CN116555169B - 一种简单、快速的体细胞化学重编程方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种简单、快速的体细胞化学重编程方法，用于制备多潜能干细胞，属于干细胞与再生医学领域。包括：1.通过提高小分子CHIR99021的使用浓度，将第一阶段诱导试剂中的3个小分子和1个细胞因子减去；2.本发明显著提高化学重编程的诱导效率（大于10倍），并且将诱导时间减少到16天；3.通过该技术获得的化学诱导的多潜能干细胞系具有多潜能性。通过诱导小鼠胚胎成纤维细胞重编程，制备化学诱导的多潜能干细胞，可用于体外疾病模型、药物筛选、毒性测试以及细胞命运转变机制等研究领域。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞与再生医学领域，具体涉及一种简单、快速的体细胞化学重编程方法。
背景技术
干细胞研究的最终目标是将干细胞来源的功能细胞用于移植治疗重大疾病。多潜能干细胞可以稳定地长期扩增，能够产生无限的种子细胞；同时，多潜能干细胞可以分化产生机体所有类型的功能细胞，在细胞治疗、药物筛选和建立疾病模型等方面具有广阔的应用前景，其应用有望带来一场新的医学革命。如何在体外建立安全的、稳定的多潜能干细胞作为种子细胞是干细胞研究的关键问题。
2006年，日本京都大学Shinya Yamanaka 研究小组用病毒转导方式将Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc（OSKM）四个基因转入小鼠胚胎成纤维细胞，可以使之转变为类似胚胎干细胞的“诱导的多潜能干细胞（induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs）”，建立了iPS技术。该技术一方面打破了传统建立胚胎干细胞系存在的伦理限制，另一方面，也为建立病人自体特异性多潜能干细胞系提供了全新的方法，从而为目前细胞治疗中异体移植所引起的免疫排斥问题提供了解决方案。此外，iPS技术还被广泛应用于疾病模型建立、新药开发等研究领域。因此，iPS技术的建立被誉为再生医学领域的里程碑式的工作，并于2012年获得诺贝尔生理或医学奖。iPS技术是通过细胞内源转录因子的过表达，驱动细胞命运发生直接转变，其诱导过程难以控制。更重要的是，iPS技术需要通过病毒转染方式转入4个基因，病毒可能会将自己的DNA片段整合到细胞的基因组上、破坏基因组的稳定性，会导致iPSCs分化获得的功能细胞具有成瘤的风险。因此，建立一种安全、可控的细胞重编程技术是再生医学领域一个重要的科学问题。
2013年，北京大学邓宏魁团队在Science杂志发表了一项原创性的成果，即不依赖卵母细胞和转录因子等细胞内源物质，仅使用外源性化学小分子就可以逆转细胞命运，将小鼠体细胞重编程为化学诱导的多潜能干细胞（Chemically induced Pluripotent StemCells, CiPSCs），开辟了全新的体细胞化学重编程技术。同胚胎干细胞类似，CiPSCs可分化成为包括血液、肝脏、神经和肌肉等各种功能细胞。相比传统方法，化学小分子具有易于合成、保存和规范化的特点，同时其生物学效应具有可塑性和可逆性，添加操作方便，因此可以通过对小分子浓度、添加时间及不同组合的微调实现对重编程过程的精细化操控。更重要的是，小分子诱导体细胞重编程技术作为非整合方法，规避了传统遗传操作引发的安全问题，有望为临床治疗提供更加安全的种子细胞。化学重编程技术开辟了一条全新的具有应用前景的体细胞重编程途径。这不仅有助于更好地理解细胞命运决定和转变机制，而且为未来再生医学治疗重大疾病带来新的可能。
尽管化学重编程技术克服了iPS技术的缺陷，具有更好的临床应用前景，但在以下三方面仍需要进行改进：1.化学重编程技术包含3个诱导阶段，每个阶段使用多个小分子，使得实验操作复杂；2.化学重编程技术全程诱导时间长于iPS技术，一般需要至少30天才能实现稳定的诱导；3.化学重编程技术实现较高效的诱导是通过在诱导中间阶段将细胞进行传代实现的，然而传代处理增加了诱导时长和诱导体系的复杂性。
发明内容
本发明的目的在于提出一种简单、快速的体细胞化学重编程方法，本发明获得的化学诱导的多潜能干细胞具有多潜能性，通过诱导小鼠胚胎成纤维细胞重编程，制备化学诱导的多潜能干细胞，可用于体外疾病模型、药物筛选、毒性测试以及细胞命运转变机制等研究领域。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种简单、快速的体细胞化学重编程方法，包括：
S1.体细胞转变为胚外内胚层样细胞，这群细胞表达胚外内胚层相关基因；
S2.表观小分子的联合使用，使细胞整体表观修饰状态发生改变，细胞进入二细胞期胚胎样状态；
S3.细胞由二细胞期胚胎样状态转变为多潜能状态。
作为本发明的进一步改进，所述体细胞为小鼠胚胎成纤维细胞。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中诱导试剂为第一阶段诱导试剂，以KnockOutDMEM为基础，添加以下成分：10%胎牛血清，10% KSR，1% GlutaMAX-I，1%非必需氨基酸，1%青霉素-链霉素，0.1 mM β-巯基乙醇以及小分子40 μM CHIR99021，10 μM 616452，10 μMForskolin，1 μM CH55和5 μM EPZ004777。
作为本发明的进一步改进，步骤S2中诱导试剂为第二阶段诱导试剂，为94% DMEM/DF12和Neurobasal按1:1混合液，1% N2，2% B27，1% GlutaMAX-I，1%非必需氨基酸，1%青霉素-链霉素，0.1 mM β-巯基乙醇，10 ng/ml白血病抑制因子（Leukemia inhibitoryfactor，Lif），25 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），50 μg/ml维他命C（Vitamin C，Vc），2 mg/ml Albumax II以及小分子1 mM VPA，10 μM CHIR99021，10 μM 616452，5 μM Tranylcypromine，10 μM Forskolin，1 μM CH55，0.05μM DZNep，0.5 μM Decitabine和5 μM SGC0946。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中诱导试剂为第三阶段诱导试剂，为94% DMEM/DF12和Neurobasal按1:1混合液，1% N2，2% B27，1% GlutaMAX-I，1%非必需氨基酸，1%青霉素-链霉素，0.1 mM β-巯基乙醇，10 ng/ml 白血病抑制因子，50 μg /ml维他命C，3 μMCHIR99021和1 μM PD0325901。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中额外添加500 μM VPA。
技术原理：
如图1，小分子可以直接调控信号通路和表观靶点，通过逐步诱导的方式使细胞发生命运转变。化学重编程技术包含3个诱导阶段，分别发生了不同的分子事件。在第一阶段，体细胞首先转变为胚外内胚层样细胞，这群细胞表达胚外内胚层相关基因，如Sall4，Gata6和Sox17等；在第二阶段，多个表观小分子的联合使用，使细胞整体表观修饰状态发生改变，细胞进入二细胞期胚胎样状态；在第三阶段，细胞由二细胞期胚胎样状态转变为多潜能状态。通过调整小分子的使用方式，如使用浓度、使用时间以及不同的小分子组合等，可以加速细胞命运发生转变。本发明通过将第一阶段诱导试剂中的小分子CHIR99021的使用浓度由原来使用的10 μM提高到40 μM，可以显著促进体细胞向胚外内胚层状态转变，缩短诱导时间并最终提高化学诱导的多潜能干细胞形成效率。
本发明具有如下有益效果：本发明解决了现有技术存在的问题。第一，开发新的第一阶段诱导试剂：在现有化学重编程技术的基础上，通过调整小分子CHIR99021的使用浓度，将第一阶段诱导试剂中的小分子个数由9个减少到5个，大幅简化了现有技术的复杂性。第二，建立新的化学重编程技术：不需要对诱导过程中的细胞进行传代处理，缩短了诱导时长，最短仅使用16天即可获得化学诱导的多潜能干细胞，并且显著提高诱导效率至少10倍。第三，采用本发明制备多潜能干细胞：从多个层面验证，本发明获得的化学诱导的多潜能干细胞具有多潜能性，通过诱导小鼠胚胎成纤维细胞重编程，制备化学诱导的多潜能干细胞，可用于体外疾病模型、药物筛选、毒性测试以及细胞命运转变机制等研究领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明化学重编程技术分子机制图；
图2为本发明和现有体系诱导诱导效率对比图；A.第一阶段第8天原孔细胞的形态图，比例尺：100 μM。B. qPCR分析提高小分子CHIR99021使用浓度对胚外内胚层相关基因表达影响；n = 2。C.现有体系和本发明（#5：提高小分子CHIR99021使用浓度或使用其它Wnt通路激活剂#1、#2、#3和#4）在第三阶段末统计化学诱导多潜能干细胞克隆数，n>3；
图3为本发明诱导获得的化学诱导的多潜能干细胞鉴定对比图；A. qPCR分析多潜能性基因在CiPSCs #3，CiPSCs #4，CiPSCs #5以及对照小鼠胚胎干细胞中的表达情况。B.散点图分析CiPSCs #1与小鼠胚胎成纤维细胞（左）和小鼠胚胎干细胞（右）的相关性。C.免疫荧光检测多潜能性核心转录因子Nanog和Sox2与pOct4-GFP在全程16天诱导获得的CiPSCs中的共表达情况。D.全程16天诱导获得的CiPSCs来源的嵌合小鼠。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.实验过程
1.1 小鼠
本发明使用C57BL/6JTg（GOFGFP）11Imeg/Rbrc（pOct4-GFP，OG）（简称OG小鼠）与ICR两种品系的小鼠。主要进行以下三方面实验：1.将OG（雄性，♂）和ICR（雌性，♀）小鼠进行杂交，产生携带有干性基因Oct4启动子驱动的绿色荧光报告蛋白（Green fluorescentprotein，GFP）的子代胚胎，用于小鼠胚胎成纤维细胞的分离；2.用纯合ICR小鼠（图3D）的八细胞或囊胚期胚胎做嵌合实验，ICR母鼠为代孕小鼠。所有动物实验操作均按照动物保护规定进行。
1.2 小鼠胚胎成纤维细胞分离及培养
a)用发育到13.5天的小鼠胚胎分离小鼠胚胎成纤维细胞。
b)取出胚胎后，在体视镜下去除头，四肢，内脏和生殖脊，将剩余的部分用含有2%青霉素-链霉素的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）洗3遍。
c)使用眼科剪将剩余胚胎组织剪碎，每个胚胎加1~2 ml 0.25% trypsin-EDTA在37 °C、5%二氧化碳（CO2）培养箱消化5~10分钟。
d)用含15%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的高糖DMEM培养基中和消化反应，反复吹吸数次促进细胞解离。400 g离心5分钟，去除上清后，将剩余细胞用含15%胎牛血清的高糖DMEM培养基重悬，每个胚胎可以铺到一个100 mm培养皿中。
e)次日，吸去未贴壁的细胞，换新鲜的含15%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养，细胞2~3天长满。
f)小鼠胚胎成纤维细胞使用含15%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养，包含以下成分：高糖DMEM培养基，15%胎牛血清，1% GlutaMAX-I，1%非必需氨基酸（nonessential aminoacids，NEAA），0.1 mM β-巯基乙醇（β-Me）和1%青霉素-链霉素。
g)细胞在37℃、5% CO2的培养箱中培养，小鼠胚胎成纤维细胞每2~3天长满，用0.25% trypsin-EDTA消化、按1:4传一次代。
h)本发明建议使用第1~2代小鼠胚胎成纤维细胞。
1.3 诱导试剂准备
i.第一阶段诱导试剂：以KnockOut DMEM为基础，添加以下成分：10%胎牛血清，10%KSR，1% GlutaMAX-I，1%非必需氨基酸，1%青霉素-链霉素，0.1 mM β-巯基乙醇以及小分子40 μM CHIR99021，10 μM 616452，10 μM Forskolin，1 μM CH55和5 μM EPZ004777。
ii.第二阶段诱导试剂（以N2B27为基础，N2B27-SII）：94% DMEM/DF12和Neurobasal按1:1混合液，1% N2，2% B27，1% GlutaMAX-I，1%非必需氨基酸，1%青霉素-链霉素，0.1 mM β-巯基乙醇，10 ng/ml白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor，Lif），25 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），50 μg/ml维他命C（Vitamin C，Vc），2 mg/ml Albumax II以及小分子1 mM VPA，10 μM CHIR99021，10μM 616452，5 μM Tranylcypromine，10 μM Forskolin，1 μM CH55，0.05 μM DZNep，0.5 μMDecitabine和5 μM SGC0946。
iii.第三阶段诱导试剂：94% DMEM/DF12和Neurobasal按1:1混合液，1% N2，2%B27，1% GlutaMAX-I，1%非必需氨基酸，1%青霉素-链霉素，0.1 mM β-巯基乙醇，10 ng/ml白血病抑制因子，50 μg /ml维他命C，3 μM CHIR99021和1 μM PD0325901。
1.4 诱导步骤
a)小鼠胚胎成纤维细胞准备：0.25% trypsin-EDTA消化小鼠胚胎成纤维细胞，用含有15%胎牛血清的DMEM培养基接种小鼠胚胎成纤维细胞，6孔板每孔接种40,000颗小鼠胚胎成纤维细胞。
b) 次日，换成第一阶段诱导试剂优化版，每4天换一次液。
c) 第4~8天或第6~12，换成第二阶段诱导试剂优化版（以N2B27为基础）。
d)第8~12或第12~16天，换成第三阶段诱导试剂，额外加500 μM VPA。
e)减去VPA，继续在第三阶段诱导试剂中培养4~10天开始出现CiPSC克隆。
2.诱导能力
2.1 本发明简化第一阶段诱导试剂成份
相比于现有化学重编程技术，本发明将第一阶段使用的小分子Tranylcypromine、Valproic acid和AM580以及细胞因子bFGF减去，在只使用5个小分子的情况下（Forskolin、Ch55、CHIR99021、616452、EPZ004777），仍可以高效诱导获得化学诱导的多潜能干细胞（见表1和图2）
表1. 现有技术和本发明第一阶段使用的小分子
2.2 本发明显著促进细胞命运发生转变并提高最终的诱导效率
相比于现有化学重编程技术，本发明在减去3个小分子和1个细胞因子的同时，将小分子CHIR99021的使用浓度提高到40 μM。我们发现在第一阶段末，能够明显地抑制未发生命运转变的小鼠胚胎成纤维细胞的增殖，同时产生更多形态更加典型的胚外内胚层样克隆（图2A）。与此同时，本发明同样显著增强胚外内胚层相关基因Gata4/6，Sox17，Cdh1和EpCAM的表达（图2B）。与qPCR结果一致的是，在第一阶段提高小分子CHIR99021的使用浓度或使用额外的Wnt通路其它激活剂Wnt a1，Wnt a2或Wnt a3均可以显著增加最终产生的化学诱导的多潜能干细胞克隆的数量（图2C）。
2.3本发明诱导获得的化学诱导的多潜能干细胞具有多潜能性
我们进一步采用qPCR、RNA-Seq和嵌合实验验证本发明诱导获得的多潜能干细胞的多潜能性。qCPR结果表明，干性基因Oct4、Sox2和Nanog等，在本发明诱导获得的化学诱导的多潜能干细胞系CiPSCs #3、#4和#5和胚胎干细胞（ESC）中表达水平相当（图3A）。免疫荧光进一步证明，本发明诱导获得的化学诱导的多潜能干细胞表达Nanog和Sox2等干性基因蛋白（图3B）。在整体转录组层面，本发明诱导获得的化学诱导的多潜能干细胞更接近于胚胎干细胞，而不是起始细胞（图3C）。体内嵌合实验结果表明，使用本发明诱导16天获得的化学诱导的多潜能干细胞具有多潜能性。上述结果表明，本发明不仅简化了化学重编程吧技术的第一阶段诱导条件，显著提高了化学重编程技术的诱导效率，同时缩短了诱导时长，并且最终获得的多潜能干细胞具有多潜能性。
本发明对第一阶段进行简化，通过提高CHIR99021的使用浓度，减去3个小分子和1个细胞因子；其次，本发明显著提高化学重编程的诱导效率（大于10倍），并且将诱导时间减少到16天；最后，通过该技术获得的化学诱导的多潜能干细胞系具有多潜能性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种简单、快速的体细胞化学重编程方法，其特征在于，包括：
S1.体细胞转变为胚外内胚层样细胞，这群细胞表达胚外内胚层基因Sox17 、Gata4、Gata6、Cdh1或EpCAM；
S2.表观小分子的联合使用，使细胞整体表观修饰状态发生改变，细胞进入二细胞期胚胎样状态；
S3.细胞由二细胞期胚胎样状态转变为多潜能状态；
步骤S1中诱导试剂为第一阶段诱导试剂，以KnockOut DMEM为基础，添加以下成分：10%胎牛血清，10% KSR，1% GlutaMAX-I，1%非必需氨基酸，1%青霉素-链霉素，0.1 mM β-巯基乙醇以及小分子40 μM CHIR99021，10 μM 616452，10 μM Forskolin，1 μM CH55和5 μMEPZ004777；
步骤S2中诱导试剂为第二阶段诱导试剂，为94% DMEM/DF12和Neurobasal按1:1混合液，1% N2添加物，2% B27添加物，1% GlutaMAX-I，1%非必需氨基酸，1%青霉素-链霉素，0.1mM β-巯基乙醇，10 ng/ml白血病抑制因子，25 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子，50 μg/ml维他命C，2 mg/ml Albumax II以及小分子1 mM VPA，10 μM CHIR99021，10 μM 616452，5 μM Tranylcypromine，10 μM Forskolin，1 μM CH55，0.05 μM DZNep，0.5 μM Decitabine和5 μM SGC0946；
步骤S3中诱导试剂为第三阶段诱导试剂，为94% DMEM/DF12和Neurobasal按1:1混合液，1% N2，2% B27，1% GlutaMAX-I，1%非必需氨基酸，1%青霉素-链霉素，0.1 mM β-巯基乙醇，10 ng/ml 白血病抑制因子，50 μg /ml维他命C，3 μM CHIR99021和1 μM PD0325901。
2.根据权利要求1所述简单、快速的体细胞化学重编程方法，其特征在于，所述体细胞为小鼠胚胎成纤维细胞。
3. 根据权利要求1所述简单、快速的体细胞化学重编程方法，其特征在于，步骤S3中额外添加500 μM VPA。
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