CN106867966B - 稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的脊椎动物细胞系及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域，涉及一种稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的脊椎动物细胞系及其制备方法；本发明涉及的哺乳动物细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO‑K1/CAF13CCTCC C2015182。本发明还涉及所述细胞系的制备方法，包括如下步骤：培养CHO‑K1细胞；取pcDNA3.1(+)‑DYK‑FucTA质粒，转染CHO‑K1细胞，获得转染pcDNA3.1(+)‑DYK‑FucTA质粒的转染细胞；取转染细胞，传代培养，通过抗生素筛选获得细胞克隆；挑取细胞克隆，扩大培养并鉴定，获得强阳性表达细胞克隆，筛选，即得所述细胞系。本发明涉及的哺乳动物细胞系能够稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶，实现了在哺乳动物细胞中获得并生产具有核心α(1,3)岩藻糖基化的N型糖蛋白。

Description

稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的脊椎动物细胞系及其 制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的脊椎动物细胞系及其制备方法。

背景技术

现行研究显示，包括哺乳动物在内的脊椎动物没有核心α(1,3)岩藻糖基转移酶活性。因此，具有核心α(1,3)岩藻糖化的脊椎动物和哺乳动物蛋白可具有新的理化特性和生物学特性，具有广阔的应用前景。例如，对复杂生物过程的理解依赖于对特定分子在包括蛋白质分子间动态相互作用在内的的定位和示踪。虽然通过对越来越多种生物的DNA测序鉴别了蛋白的开放阅读框(ORF)，但是在体内和体外对相应蛋白质性质的鉴定的方法仍是有限的。现有技术中，绝大多数致力于实现这一目标的策略基于构建一个融合蛋白，这个融合蛋白带有的融合多肽标记不仅可以用作蛋白纯化以在体外应用，也可以进一步在体内应用。研究实践中应用的标签实例包括FLAG标签、6X His标签、S－谷胱甘肽转移酶、麦芽糖结合蛋白、绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白和抗原决定簇标签等，但是这些标记都或多或少的改变了原有蛋白的氨基酸序列，而基于N型糖蛋白上的核心α(1,3)岩藻糖化标记则无需改变现有N型糖蛋白的氨基酸序列，且在后续对标记过的N型糖蛋白的体内外检测，示踪和/或操纵也无需制备特异的抗体，使用通用的抗核心α(1,3)岩藻糖的抗体便可以实现，使用方便。

经对现有技术的文献检索，专利文献201010607689.6(公开日2011年9月7日)披露了一种检测IgG岩藻糖化的方法及其应用。该方法利用凝集素检测位于IgG上的核心α(1,6)岩藻糖化度和位于糖链末端的α(1,3)岩藻糖化度，用于乙肝患者中慢性肝炎患者和肝硬化患者的鉴别诊断。该文献披露的技术方案不涉及蛋白核心α(1,3)岩藻糖化，不涉及核心α(1,3)岩藻糖基转移酶，也不涉及核心α(1,3)岩藻糖基转移酶在哺乳动物细胞内的表达。

如前所述，天然脊椎和哺乳动物细胞虽然具有蛋白核心α(1,6)岩藻糖化以及末端α(1,3)岩藻糖化的能力，但没有核心α(1,3)岩藻糖基转移酶活性。迄今尚未见有稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的哺乳动物细胞系报道。虽然部分植物和昆虫具有核心α(1,3)岩藻糖基转移酶，由于以下众多的不确定因素：限制了核心α(1,3)岩藻糖基转移酶在哺乳动物中的表达和应用：

1.不同种属的细胞糖链具有种属特性，糖链的特异性可限制核心α(1,3)岩藻糖基转移酶活性；2。蛋白序列也有种属特性蛋白序列的特异性可限制核心α(1,3)岩藻糖基转移酶活性；3。不同种属的细胞有结构特异性，细胞的基本结构可限制核心α(1,3)岩藻糖基转移酶活性；4。细胞内环境pH和盐浓度，可能限制核心α(1,3)岩藻糖基转移酶活性；5。不同的细胞可能使用完全不同的底物系统；6。酶的细胞内分布可能限制核心α(1,3)岩藻糖基转移酶活性。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟建立一种稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的哺乳动物细胞系及其制备方法。与融合蛋白标记技术相比，由核心α(1,3)岩藻糖基化标记的蛋白，不带有可引起宿主免疫反应的融合多肽，蛋白序列不发生变化；与在昆虫和植物细胞中表达的蛋白相比，并可排除由昆虫或植物细胞糖链以及蛋白酶带来的异质性。进一步的本发明的上述方法可用于其它的脊椎动物细胞。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，利用蛋白糖修饰的种属差异，提供一种稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的哺乳动物细胞系及其制备方法。本发明涉及的细胞系能够稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶，并进一步实现在哺乳动物细胞中产生核心α(1,3)岩藻糖基化的N型糖蛋白，核心α(1,3)岩藻糖基化标记为通用标记，可用于不同蛋白在复杂生物系统理解和蛋白质分子间潜在的相互作用的示踪和体内体外的研究，具有广阔的基础和应用价值。

本发明是通过以下的技术方案实现的，

第一方面，本发明提供一种稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的哺乳动物细胞系。

优选地，所述细胞系可通过包括如下步骤的方法制备：取源于非哺乳动物的核心α(1,3)岩藻糖基转移酶基因，导入哺乳动物细胞系即得；所述细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1，或中国仓鼠卵巢细胞CHO-S，或人胚肾细胞系HEK293。

第二方面，本发明提供一种稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的细胞系，所述细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1/CAF13 CCTCC C2015182。

第三方面，本发明涉及一种前述中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1/CAF13 CCTCCC2015182的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、培养CHO-K1细胞；

步骤二，取pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒，转染CHO-K1细胞，获得转染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒的转染细胞；

步骤三，取步骤二得到的转染细胞，传代培养，通过抗生素筛选获得细胞克隆；

步骤四，挑取细胞克隆，扩大培养并鉴定，获得强阳性表达细胞克隆，筛选，即得所述细胞系，即中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1/CAF13 CCTCC C2015182。

优选地，所述步骤一包括如下步骤：取100mm细胞培养皿，加入10mL新鲜F12K完全培养基，所述F12K完全培养基含10％胎牛血清及青链霉素，在培养皿中加入CHO-K1细胞，孵育。

优选地，所述在培养皿中加入CHO-K1细胞具体为：按每个培养皿1.25 x 10⁶个CHO-K1细胞浓度加入细胞，之后放入CO₂培养箱中37℃孵育过夜。

优选地，所述步骤二包括如下步骤：取pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒，浓度为453ng/μL；按照每2mL Opti-Mem中含有24μg质粒和40μL Lipofectamine2000转染试剂配制转染复合物，摇匀后室温放置5分钟；取铺有CHO-K1细胞的100mm细胞培养皿加入2mL上述配制的转染复合物，摇匀后放入37℃CO₂培养箱中继续孵育6小时；6小时后将培养皿取出，吸掉全部培养基，缓慢加入新鲜的F12K完全培养基，然后放入37℃CO₂培养箱中培养24小时，获得转染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒的CHO-K1细胞。

优选地，所述步骤三包括如下步骤：取转染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒24小时后的CHO-K1细胞，使用预先加入G418的F12K完全培养基，37℃CO₂培养箱中进行传代培养。

优选地，所述步骤三包括如下步骤：将转染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒24小时后的CHO-K1细胞取出，吸掉全部培养液上清，用10mL PBS洗一遍，加入2mL胰酶消化液；室温放置并消化5-7分钟作用，吸掉胰酶消化液，再放置2-4分钟；等待期间取3个新100mm细胞培养皿，每个预先加入10mL含有800μg/mL G418的F12K完全培养基，待用；倒置显微镜下观察，待所有细胞脱壁后立刻加入10mL新鲜F12K完全培养基，缓慢吹打几遍；将细胞悬液取1/30的体积分别加入到刚才准备的3个100mm细胞培养皿中，轻轻摇匀后放入37℃CO₂培养箱中培养数天后；再次按照上述方法传代细胞一次，继续培养若干天，待细胞群落生长出来后，挑取细胞克隆待用。

优选地，步骤四中，所述筛选包括如下步骤：通过极限稀释法，将获得的阳性克隆细胞的单个细胞接种于96孔细胞培养板中，经过培养挑取生长健康的单克隆细胞株，并经过若干天扩大培养并制备细胞裂解液，随后进行针对核心α(1,3)岩藻糖基转移酶及其产物核心α(1,3)岩藻糖表位的蛋白免疫印迹，以此筛选出强阳性表达的单克隆细胞株。

第四方面，本发明还提供一种制备核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的方法，包括如下步骤：发酵培养中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1/CAF13 CCTCC C2015182，即得核心α(1,3)岩藻糖基转移酶。

第五方面，本发明还提供一种中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1/CAF13 CCTCC C2015182在制备核心α(1,3)岩藻糖基化糖蛋白中的应用。

本发明涉及的中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1/CAF13 CCTCC C2015182已经于2015年11月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编：430072；保藏编号为CCTCC C2015182。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明成功获得了能够稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的哺乳动物细胞系，首次在哺乳动物细胞中产生α(1,3)核心岩藻糖基化的N型糖蛋白，且表达稳定，解决了现有技术中长期未能解决的稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的技术问题，为研究复杂生物系统和和蛋白质分子间潜在的相互作用提供了新的方法和手段，具有显著地意想不到的效果。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为通过对核心α(1,3)岩藻糖进行相对定量免疫组织化学染色，鉴定出核心α(1,3)岩藻糖基转移酶阳性CHO-K1细胞克隆结果图；

图2为免疫组织化学染色法揭示核心α(1,3)岩藻糖在CHO-K1细胞中的表达结果图；

图3为蛋白免疫印迹法筛选出表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的CHO-K1细胞株结果图；

图4为蛋白免疫印迹法筛选出表达核心α(1,3)岩藻糖的CHO-K1细胞株结果图；

图5为蛋白免疫印迹揭示核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的产物，即核心α(1,3)岩藻糖在CAF13细胞中表达持续且稳定结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明涉及的中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1/CAF13 CCTCC C2015182已经于2015年11月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编：430072；保藏编号为CCTCC C2015182。

实施例1、培养细胞

取100mm细胞培养皿，加入10mL新鲜F12K完全培养基(含10％胎牛血清及青链霉素)，按每个培养皿1.25 x 10⁶个CHO-K1细胞浓度加入细胞，放入CO₂培养箱中37℃孵育过夜；本实施例中的F12K完全培养基和CHO-K1细胞均可通过公开的市售渠道获得，为本领域技术人员所熟知。

实施例2、转染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒

取pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒(浓度为浓度为453ng/μL，序列如SEQ ID NO.1所示)，冰上解冻后待用；

取出铺有CHO-K1细胞的100mm细胞培养皿，吸掉全部培养液，分别用10mL PBS洗一遍，后加入无血清无青链霉素新鲜F12K培养基，再将细胞放入37℃CO₂培养箱中孵育待用；

按照每2mL Opti-Mem中含有24μg质粒和40μL Lipofectamine 2000转染试剂配制转染复合物，摇匀后室温放置5分钟；

取铺有CHO-K1细胞的100mm细胞培养皿加入2mL上述配制的转染复合物，摇匀后放入37℃ CO₂培养箱中继续孵育6小时；

6小时后将6碟培养皿取出，吸掉全部培养基，缓慢加入新鲜的F12K完全培养基，然后放入37℃CO₂培养箱中培养24小时，获得转染了pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒的CHO-K1细胞。

实施例3、传代培养，通过抗生素筛选获得细胞克隆

本实施例中，将转染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒24小时后的CHO-K1细胞取出，吸掉全部培养液上清，用10mL PBS洗一遍，加入2mL胰酶消化液；

室温放置并消化5-7分钟作用，吸掉胰酶消化液，再放置2-4分钟；

等待期间取3个新100mm细胞培养皿，每个预先加入10mL含有800μg/mL G418的F12K完全培养基，待用；

倒置显微镜下观察，待所有细胞脱壁后立刻加入10mL新鲜F12K完全培养基，缓慢吹打几遍；

将细胞悬液取1/30的体积分别加入到刚才准备的3个100mm细胞培养皿中，轻轻摇匀后放入37℃CO₂培养箱中培养数天后；

再次按照上述方法传代细胞一次，继续培养若干天，待细胞群落生长出来后，挑取细胞克隆进行后续实验。

实施例4、挑取细胞克隆，扩大培养并鉴定，获得强阳性表达细胞克隆

挑取16个细胞克隆，提前两天接种于3个6孔细胞培养板中，长满后依次吸掉孔内培养液上清，用2mL PBS洗一遍，加入0.6mL胰酶消化液；

室温放置并消化5-7分钟作用，待消化结束时依次用移液器先吸入0.6mL培养基，加入到刚刚正在消化的6孔细胞培养板中，吹打均匀，将全部细胞悬液依次转入到16个空的1.5mL离心管中；

对所有16管细胞悬液进行细胞计数，并根据细胞计数结果，将每个细胞克隆的5 x10⁴个细胞加入到96孔板中，每个细胞克隆3个复孔，加入后放入CO2培养箱中37℃培养过夜；

第二天将96孔板取出，在水池边将培养基全部甩出，放在干的吸水纸上将板子翻过来轻拍数次；

缓慢加入300μL/孔的PBS将贴壁的细胞洗一遍，在水池边将PBS全部甩出，放在干的吸水纸上将板子翻过来轻拍数次；

立刻加入预冷的固定液(含4％(w/v)多聚甲醛的PBS溶液)，100μL/孔，室温固定30分钟；

固定好后，在水池边将固定液全部甩出，放在干的吸水纸上将板子翻过来轻拍数次后，缓慢加入300μL/孔的PBS将固定好的细胞洗一遍，然后在水池边将PBS全部甩出，放在干的吸水纸上将板子翻过来轻拍数次；

立刻加入PBST溶液(含0.5％(w/v)Triton X-100的PBS溶液)，100μL/孔，室温放置15分钟进行破膜；

破膜后，在水池边将PBST溶液全部甩出，放在干的吸水纸上将板子翻过来轻拍数次后，缓慢加入封闭缓冲液(10％FBS+90％PBS)，室温放置1小时进行封闭处理；封闭后，加入一抗缓冲液(将兔抗核心α(1,3)岩藻糖抗体按1：2000稀释在上述封闭液中)或者封闭液，50μL/孔，置于4℃孵育过夜。

第三天，将前一天进行一抗孵育过夜的96孔板取出，在水池边将一抗缓冲液全部甩出，放在干的吸水纸上将板子翻过来轻拍数次；

缓慢加入300μL/孔的TBST溶液将细胞洗一遍，在水池边将TBST溶液全部甩出，放在干的吸水纸上将板子翻过来轻拍数次；重复上述步骤4遍；

由此步开始全部操作避光进行，加入二抗缓冲液(将AlexaFluor488标记的羊抗兔二抗按1：1000稀释在上述封闭液中)或者封闭液，50μL/孔，室温孵育1小时；

孵育结束后，在水池边将二抗缓冲液全部甩出，放在干的吸水纸上将板子翻过来轻拍数次；

缓慢加入300μL/孔的TBST溶液将细胞洗一遍，在水池边将TBST溶液全部甩出，放在干的吸水纸上将板子翻过来轻拍数次；

在所有孔中缓慢加入50μL/孔的DAPI溶液(含100ng/mL DAPI的PBS溶液)，室温孵育5分钟；

孵育结束后，在水池边将DAPI溶液全部甩出，放在干的吸水纸上将板子翻过来轻拍数次；

缓慢加入300μL/孔的TBST溶液将细胞洗一遍，在水池边将TBST溶液全部甩出，放在干的吸水纸上将板子翻过来轻拍数次；重复上述步骤3遍；

将洗好的板子放入多功能酶标仪中分别读取FITC(激发波长为488nm，发射波长为535nm)和DAPI(激发波长为358nm，发射波长为461nm)荧光值，并根据FITC相对荧光值与DAPI相对荧光值的比值(单位细胞FITC相对荧光值)作为参考挑取阳性细胞克隆以进行后续单克隆稀释，如图1所示，图1中显示了核心α(1,3)岩藻糖在16个细胞克隆中的相对含量；并对强阳性细胞克隆拍照，包括11号与13号克隆细胞，如图2所示，相较于母细胞，这两株阳性细胞由于表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶从而产生了核心α(1,3)岩藻糖而被标记为亮绿色，能够被明显被识别出来。

之后进行获得纯化过的稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的细胞系CAF13及效果验证：通过极限稀释法，将这两株阳性克隆细胞的单个细胞接种于96孔细胞培养板中，经过若干天培养挑取数个生长健康的单克隆细胞株，并经过若干天扩大培养并制备细胞裂解液，随后进行针对核心α(1,3)岩藻糖基转移酶及其产物核心α(1,3)岩藻糖表位的蛋白免疫印迹，以此筛选出强阳性表达的单克隆细胞株。如图3所示，11号克隆的3号单克隆细胞株内检测到核心α(1,3)岩藻糖基转移酶表达；又如图4所示，在对应的表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的单克隆细胞株中也检测出该酶的产物，N型糖蛋白上的核心α(1,3)岩藻糖。综上，其中11号克隆的3号单克隆细胞株被鉴定为强阳性表达细胞株，此结果表明表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的单克隆细胞系被成功纯化得到，并命名为CAF13，即中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1/CAF13 CCTCC C2015182，该细胞系已经于2015年11月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编：430072；保藏编号为CCTCC C2015182。

通过对CAF13细胞的连续培养及对该核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的产物，即N型糖蛋白上核心α(1,3)岩藻糖的连续检测，蛋白免疫印迹实验证明了该细胞系能够稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶。如图5所示，第7代CAF13细胞与连续培养至第22代的CAF13细胞具有一致的蛋白免疫印迹效果，从而表明此细胞经过连续数代培养后，核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的表达持续且稳定。由此可见，本发明成功获得了能够稳定表达α(1,3)核心岩藻糖基转移酶的细胞系，首次在哺乳动物细胞中产生核心α(1,3)岩藻糖基化的N型糖蛋白，且表达稳定，解决了现有技术中长期未能解决的稳定表达核心α(1,3)岩藻糖的技术问题，对复杂生物系统理解和蛋白质分子间潜在的相互作用有着重要的研究价值，具有意想不到的技术效果。

综上所述，本发明涉及的细胞系能够稳定表达α(1,3)核心岩藻糖基转移酶，本发明首次实现了在哺乳动物细胞中产生核心α(1,3)岩藻糖基化的N型糖蛋白，对复杂生物系统理解和蛋白质分子间潜在的相互作用有着重要的研究价值。利用本发明涉及的细胞系中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1/CAF13 CCTCC C2015182表达的核心α(1,3)岩藻糖基转移酶，能够标记且无需改变现有N型糖蛋白的氨基酸序列，实现检测功能，解决了现有技术中未能解决的在哺乳动物细胞中稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的技术问题，实现了意想不到的技术效果。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。上述方法可用于其它的脊椎动物细胞。

需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (11)

1.一种稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的脊椎动物细胞系，所述细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1/CAF13 ，保藏号CCTCC NO: C2015182。

2.根据权利要求1所述的细胞系，其特征在于，所述细胞系通过包括如下步骤的方法制备：取源于非哺乳动物的核心α(1,3)岩藻糖基转移酶基因，导入脊椎动物细胞系即得；所述的脊椎动物细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1。

3.一种如权利要求1所述的细胞系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、培养CHO-K1细胞；

步骤二，取pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒，转染CHO-K1细胞，获得转染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒的转染细胞；

步骤三，取步骤二得到的转染细胞，传代培养，通过抗生素筛选获得细胞克隆；

步骤四，挑取细胞克隆，扩大培养并鉴定，获得强阳性表达细胞克隆，筛选，即得所述细胞系，即中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1/CAF13 CCTCC C2015182。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征是，所述步骤一包括：取100mm细胞培养皿，加入10mL新鲜F12K完全培养基，所述F12K完全培养基含10%胎牛血清及青链霉素，在培养皿中加入CHO-K1细胞，孵育。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征是，所述在培养皿中加入CHO-K1细胞为：按每个培养皿1.25 x 10⁶个CHO-K1细胞浓度加入细胞，之后放入CO₂培养箱中37ºC孵育过夜。

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征是，所述步骤二包括：取pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒，浓度为453ng/µL；按照每2mL Opti-Mem中含有24μg质粒和40μL Lipofectamine2000转染试剂配制转染复合物，摇匀后室温放置5分钟；取铺有CHO-K1细胞的100mm细胞培养皿加入2mL上述配制的转染复合物，摇匀后放入37ºC CO₂培养箱中继续孵育6小时；6小时后将培养皿取出，吸掉全部培养基，缓慢加入新鲜的F12K完全培养基，然后放入37ºC CO₂培养箱中培养24小时，获得转染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒的CHO-K1细胞。

7.如权利要求3所述的制备方法，其特征是，所述步骤三包括：取转染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒24小时后的CHO-K1细胞，使用预先加入 G418的F12K完全培养基，37ºC CO₂培养箱中进行传代培养。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征是，所述步骤三包括：将转染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒24小时后的CHO-K1细胞取出，吸掉全部培养液上清，用10mL PBS洗一遍，加入2mL胰酶消化液；室温放置并消化5-7分钟作用，吸掉胰酶消化液，再放置2-4分钟；等待期间取3个新100mm细胞培养皿，每个预先加入10mL含有800μg/mL G418的F12K完全培养基，待用；倒置显微镜下观察，待所有细胞脱壁后立刻加入10mL新鲜F12K完全培养基，缓慢吹打几遍；将细胞悬液取1/30的体积分别加入到准备的3个100mm细胞培养皿中，摇匀后放入37ºCCO₂培养箱中培养数天后；再按上述方法传代细胞一次，继续培养，待细胞群落生长出来后，挑取细胞克隆待用。

9.如权利要求3所述的制备方法，其特征是，步骤四中，所述筛选包括如下步骤：通过极限稀释法，将获得的阳性克隆细胞的单个细胞接种于96孔细胞培养板中，经过培养挑取生长健康的单克隆细胞株，并经过扩大培养并制备细胞裂解液，随后进行针对核心α(1,3)岩藻糖表位的蛋白免疫印迹，进而筛选出强阳性表达的单克隆细胞株。

10.一种制备核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：发酵培养中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1/CAF13，保藏号CCTCC NO: C2015182，得核心α(1,3)岩藻糖基转移酶。

11.中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1/CAF13，保藏号CCTCC NO: C2015182在用于制备核心α(1,3)岩藻糖基化糖蛋白中的应用。

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