CN116536251B - 一种无饲养层的化学诱导多能干细胞单克隆建株方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种无饲养层的化学诱导多能干细胞单克隆建株方法，属于干细胞与再生医学领域。包括：S1.准备建株专用的培养液；S2.准备重组人层黏连蛋白521蛋白包被的96孔板；S3.将化学诱导重编程第四阶段末，原孔细胞用消化液消化成单细胞、过筛，制备成单细胞悬液；S4.计数，离心取上清液，清洗，用接种培养液重悬细胞，分选SUSD2阳性的细胞；S5.吸掉蛋白包被液，加入分选后的SUSD2阳性细胞悬液，次日更换为多能干细胞培养液，继续培养，可获得典型形态的多潜能干细胞单克隆。本发明方法极大地简化了人化学诱导的多潜能干细胞单克隆挑选和建株流程，降低了操作的技术要求，避免使用外源饲养层细胞，提高了临床应用的安全性。
Description
技术领域
本发明涉及细胞克隆技术领域，具体涉及一种无饲养层的化学诱导多能干细胞单克隆建株方法。
背景技术
化学重编程制备人多能干细胞技术是北京大学干细胞研究中心主任邓宏魁教授团队自主研发的、全球首创的的新一代多能干细胞制备技术，为我国干细胞和再生医学的发展解决了底层技术上的“瓶颈”问题，开创了全新的人“种子细胞”的制备体系。
与传统的 iPS技术相比，化学小分子是分子量小于900的化学物质，广泛存在于自然界、食物和人体中，可以直接透过细胞膜作用于靶点，操作简单，易于生产和标准化且不整合到基因组，无免疫原性。相比于传统技术利用细胞内转录因子的方式，化学诱导利用细胞外源小分子，使干细胞制备更加简单安全、更易于标准化、更便于临床应用。
无论是哪种重编程的技术，在诱导体细胞形成多能干细胞克隆后，需要挑取单克隆才能建立稳定的多能干细胞株，用于下游的基础研究和医疗技术开发。目前挑取克隆的方法主要是物理机械法，即用玻璃针等方式在显微镜的帮助下实现，将克隆接种到饲养层细胞和特定的多能干细胞培养液中实现。但是该方法对操作人员有较高的技术要求，操作复杂，工作效率低，且克隆可能不纯，同时需要饲养层细胞的支持，会带来安全性的风险。
在研究中发现，化学诱导重编程的第四阶段，原代的化学诱导多能干细胞集落高表达naïve（原始态）多能性的标志物，转录组合DNA甲基化的分析也显示与naïve状态的细胞性质类似，因此认为hCiPSCs（人化学诱导多能干细胞）在被建立为稳定的细胞系之前是naïve类似的多能性状态。SUSD2分子在之前的研究中被认为是人胚胎中naïve上胚层的特异性表达的表面标记蛋白，利用抗SUSD2抗体的染色水平来分类，可以定量和分离naïve性质的多能干细胞。利用化学重编程的特性，结合SUSD2在naïve细胞中的特异性表达，可以用来开发新的方法来建立化学诱导多能干细胞的单克隆细胞株。
但是，物理机械法操作在单克隆建株中，操作复杂，工作效率低，且克隆可能不纯，同时需要外源饲养层的支持，有外源污染的风险，极大限制了多能干细胞未来的临床应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无饲养层的化学诱导多能干细胞单克隆建株方法。该方法通过流式分选技术，通过标记SUSD2分子，分离单个细胞到96孔，通过简单的方法就能方便获得大量的单细胞来源的单细胞克隆，可以缩短单克隆建株的时间，用于稳定的多能干细胞单克隆建株，未来可用于规模化和产业化的技术平台使用。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种无饲养层的化学诱导多能干细胞单克隆建株方法，包括：
S1.准备建株专用的培养液；
S2.准备重组人层黏连蛋白521蛋白包被的96孔板；
S3.将化学诱导重编程第四阶段末，有原代hCiPSCs的细胞孔细胞用消化液Accutase消化成单细胞，过筛，制备成单细胞悬液；
S4.计数，离心取上清液，清洗，用接种培养液重悬细胞，分选，选择分选SUSD2阳性的细胞；
S5.吸掉稀释的蛋白包被液，加入培养液，培养，换液为多能干细胞培养液，继续培养，可得到典型的单克隆形态。
作为本发明的进一步改进，所述建株专用的培养液包括接种培养液，为0-7天使用；第二种多能干细胞培养液，为7-14天使用。
作为本发明的进一步改进，所述接种培养液的配方如下：
作为本发明的进一步改进，步骤S5中培养液为接种培养液。
作为本发明的进一步改进，所述多能干细胞培养液的配方如下：
作为本发明的进一步改进，所述重组人层黏连蛋白521蛋白由iMatirx 511替代。
作为本发明的进一步改进，所述培养条件为36-38℃培养。
作为本发明的进一步改进，所述步骤S2的具体方法如下：将1 ml化冻的100 μg的重组人层黏连蛋白521蛋白用体积为40 mL的4℃的有钙镁DPBS稀释，按照每孔90 μL加入，37℃培养箱中孵育过夜。
本发明具有如下有益效果：本发明方法极大地简化了人化学诱导的多潜能干细胞（human Chemical induced Pluripotent Stem Cell，hCiPSCs）单克隆挑选和建株流程，降低了操作的技术要求，避免使用外源饲养层细胞，使用该技术制备的多能干细胞提高了临床应用的安全性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同基质包被或饲养层细胞对hCiPSCs建系的影响图；
图2为传代、接种在饲养层细胞扩增后的hCiPSCs单克隆形态图；
图3为传代、接种在Laminin 521扩增后的hCiPSCs单克隆形态图；
图4为通过Laminin 521建立的hCiPSCs细胞系明场形态图；
图5为免疫组化检测通过Laminin 521建立的hCiPSCs细胞系的多潜能基因表达情况图；
图6为通过Laminin 521建立的hCiPSCs细胞系畸胎瘤实验结果图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种无饲养层的化学诱导多能干细胞单克隆建株方法，包括以下步骤：
（1）准备建株专用的培养液，分为两种，第一种为接种培养液，为0-7天使用；第二种多能干细胞培养液，为7-14天使用，配方如下表所示（表1和表2）。
表1：接种培养液
表2：多能干细胞培养液
（2）准备Lamninin 521（重组人层黏连蛋白521）蛋白包被的96孔板。方法为，将1ml化冻的100 μg的Lamninin 521用体积为40 mL的4度冷的有钙镁DPBS（Dulbecco'sphosphate-bufferedsaline）稀释，按照每孔90 μL加入，37度培养箱中孵育过夜。
（3）将化学诱导重编程第四阶段末，有原代hCiPSCs的细胞孔细胞用消化液Accutase消化成单细胞，过40微米的细胞筛，制备成单细胞悬液。
（4）细胞计数，PBS（phosphatebufferedsaline磷酸盐平衡生理盐水）洗一次；每10万细胞中加入1μL SUSD2的流式抗体，4度孵育30分钟。
（5）离心取上清，使用PBS洗一次，用接种培养液重悬细胞。上机流式分选仪，画门，选择分选SUSD2阳性的细胞。
（6）吸掉稀释的蛋白包被液，加入第一种培养液，每孔100 μL；分选打板，每孔1颗细胞。
（7）37℃培养箱中培养，4天左右可以观察到小的单克隆，7天之后换液为多能干细胞培养液；继续培养5-7天，根据克隆生长的大小决定。
（8）12-14天可以观察到典型的单克隆形态，上皮样紧致的，边缘清晰、高核质比。
测试例1
1、使用Lamninin 521胞外基质蛋白可替代传统饲养层细胞：
已有的多能干细胞建单克隆细胞株，基本采用小鼠饲养层的方法。随着研究的开发，发现从小鼠肿瘤中提取的基底膜基质matrigel能够替代饲养层用来培养多能干细胞。但是matrigel，来源于小鼠，且成分不确定，批次间不稳定，有生物安全的风险。之后的研究中逐渐发现有一些胞外基质蛋白能够用来培养多能干细胞，例如玻璃粘连蛋白，纤连蛋白，层连蛋白等细胞。通过模拟单细胞接种建株实验，在同等接种细胞的密度下，经分析发现，Laminin 521包被的皿中，单克隆的数量是最多的，说明其是最适合能够支持无饲养层的单克隆株的建立（图1），iMatirx 511效果其次。
2、使用接种培养液可促进hCiPSCs单克隆生长
化学重编程最后一个阶段细胞的性质与naïve状态的多能干细胞性质类似，高表达naïve相关基因，推测此时接种细胞进行单克隆株建株的培养液应该适用于适用naïve才能更加高效。通过实验我们发现，利用naïve特征的培养液在接种早期，等克隆长出之后再切换成多能干细胞的培养液才能获得明显的单克隆，箭头表示典型的多能干细胞克隆（图2）。
3、使用流式细胞分选SUSD2标记后的hCiPSCs可稳定获得单克隆细胞
通过对于重编程细胞性质的了解，采用SUSD2标记分选单细胞打板的方式，实验结果显示，此策略可行，且操作方便简单，得到的单细胞在培养之后可以获得单克隆，且单克隆可通过进一步传代扩增获得稳定的单克隆株（图3）。
4、通过单克隆挑选后可获得稳定的hCiPSCs细胞株
该发明建立的化学诱导多能干细胞单克隆方法建立的细胞株通过体外的多次传代，结果表明，可以快速扩增，能够维持典型的多能干细胞形态（图4）。通过免疫荧光染色（图5）和体内畸胎瘤实验（图6），表明建立的单克隆株具备多能性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种无饲养层的化学诱导多能干细胞单克隆建株方法，其特征在于，包括：
S1.准备建株专用的培养液；
S2.准备重组人层黏连蛋白521蛋白包被的96孔板；
S3.将化学诱导重编程第四阶段末，有原代hCiPSCs的细胞孔细胞用消化液Accutase消化成单细胞，过筛，制备成单细胞悬液；
S4.计数，离心取上清液，清洗，用接种培养液重悬细胞，分选，选择SUSD2阳性的细胞；
S5.吸掉稀释的蛋白包被液，加入培养液，培养，换液为多能干细胞培养液，继续培养，可得到典型的单克隆形态；
所述建株专用的培养液包括接种培养液，为0-7天使用；第二种多能干细胞培养液，为7-14天使用；
所述接种培养液的配方如下：
步骤S5中培养液为接种培养液；
所述多能干细胞培养液的配方如下：
2.根据权利要求1所述无饲养层的化学诱导多能干细胞单克隆建株方法，其特征在于，所述步骤S2的具体方法如下：将1 ml化冻的100 μg的重组人层黏连蛋白521蛋白用体积为40 mL的4℃的有钙镁DPBS稀释，按照每孔90 μL加入，37℃培养箱中孵育过夜。
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-
2023
- 2023-07-06 CN CN202310825804.4A patent/CN116536251B/zh active Active
Patent Citations (7)
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