CN111979194A - 重编程细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域。更具体地，本发明涉及重编程细胞的方法，所述方法通过使用小分子混合物处理细胞群体，将其诱导为多谱系引发状态，此状态的细胞群体可被直接诱导为特定细胞类型。

Description

重编程细胞的方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域。更具体地，本发明涉及重编程细胞的方法，所述方法通过使用小分子混合物处理细胞群体，将其诱导为多谱系引发状态，此状态的细胞群体可被直接诱导为特定细胞类型。
发明背景
体细胞可通过核转移到卵母细胞、转录因子的递送或用化学物质混合物(cocktail)处理而被重编程成多能性(Gurdon，1962；Takahashi和Yamanaka，2006；Hou等，2013)。这些体细胞重编程技术由于提供无限的细胞来源而在再生医学中具有很大的前景。与其他两种策略相比，化学重编程更容易，并且对于未来的应用可能更安全，因为它是非整合的、非转基因的、且易于标准化和时间调节，具有较低的致瘤性(Hou等，2013)。
近几年来，人们研究了细胞动力学和化学重编程的分子机制。例如，本发明人发现了一种类似胚外内胚层(XEN)的状态，它将化学重编程与不同体细胞类型的CiPSCs联系起来(Zhao等，2015；Ye等，2016)。此外，动态的早期胚胎样程序对于XEN样状态向多能状态的转变至关重要(Zhao等，2018)，并且通过额外的化学增效剂(例如溴脱氧尿苷、维甲酸激动剂、Dolt1L抑制剂和糖原合酶激酶3抑制剂)，或甚至可以用化学确定的培养基诱导，使CiPSC诱导的化学重编程效率得到极大提高(Long等，2015；Zhao等人，2015；Li等，2017b；Cao等，2018年)。
然而，目前化学重编程策略效率不高且耗时较长，阻碍了其在生物医学领域的实际应用情况。因此，本领域仍需要更为精确以及便捷的化学重编程方法。
发明简述
在一方面，本发明涉及一种重编程细胞的方法，所述方法包括将细胞群体暴露于引发重编程小分子混合物一段时间，由此获得引发的细胞群体，
其中所述引发重编程小分子混合物至少包括GSK-3α/β抑制剂、TGFβR-1/ALK5抑制剂、和cAMP激活剂，
其中所述一段时间不多于大约11天。
在一方面，本发明涉及将起始细胞重编程为靶细胞的方法，所述方法包括第一阶段和第二阶段，
其中所述第一阶段包括将起始细胞群体暴露于引发重编程小分子混合物一段时间从而获得引发的细胞群体，所述引发重编程小分子混合物至少包括GSK-3α/β抑制剂、TGFβR-1/ALK5抑制剂、和cAMP激活剂，所述一段时间不多于11天，
其中所述第二阶段包括将第一阶段得到的引发的细胞群体暴露于靶细胞重编程小分子混合物，由此获得靶细胞群体。
附图简述
图1.化学混合物激活多个谱系的转录因子的内源表达。A.化学重编程期间RNA-seq分析策略的示意图。B.化学重编程早期基因表达的可变模式。C.大量RNA谱中簇1/2、簇3/4/5、簇6/7/8/9和簇10的代表性基因。D.在化学重编程的前8天，与不同胚胎层相关的活化内源转录因子。E.3种不同XEN重编程混合物的活化转录因子的数量。F.对前8天上调的活化基因的GO分析(簇3、4和5中的基因分组)
图2.化学混合物激活多个谱系的转录因子的内源表达。A.在大量RNA谱中的簇1/2、簇6/7/8/9和簇10的代表性GO分析。B.VC6FAE介导的化学重编程早期基因表达的可变模式。C.C6F5UE介导的化学重编程早期基因表达的可变模式。D.在多种细胞中的细胞引发。E.NDF和TTF中活化的内源转录因子的GD分析。
图3.在CaMP之后衍生出多种其他细胞类型。A.通过免疫荧光检测诱导的神经细胞的代表性基因。比例尺，100微米。B.通过RT-qPCR检测的不同条件下神经元基因的相对表达。C.用CaMP改善神经元诱导。D.通过免疫荧光检测诱导的骨骼肌细胞的代表性基因。比例尺，100微米。E.通过RT-qPCR检测的不同条件下骨骼肌基因的相对表达。F.用CaMP改善骨骼肌细胞诱导。G.具有或不具有CaMP步骤而通过C6FI诱导的神经元特异性基因的RNA-seq谱。在不同阵列上使用分位数标准化，然后用Z-Score对每个基因的表达谱进行标准化。H.具有或不具有CaMP步骤而通过C6FS诱导的骨骼肌特异性基因的RNA-seq谱。I.骨骼肌、神经元重编程过程的PCA投射。J.从引发的细胞诱导功能性细胞的示意图。
图4.在CaMP之后衍生出多种其他细胞类型。A.不同预处理诱导的神经元数量。B.从C6FI中去除化学物质对神经元诱导的影响。C.Sall4和Gata4敲低对神经元的影响。D.通过不同预处理诱导的骨骼肌细胞的数量。E.从C6FS中去除化学物质对骨骼肌细胞诱导的影响。F.Sall4和Gata4敲低对骨骼肌诱导的影响。G.Gata4敲低后Gata4表达的RT-qPCR。H.Sall4敲低后Sall4表达的RT-qPCR。
图5.化学混合物对内源转录因子的随机激活。A.重编程过程中所有610个单体细胞的t-SNE投射。B.t-SNE投射中激活的谱系特异性基因的实例。C.前5天中活化和失活基因数量的统计。D.第1-5天期间活化的转录因子之间的相关性。E.转录因子对的相关系数的统计。F.在t-SNE投射中XEN主基因(Sox17、Sall4、Gata4)和MEF主基因(Osr1、Prrx1、Twist2)的表达。
图6.化学混合物对内源转录因子的随机激活。A.早期化学重编程单细胞RNA-seq时间点的示意图。B.单细胞测序原始数据的质量控制。C.在每个时间点检测到的基因数量。D.在每个时间点检测到的细胞数。E.重编程过程中所有610个单体细胞的PCA投射。F.前6天每个细胞中活化的转录因子的数量。颜色表示不同的时间点。G.第20天早期激活的转录因子的表达水平。
图7.Sox17激活细胞中渐进细胞命运专化和转换。A.在t-SNE投射中的MEF和XEN性质分析。B.被困分支和成功分支之间差异表达的基因。C.通过免疫染色揭示的Sox17和其他XEN主基因之间的子集关系。比例尺，100微米。D.Sox17敲低后XEN基因的相对表达。E.用数学模型模拟XEN基因调控网络的稳定状态和不稳定状态。F.XEN和MEF的转录因子相关网络。G.Sox17过表达时MEF基因的相对表达。H.MEF基因敲低后XEN基因的相对表达。OPT＝Osr1、Prrx1和Twist2。
图8.Sox17激活细胞中渐进细胞命运专化和转变。A.具有聚类信息的单个细胞的t-SNE图谱。B.t-SNE图谱中每个簇的基因表达谱。C.MEF和XEN性质的动态变化。D.被困和成功分支的细胞通路示意图。E.细胞传代后经过被困和成功分支产生的XEN群落数。F.XEN主基因的表达水平随XEN性质增加。G.随着Sox17过表达XEN基因的相对表达。H.不同起始Sox17表达的模拟基因表达。I.随着MEF基因敲低成纤维细胞基因的相对表达。OPT＝Osr1、Prrx1和Twist2。
图9.化学增效剂有利于重编程的不同阶段。A.在不同时间点CH55和VPA对XEN基因的影响。将具有额外CH55或VPA的C6FAE条件与仅具有C6FAE条件进行比较。红色表示改善。B.在不同时间点CH55和VPA对其他谱系基因和其他谱系的相同性的影响。C.用CH55处理不同时间后XEN基因的相对表达。D.用VPA处理不同时间后XEN基因的相对表达。E.用CH55/VPA处理不同时间后XEN群落的相对数目。
图10.化学增效剂有利于重编程的不同阶段。A.模糊和平滑群落的形态学和基因表达。比例尺，100微米。B.不同化学组合中总群落数和XEN样群落数。C.模糊和平滑群落中XEN主基因的相对表达。D.模糊和平滑群落中MEF主基因的相对表达。E.用CH55处理不同时间后XEN基因的相对表达。F.用VPA处理不同时间后XEN基因的相对表达。G.用CH55/VPA处理不同时间后XEN基因的相对变化。
图11.核心重编程化学品(FC6)通过不同的机制同时启动细胞塑化和XEN细胞专化。A.在XEN重编程的前4天期间相对于MEF由CHIR99021/Forskolin/616452激活的转录因子的数目。基因列表限于150个由C6FAE激活的转录因子。B.在XEN重编程的前8天期间相对于MEF由CHIR99021/Forskolin/616452激活的转录因子的数目。基因列表限于150个由C6FAE激活的转录因子。C.在XEN重编程的前4天期间相对于MEF由CHIR99021/Forskolin/616452调节的转录因子。D.在XEN重编程的前8天期间相对MEF由CHIR99021/Forskolin/616452调节的转录因子。E.从第4天去除CHIR99021/Forskolin/616452后第12天的XEN主基因的相对表达。F.从第4天去除616452后第12天Sall4和Gata4的免疫染色。比例尺，100μm。G.从第4天去除CHIR99021/Forskolin/616452后第12天Gata4阳性群落的定量。H.从第6天去除CHIR99021和Forskolin后第12天对Sall4和Gata4的免疫染色。比例尺，100μm。I.从第6天去除CHIR99021/Forskolin/616452后第12天Sall4阳性群落的定量。J.CHIR99021/Forskolin/616452在调节XEN主基因中的作用的示意图。
图12.核心重编程化学品(FC6)通过不同的机制同时启动细胞塑化和XEN细胞专化。A.CHIR99021/Forskolin/616452调控的转录因子在前4天相对于C6FAE调控的转录因子(红点，上调转录因子；蓝点，下调转录因子；箭头，促进；水平线，抑制。更深的线：更强的调节)。通过比较完整混合物与去除单分子的混合物来检测上调和下调的基因。B.从第0天除去CHIR99021/Forskolin/616452后第12天的XEN主基因的相对表达。C.随着Sall4敲低XEN基因的相对表达。D.随着Sall4表达XEN基因的相对表达。E.Sall4和Gata4在翻译水平上的关系。比例尺，100微米。F.从第8天除去CHIR99021/Forskolin/616452后第12天的XEN主基因的相对表达。
图13.多谱系引发阶段模式图
发明详述
一.重编程细胞的方法
本发明人惊奇地发现，只需要将分化的细胞群体例如成纤维细胞用特定的引发重编程小分子混合物进行短暂的处理，就可以将所述细胞群体诱导为一种称为多谱系引发的状态，该状态下的细胞群体通过进一步的靶细胞类型特异性的定向诱导，可以直接重编程为所需的靶细胞类型。此种重编程细胞的方法不需要经过常规的需要更长时间(例如额外的8-20天)的多能干细胞诱导或所谓的XEN样细胞诱导，从而大大节省了细胞重编程的时间及成本。此外，通过本发明的分阶段的化学诱导重编程方法，相比于常规的化学重编程方法(例如全程仅使用一种重编程小分子混合物)，可以显著提高将起始细胞重编程为靶细胞的效率。
本发明涉及一种重编程细胞的方法，所述方法包括将细胞群体暴露于引发重编程小分子混合物一段时间，由此获得引发的细胞群体，其中所述一段时间不多于大约11天。
在一些实施方案中，所述一段时间不多于大约10天、不多于大约9天、不多于大约8天、不多于大约7天、不多于大约6天、不多于大约5天、不多于大约4天、不多于大约3天、不多于大约2天或不多于大约1天。在一些实施方案中，所述一段时间为大约1-11天，例如大约2-10天、大约3-9天、大约4-8天，例如大约1天、大约2天、大约3天、大约4天、大约5天、大约6天、大约7天、大约8天、大约9天、大约10天、大约11天。在一些优选实施方案中，所述一段时间为大约4天。
在一些实施方案中，其中所述引发重编程小分子混合物至少包括GSK-3α/β抑制剂、TGFβR-1/ALK5抑制剂、和cAMP激活剂。
所述GSK-3α/β抑制剂的实例包括但不限于CHIR99021或其结构类似物、BIO或其结构类似物、IM-12或其结构类似物等。在一些优选实施方案中，所述GSK-3α/β抑制剂是CHIR99021或其结构类似物。
所述cAMP激活剂的实例包括但不限于Forskolin或其结构类似物、IBMX或其结构类似物、Dibutyryl-cAMP或其结构类似物等。在一些优选实施方案中，所述cAMP激活剂是Forskolin或其结构类似物。
所述TGFβR-1/ALK5抑制剂的实例包括但不限于616452或其结构类似物、SB431542或其结构类似物、LY364947或其结构类似物。在一些优选实施方案中，所述TGFβR-1/ALK5抑制剂是616452或其结构类似物等。
在一些实施方案中，所述方法不包括将所述细胞群体暴露于外源转录因子的步骤。例如，所述方法不包括将所述细胞群体暴露于细胞重编程相关的外源转录因子，例如Oct4、Sox2、Klf4和C-Myc等。也就是说，本发明的重编程细胞的方法是化学诱导(利用小分子化合物)的重编程方法。
除非明确地限制为相反情况，否则“细胞”包括任何体细胞、胚胎干(ES)细胞、成体干细胞、器官特异性干细胞、核转移(NT)单位和干样细胞。细胞能够从任何器官或组织中获得。细胞能够是人或其它动物的。例如，细胞能够是小鼠的、豚鼠的、大鼠的、牛的、马的、猪的、绵羊的、山羊的等。细胞也能够来自非人灵长类。
在一个实施方案中，所述细胞群体中的细胞为分化的细胞。在一个实施方案中，所述细胞群体中的细胞为中胚层来源细胞诸如心脏细胞，外胚层来源细胞诸如神经细胞，内胚层来源细胞如结肠细胞。在一个实施方案中，所述细胞为神经元细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、间质细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、神经细胞、造血细胞、胰岛细胞或体内几乎任何细胞。在一个实施方案中，所述细胞为成纤维细胞。
“分化”指的是细胞在胚胎发育期间结构和功能特化的过程。在多细胞生物体的发育期间，不同的细胞和组织获得不同的基因表达模式，即每种细胞类型具有独特的基因表达模式，通常认为该模式在细胞分化后会变成“固定的”且不变的。“分化的细胞”指的是同一来源的细胞逐渐产生出形态结构、功能特征各不相同的细胞类群。
在本文中，“引发的细胞群体”与“多谱系引发的细胞群体”可互换使用，意指该细胞群体中具有多种细胞类型，其各自具有发展成特定细胞类型的可能性。这样的引发的细胞群体具有不同于起始的分化细胞群体的基因转录模式，例如，在引发的细胞群体中许多谱系相关的转录因子(TF)被上调，并且内源性发育相关转录因子随机表达。通过小分子化合物诱导的“多谱系引发”也称作“化学激活的多谱系引发(CaMP)”。
在一个实施方案中，所述引发重编程小分子混合物进一步包括RARα激活剂和/或DOT1L抑制剂。
所述RARα激活剂的实例包括但不限于AM580或其结构类似物、Tamibarotene或其结构类似物、TTNPB或其结构类似物等。在一些优选实施方案中，所述RARα激活剂是AM580或其结构类似物。
所述DOT1L抑制剂的实例包括但不限于EPZ00477或其结构类似物、SGC0496或其结构类似物、EPZ5676或其结构类似物等。在一些优选实施方案中，所述DOT1L抑制剂是EPZ00477或其结构类似物。
在一个实施方案中，所述引发重编程小分子混合物进一步包括HDAC抑制剂、组蛋白赖氨酸甲基转移酶(HMTase)抑制剂(例如UNC0638或其结构类似物、BIX01294或其结构类似物、UNC0642或其结构类似物)，和/或RAR-α/β激活剂(例如CH55或其结构类似物)。
所述HDAC抑制剂包括但不限于丙戊酸(VPA)或其结构类似物、Trichostatin A(TSA)或其结构类似物、Vorinostat(SAHA)或其结构类似物等。在一些优选实施方案中，所述HDAC抑制剂是丙戊酸(VPA)或其结构类似物。
在一个实施方案中，所述引发重编程小分子混合物由GSK-3α/β抑制剂、TGFβR-1/ALK5抑制剂、和cAMP激活剂组成。在一个实施方案中，所述引发重编程小分子混合物由CHIR99021或其结构类似物、Forskolin或其结构类似物和616452或其结构类似物组成。在一个具体实施方案中，所述引发重编程小分子混合物由CHIR99021、Forskolin和616452组成。
在一个实施方案中，所述引发重编程小分子混合物由GSK-3α/β抑制剂、TGFβR-1/ALK5抑制剂、cAMP激活剂、RARα激活剂和DOT1L抑制剂组成。在一个实施方案中，所述引发重编程小分子混合物由CHIR99021或其结构类似物、Forskolin或其结构类似物、616452或其结构类似物、AM580或其结构类似物和EPZ00477或其结构类似物组成。在一个具体实施方案中，所述引发重编程小分子混合物由CHIR99021、Forskolin、616452、AM580和EPZ00477组成。
在一个具体实施方案中，所述引发重编程小分子混合物由VPA、CHIR99021、Forskolin、616452、AM580和EPZ00477组成。在一个具体实施方案中，所述引发重编程小分子混合物由CHIR99021、Forskolin、616452、EPZ00477、UNC0638和CH55组成。在一个具体实施方案中，所述引发重编程小分子混合物由CHIR99021、Forskolin、616452和CH55组成。
在一个实施方案中，CHIR99021的使用浓度为大约1μM-大约100μM，例如大约1μM、大约5μM、大约10μM、大约15μM、大约20μM、大约25μM、大约30μM、大约35μM、大约40μM、大约45μM、大约50μM、大约60μM、大约70μM、大约80μM、大约90μM、大约100μM。优选地，CHIR99021的使用浓度为大约20μM。
在一个实施方案中，616452的使用浓度为大约1μM-50μM之间，例如大约1μM、大约5μM、大约10μM、大约15μM、大约20μM、大约25μM、大约30μM、大约35μM、大约40μM、大约45μM、大约50μM。优选地，616452的使用浓度为大约10μM。
在一个实施方案中，Forskolin的使用浓度为大约10μM-大约200μM，例如大约10μM、大约20μM、大约30μM、大约40μM、大约50μM、大约60μM、大约70μM、大约80μM、大约90μM、大约100μM、大约125μM、大约150μM、大约175μM、大约200μM。优选地，Forskolin的使用浓度为大约50μM。
在一个实施方案中，AM580的使用浓度为大约0.01μM-大约1μM，例如大约0.01μM、大约0.02μM、大约0.03μM、大约0.04μM、大约0.05μM、大约0.06μM、大约0.07μM、大约0.08μM、大约0.09μM、大约0.1μM、大约0.2μM、大约0.3μM、大约0.4μM、大约0.5μM、大约0.6μM、大约0.7μM、大约0.8μM、大约0.9μM、大约1μM。优选地，AM580的使用浓度为大约0.05μM。
在一个实施方案中，EPZ004777的使用浓度为大约1μM-大约20μM，例如大约1μM、大约2μM、大约3μM、大约4μM、大约5μM、大约6μM、大约7μM、大约8μM、大约9μM、大约10μM、大约12.5μM、大约15μM、大约17.5μM、大约20μM。优选地，EPZ004777的使用浓度为大约5μM。
在一个实施方案中，VPA的浓度为大约0.1mM-大约0.9mM，例如大约0.1mM、大约0.2mM、大约0.3mM、大约0.4mM、大约0.5mM、大约0.6mM、大约0.7mM、大约0.8mM或大约0.9mM。优选地，VPA的浓度为大约0.5mM。
在一个实施方案中，CH55的浓度为大约0.2μM、大约0.5μM、大约1μM、大约2μM、大约5μM、或大约0.5-大约2μM之间。优选地，CH55的浓度为大约1μM。
在一个实施方案中，UNC0638的浓度为大约0.1μM、大约0.2μM、大约0.5μM、大约1μM、大约2μM、或大约0.2-大约2μM之间。优选地，UNC0638的浓度为大约0.5μM。
在另一方面，本发明还涵盖了通过本发明的重编程细胞的方法获得的引发的细胞及其用途。
二.将起始细胞重编程为靶细胞的方法
本发明涉及将起始细胞重编程为靶细胞的方法，所述方法包括第一阶段和第二阶段，
其中所述第一阶段包括将起始细胞群体暴露于引发重编程小分子混合物一段时间从而获得引发的细胞群体，所述一段时间不多于11天，
其中所述第二阶段包括将第一阶段得到的引发的细胞群体暴露于靶细胞重编程小分子混合物，由此获得靶细胞群体。
在一些实施方案中，第一阶段的所述一段时间不多于大约10天、不多于大约9天、不多于大约8天、不多于大约7天、不多于大约6天、不多于大约5天、不多于大约4天、不多于大约3天、不多于大约2天或不多于大约1天。在一些实施方案中，第一阶段的所述一段时间为大约1-11天，例如大约2-10天、大约3-9天、大约4-8天，例如大约1天、大约2天、大约3天、大约4天、大约5天、大约6天、大约7天、大约8天、大约9天、大约10天、大约11天。在一些优选实施方案中，第一阶段的所述一段时间为大约4天。
在一些实施方案中，其中所述引发重编程小分子混合物至少包括GSK-3α/β抑制剂、TGFβR-1/ALK5抑制剂、和cAMP激活剂。
所述GSK-3α/β抑制剂的实例包括但不限于CHIR99021或其结构类似物、BIO或其结构类似物、IM-12或其结构类似物等。在一些优选实施方案中，所述GSK-3α/β抑制剂是CHIR99021或其结构类似物。
所述cAMP激活剂的实例包括但不限于Forskolin或其结构类似物、IBMX或其结构类似物、Dibutyryl-cAMP或其结构类似物等。在一些优选实施方案中，所述cAMP激活剂是Forskolin或其结构类似物。
所述TGFβR-1/ALK5抑制剂的实例包括但不限于616452或其结构类似物、SB431542或其结构类似物、LY364947或其结构类似物。在一些优选实施方案中，所述TGFβR-1/ALK5抑制剂是616452或其结构类似物等。
在一些实施方案中，所述方法不包括将所述细胞群体暴露于外源转录因子的步骤。例如，所述方法不包括将所述细胞群体暴露于细胞重编程相关的外源转录因子，例如Oct4、Sox2、Klf4和C-Myc等。也就是说，本发明的重编程细胞的方法是化学诱导(利用小分子化合物)的重编程方法。
在一个实施方案中，所述引发重编程小分子混合物进一步包括RARα激活剂和/或DOT1L抑制剂。
所述RARα激活剂的实例包括但不限于AM580或其结构类似物、Tamibarotene或其结构类似物、TTNPB或其结构类似物等。在一些优选实施方案中，所述RARα激活剂是AM580或其结构类似物。
所述DOT1L抑制剂的实例包括但不限于EPZ00477或其结构类似物、SGC0496或其结构类似物、EPZ5676或其结构类似物等。在一些优选实施方案中，所述DOT1L抑制剂是EPZ00477或其结构类似物。
在一个实施方案中，所述引发重编程小分子混合物进一步包括HDAC抑制剂、UNC0638或其结构类似物或功能类似物，和/或CH55或其结构类似物或功能类似物。
所述HDAC抑制剂包括但不限于丙戊酸(VPA)或其结构类似物、Trichostatin A(TSA)或其结构类似物、Vorinostat(SAHA)或其结构类似物等。在一些优选实施方案中，所述HDAC抑制剂是丙戊酸(VPA)或其结构类似物。
在一个实施方案中，所述引发重编程小分子混合物由GSK-3α/β抑制剂、TGFβR-1/ALK5抑制剂、和cAMP激活剂组成。在一个实施方案中，所述引发重编程小分子混合物由CHIR99021或其结构类似物、Forskolin或其结构类似物和616452或其结构类似物组成。在一个具体实施方案中，所述引发重编程小分子混合物由CHIR99021、Forskolin和616452组成。
在一个实施方案中，所述引发重编程小分子混合物由GSK-3α/β抑制剂、TGFβR-1/ALK5抑制剂、cAMP激活剂、RARα激活剂和DOT1L抑制剂组成。在一个实施方案中，所述引发重编程小分子混合物由CHIR99021或其结构类似物、Forskolin或其结构类似物、616452或其结构类似物、AM580或其结构类似物和EPZ00477或其结构类似物组成。在一个具体实施方案中，所述引发重编程小分子混合物由CHIR99021、Forskolin、616452、AM580和EPZ00477组成。
在一个具体实施方案中，所述引发重编程小分子混合物由VPA、CHIR99021、Forskolin、616452、AM580和EPZ00477组成。在一个具体实施方案中，所述引发重编程小分子混合物由CHIR99021、Forskolin、616452、EPZ00477、UNC0638和CH55组成。在一个具体实施方案中，所述引发重编程小分子混合物由CHIR99021、Forskolin、616452和CH55组成。
在一个实施方案中，CHIR99021的使用浓度为大约1μM-大约100μM，例如大约1μM、大约5μM、大约10μM、大约15μM、大约20μM、大约25μM、大约30μM、大约35μM、大约40μM、大约45μM、大约50μM、大约60μM、大约70μM、大约80μM、大约90μM、大约100μM。优选地，CHIR99021的使用浓度为大约20μM。
在一个实施方案中，616452的使用浓度为大约1μM-50μM之间，例如大约1μM、大约5μM、大约10μM、大约15μM、大约20μM、大约25μM、大约30μM、大约35μM、大约40μM、大约45μM、大约50μM。优选地，616452的使用浓度为大约10μM。
在一个实施方案中，Forskolin的使用浓度为大约10μM-大约200μM，例如大约10μM、大约20μM、大约30μM、大约40μM、大约50μM、大约60μM、大约70μM、大约80μM、大约90μM、大约100μM、大约125μM、大约150μM、大约175μM、大约200μM。优选地，Forskolin的使用浓度为大约50μM。
在一个实施方案中，AM580的使用浓度为大约0.01μM-大约1μM，例如大约0.01μM、大约0.02μM、大约0.03μM、大约0.04μM、大约0.05μM、大约0.06μM、大约0.07μM、大约0.08μM、大约0.09μM、大约0.1μM、大约0.2μM、大约0.3μM、大约0.4μM、大约0.5μM、大约0.6μM、大约0.7μM、大约0.8μM、大约0.9μM、大约1μM。优选地，AM580的使用浓度为大约0.05μM。
在一个实施方案中，EPZ004777的使用浓度为大约1μM-大约20μM，例如大约1μM、大约2μM、大约3μM、大约4μM、大约5μM、大约6μM、大约7μM、大约8μM、大约9μM、大约10μM、大约12.5μM、大约15μM、大约17.5μM、大约20μM。优选地，EPZ004777的使用浓度为大约5μM。
在一个实施方案中，VPA的使用浓度为大约0.1mM-大约0.9mM，例如大约0.1mM、大约0.2mM、大约0.3mM、大约0.4mM、大约0.5mM、大约0.6mM、大约0.7mM、大约0.8mM或大约0.9mM。优选地，VPA的使用浓度为大约0.5mM。
在一个实施方案中，CH55的浓度为大约0.2μM、大约0.5μM、大约1μM、大约2μM、大约5μM、或大约0.5-大约2μM之间。优选地，CH55的浓度为大约1μM。
在一个实施方案中，UNC0638的浓度为大约0.1μM、大约0.2μM、大约0.5μM、大约1μM、大约2μM、或大约0.2-大约2μM之间。优选地，UNC0638的浓度为大约0.5μM。
在一个实施方案中，所述起始细胞为分化的细胞。在一个实施方案中，所述起始细胞可以为中胚层来源细胞诸如心脏细胞，外胚层来源细胞诸如神经细胞，或者内胚层来源细胞如结肠细胞。在一个实施方案中，所述起始细胞可以为神经元细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、间质细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、神经细胞、造血细胞、胰岛细胞或体内几乎任何细胞。在一个实施方案中，所述起始细胞为成纤维细胞。
在一个实施方案中，所述靶细胞与所述起始细胞的细胞类型不同。在一个实施方案中，所述靶细胞为中胚层来源细胞诸如心脏细胞，外胚层来源细胞诸如神经细胞，内胚层来源细胞如结肠细胞。在一个实施方案中，所述靶细胞为神经元细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、间质细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、神经细胞、造血细胞、胰岛细胞或体内几乎任何细胞。
如本文所用，“靶细胞重编程小分子混合物”是指能够将具有多能性的细胞定向诱导成特定的细胞类型的小分子混合物。本领域已知多种可以将例如CiPSC、XEN样细胞定向诱导成特定细胞类型例如神经元、心肌细胞、骨骼肌细胞等的小分子混合物。这些小分子混合物都可应用于或经调整可应用于本发明。
在一些实施方案中，所述“靶细胞重编程小分子混合物”的小分子种类与所述“引发重编程小分子混合物”相同或不同。在一些实施方案中，所述“靶细胞重编程小分子混合物”中一或多种小分子的量不同于所述“引发重编程小分子混合物”相应小分子的量。
在一些实施方案中，所述靶细胞重编程小分子混合物至少包括GSK-3α/β抑制剂、TGFβR-1/ALK5抑制剂、和cAMP激活剂。在一些具体实施方案中，所述靶细胞重编程小分子混合物至少包括CHIR99021或其结构类似物、Forskolin或其结构类似物、和616452或其结构类似物。在一个实施方案中，所述靶细胞重编程小分子混合物进一步包括HDAC抑制剂。所述HDAC抑制剂包括但不限于丙戊酸(VPA)或其结构类似物、Trichostatin A(TSA)或其结构类似物、Vorinostat(SAHA)或其结构类似物等。在一些优选实施方案中，所述HDAC抑制剂是丙戊酸(VPA)或其结构类似物。在一些优选实施方案中，所述HDAC抑制剂是丙戊酸(VPA)或其结构类似物。在一个实施方案中，所述靶细胞重编程小分子混合物进一步包括成体神经发生的合成促进剂，例如ISX9或其结构类似物。在一个实施方案中，所述靶细胞重编程小分子混合物进一步包含SB431542或其结构类似物。
在一个实施方案中，所述第二阶段中CHIR99021的使用浓度为大约1μM-大约100μM，例如大约1μM、大约5μM、大约10μM、大约15μM、大约20μM、大约25μM、大约30μM、大约35μM、大约40μM、大约45μM、大约50μM、大约60μM、大约70μM、大约80μM、大约90μM、大约100μM。优选地，CHIR99021的使用浓度为大约20μM。
在一个实施方案中，所述第二阶段中616452的使用浓度为大约1μM-50μM之间，例如大约1μM、大约5μM、大约10μM、大约15μM、大约20μM、大约25μM、大约30μM、大约35μM、大约40μM、大约45μM、大约50μM。优选地，616452的使用浓度为大约10μM。
在一个实施方案中，所述第二阶段中Forskolin的使用浓度为大约10μM-大约200μM，例如大约10μM、大约20μM、大约30μM、大约40μM、大约50μM、大约60μM、大约70μM、大约80μM、大约90μM、大约100μM、大约125μM、大约150μM、大约175μM、大约200μM。优选地，Forskolin的使用浓度为大约50μM。
在一个实施方案中，所述第二阶段中VPA的使用浓度为大约0.1mM-大约1mM，例如大约0.1mM、大约0.2mM、大约0.3mM、大约0.4mM、大约0.5mM、大约0.6mM、大约0.7mM、大约0.8mM、大约0.9mM或大约1mM。优选地，VPA的使用浓度为大约0.5mM。
在一个实施方案中，所述第二阶段中SB431542的使用浓度为大约1μM-大约5μM，例如大约1μM、大约2μM、大约3μM、大约4μM、大约5μM。优选地，SB431542的浓度为3μM。
在一个实施方案中，所述第二阶段中ISX-9的使用浓度为大约1μM-大约20μM，例如大约1μM、大约2.5μM、大约5μM、大约7.5μM、大约10μM、大约12.5μM、大约15μM、大约17.51μM、大约20μM。优选地，ISX-9的浓度为10μM。
不受任何理论限制，据认为本发明的方法第一阶段所产生的经引发的细胞群体已经包含了多种不同的细胞类型，其各自具有发展成不同特定细胞类型的潜能或细胞命运。因此，在第二阶段，经过靶细胞重编程小分子混合物的定向处理，可以使得具有所需靶细胞命运的细胞富集并扩增，从而获得所需的靶细胞群体。
在一个实施方式中，所述靶细胞为神经元细胞，且所述靶细胞重编程小分子混合物包含CHIR99021、Forskolin、616452和ISX9。在一个实施方案中，CHIR99021使用浓度为20μM、616452使用浓度为10μM、Forskolin使用浓度为50μM和ISX9使用浓度为10μM。
在一个实施方式中，所述靶细胞为骨骼肌细胞，且所述靶细胞重编程小分子混合物包含CHIR99021、Forskolin、616452和SB431542。在一个实施方案中，CHIR99021使用浓度为20μM、616452使用浓度为10μM、Forskolin使用浓度为50μM和SB431542使用浓度为3μM。
在一个实施方案中，第二阶段中，所述引发的细胞暴露于所述靶细胞重编程小分子混合物一段时间，所述一段时间为不多于12天、不多于11天、不多于10天、不多于9天、不多于8天或为约8-12天。
在另一方面，本发明还涵盖了通过本发明的方法获得的靶细胞及其用途。
三.组合物及培养基
本发明涉及一种用于制备“多谱系引发的细胞群体”的引发重编程组合物，所述组合物包括引发重编程小分子混合物，所述引发重编程小分子混合物如上文所定义。
本发明涉及一种用于制备“多谱系引发的细胞群体”的引发重编程培养基，所述培养基包括引发重编程小分子混合物，所述引发重编程小分子混合物如上文所定义。
在一个实施方案中，所述引发重编程培养基中CHIR99021的浓度为大约1μM-大约100μM，例如大约1μM、大约5μM、大约10μM、大约15μM、大约20μM、大约25μM、大约30μM、大约35μM、大约40μM、大约45μM、大约50μM、大约60μM、大约70μM、大约80μM、大约90μM、大约100μM。优选地，CHIR99021的浓度为大约20μM。
在一个实施方案中，所述引发重编程培养基中616452的浓度为大约1μM-50μM之间，例如大约1μM、大约5μM、大约10μM、大约15μM、大约20μM、大约25μM、大约30μM、大约35μM、大约40μM、大约45μM、大约50μM。优选地，616452的浓度为大约10μM。
在一个实施方案中，所述引发重编程培养基中Forskolin的浓度为大约10μM-大约200μM，例如大约10μM、大约20μM、大约30μM、大约40μM、大约50μM、大约60μM、大约70μM、大约80μM、大约90μM、大约100μM、大约125μM、大约150μM、大约175μM、大约200μM。优选地，Forskolin的浓度为大约50μM。
在一个实施方案中，所述引发重编程培养基中AM580的浓度为大约0.01μM-大约1μM，例如大约0.01μM、大约0.02μM、大约0.03μM、大约0.04μM、大约0.05μM、大约0.06μM、大约0.07μM、大约0.08μM、大约0.09μM、大约0.1μM、大约0.2μM、大约0.3μM、大约0.4μM、大约0.5μM、大约0.6μM、大约0.7μM、大约0.8μM、大约0.9μM、大约1μM。优选地，AM580的浓度为大约0.05μM。
在一个实施方案中，所述引发重编程培养基中EPZ004777的浓度为大约1μM-大约20μM，例如大约1μM、大约2μM、大约3μM、大约4μM、大约5μM、大约6μM、大约7μM、大约8μM、大约9μM、大约10μM、大约12.5μM、大约15μM、大约17.5μM、大约20μM。优选地，EPZ004777的浓度为大约5μM。
在一个实施方案中，所述引发重编程培养基中VPA的浓度为大约0.1mM-大约0.9mM，例如大约0.1mM、大约0.2mM、大约0.3mM、大约0.4mM、大约0.5mM、大约0.6mM、大约0.7mM、大约0.8mM或大约0.9mM。优选地，VPA的浓度为大约0.5mM。
在一个实施方案中，CH55的浓度为大约0.2μM、大约0.5μM、大约1μM、大约2μM、大约5μM、或大约0.5-大约2μM之间。优选地，CH55的浓度为大约1μM。
在一个实施方案中，UNC0638的浓度为大约0.1μM、大约0.2μM、大约0.5μM、大约1μM、大约2μM、或大约0.2-大约2μM之间。优选地，UNC0638的浓度为大约0.5μM。
在一个实施方案中，所述引发重编程培养基包含0.5mM丙戊酸、20μM CHIR99021、10μM 616452、50μM Forskolin、0.05μM AM580和5μM EPZ004777。或者，所述引发重编程培养基包含20μM CHIR99021、10μM 616452、50μM Forskolin、0.05μM AM580和5μMEPZ004777。或者，所述引发重编程培养基包含20μM CHIR99021、10μM 616452、50μMForskolin。
在一个实施方案中，所述引发重编程培养基为补充了KnockOut血清替代物(KSR)、FBS、GlutaMAX、NEAA(Non-Essential Amino Acid)、2-巯基乙醇、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和所述引发重编程小分子混合物的KnockOut DMEM。在一些实施方案中，所述引发重编程培养基还包含抗生素例如青霉素和/或链霉素。
在一个具体实施方案中，所述引发重编程培养基为补充了10％KnockOut血清替代物(KSR)、10％FBS、1％GlutaMAX、1％NEAA、0.055mM 2-巯基乙醇、1％青霉素-链霉素、50ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和所述引发重编程小分子混合物的KnockOut DMEM。
本发明涉及一种用于从“多谱系引发的细胞群体”制备靶细胞群体的靶细胞重编程组合物，所述组合物包含靶细胞重编程小分子混合物。所述“靶细胞重编程小分子混合物”如上所定义。
本发明涉及一种用于从“多谱系引发的细胞群体”制备靶细胞群体的靶细胞重编程培养基，其包含靶细胞重编程小分子混合物。所述“靶细胞重编程小分子混合物”如上所定义。靶细胞重编程培养基还可以另外包含适合于靶细胞生长或者是靶细胞生长必需的成分。例如，本发明的靶细胞重编程培养基可以衍生自本领域已知的用于特定靶细胞培养的培养基。
在一些实施方案中，所述“靶细胞重编程小分子混合物”的成分与所述“引发重编程小分子混合物”相同或不同。在一些实施方案中，所述“靶细胞重编程小分子混合物”中一或多种小分子的量不同于所述“引发重编程小分子混合物”相应小分子的量。
在一个实施方案中，所述靶细胞重编程培养基中CHIR99021的浓度为大约1μM-大约100μM，例如大约1μM、大约5μM、大约10μM、大约15μM、大约20μM、大约25μM、大约30μM、大约35μM、大约40μM、大约45μM、大约50μM、大约60μM、大约70μM、大约80μM、大约90μM、大约100μM。优选地，CHIR99021的浓度为大约20μM。
在一个实施方案中，所述靶细胞重编程培养基中616452的浓度为大约1μM-50μM之间，例如大约1μM、大约5μM、大约10μM、大约15μM、大约20μM、大约25μM、大约30μM、大约35μM、大约40μM、大约45μM、大约50μM。优选地，616452的浓度为大约10μM。
在一个实施方案中，所述靶细胞重编程培养基中Forskolin的浓度为大约10μM-大约200μM，例如大约10μM、大约20μM、大约30μM、大约40μM、大约50μM、大约60μM、大约70μM、大约80μM、大约90μM、大约100μM、大约125μM、大约150μM、大约175μM、大约200μM。优选地，Forskolin的浓度为大约50μM。
在一个实施方案中，所述靶细胞重编程培养基中VPA的浓度为大约0.1mM-大约1mM，例如大约0.1mM、大约0.2mM、大约0.3mM、大约0.4mM、大约0.5mM、大约0.6mM、大约0.7mM、大约0.8mM、大约0.9mM或大约1mM。优选地，VPA的浓度为大约0.5mM。
在一个实施方案中，所述靶细胞重编程培养基中SB431542的浓度为大约1μM-大约5μM，例如大约1μM、大约2μM、大约3μM、大约4μM、大约5μM。优选地，SB431542的为3μM。
在一个实施方案中，所述靶细胞重编程培养基中ISX-9的浓度为大约1μM-大约20μM，例如大约1μM、大约2.5μM、大约5μM、大约7.5μM、大约10μM、大约12.5μM、大约15μM、大约17.51μM、大约20μM。优选地，ISX-9的浓度为10μM。
在一个实施方案中，所述靶细胞为中胚层来源细胞诸如心脏细胞，外胚层来演细胞诸如神经细胞，内胚层来源细胞如结肠细胞。例如，所述靶细胞可以是神经元细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、间质细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、神经细胞、造血细胞、胰岛细胞或体内几乎任何细胞。
在一个实施方式中，所述靶细胞为神经元细胞，且所述靶细胞(神经元)重编程培养基包含CHIR99021、Forskolin、616452和ISX9。在一个实施方案中，所述靶细胞(神经元)重编程培养基包括20μM CHIR99021、10μM 616452、50μM Forskolin和10μM ISX9。在一个实施方案中，所述靶细胞(神经元)重编程培养基为包括补充有FBS、N2、B27补充剂、GlutaMAX、bFGF和CHIR99021、616452、Forskolin和ISX-9的Neurobasal培养基。在一个实施方案中，所述靶细胞(神经元)重编程培养基为补充有5％FBS、1％N-2补充剂、2％B27补充剂、1％GlutaMAX、25ng/ml bFGF和20μM CHIR99021、10μM616452、50μM Forskolin和10μM ISX-9的Neurobasal培养基。在一些实施方案中，所述靶细胞(神经元)重编程培养基还补充有抗生素，例如1％青霉素-链霉素。
在一个实施方式中，所述靶细胞为骨骼肌细胞，且所述靶细胞(骨骼肌细胞)重编程培养基包含CHIR99021、Forskolin、616452和SB431542。在一个实施方案中，所述靶细胞(骨骼肌细胞)重编程培养基包括20μM CHIR99021、10μM 616452、50μM Forskolin和3μMSB431542。在一个实施方案中，所述靶细胞(骨骼肌细胞)重编程培养基为补充有KSR、FBS、GlutaMAX、NEAA、和CHIR99021、616452、Forskolin和SB431542的DMEM/M199培养基。在一个实施方案中，所述靶细胞(骨骼肌细胞)重编程培养基为包括补充10％KSR、10％FBS、1％GlutaMAX、1％NEAA、和20μM CHIR99021、10μM616452、50μM Forskolin和3μM SB431542的DMEM/M199(4：1)培养基。在一些实施方案中，所述靶细胞(骨骼肌细胞)重编程培养基还补充有抗生素，例如1％青霉素-链霉素。
在另一方面，本发明提供一种将起始细胞重编程为靶细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在本发明的引发重编程培养基中培养起始细胞群体一段时间，所述一段时间不多于11天，例如是大约1-大约11天，优选4天；
(b)在本发明的靶细胞重编程培养基中培养步骤(a)获得的细胞群体；和
(c)任选地，收获步骤(b)所获得的靶细胞群体。
在一些实施方案中，其中在步骤(b)每4天更换一次新鲜的靶细胞重编程培养基。
在一些实施方案中，其中步骤(b)中的培养进行大约8-16天，例如约8天、约12天、约16天。
在一些实施方案中，所述方法不包括将所述细胞群体暴露于外源转录因子的步骤。例如，所述方法不包括将所述细胞群体暴露于细胞重编程相关的外源转录因子，例如Oct4、Sox2、Klf4和C-Myc等。也就是说，本发明的重编程细胞的方法是化学诱导(利用小分子化合物)的重编程方法。
本发明还涉及本发明的小分子混合物、组合物、培养基在细胞重编程中的用途。
四.试剂盒
本发明的范围内还包括试剂盒，该试剂盒包括本发明的小分子混合物、组合物、培养基和/或细胞，以及使用说明。该试剂盒可以进一步包括至少一种另外的试剂。试剂盒一般包括表明试剂盒内容物的预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或以其他方式随试剂盒提供的任何书面的或记录的材料。在一个实施方案中，本发明的试剂盒用于实施本发明的方法。在一些优选实施方案中，所述试剂盒包含本发明的引发重编程培养基和/或靶细胞重编程培养基。
实施例
方法
MEF分离
MEF培养基：补充有10％胎牛血清(FBS)、1％GlutaMAX、1％非必需氨基酸(NEAA)、0.055mM 2-巯基乙醇和1％青霉素-链霉素的高葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)。
从ICR小鼠胚胎中分离小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。简言之，在去除头部、四肢和内脏后，用剪刀将E13.5胚胎切碎并在胰蛋白酶-EDTA中于37℃解离10分钟。加入MEF培养基并离心后，收集并培养MEF细胞。
从成纤维细胞产生XEN样细胞
XEN重编程培养基(引发重编程培养基)：补充10％KnockOut血清替代(KSR)、10％FBS、1％GlutaMAX、1％NEAA、0.055mM 2-巯基乙醇、1％青霉素-链霉素(Invitrogen)、50ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和指定的小分子混合物例如VC6FAE(0.5mM丙戊酸、20μMCHIR99021、10μM 616452、50μM Forskolin、0.05μM AM580和5μM EPZ004777)的KnockOutDMEM。
MEF在具有MEF培养基的12孔板中以每孔20,000个细胞接种。对于XEN诱导，第二天将培养基更换为XEN重编程培养基，并且每4天更换一次至12天。
从引发的细胞诱导骨骼肌细胞
骨骼肌重编程培养基：补充10％KSR、10％FBS、1％GlutaMAX、1％NEAA、1％青霉素-链霉素(Invitrogen)和小分子混合物C6FS(20μM CHIR99021、10μM 616452、50μMForskolin和3μM SB431542)的DMEM/M199培养基(4：1)。
MEF在具有MEF培养基的12孔板中以每孔20,000个细胞接种。对于骨骼肌细胞诱导，第二天(第0天)将培养基更换为XEN重编程培养基，并在第4天将培养基换成骨骼肌重编程培养基以诱导肌细胞8-12天。每4天更换一次骨骼肌重编程培养基。
从引发的细胞诱导神经元
神经元重编程培养基：补充有5％FBS、1％N2、2％B27补充剂、1％GlutaMAX、1％青霉素-链霉素(Invitrogen)、25ng/ml bFGF和小分子混合物C6FI(20μM CHIR99021、10μM616452、50μM Forskolin和10μM ISX-9)的Neurobasal培养基。
MEF在具有MEF培养基的12孔板中以每孔20,000个细胞接种。对于神经元诱导，第二天(第0天)将培养基更换为XEN重编程培养基，并在第4天将培养基换成神经元重编程培养基以诱导神经元8-12天。每4天更换一次神经元重编程培养基。
免疫荧光
用PBS洗涤细胞，并在室温下在4％多聚甲醛中固定15分钟。用PBS洗涤两次后，将细胞透化并在含有0.2％Triton X-100和3％驴血清的PBS中在室温下封闭1小时。然后将细胞与一抗在4℃孵育过夜。用PBS洗涤三次后，在37℃下孵育二抗(JacksonImmunoResearch)保持1小时。将细胞核用DAPI(Roche Life Science)染色5分钟。
一抗是以下特异性抗体：兔抗SALL4(Abcam，1：500)、山羊抗SOX17(R&D，1：500)、山羊抗GATA4(Santa Cruz，1：300)、山羊抗GATA6(R&D，1：200)、小鼠抗Tubb3(Biolegend，1：300)、兔抗-Synapsin 1(Ancam，1：500)、兔抗-Map2(Millipore，1：200)、兔抗Neun(Millipore 1：500)、小鼠抗肌球蛋白重链(R&D，1：300)、小鼠抗MyoD(Thermo fisher，1：200)、小鼠抗肌肉蛋白(Thermo fisher，1：200)和小鼠抗α-肌动蛋白(Sigma，1：500)、山羊抗Alb(Bethyl，1：500)、山羊抗Hnf4a(Santa cruz，1：500)、小鼠抗Cps1(Santa cruz，1：300)。使用的二抗是FITC-缀合的二抗和TRITC-缀合的二抗(Jackson ImmunoResearch，1：200)。
RT-qPCR
使用EasyPure RNA Kit(TransGen Biotech)提取总RNA，并使用TransScriptOne-step gDNA Removal和cDNA Synthesis SuperMix(TransGen Biotech)将其逆转录成cDNA。使用2×T5 Fast qPCR Mix(TSINGKE Biological Technology)在Quantagene q225系统(KUBO技术)上进行实时PCR。
单细胞RNA-seq
在消化后手动挑取单个细胞，裂解并进行cDNA合成(Li等，2017；Gu等，2019)。然后如公开的步骤扩增和片段化单细胞cDNA(Li等，2017a；Gu等，2019)。构建测序文库(NewEngland Biolabs)并在Illumina HiSeq X-Ten平台(Novogene)上用配对末端150-bp读段测序。原始读数首先通过细胞条码分离，然后修整，并与mm9小鼠转录组比对，并如先前所述(Trapnell等人，2010)通过UMI信息进行重复数据删除。
数据处理和分析
在所有大量RNAseq数据中将基因表达水平标准化为log2(FPKM+1)。第20天和XEN数据、原代神经元数据、骨骼肌数据改编自GEO DataSet(GEO ID：GSE73631、GSE68715、GSE111671、GSE85251)。在整个重编程过程(第0-20天)中变化超过阈值(1.5)的那些被认为是受调节的基因。用K-means方法将这些基因分组成10个簇。对于dropout实验，首先在第4天和第8天在MEF中比较C6FAE条件下的基因表达。增加至少1.5的转录因子被鉴定为上调并保留用于后续分析。为了分析用于诱导神经元和骨骼肌细胞的优化的混合物，本发明人将基因列表限制在其在神经元细胞中的表达比在MEF中高，其在骨骼肌细胞中的表达比在MEF中高的前100个基因的联合组中，然后PCA基于该基因列表进行。基于每种成分的基因负荷，将原代神经元、骨骼肌细胞映射到主成分分析坐标。
清除单细胞数据以去除其中检测到几种加标RNA的细胞，然后用R packageRUVSeq标准化以去除批次效应(Risso等人，2014)。当获取可变基因用于主成分分析和t分布随机邻域嵌入时，考虑平均值和分散。通过计算基因对之间的相关性构建转录因子基因相关网络，并且仅保留相关性小于-0.4(负相关)或大于0.4(正调节)的边缘。
对于T分布随机邻域嵌入(van der Maaten，2014)，本发明人使用了DmitryUlyanov的multicore-tsne python执行。为了加快计算速度，本发明人首先使用主成分分析减少了数据的维数，将其限制在前50个维度。本发明人使用默认的T-SNE参数：perplexity＝30，learning rate＝200，early exaggeration＝12。算法允许1500次迭代。为了确保T-SNE嵌入忠实地代表细胞状态的基本特征而不是批量效应，本发明人使用Mutual Nearest Neighbor(MNN)算法纠正了用于批量效应的计数矩阵(Haghverdi等，2018)。特定的MNN实现是mnnpy，参数k＝15，sigma＝100和高度可变基因的子集，使用python framework Scanpy(Wolf等，2018)发现，它执行了Seurat的算法(Satija等人，2015)。
为了聚类细胞，如图6A所示，本发明人使用了Louvain算法(Blondel等，2008)，特别是Vincent Traag的open source python执行。使用0.95的分辨率。
试剂供应商及货号
试剂名称 供应商 货号
1 KnockOut DMEM Thermo Fisher 10829018
2 KnockOut Serum Replacement(KSR) Thermo Fisher A3181502
3 Fetal Bovine Serum(FBS) VISTECH VIS146975
4 GlutaMAX Gibco 2059987
5 Non-Essential Amino Acid Gibco 2027433
6 penicillin-streptomycin Gibco 2029636
7 Neurobasal medium Thermo Fisher 21103049
8 N-2Supplement Thermo Fisher A1370701
9 B27 supplement Thermo Fisher 17504044
10 CHIR99021 selleck S2924
11 Forskolin selleck S2449
12 616452 selleck S7223
13 AM580 MCE HY-10475
14 EPZ00477 selleck S7353
15 ISX-9 selleck S7914
16 Medium 199 Gibco 11150059
17 DMEM HyClone AE27369267
18 SB431542 selleck S1067
19 Recombinant Human FGF-4 PEPROTECH 100-31
本发明中施用的化合物CAS号和结构式
Figure BDA0002506375660000171
Figure BDA0002506375660000181
Figure BDA0002506375660000191
实施例1化学混合物激活多个谱系的转录因子的内源表达
为了研究化学化合物如何确定细胞命运，在将小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)重编程为XEN样细胞的过程中，本发明人在用不同的化学混合物(由CHIR99021、Forskolin、616452、AM580和EPZ00477；VPA、CHIR99021、Forskolin、616452、AM580和EPZ00477；或CHIR99021、Forskolin、616452、EPZ00477、UNC0638和CH55组成)处理的第0、4、8、12和20天重编程期间通过RNA测序测量了基因表达谱。(图1A)
如图所示，由C6FAE诱导的基因表达的动态显示可变模式(图1B)，由10个簇组成，其以逐步方式分成4组(图1B)：在前4天在1/2簇中下调的纤维细胞基因、从第4天到第8天在3/4/5簇中上调的基因、在6/7/8/9簇中上调的XEN基因以及在最后一段时间中在第10簇中减少的成纤维细胞的主基因(图1C和2A)。出乎意料的是，在成纤维细胞重编程为XEN样细胞期间上调的基因(3/4/5簇)包括许多谱系相关的转录因子(TFs)，如Ascl1、Zic1、Hand2、Hey2、Ptf1a和Gata3，据报道分别调节外胚层、中胚层和内胚层的发育(图1D和1E)。这种基因表达模式也可以在用其他混合物的化学重编程中检测到，即使在混合物中包括用于XEN产生的额外的化学增效剂(VPA、UNC0638和CH55)(图1E、2B和2C)。这些基因的排名最高的相关基因类别包括“多细胞生物过程的调节”、“细胞分化的调节”和“前脑发育”(图1F)。因此，本发明人将这种独特的状态称为“化学激活的多谱系引发”(CaMP)。
为了探索CaMP是否只能从发育更幼稚
Figure BDA0002506375660000192
的胚胎成纤维细胞中诱导，本发明人还使用小鼠新生儿真皮成纤维细胞(NDF)和成鼠尾尖成纤维细胞(TTF)进行CaMP诱导。基因谱显示，重编程混合物还激活了这些细胞中许多与发育相关的TF，这些TF具有相似的但略有不同的特征(图2D和2E)。
XEN主基因在最后阶段被显著激活，表明XEN细胞命运以逐步方式诱导而不是在化学重编程的初始阶段确定。
CHIR99021属于GSK-3α/β抑制剂；616452属于TGFβR-1/ALK5抑制剂；Forskolin属于cAMP激活剂；AM580属于RARα激活剂；EPZ004777属于DOT1L抑制剂。此外，UNC0638是蛋白赖氨酸甲基转移酶(HMTase)例如G9a和GLP的选择性抑制剂，CH55是RAR-α和RAR-β的激活剂。预期在相同信号通路发挥相同抑制/激活活性的其他化合物的组合也能实现本发明的“化学激活的多谱系引发”。
实施例2通过微调化学物质的组成，CaMP细胞作为种子而专化为不同胚层的细胞类型
由于CaMP步骤可能已经制备了用于多谱系专化(specification)的细胞，这些细胞中具有细胞类型相关的主基因的内源性表达，本发明人接下来研究是否可以通过CaMP诱导后改变培养基/或化学混合物来诱导其他细胞类型(例如神经元、肌细胞)。
对于神经元的专化，本发明人改变了神经元偏好的培养基，并尝试在CaMP过程后微调混合物。本发明人发现了混合物C6FI(CHIR99021、616452、Forskolin和ISX9)可以显著促进从CaMP向神经元样细胞的转变(图4A和4B)。得到的诱导的神经元样细胞表达神经元标记Tuj1、Map2、Syn1、NeuN，并通过免疫染色检测到典型的神经元形态(图3A)。此外，这些诱导的神经元样细胞还通过定量PCR检测到表达一组功能标记Rbfox3、Gabbr2和Chat(图3B)。重要的是，在仅用C6FI诱导12天后几乎没有神经细胞，除非细胞经历了CaMP期(图3C)，这表明通过XEN重编程培养基的短暂处理诱导的CaMP状态为化学重编程提供了极大增强的可塑性。为了确定是否诱导了中间XEN样状态(据报道它也是塑性的)，本发明人在神经元样细胞诱导过程中敲除了XEN主基因Sall4和Gata4。本发明人发现它们的敲除显著减少了XEN集落形成，而没有降低神经元样细胞生成的效率(图4C、4G和4H)，表明CaMP细胞已经具有独立于XEN样细胞生成的可塑性。
此外，通过在第二步中转换至包含化合物CHIR99021、616452、Forskolin、SB431542(C6FS)的肌细胞培养基，本发明人非常有效地诱导了表达MyHC、Myog、Myod1和Tnnt3的骨骼肌细胞(图3D和3E)。就像神经元重编程一样，有效的骨骼肌重编程也需要CaMP诱导(图3F)。本发明人通过进行dropout实验优化了CaMP阶段的混合物，并发现减去CHIR99021对于骨骼肌细胞诱导具有最高效率(图4D)。化合物CHIR99021、Forskolin、616452和SB431542都是骨骼肌诱导所必需的(图4E)。XEN主基因的敲低不会损害神经元的诱导效率，表明存在绕过XEN样状态的更直接的分子途径(图4F、4G和4H)。
通过RNA测序，本发明人发现通过CaMP产生的诱导的神经元、肌细胞分别激活神经元特异性、肌细胞特异性基因的表达(图3G、3H)。通过主成分分析，本发明人发现由CaMP-C6FI、CaMP-C6FS诱导的神经元、肌细胞具有比没有引发诱导的细胞更接近原代功能细胞的转录状态(图3I)。
总之，本发明人能够有效地从CaMP细胞诱导来自不同胚层的细胞类型，例如骨骼肌细胞、神经元(图3J)。通过简单处理化合物来引发多种谱系可能为获得其他谱系提供了很好的新机会。
实施例3 CaMP的特征在于内源性发育相关转录因子的随机表达
为了探究意外上调的多发育基因是否在不同表达水平上同时或分别在每个单细胞中被激活，本发明人通过单细胞RNA测序进一步研究了重编程过程。本发明人在C6FAE介导的MEFXEN重编程过程中对10个时间点的808个单细胞进行了取样，并使用高灵敏度的单细胞RNA测序方法SMART-seq2来评估全基因组基因(包括单个细胞中转录水平低的TF)的表达(图6A)。在对技术噪声和批次效应进行大量数据验证和校正之后(图6B、6C和6D)，保留610个细胞用于进一步分析。
在单细胞中，在前5天内许多谱系特异性基因的mRNA水平上调(图5A、5B和6E)，这与本发明人的大量RNA测序数据一致。在改变的内源性TF中，78.96％(用两侧Wilcoxon秩和检验，总442个，p值<0.05)被上调，而在诱导5天后仅有少数被抑制(图5C)。
有趣的是，这些基因不是在每个细胞中显示任何精心设计的动态模式，而是随机激活。激活的基因几乎没有相互关联(图5D和5E)。细胞具有不同数量的活化基因，并且这些基因在第1天至第5天的不同时间点上调(图6F)。
由于在活化的细胞中XEN TF的低表达和成纤维细胞主基因的高表达，化学混合物随机激活多个谱系的TF的内源性表达而不是优先考虑XEN细胞命运(图5F)。当其主基因如Sox17和Sall4高度表达(图6G)并且其他谱系的大多数TF下调时，XEN细胞的命运从这种多重启动状态中脱颖而出，这进一步表明在XEN样细胞命运重编程期间的两步模型(多谱系启动和专化)。
实施例4 Sox17激活细胞中的渐进细胞命运专化和转变
由于尚不清楚非特异于任何细胞类型的可塑CaMP状态如何被驱动到特定细胞类型中，本发明人接下来探讨了XEN样细胞命运如何从在化学重编程的早期阶段中的群体脱颖而出为CiPSCs。本发明人采用主成分分析(PCA)和单细胞RNA-seq数据的t分布随机邻域嵌入(t-SNE)分析。这两种经过充分测试的方法给出了类似的图谱，该图谱捕获了从第0天到第20天的细胞变化的整个趋势(图5A和6E)。细胞在早些时候彼此非常接近，然后逐渐分离，最后分成两个分支。这两个分支主要由第12天和第20天的细胞组成，并且它们属于八个簇中的两个，这些簇中的细胞使用分辨率为0.95的Louvain聚类将细胞聚集在一起(Blondel等，2008；Levine等，2015；Wolf等，2018)(图8A和8B)。
位于t-SNE图(簇8)左侧分支的细胞具有显著的XEN主基因Sox17、Sall4和Gata4的表达水平，表明它们是成功诱导的XEN样细胞。另一个分支，即被困状态，包括具有较低表达的Sall4和Gata4的细胞，其仍保留成纤维细胞基因的表达，表明它们未能获得新的细胞命运(图5F)。
为了更广泛地评价两个不同分支的细胞命运，本发明人使用前1000差异表达基因MEF和XEN的大量RNA-seq数据以基于二次编程的分析技术来评估细胞相同性(Treutlein等人，2016)。成纤维细胞的相同性在早期阶段适度降低并保持恒定水平直至XEN的相同性出现，而XEN的相同性在前8天缓慢上调，而大部分改善发生在第8天之后(图8C)。在后4天内，从MEF细胞命运到XEN细胞命运的转换非常迅速。与标记基因一致，左分支具有最高的XEN相同性和最低的MEF相同性(图7A)，表明XEN重编程已完成，本发明人将其称为“成功的分支”。由于MEF相同性最高，右分支被称为“被困分支”。非常有趣的是，这两种细胞命运在相同的单细胞中从未显示出高分数，这意味着两种细胞命运具有竞争关系，并且不能同时在同一细胞中共存。
接下来本发明人询问被困分支是否可以重新编程为XEN细胞。为了回答这个问题，本发明人选择了基于Epcam表达较弱的单个克隆及其被困分支的模糊形态。用胰蛋白酶将群落消化成单细胞，并接种到分离的孔中(图8D)。即使用C6FAE培养基再培养12天，来自捕获的群落的单细胞也很少形成XEN群落(图8E)。该结果表明，被困分支中的细胞不能转化为成功的分支并重新编程为XEN细胞。
成功和被困的分支之间的最大差异是后者中XEN和成纤维细胞主基因的差异表达(图7B)。XEN主TF，尤其是Sox17，在成功的分支中具有最高的表达。XEN主TF的表达顺序是Sox17、Sall4、Gata4，然后是Foxa2(图8F)，这表明Sox17是其他XEN基因的上游。通过免疫染色，本发明人发现表达Sall4的细胞、表达Gata4的细胞和表达Foxa2的细胞都包含在表达Sox17的群落中(图7C)。从重编程开始敲除Sox17阻碍了XEN形成，并且其他XEN主基因受到严重损害(图7D)。此外，Sox17的过表达促进了Gata4和Foxa2的上调(图8G)。这些发现进一步证实了Sall4、Gata4和Foxa2在Sox17之后出现的观点，并且Sox17是基因调控网络分级结构中XEN主基因的顶级上游基因。
重要的是，CaMP过程中Sox17的激活水平决定了细胞命运专化和转换过程。XEN主基因之间的分级调控的数学模型显示基因表达动态系统中的鞍结分叉，具有两个稳定的固定点和一个不稳定的固定点(图7E)。在CaMP步骤中激活Sox17后，细胞状态移动到接近不稳定的固定点，然后转移到两个稳定的固定点中的任何一个，分别代表成功的分支和被困的分支。在CaMP步骤中Sox17的较高表达将细胞转移至具有较高Sall4和Gata4表达水平的稳定的固定点(图7E和8H)，因此完成了细胞命运专化和转变的核心调节网络(图7F)。在XEN子网络中，Sox17是与其他基因(包括成纤维细胞主基因)相互作用最多的主要调节因子。Sox17的过表达促进了成纤维细胞核心基因的下调(图7G)，反过来，成纤维细胞核心基因的下调促进了XEN核心调控网络中元素的上调(图7H和8I)。因此，作为CaMP过程中激活的最重要的TF之一，Sox17确定了细胞命运专化和转换过程。
实施例5化学增效剂有利于重编程的不同阶段
尽管相同的混合物既能用于塑化也能用于专化，未覆盖的两步“塑化和专化”过程提出了不同步骤需要不同化学混合物的可能性。为了验证这种可能性，本发明人首先比较在不同步骤中使用和不使用化学增效剂的C6FAE诱导的细胞的基因表达谱。结果，CH55在前4天促进Sox17和Sall4的表达，同时从第4天到第12天抑制XEN基因的进一步表达(图9A和9B)。这表明CH55仅在第一步中通过促进Sox17的表达而具有功能，Sox17是CaMP步骤中的早期引发基因之一。
然而，另一种化学增效剂丙戊酸(VPA)以不同的方式改善了重编程效率。它在后8天内促进了XEN基因的上调(图9A)，同时从第4天开始抑制其他谱系特异性基因(图9B)。然而，VPA在第4天下调Sox17表达。这表明VPA仅在第二步中通过支持XEN网络的上调来改善XEN重编程。
同样的，通过免疫荧光，本发明人发现VC6FAE混合物主要诱导共表达Sox17、Gata4和Sall4的“平滑”群落，而C6FAE混合物诱导许多具有强大的Sox17表达和Sall4和Gata4表达受损的“模糊”群落(图10A、10B和10C)。模糊群落具有较高的成纤维细胞主基因Osr1、Prrx1和Twist2的转录水平(图10D)。这些发现表明，VPA通过促进XEN专化过程和抑制特异于其他谱系的基因来改善C6FAE介导的XEN重编程。
本发明人进一步确定是否可以通过逐步使用化学增效剂，通过在不同步骤中添加CH55和VPA来进一步促进XEN重编程。本发明人发现在前4天加入CH55促进Sox17和Sall4的表达比在整个重编程过程中加入CH55更强烈(图9C和10E)。与在整个重编程过程中添加VPA相比，VPA在后8天内添加能促进更多的Gata4和Foxa2转录(图9D和10F)。重要的是，在不同步骤中顺序使用CH55和VPA具有最高的重编程效率以产生XEN样群落(图10G和9E)。这些数据进一步支持了两步重编程假设，并且指定的化学增效剂可以有利于不同步骤的重编程，并且可能具有不同的机制。
实施例6核心重编程化学品(FC6)通过不同的机制协调CaMP过程和专化过程
本发明人进一步询问核心重编程化学品CHIR99021、Forskolin和616452(C6F)如何在双相“塑化和专化”过程中发挥作用。从用混合物处理的样品中分析大量RNA表达谱，所述混合物在不同阶段减去三种化学物质中的每一种。
本发明人发现CHIR99021、616452和Forskolin对于大多数谱系特异性TF的激活都是必需的。在由C6FAE混合物活化的基因中，在没有三种化合物中的任何一种时它们中有44和48个分别在第4天和第8天不能被活化(图11A和11B)。CHIR99021、616452或Forskolin的减去分别阻碍了一小部分TF的表达(图11C和11D)。另外，更大比例的TF由CHIR99021、Forskolin和616452一起诱导，因为减去任何一种化合物阻碍了它们的活化(图11C和11D)。重要的是，化学引发的基因之一Sox17也需要所有3种核心化合物来激活其表达。从第0天减去CHIR/FSK/616中的任何一个阻碍了XEN主基因的表达，尤其是Sox17(图11C、12A和12B)。因此，本发明人得出结论，CHIR99021/Forskolin/616452共同促成了CaMP过程。
但是，CHIR99021/Forskolin/616452在专化步骤中扮演了不同的角色。由于Sall4和Gata4是XEN细胞命运核心调控网络中的核心TF，本发明人分析了CHIR99021/Forskolin/616452对Sall4和Gata4表达的影响。通过从第4天到第12天减去它们中的每一个，本发明人发现含有CHIR99021和Forskolin的混合物在mRNA和蛋白质水平上促进Gata4(图11E、11F和11G)，表明这两种化合物通过Gata4激活起作用。此外，减去616452阻断了Sall4的上调，并且所有含有616452的混合物都可以上调Sall4的mRNA和蛋白水平(图11E、11H和11I)，表明616452在Sall4激活中的关键作用。因为Sall4的表达促进了Gata4的上调(图12C、12D和12E)，本发明人还可以检测Sall4阳性群落中Gata4的表达。总之，CHIR99021/Forskolin/616452同时在CaMP步骤中引发了包括Sox17在内的多谱系TF，而CHIR99021/Forskolin和616452分别在专化阶段激活了Gata4和Sall4，从而建立了XEN的整个核心调控网络(图11J)。在第8天后，CHEN99021/Forskolin/616452对于XEN基因表达不是必需的(图12F)，表明过渡期是XEN主基因调控网络的自组织过程。CHIR99021/Forskolin/616452在两个阶段中的不同功能还进一步支持XEN重编程可被认为是逐步过程的假设。
在本发明中，本发明人通过简单的化学处理诱导的“化学激活的多谱系引发(CaMP)”状态，为再生医学中产生功能细胞提供了一种全新的方法。该策略可能对iPS策略具有一些主要优势，即绕过iPS细胞诱导的长期培养。此外，这种策略可能更直接，更容易操作。此外，可以通过诱导CaMP细胞获得来自不同胚层的细胞类型，例如骨骼肌细胞、神经元细胞，以及胚胎外XEN样细胞(图13)。这种分化潜能仅在幼稚
Figure BDA0002506375660000241
多能性中有过描述。
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Claims (17)

1.一种重编程细胞的方法，所述方法包括将细胞群体暴露于引发重编程小分子混合物一段时间，由此获得引发的细胞群体，其中所述引发重编程小分子混合物至少包括GSK-3α/β抑制剂、TGFβR-1/ALK5抑制剂、和cAMP激活剂，其中所述一段时间不多于大约11天，例如是大约1-11天，优选为4天。
2.权利要求1的方法，所述引发重编程小分子混合物进一步包括RARα激活剂和/或DOT1L抑制剂。
3.权利要求1或2的方法，其中所述所述GSK-3α/β抑制剂是CHIR99021或其结构类似物，所述cAMP激活剂是Forskolin或其结构类似物，所述TGFβR-1/ALK5抑制剂是616452或其结构类似物，所述RARα激活剂是AM580或其结构类似物，所述DOT1L抑制剂是EPZ00477或其结构类似物。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述引发重编程小分子混合物进一步包括HDAC抑制剂例如VPA或其结构类似物、UNC0638或其结构类似物，和/或CH55或其结构类似物。
5.权利要求1-4中任一项的方法，所述引发重编程小分子混合物由选自以下的混合物组成：CHIR99021、Forskolin和616452；CHIR99021、Forskolin、616452、AM580和EPZ00477；VPA、CHIR99021、Forskolin、616452、AM580和EPZ00477；CHIR99021、Forskolin、616452、EPZ00477、UNC0638和CH55。
6.权利要求1-5中任一项的方法，所述细胞选自神经元细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、间质细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、神经细胞、造血细胞、胰岛细胞。
7.一种将起始细胞重编程为靶细胞的方法，所述方法包括第一阶段和第二阶段，
其中所述第一阶段包括将起始细胞群体暴露于引发重编程小分子混合物一段时间从而获得引发的细胞群体，所述引发重编程小分子混合物至少包括GSK-3α/β抑制剂、TGFβR-1/ALK5抑制剂、和cAMP激活剂，所述一段时间不多于11天，例如是大约1-11天，优选为4天；
其中所述第二阶段包括将第一阶段得到的引发的细胞群体暴露于靶细胞重编程小分子混合物，由此获得靶细胞群体。
8.权利要求7的方法，所述引发重编程小分子混合物进一步包括RARα激活剂和/或DOT1L抑制剂。
9.权利要求7或8的方法，其中所述GSK-3α/β抑制剂是CHIR99021或其结构类似物，所述cAMP激活剂是Forskolin或其结构类似物，所述TGFβR-1/ALK5抑制剂是616452或其结构类似物，所述RARα激活剂是AM580或其结构类似物，所述DOT1L抑制剂是EPZ00477或其结构类似物。
10.权利要求7-9中任一项的方法，所述引发重编程小分子混合物进一步包括HDAC抑制剂例如VPA或其结构类似物、蛋白赖氨酸甲基转移酶(HMTase)抑制剂例如UNC0638或其结构类似物，和/或RAR-α/β激活剂例如CH55或其结构类似物。
11.权利要求7-10中任一项的方法，所述引发重编程小分子混合物由选自以下的组成：CHIR99021、Forskolin和616452；CHIR99021、Forskolin、616452、AM580和EPZ00477；VPA、CHIR99021、Forskolin、616452、AM580和EPZ00477；CHIR99021、Forskolin、616452、EPZ00477、UNC0638和CH55。
12.权利要求7-11中任一项的方法，所述起始细胞选自神经元细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、间质细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、神经细胞、造血细胞、胰岛细胞。
13.权利要求7-12中任一项的方法，所述靶细胞重编程小分子混合物至少包括GSK-3α/β抑制剂、TGFβR-1/ALK5抑制剂、和cAMP激活剂，例如所述GSK-3α/β抑制剂是CHIR99021或其结构类似物，所述cAMP激活剂是Forskolin或其结构类似物，所述TGFβR-1/ALK5抑制剂是616452或其结构类似物。
14.权利要求7-13中任一项的方法，所述靶细胞重编程小分子混合物进一步包括HDAC抑制剂例如VPA或其结构类似物。
15.权利要求7-14中任一项的方法，所述靶细胞重编程小分子混合物进一步包括ISX9或其结构类似物，或SB431542或其结构类似物。
16.权利要求7-15中任一项的方法，所述靶细胞重编程小分子混合物中的一种或多种小分子的量与所述引发重编程小分子混合物中的一种或多种小分子的量不同。
17.权利要求7-16中任一项的方法，所述靶细胞选自神经元细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、间质细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、神经细胞、造血细胞、胰岛细胞。
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