데, 이들과 관련하여 성체세포를 역분화시키는 기술에 대한 연구는 전무한 실정이다.
이에 본 발명자들은 세포를 효율적으로 리프로그래밍하여 유도만능줄기세포로 역분화시키는 기술을 연구하던 중에, 포피라334가 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는데 효과있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 역분화인자가 도입된 성체세포를 포피라334를 처리하여 배양하는 단계를 포함하는, 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법을 제공하는데 있다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 포피라334를 이용한, 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법을 제공한다.
본 발명은, 역분화인자가 도입된 성체세포를 포피라334를 처리하여 배양하는 단계를 포함하는, 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법을 제공한다.
또한, 상기 방법에 의하여 역분화된 유도만능 줄기세포를 제공한다.
또한, 상기 포피라334를 포함하는, 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 유도용 배지 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
일 관점에서, 본 발명은 포피라334를 처리하여 성체세포를 배양함으로써 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 역분화인자가 도입된 성체세포를 포피라334를 처리하여 배양하는 단계를 포함하는 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 "줄기세포"는 여러 종류의 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포, 즉 미분화세포이며 배아 줄기세포와 성체 줄기세포로 분류할수 있다. "배아 줄기세포"는 분화능력을 가지고 있으나 아직 분화가 일어나지 않은 미분화 세포로, 이러한 미분화 상태에서 적절한 조건을 맞춰주면 다양한 조직세포로 분화가 가능한 만능 줄기세포성(pluripotency)을 가지는 세포를 의미하며, 넓은의미로는 배아 줄기세포로부터 유래한 배아체 (embryoid bodies)도 포함한다. "성체 줄기세포"는 모든 조직으로 분화할 수는 없으나 각 표적기관으로는 분화할 수 있는, 제한된 분화능을 가지는 세포를 의미한다. 더불어 "분화능"이란 생물의 초기발생에서 배의 일부가 주어진 발생조건에 따라 각종 기관이나 조직으로 분화될 수 있는 능력을 말한다.
본 발명에서 "유도 만능 줄기세포"란 분화가 끝난 세포를 역분화시켜 전분화능(pluripotency)을 갖는 세포를 지칭하며, 배아 줄기세포와 유사하게 자가재생할 수 있는 능력을 가지고 신체의 모든 타입의 세포로 분화할 수 있는 특징을 가진 것으로, "역분화 줄기세포"라고도 한다. 유도 만능 줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가지며, 구체적으로는 비슷한 세포 모양을 보여주며, 유전자, 단백질 발현 패턴이 유사하며, in vitro 및 in vivo에서 전분화능을 갖는다.
또한, 본 발명에서 "성체세포"는 배아세포와 반대되는 용어로, 태어나서 생존하는 성체로부터 유래한 세포를 지칭한다. 본 발명에서 사용되는 성체세포의 유전적 배경에는 제한이 없으나, 개과 동물, 고양이과 동물, 멧돼지과 동물, 소과 동물, 사슴과 동물, 기린과 동물, 페커리과 동물, 낙타과 동물, 하마과 동물, 말과 동물, 맥과 동물, 코뿔소과 동물, 족제비과 동물, 토끼과 동물, 설치류 및 영장류로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상으로부터 유래일 수 있고, 바람직하게는 마우스 또는 인간의 섬유아세포일 수 있다.
본 발명에서 "역분화 (dedifferentiation)"는 부분 또는 최종 분화된 세포를 만능 또는 다능과 같은 미분화 상태로 되돌려서, 새로운 분화 조직의 형성이 가능하도록 하는 후성학적인 역행 과정을 의미한다. 이러한 역분화 현상은 세포 유전체의 후성학적인 변형(epigenetic changes)들이 고정되어 있는 것이 아니라 지워지고 다시 형성될 수 있는 가역적인 과정이기 때문에 가능하다. 역분화는 "재프로그램화 (reprogramming)"라고도 불리우며, 부분 또는 최종 분화된 세포의 유전적 및 표현적 프로필을 배아줄기세포의 그것과 비슷하도록 변화시키는 과정에 관한 것이다. 예를 들면, 상기 변화는 메틸화 패턴의 변화, 줄기세포성 유전자의 발현율 변화 등을 포함한다.
본 발명에서 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 효과가 있는 포피라334(porphyra 334)는 미코스포린 유사 아미노산(MAA)의 한 종류로, 자외선 흡수물질로 잘 알려져 있으며, 도 1에 (A)에 나타나는 구조를 가지고 있으며, 334 nm의 최대 흡수 파장을 가진다. 본 발명자는 포피라334를 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 와 질량분석기를 이용한 정량분석 (MS/MS) 및, UV 분광기 (UV spectrum) 분석을 통하여 이의 성질을 확인 하였다 (도 1 B, C 및 D).
본 발명에서 역분화 인자(또는, 역분화 유도인자)는 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog 및 Lin28 중 선택되는 1종 이상이고, 바람직하게는 Oct4, Sox2, Klf4 및 C-Myc이나, 이에 제한되지 않는다. 상기와 같이 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog 및 Lin28 유전자를 "역분화 유도인자 (reprogramming-inducing gene)"라고 하며, 역분화 유도인자는 분화가 끝난 세포를 재프로그램화시킬 수 있는 유전자들을 의미한다. 특히, Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 야마나카 인자(Yamanaka factors) 라고 부른다.
본 발명에서 역분화 유도인자를 성체세포 내로 도입하는 과정은, 구체적으로, 레트로바이러스나 렌티바이러스를 이용하여 역분화인자를 코딩하는 유전자를 전달하는 방법을 이용할 수 있다.
본 발명에서 상기 성체세포의 배양은 FBS (Fetal Bovine serum) 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 배지에서 성체세포를 배양할 수 있다.
상기 배지는 DMEM (Dulbecco`s Modified Eagle Medium)일 수 있으나, 이에 제한 되지 않는다. 5 내지 15% (v/v)의 FBS (Fetal Bovine serum), 바람직하게는 10 %의 FBS, 0.1 내지 5 % (v/v)의 페니실린/스트렙토마이신, 바람직하게는 1 %의 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 배지에서 성체세포를 배양할 수 있고, 상기 배양은 1 내지 10일, 바람직하게는 5일 동안 배양할 수 있다.
본 발명에서, 상기 배양된 성체세포가 인간 유래의 성체세포인 경우에는, 혈청 대체물 (serum replacer), 비필수 아미노산, 페니실린/스트렙토마이신, 글루타민 및 β-머캅토에탄올의 혼합물 및 bFGF (bovine fibroblast growth factor)가 포함된 배지에서 추가적으로 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 추가 배양을 위한 배지로는 DMEM (Dulbecco`s Modified Eagle Medium)일 수 있고, 5 내지 20% (v/v)의 FBS (Fetal Bovine serum), 바람직하게는 15 %의 FBS, 0.1 내지 5 % (v/v)의 비필수 아미노산, 바람직하게는 1 %의 비필수 아미노산, 0.1 내지 5 % (v/v)의 페니실린/스트렙토마이신, 바람직하게는 1 %의 페니실린/스트렙토마이신, 0.1 내지 5 % (v/v), 바람직하게는 1 % (v/v)의 글루타민 (100 mM 내지 500 mM, 바람직하게는 200 mM), 0.1 내지 5 % (v/v), 바람직하게는 1 % (v/v)의 β-머캅토에탄올 및 10-6 내지 10-5 % (v/v), 바람직하게는 4 ×10-6 % (v/v)의 백혈병억제인자 (LIF; Leukemia Inhibitory factor) 와 Ascorbic acid (AA) 가 포함된 배지에서 성체세포를 추가적으로 배양할 수 있으며, 상기 배양은 10 내지 20일, 바람직하게는 15일 동안 배양할 수 있다.
상기 성체세포가 인간 유래의 성체세포인 경우, 추가배양을 위한 배지로 DF12 배양 배지를 이용할 수 있고, 10 내지 30 % (v/v), 바람직하게는 20 % (v/v)의 혈청 대체물 (serum replacer), 0.1 % 내지 5 % (v/v), 바람직하게는 1 % (v/v)의 비필수 아미노산, 0.1 % 내지 5 % (v/v), 바람직하게는 1 %의 페니실린/스트렙토마이신, 0.1 내지 5 % (v/v), 바람직하게는 1 % (v/v)의 글루타민 및 β-머캅토에탄올의 혼합물 및 10-5 내지 10-4% (v/v), 바람직하게는 1.4 × 10-5 (v/v) %의 bFGF (bovine fibroblast growth factor)가 포함된 배지에서 성체세포를 추가적으로 배양할 수 있으며, 상기 배양은 20 내지 40 일, 바람직하게는 30일 동안 수행할 수 있다.
상기한 추가 배양을 위한 배지를 사용할 경우 사용을 하지 않았을 때와 비교하여 역분화된 유도만능 줄기세포의 생성 효율이 늘어나는 효과가 있다.
본 발명의 방법에 따라 역분화된 유도만능 줄기세포는 역분화 인자의 발현양이 높고, 역분화 인자의 프로모터 부위가 탈 메틸화가 된다. 또한, 상기 역분화된 유도만능 줄기세포를 마우스에 이식하는 경우, 전분화능이 나타난다. 따라서, 상기 역분화된 유도만능 줄기세포를 세포치료제 개발 및 재생의학 분야의 연구 등에 유용하게 사용할 수 있다.
따라서, 다른 관점에서, 본 발명은 상기와 같은 방법으로 얻어진 역분화된 만능줄기세포에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 다른 관점에서, 포피라334를 포함하는, 성체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 유도용 배지 조성물에 관한 것이다.
상기 배지 조성물은 5 내지 15% (v/v)의 FBS (Fetal Bovine serum), 바람직하게는 10 %의 FBS, 0.1 내지 5 % (v/v)의 페니실린/스트렙토마이신, 바람직하게는 1 %의 페니실린/스트렙토마이신을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 역분화 방법은 리프로그래밍 단계동안 포피라334를 처리하는 것으로서, 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 효율이 우수하고, 유도만능 줄기세포를 용이하게 수득할 수 있다. 또한, 상기방법으로 제조된 유도만능 줄기세포는 역분화 인자의 발현양이 매우 높고, 분화를 시킬 경우, 전분화능이 나타난다. 따라서, 상기 역분화된 유도만능 줄기세포를 세포치료제 개발 및 재생의학 분야의 연구 등에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은, 본 발명에서 사용된 물질인 포피라334(Porphyra334) 의 구조 및 물성 상태를 개략적으로 나타낸 결과이다 (A. 포피라334의 화학식적 구조. B. 포피라334에 대한 고성능액체크로마토그래피 분석. C. 포피라334의 질량 분석. D. 포피라334 의 UV 스펙트럼 분석).
도 2는, Oct4-GFP Knock-in 마우스의 섬유아세포에 역분화인자(Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4)를 도입하고 포피라334를 처리한 후, GFP-양성 유도만능 줄기세포 콜로니를 확인한 결과이다.
도 3는, Oct4-GFP Knock-in 마우스의 섬유아세포에 역분화인자(Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4)를 도입하고 포피라334를 처리한 후, 전분화능 마커유전자 (oct4, Sox2, Esrrb, Ssea1 및 Ecad) 의 mRNA 발현변화를 Rt-PCR (도 3 A) 및 AP staining 방법을 통하여 확인하고 도식화한 결과 (도 3 B, C)이다.
도 4는, Oct4-GFP Knock-in 마우스의 섬유아세포에 역분화인자 (Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4)를 도입하고 포피라334를 처리한 후, 면역염색법을 통하여 전분화능 마커 유전자 (Oct4, 와 Nanog)의 단백질 수준에서 발현을 확인하고 도식화한 결과이다. (도4 A, B) 또한, 시간이 지남에 따라 유도만능 줄기세포의 크기가 포피라334를 처리한 군에서 더 크기가 커짐을 확인한 결과이다. (도4 C)
도 5는, Oct4-GFP Knock-in 마우스의 섬유아세포에 역분화인자 (Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4)를 도입하고 포피라334를 처리한 후, 메틸화된 정도를 western blot (도5 A) 과 면역염색법으로 분석하고 이를 도식화한 결과 (도5 B, C) 이다.
도 6은 인간세포 (human dermal papilla) 에 역분화인자 (Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4)를 도입하고 포피라334를 처리한 후, 인간 역분화 줄기세포로의 변환을 면역염색법과 전분화능 마커유전자의 발현을 면역염색법 (도6 A,B,C), Rt-PCR을 통하여 분석하고 이를 도식화한 결과 (도6 D,E) 이다.
도 7은 포피라334를 처리하여 만들어진 역분화 줄기세포를 분화시켰을 때 전분화능을 갖는지를 분석해보기 위하여 여러 Marker (Ectoderm, Mesoderm, Endoderm) 들로 면역염색을 실행한 결과이다 (도7 A). 또한, 이의 분화능을 보기위하여 뼈세포 및 도파민성 신경세포로 분화한 결과 분화가 잘 이루어졌음을 면역염색법을 통하여 확인한 결과이다. (도7 B)
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
실시예 1. 마우스 성체세포의 유도만능 줄기세포로의 역분화 .
1.1 포피라를 이용한 성체세포의 유도만능 줄기세포로의 역분화 확인.
OCT4-GFP Knock-in 성체마우스의 꼬리를 잘라 일차 (primary) 세포배양을 한 후, 상기 세포에 4가지 역분화 인자 (Oct4/Sox2/c-Myc/Klf4)가 도입된 렌티바이러스 (lentivirus)를 처리하였다. 이 후, 포피라(Porphyra)-334 2uM 를 배양 접시에 처리하고 10 %(v/v)의 DMEM, 1 % (v/v)의 FBS, 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 배양 배지에서 5일간 배양한 후(2일에 한번 배양 배지 교환), 15 % (v/v)의 DMEM에 1 % (v/v)의 FBS, 1 % (v/v)의 비-필수아미노산, 1 % (v/v)의 페니실린/스트렙토마이신, 200 mM의 글루타민, 0.7 ul의 β-머캅토에탄올, 5 μl의 백혈병 억제인자 (LIF; Leukemia Inhibitory factor)가 함유된 배양 배지에서 15일 동안 배양하였다 (2일에 한번 배양 배지 교환). 이 후, 형광 현미경을 통하여 GFP 양성 유도 만능줄기세포 콜로니를 관찰 및 정량적 분석하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 포피라334를 처리한 군이, 처리하지 않은 군에 비해 훨씬 우수한 유도만능 줄기세포 콜로니 형성을 나타냄을 확인하였다. (Mock: 아무것도 처리하지 않은 그룹, DMSO: 포피라334 함유된 용액으로 Dox 만 처리된 그룹.)
1.2. 분자수준에서의 역분화 인자 발현 확인.
상기 1.1 에서 제조된 유도만능 줄기세포를 계대 배양하였다. 보다 구체적으로 계대 하루 전, 0.2 %의 젤라틴을 코팅한 6-웰 플레이트에 미토마이신 C (Mitomycin C; 10 ug/ml)를 37 ℃로 유지되는 CO2 배양기에서 2시간 처리한 마우스 배아 섬유아세포 (배아 단계 13일 후의 mouse embryonic fibroblast(feeder))를 배양한 후, 다음날 1000~5000개의 유도만능줄기세포를 트립신아제를 처리한 다음, 상기 섬유아세포 상에서 배양하였다. 이 후, 통상적인 방법으로 mRNA를 수득하고, cDNA를 합성 후, 전분화능 마커 유전자 (Oct4, Sox2, Nanog)들을 정량적 PCR (quantitative PCR)로 분석하였고, 이 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3의 C 에서의 control 은 DMSO 만 처리된 그룹으로 대조군을 의미한다.
또한, 면역염색법을 통하여 전분화능 마커 유전자들 (Oct4 또한 Nanog)의 단백질 수준에서의 발현을 확인한 결과, 도 4에서와 같이 포피라334 처리 군에서 우수한 발현능을 확인할 수 있었고 iPSC 의 colony 크기를 비교분석한 결과 iPSC 가 완벽하게 생성되는 15 일째에 가장 큰 효율 차이를 보여주었다.
또한, 유도만능 줄기세포가 생성될 때 발현성이 높아지는 H3K4me3 와 Nanog 유전자를 웨스턴 블롯팅 분석법을 통하여 포피라334가 처리된 군에서 증가함을 분석하였다. 또한 이를 면역염색법 및 면역흡광정도 분석을 통하여 포피라334 가 처리된 군에서 증가함을 분석하였다. 여기서 사용된 H3k27me3 는 유도만능 줄기세포와 무관한 유전자로서 음성대조군으로 사용되었다.
실시예 2. 인간 성체세포의 유도만능 줄기세포의 역분화 확인.
2.1 포피라 를 이용한 성체세포의 유도만능 줄기세포로의 역분화 확인.
인간 섬유아세포를 배양하여 역분화 인자 (Oct4/Sox2/c-Myc/Klf4)가 도입된 렌티바이러스를 처리하고, 포피라334를 처리후 10 %(v/v)의 DMEM, 1 % (v/v)의 FBS, 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 배양배지에서 5일간 배양한 후(2일에 한번 배양배지 교환), 200ml의 DF12 배지에 50 ml(v/v) 혈청 대체물 (serum replacer), 2.5 ml의 1% 비-필수아미노산, 1 % (v/v)의 페니실린/스트렙토마이신, 1.25 ml의 [200 mM 글루타민 및 β-머캅토에탄올] 및 10 μl의 bFGF가 함유된 배양배지에서 30일 동안 배양(매일한번 배양배지 교환)하였다.
도 6은 인간세포 (human dermal papilla) 에 역분화인자 (Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4)를 도입하고 포피라334를 처리한 후, 인간 역분화 줄기세포로의 변환을 Oct4, Nanog 의 면역염색법 (도6 A) 과 전분화능 마커유전자의 발현을 Rt-PCR을 통하여 분석한 도이다. (도6 D) 또한, 시간이 지날수록 유도만능 줄기세포의 숫자가 증가함을 확인하였고, 역분화 마커 유전자인 Ecad 와 Occuludin 유전자의 발현 역시 증가함을 qRTPCR을 통하여 분석하였다. (도6 B, C, E)
2.2 유도만능 줄기세포의 전분화능 확인.
상기 2.1에서 포피라334를 세포에 처리한 경우, 전분화능 마커의 발현이 증가함을 확인하였고, 삼배엽 (three-germ layers) 들이 생성됨 (내배엽: Sox17, 외배엽: Tuj1, Nestin; 중배엽: Brachyury)을 면역염색법을 통하여 확인함으로써, 본 발명의 유도만능 줄기세포가 전분화능을 갖고 있음을 확인하였다. (도7 A) 또한 특별한 세포로 분화할수 있는가를 확인하기 위하여 뼈세포 및 도파민성 신경세포로의 분화를 면역염색법을 통하여 확인하였다. (도7 B)

Claims (8)

  1. 포피라334를 이용한, 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법으로,
    상기 방법은,
    역분화인자 Oct4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc이 도입된 성체세포를 포피라 334를 처리한 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 성체세포는 개과 동물, 고양이과 동물, 멧돼지과 동물, 소과 동물, 사슴과 동물, 기린과 동물, 페커리과 동물, 낙타과 동물, 하마과동물, 말과 동물, 맥과 동물, 코뿔소과 동물, 족제비과 동물, 토끼과 동물, 설치류및 영장류로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상으로부터 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 배지는 FBS (Fetal Bovine serum) 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 배양은 1 내지 10일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 성체세포를, 혈청 대체물 (serum replacer), 비필수 아미노산, 페니실린/스트렙토마이신, 글루타민 및 β-머캅토에탄올의 혼합물 및 bFGF (bovine fibroblast growth factor)가 포함된 배지에서 추가적으로 배양하는 단계를 포함하는 방법.


  6. 삭제
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