CN102220257A - 一种新的酵母双杂交方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新的的酵母双杂交方法，该方法通过降低低丰度基因丢失率的文库扩增、酵母菌快速转化质粒、逐渐提高选择压筛选蛋白质互作并判断相互作用的强弱程度和富集表达β-半乳糖苷酶而发现弱互作的蛋白质。本方法操作简单，假阳性和假阴性少，采用本系统的酵母双杂交方法，不仅能够发现新的相互作用蛋白质，而且能够筛选到已知的阳性克隆。本发明公开的酵母双杂交方法可用于基因的新功能分析和相互作用网络图谱的绘制。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的酵母双杂交方法，具体地说，本发明涉及一种新的系统筛选蛋白质相互作用的酵母双杂交方法，及该方法在信号转导、基因工程和蛋白质组学领域中有应用。
背景技术
酵母双杂交系统是1989年由Fields和Song提出的（Fields S, et al. Nature,1989,340:245–246；Fields S, et al. Trends Genet,1994,10(8):286-92），其作用原理基于真核细胞转录因子（如GAL4和GCN4蛋白质）的结构特性。转录因子通常含有两个独立的结构域：DNA结合域(BD)和转录激活域(AD)，只有当这两种结构域共同作用时才能使转录正常进行。利用此特性，可以分别使BD与AD同“诱饵”蛋白(X)和“猎物”蛋白(Y)形成融合蛋白，一般把用来进行筛选的目的蛋白称为“诱饵”蛋白，而筛到的阳性克隆称为“猎物”蛋白。如果两种蛋白X 和Y可以发生相互作用，就能使BD与AD在空间上充分接近，从而激活报告基因的转录；而单独的BD与AD蛋白质游离于细胞中不同的位置而分开，不能激活报告基因的转录。
目前公司开发出来的酵母双杂交系统有很多种，比如Clontech公司的Matchmaker GAL4 Two-Hybrid System系列、Invitrogen公司的ProQuest Two-Hybrid System等。系统中对应的酵母表达载体含有高拷贝的2u复制子（Clontech），或者是低拷贝的ARS/CEN6复制子（Invitrogen）。其中的酵母菌种经过了基因改造后既不能产生GAL4，又不能合成亮氨酸（LEU）、色氨酸（TRP）、组氨酸（HIS）、腺嘌呤（ADE），因此，酵母在缺乏这些营养的培养基（SD-LEU-TRP-HIS-ADE）上无法正常生长。当所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的这些报告基因从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。酵母双杂交的文库转化方法有两种，一种是直接将cDNA文库以质粒的形式转化到含有“诱饵”质粒的酵母感受态细胞中；另外一种是根据酵母有性生殖的特点，事先将cDNA文库质粒转化α接合型酵母细胞，将“诱饵”表达载体转化a接合型细胞。α接合型和a接合型两种单倍体之间接合（mating）能形成二倍体（ Bendixen C, et al. Nucleic Acids Res,1994,22(9):1778-9）。
酵母双杂交系统主要应用于快速验证已知蛋白之间的相互作用及寻找新的相互作用蛋白质，尤其在寻找蛋白质互作区域时相当有优势。其优点有:1、采用高拷贝和强启动子的表达载体使目的蛋白过量表达，方便复合物的形成。2、筛选过程在真核酵母活细胞内进行，一定程度上反映了体内的真实情况。3、检测的结果是基因表达产物的级联效应，通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用，而细胞内的免疫共沉淀依赖于两个互作蛋白质的解离程度，因为在免疫沉淀的过程中通过洗涤的过程降低了互作信号。4、通过激活区域与转录起始复合物蛋白的互作增强了杂交蛋白质的稳定性，提高了检测灵敏度。4、文库来源广泛，可采用不同组织、器官、细胞类型和特殊分化时期材料构建成cDNA文库（Luban J, et al. Curr Opin Biotechnol,1995,6(1):59-64）。根据不同的基因和蛋白质的特点，还可构建很多适用于筛选某个特定蛋白质的相互作用的酵母双杂交载体和系统，如有筛选激酶底物的酵母双杂交系统（Yang X, et al.Science ,1992 ,257(5070):680-2），有筛选药物配体的酵母双杂交系统（Yang M, et al. Nucleic Acids Res,1995,23(7):1152-6），有筛选核糖体RNA合成酶相互作用蛋白质的酵母双杂交系统等（Nogi Y, et al. Proc Natl Acad Sci, 88(16):7026-38）。
虽然酵母双杂交技术得到了广泛的应用，但是系统本身也存在一些问题。首先，“诱饵”不能包含所有类型的蛋白质，如胞外蛋白、膜蛋白受体、和某些转录因子，这是由于酵母双杂交的原理决定的，重构的转录因子GAL4激活报告基因转录是在细胞核内发挥作用，所以“诱饵”蛋白质能否和在真核细胞中一样发生修饰和正确折叠（如糖基化和二硫键的形成）并转运至核内是进行筛选的前提条件。虽然现在开发出来的“诱饵”表达质粒插入了核定位序列，但不能排除某些必须经过内质网等细胞器进行翻译后加工修饰的蛋白质不能进入核内，或者因为加入了额外的融合蛋白质产生错误的构象而影响筛查结果（Allen JB,et al. Trends Biochem Sci,1995,20(12):511-6）。其次，假阳性较多。即通过双杂交观察到的蛋白质间相互作用，在真实情况下不一定发生。其产生的原因可能是:① 由于有些蛋白质本身具有激活转录的功能，即使BD- X融合蛋白与AD-Y融合蛋白不特异结合，也能启动转录。有三种情况可以产生假阳性，即：单独的AD-Y融合蛋白激活转录，AD-Y融合蛋白和空BD激活转录，AD-Y融合蛋白与任意BD融合蛋白激活转录（Gietz RD,et al.Mol Cell Biochem,1997,172(1-2):67-79）。②在细胞的正常生命活动中靶蛋白和“诱饵”蛋白在时空上或者细胞类型以及组织中可能不在一起，而报告基因的表达是因为强行地将它们聚在了一起。如有些蛋白质的相互作用是在胞外因素刺激或者在特殊条件下才结合在一起，虽然酵母双杂交结果显示可以互作，但是后续的验证很难得到阳性结果而被认为是假阳性。③ 有些蛋白具有特殊的生物学功能和普遍的蛋白质相互作用，如一些蛋白水解酶和核糖体蛋白质。④ 一些实际上不发生相互作用的蛋白质由于有相同的模体可聚合在一起，如含有大的疏水氨基酸残基的蛋白质能形成稳定复合物。最后，阴性干扰。即两个蛋白本应该发生相互作用，但报告基因不表达或表达量很低以至检测不出，原因主要有融合蛋白的表达对细胞有毒性（如细胞周期调控蛋白cyclin A和cyclin B），有时为了抑制背景表达而在培养其中添加的3-AT（3-Amino-1,2,4-triazole）也对菌株有一定毒性，使一些蛋白质间较弱的相互作用可能会因此而被掩盖（James P,et al.Genetics,1996,144(4):1425-36）。
目前的酵母双杂交方法存在操作复杂，难以寻找低丰度的基因所表达蛋白质的互作，假阳性和假阴性多的缺点。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的酵母双杂交方法，本方法可增加低丰度基因数量提高筛选到阳性克隆的几率，操作简单，假阳性和假阴性少，通过酵母双杂交方法获得的结果可靠。
本发明的另一个目的是提供新的酵母双杂交方法在筛选确认蛋白质新功能中的应用。
本发明公开了一种新的酵母双杂交方法，该方法包括下列步骤：
1) 文库扩增：以大肠杆菌形式保存的组织或者细胞的cDNA文库，通过10倍梯度稀释测定文库的滴度，根据实际实验需要计算出扩增文库所需要的原始文库菌液的体积，实际扩增文库是在原始菌液所需体积的基础上增加1-3倍；
2) 诱饵质粒转化酵母细胞：将用来筛选蛋白质相互作用的诱饵质粒与转化混合物一起直接加入酵母菌AH109中并进行热激转化以获得含有能表达诱饵蛋白的重组酵母菌；
3) 文库的转化和阳性克隆的筛选：将能表达诱饵蛋白的重组酵母菌通过选择培养基扩大培养后再转接到丰富培养基中培养并达到一定的浓度，然后将需要筛选的cDNA文库直接与转库混合物一起转化酵母菌，通过一系列的逐步增大的选择压筛选准阳性克隆；
4) β-半乳糖苷酶的活性测定筛选阳性克隆：将准阳性克隆富集培养以高表达β-半乳糖苷酶，通过酶促反应后的颜色变化进一步肯定阳性克隆；
5) 测序分析后的共转化验证：测序并经过分析后的猎物质粒与诱饵质粒共转化到酵母菌AH109中以表达两个融合蛋白质，通过选择压筛选和β-半乳糖苷酶的活性测定进一步排除假阳性以肯定蛋白质相互作用的真实性。
本发明还公开了一种优化的新的酵母双杂交方法，该方法包括下列步骤：
1) 文库扩增：吸取文库扩增所需的菌液体积的3倍原始文库菌液90微升稀释于52.5毫升LB液体培养基，吸取150微升涂布300块直径为15厘米的含氨苄抗生素的LB平板上，在30℃培养2天后用含氨苄的5 毫升 LB液体培养基将每块平板上的菌刮洗下来，收集到一起，再在37℃摇床培养2-6个小时，菌体用QUAJIAN公司的试剂盒进行质粒的提取，并测试质粒的浓度；
2) 诱饵质粒转化酵母细胞：活化酵母菌AH109收集菌体后无菌水洗一次，加入一步法转化缓冲液（PEG3350(50%质量体积比)，80微升；LiAc(1摩尔/升)，10微升；鲑鱼精DNA(10毫克/毫升)，5微升；DTT(1摩尔/升)，10微升；质粒1微克），在42℃水浴锅热激30分钟，离心后用无菌水重悬并涂平板，获得含有能表达诱饵蛋白的重组酵母菌；
3) 文库的转化和阳性克隆的筛选：收集通过缺陷培养基培养后转接到丰富培养基中培养4-6小时的，OD660=0.9-1.1的菌体并用LiAC(0.1摩尔/升)重悬，加入转库缓冲液混匀（PEG3350(50%质量体积比)，4800微升；LiAc(1摩尔/升)，720微升；鲑鱼精DNA(10毫克/毫升)，200微升；文库质粒100-200微克，在30℃水浴孵育15分钟，加入DMSO后42℃热激20分钟，收集菌体涂SD-LEU-TRP-HIS-ADE平板，并依次转移到SD-LEU-TRP-HIS-ADE并含5毫摩尔/升3AT，10毫摩尔/升3AT，15毫摩尔/升3AT平板上，筛选准阳性克隆；
4) β-半乳糖苷酶的活性测定筛选阳性克隆：将SD-LEU-TRP-HIS-ADE固体平板上长出来的单菌落划线到SD-LEU-TRP固体平板上富集表达足够的β-半乳糖苷酶，挑出菌落点到滤纸上，液氮破菌后在37℃显色，通过酶促反应后的颜色变化进一步肯定阳性克隆，并测序；
5) 测序分析后的共转化验证：将测序正确的猎物质粒与诱饵质粒共转化酵母菌AH109，涂布SD-LEU-TRP固体平板，再通过划线转到SD-LEU-TRP-HIS-ADE平板，并依次转移到SD-LEU-TRP-HIS-ADE并含5毫摩尔/升 3AT，10毫摩尔/升3AT，15毫摩尔/升3AT平板上，筛选准阳性克隆。
将通过上述步骤筛选所获得的准阳性克隆对应的质粒进行测序分析，选取能与猎物载体能够正确融合表达的基因在Genebank上进行比对分析，确定筛选到相互作用的蛋白质的名称和区段。为了排除假阳性，必须再将猎物质粒与诱饵质粒通过第2）步的方法一起转化酵母菌AH109，涂布SD-LEU-TRP固体平板，再通过划线转到SD-LEU-TRP-HIS-ADE平板，并依次转移到SD-LEU-TRP-HIS-ADE并含5毫摩尔/升3AT，10毫摩尔/升3AT，15毫摩尔/升3AT平板上，测试菌落能否生长。同时将涂布SD-LEU-TRP固体平板上的菌体通过第4）步方法进行β-半乳糖苷酶的活性测定，验证菌体能否显示蓝色。本过程的目的是进一步肯定蛋白质互作的真实性，通过排除其它因素的干扰直接测试猎物蛋白与诱饵蛋白能否重复上述筛库的过程。
本发明与已有的方法相比优点：
1 ）本文库的扩增过程能增加了低丰度基因数量，提高筛选到阳性克隆的几率。
2）通过一步法快速方便的转化酵母细胞，该过程简单，无需事先制备感受态，转化过程时间短，转化效率高，试剂消耗少，尤其适用于大规模的“诱饵”转化和多对蛋白质相互作用的验证。
3）文库的转化和阳性克隆的筛选中采用最低筛选压来寻找相互作用，避免了添加3-AT对酵母有毒性而产生阴性结果，能发现互作关系比较弱、低丰度的互作蛋白质。逐步增加选择压能方便快速的判断相互作用的强弱程度并有利于后续的验证实验。该过程快速方便，转化效率高，筛选到阳性克隆的几率也高。整个转化过程在一个大离心管中进行，不需要分装成很多小份分别转化。本转化过程比传统转化过程缩短4-6个小时时间。筛库过程消耗的试剂少。
4）β-半乳糖苷酶的活性测定筛选阳性克隆：扩增使菌落富集表达足够的β-半乳糖苷酶以使弱的互作显蓝色。该过程则将所有克隆进行了富集，能表达足够的β-半乳糖苷酶以使弱的互作显蓝色，排除了假阴性结果。
附图说明
图1是本方法中筛选到的阳性克隆的酵母双杂交回转验证图
A为转化酵母的配对质粒
B为配对的质粒转化酵母后在SD-LEU-TRP平板上的生长情况
C为β-半乳糖苷酶的活性测定膜法实验验证酵母双杂交的结果
D为配对的质粒转化酵母后在SD-LEU-TRP-HIS-ADE+5毫摩尔/升3AT平板上的生长情况
图2是免疫荧光共定位和免疫共沉淀检测“猎物”DVL2和VHL互作以验证酵母双杂交的结果图
A为免疫荧光共定位检测DVL2和VHL互作的结果
B为免疫共沉淀检测DVL2和VHL互作的结果
图3是GST-Pulldown和免疫共沉淀检测“猎物”PFDN5和VHL互作以验证酵母双杂交的结果图
A为GST-Pulldown检测PFDN5和VHL互作的结果
B为用Flag抗体免疫共沉淀检测PFDN5和VHL互作的结果
C为用Myc抗体进行免疫共沉淀检测PFDN5和VHL互作的结果
图4是GST-Pulldown和免疫共沉淀检测“猎物”UXT和VHL互作以验证酵母双杂交的结果图
A为GST-Pulldown检测UXT和VHL互作的结果
B为用Flag抗体免疫共沉淀检测UXT和VHL互作的结果
C为用Myc抗体免疫共沉淀检测UXT和VHL互作的结果
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
实施例
实施例一：酵母双杂交中文库扩增的优化方案(以人胎脑的cDNA文库为例)
1.从原始购买的以大肠杆菌形式保存的文库中吸取1微升菌液，进行一系列的梯度稀释，本实例中是将人胎脑cDNA文库以10-1，10-2，10-3，10-4， 10-5， 10-6 进行稀释，根据梯度稀释凃的平板上的菌落数量准确计算菌液的滴度。而一般采取2个梯度的稀释进行计算，由于实验过程中容易产生误差导致计算的结果不一致，所以本实验中采取6个梯度稀释来缩小误差，本实例中文库的滴度为2×108。
2.一般涂布150微升菌体到直径为15厘米的LB平板上的平均菌落数为20000cfu/plate（克隆形成单位/平板），如果我们打算用200微克文库，（一般100-500微克文库质粒可以检测大约1×106独立克隆）那么筛选的文库大小为2×106。
3.一般选择3倍文库大小的克隆数来进行酵母双杂交的筛选。即要求筛选的文库能够达到3×2×106=6×106独立克隆数，那么所需的文库扩增平板的数量N=独立克隆数/平均菌落数,即3×2×106/20000=300块平板。
4.计算文库扩增所需的菌液体积V1= 待检测的独立克隆数/文库的滴度，即6×106/2×108=30微升菌液，我们采用3倍计算体积的菌体即90微升菌液以获得高覆盖度的文库。
5.计算总的用于稀释文库的培养基的体积V2=300块平板×150微升=52.5毫升 LB液体培养基。
6.吸取原始文库90微升菌液稀释于52.5毫升 LB液体培养基，吸取150微升涂布300块直径为15厘米的含氨苄抗生素的LB平板上，在30℃培养2天后用含氨苄的5 毫升 LB液体培养基将每块平板上的菌刮洗下来，收集到一起，再在37℃摇床培养2-6个小时，菌体用QUAJIAN公司的试剂盒进行质粒的提取，并测试质粒的浓度。
实施例二、酵母的高效快速转化质粒方法
1.活化酵母菌AH109于YPDA固体平板上，30℃培养箱培养至长出单菌落。
2.晚上接种单菌落于3 毫升YPDA液体培养基中，250rpm,30℃培养过夜。
3.待OD660=1.0左右时将菌液分装到1.5毫升的Eppendorf管中离心收集菌体，10000 rpm,离心 1分钟。收集两次。
4.用1毫升无菌水洗菌体一次。
5.在每个1.5毫升的Eppendorf管中加入105 微升一步法转化缓冲液，与啤酒酵母液混匀，再加入0.5微克质粒DNA，同时设不加质粒的负对照。
6.将悬浊液混匀，然后放入42℃水浴锅热激30分钟。
7.10000 rpm 离心1分钟,弃上清，用100微升无菌水重悬。
8.将液体加入到SD–TRP 固体小平板上，涂匀，放置30℃培养箱中培养2-3天，得到含有”诱饵”质粒的酵母菌。
一步法转化缓冲液
| 反应成分 | 体积 |
| PEG3350(50%质量体积比) | 80微升 |
| LiAc(1摩尔/升) | 10微升 |
| DTT(1摩尔/升) | 10微升 |
| 鲑鱼精DNA(10毫克/毫升) | 5微升 |
| “诱饵”质粒 | 1微克 |
本方法中的实例酵母“诱饵”表达质粒pGBKT7-VHL构建过程
人的VHL基因由Moon-Kyoung Bae教授提供，使用带有EcoRⅠ酶切位点的5'端引物5HV1（5’– cggaattcatgccccggagggcggagaac–3’）与带有BamHⅠ位点的3'端引物3HV2（5’– cgggatcctcaatctcccatccgttgatg–3’）搭配，以人的VHL基因为模板扩增出VHL基因片段；PCR体系如下：
| 反应成分 | 体积 |
| 10×LA Taq 缓冲液 | 2.0微升 |
| 5'端引物（5微摩尔/升） | 1.5微升 |
| 3'端引物（5微摩尔/升） | 1.5微升 |
| dNTP（各2毫摩尔/升） | 1.0微升 |
| 模板DNA | 0.5微升 |
| La Taq（1单位/微升） | 0.2微升 |
| 去离子水 | 13.3微升 |
PCR程序：94℃ 5分钟，94℃ 30秒→60℃ 30秒→72℃ 30秒共进行35个循环，最后72℃ 5分钟，4°C保存。
将上述PCR片段使用EcoRⅠ/ BamHⅠ双酶切，酶切产物经过胶回收试剂盒回收，定向克隆到pGBKT7载体中，命名为pGBKT7-VHL。重组质粒经限制性内切酶酶切鉴定和测序确认。
实施例三、酵母菌的cDNA文库转化
1.第一天早上或晚上接单菌落于50毫升 SD–TRP液体培养基中，250rpm,30℃培养36-48小时。
2.第三天早上测试菌体浓度，取适量体积菌液转接于100毫升 YPDA液体培养基中(YPDA液体培养基在30℃水浴预热)，使起始OD660=0.3-0.4。
3.200rpm,30℃培养4-6小时至OD660=1.0。
4.3000g离心5 分钟收集菌体。
5.用6毫升LiAC（100毫摩尔/升）重悬菌体，30℃水浴孵育15分钟(每5分钟混匀一次)。
6.10000g离心1 分钟,弃上清，加入7.2毫升转库缓冲液,充分混匀，30℃水浴孵育30分钟。
7.在超净台上边晃动菌体边加入800微升 DMSO，42℃热激20分钟。
8.10000g离心1 分钟,弃上清。
9.用2.5毫升无菌水水重悬菌体，均匀涂布于25块直径为15厘米的SD-LEU-TRP-HIS-ADE固体平板上倒置于30℃培养5-7天。
10.将平板上的所有菌落做上标记并编号后用牙签挑到SD-LEU-TRP-HIS-ADE+5毫摩尔/升 3AT固体平板上，将长出来的菌再用牙签挑到SD-LEU-TRP-HIS-ADE+10毫摩尔/升3AT固体平板上，然后用牙签挑到SD-LEU-TRP-HIS-ADE+15毫摩尔/升3AT固体平板上，至此，已经有3个梯度的准阳性克隆并大致了解其相互作用的强弱。
转库缓冲液
| 反应成分 | 体积 |
| PEG3350(50%质量体积比) | 4800微升 |
| LiAc(1摩尔/升) | 720微升 |
| 鲑鱼精DNA(10毫克/毫升) | 200微升 |
| 文库质粒 | 100-200微克 |
| 水 | 补到总体积7200微升 |
实施例四、β-半乳糖苷酶的活性测定膜法实验方法
1.将SD-LEU-TRP-HIS-ADE固体平板上长出来的准阳性单菌落划线接种到SD-LEU-TRP固体平板上，30℃培养2-3天，以使菌落富集表达足够的β-半乳糖苷酶。
2.将SD-LEU-TRP固体平板上划线长出来的菌落用灭过菌的牙签挑出来点到Whatman滤膜或者滤纸上，滤膜或者滤纸事先剪成一定的大小能放入直径15厘米的培养皿中。
3.在点有菌体的滤纸的反面放一张同等大小的干净的滤纸，将滤纸弯曲成圆筒状放入吊桶中。
4.将吊桶轻轻放入液氮中1分钟进行破菌。
5.将吊桶缓慢的拿出来，用镊子将滤纸轻轻的夹出来，防止滤纸上的菌体掉下来。
6.把卷成圆筒状的滤纸轻轻展平，将下层滤纸拿出来放入直径15厘米的培养皿中，加入显色液{10毫升Z-缓冲液,167微升X-gal(20毫克/毫升)和27 微升beta-巯基乙醇}。用玻璃凃棒将滤纸推平使液体均匀分布。
7.将点有菌体的滤纸放在培养皿中，使液体均匀浸湿点菌的滤纸，倾斜平板并将多余的液体吸出来丢掉，将平板放置于37℃显色。
8.记录正对照的显色时间和所有菌体的显色时间和颜色深浅。显色时间早并且颜色深的为阳性克隆。
实施例五、常规的阳性克隆对应的质粒营救与分析
根据实验四和五中的结果进行综合分析后，优先选取能抵抗强筛选压和显色时间早并且颜色深的克隆，分批进行质粒营救。用SD–LEU液体培养基培养阳性克隆以丢失“猎物”质粒pGBKT7-VHL，再用天根公司试剂盒采用酶法Lyticase破壁和碱裂解法相结合提取质粒。用测序通用引物MATCHMAKER 5' AD LD-Insert Screening Amplimer和MATCHMAKER 3' AD LD-Insert Screening Amplimer进行PCR扩增，排除小于200bp片段对应的假阳性克隆。阳性的克隆对应的质粒进行测序分析并在NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上进行比对分析确定目的基因名称和互作的区段。由于有前面一系列优化步骤的筛选，再通过进一步的PCR验证，最终能够满足条件的阳性克隆数已经比较少，这时采用试剂盒直接提取质粒能够比传统的玻璃珠法和液氮反复冻融法节省时间并且效率更高。将能与“猎物”载体正确融合表达的阳性克隆对应的质粒与“诱饵”质粒pGBKT7-VHL共转化酵母菌AH109，以验证互作的真实性，这样通过直接的两个蛋白互作的验证就排除了其它因素的干扰。如果回转验证能够重复筛库的结果，基本就可以肯定互作是真实的。例如通过本方法找到了三个蛋白质： PFDN5、UXT和DVL2能和VHL相互作用。通过回转酵母菌AH109，三对互作既能够在SD-LEU-TRP固体平板上生长（结果如附图1 B），也能够在缺陷型的培养基SD-LEU-TRP-HIS-ADE+5毫摩尔/升 3AT固体平板上生长（结果如附图1 C）,还能够通过β-半乳糖苷酶的作用使菌体显蓝色（结果如附图1 D）,即回转验证结果与筛库的结果完全一样。
实施例六、利用本方法筛选到的“猎物”与“诱饵”互作的真实性的进一步验证，以肯定本方法的有效性
利用本发明获得的3个阳性克隆： PFDN5、UXT和DVL2，其中DVL2是已经报道过的阳性克隆， PFDN5和UXT是新发现的相互作用蛋白。
为了继续验证DVL2和VHL互作的真实性，我们做了后续的免疫荧光共定位实验。免疫荧光共定位实验过程：先将处理好的玻片铺到24孔板中并接种人的胚胎肾细胞HEK293，再将质粒pCMV-Myc-DVL2和pRK-Flag-VHL用Lipofection2000按说明书共转染到细胞中，36-48小时后用Triton处理并用羊血清IgG封闭细胞，然后用鼠的Flag抗体和FITC标记羊抗鼠的二抗与玻片上的细胞杂交以检测pRK-Flag-VHL质粒的表达；用兔的DVL2抗体和CY3标记羊抗兔的二抗杂交细胞以检测pCMV-Myc-DVL2质粒的表达；最后用Hoechest33258染细胞核。在激光共聚焦扫描显微镜下分别观察两个蛋白质的定位情况并重叠拍照。结果如附图2 A，附图2 A中的结果说明DVL2和VHL都在细胞质中有表达并且定位在一起。免疫共沉淀实验过程：将质粒pCMV-Flag-DVL2分别单独或与pCMV-Myc-VHL一起按图 2B所示配对用Lipofection2000转染人的胚胎肾细胞HEK293，36-48小时后裂解细胞，离心后取上清，留一部分用于检测蛋白质的表达，剩下的裂解物用Myc抗体和磁珠进行免疫沉淀，用Flag抗体检测免疫沉淀的结果。附图2 B显示DVL2和VHL在细胞中能够结合形成复合物，上图表示用Flag抗体检测免疫沉淀的结果，中间图表示用Flag抗体检测质粒pCMV-Flag-DVL2的表达，下图表示用Myc抗体检测质粒pCMV-Myc-VHL的表达。上述结果与已经报道的一致。
为了进一步肯定PFDN5能和VHL互作，我们做了体外的GST-Pulldwon实验（结果如附图3 A）和体内的免疫共沉淀实验（结果如附图3 B和C），GST-Pulldwon的结果说明PFDN5能在体外和VHL直接结合，不需要其它蛋白质或者因素的参与。免疫共沉淀实验结果显示PFDN5和VHL能在体内细胞中相互作用。GST-Pulldwon实验过程：将GST蛋白、GST-PFDN5融合蛋白和His-VHL融合蛋白分别在大肠杆菌BL21中表达并纯化。用GST磁珠富集体外原核表达纯化的GST蛋白和GST-PFDN5融合蛋白，再分别与纯化的His-VHL在4℃共同孵育12小时后用GST结合缓冲液进行洗脱，然后将蛋白质变性进行SDS-PAGE分离，最后考马斯亮蓝（Coomassic Brilliant Blue）染色和Westernblot检测。图3 A最上边图左边的目的带是直接纯化的His-VHL正对照；图3 A最上边图中间的空白是单独的GST与His-VHL孵育的结果，表明单独的GST标签蛋白不能和VHL互作；图3 A最上边图右边的目的带是GST-PFDN5与His-VHL孵育的结果，表示PFDN5能和VHL结合。图3 A中间的图是直接通过Coomassic Brilliant Blue染色检测GST蛋白（左边目的带）和GST-PFDN5融合蛋白（右边目的带），图3 A最下图是用GST抗体检测GST（左边目的带）和GST-PFDN5融合蛋白（右边目的带）。免疫共沉淀实验过程：将质粒pCMV-Myc-PFDN5分别单独或与pRK-Flag-VHL用Lipofection2000按图3B所示配对转染人的胚胎肾细胞HEK293，36-48小时后裂解细胞，离心后取上清，留一部分用于检测蛋白质的表达，剩下的裂解物用Flag抗体和磁珠进行免疫沉淀，用Myc抗体检测免疫沉淀的结果，结果表示PFDN5和VHL能互作（上图），质粒pRK-Flag-VHL的表达用Flag抗体检测（中间图），质粒pCMV-Myc-PFDN5的表达用Myc抗体检测（下图）。图3C的实验过程与图3B的过程一样，只是转染所用的质粒的配对不一样并且用Myc抗体进行的免疫沉淀实验。
为了进一步肯定UXT能和VHL互作，我们也做了体外的GST-Pulldwon（结果如附图4 A）和体内的免疫共沉淀实验（结果如附图4 B和C），与PFDN5的结果一样，UXT和VHL也能够在体外和体内互作。GST-Pulldwon实验过程：将GST蛋白、GST-VHL融合蛋白和His-UXT融合蛋白分别在大肠杆菌BL21中表达并纯化。用GST磁珠富集体外原核表达纯化的GST蛋白和GST-VHL融合蛋白，再分别与纯化的His-UXT在4℃共同孵育12小时后用GST结合缓冲液进行洗脱，然后将蛋白质变性进行SDS-PAGE分离，最后考马斯亮蓝（Coomassic Brilliant Blue）染色和Westernblot检测。图4 A最上边图左边的目的带是直接纯化的His-UXT正对照；图4 A最上边图中间的空白是单独的GST与His-UXT孵育的结果，表明单独的GST标签蛋白不能和UXT互作；图4 A最上边图右边的目的带是GST-VHL与His-UXT孵育的结果，表示UXT能和VHL结合。中间的图是直接通过Coomassic Brilliant Blue染色检测GST蛋白（左边目的带）和GST-VHL融合蛋白（右边目的带），最下图是用GST抗体检测GST（左边目的带）和GST-VHL融合蛋白（右边目的带）。免疫共沉淀实验过程：将质粒pCMV-Myc-UXT分别单独或与pRK-Flag-VHL用Lipofection2000按图4B所示配对转染人的胚胎肾细胞HEK293，36-48小时后裂解细胞，离心后取上清，留一部分用于检测蛋白质的表达，剩下的裂解物用Flag抗体和磁珠进行免疫沉淀，用Flag抗体进行免疫共沉淀的结果，结果表示UXT和VHL能互作（上图），质粒pCMV-Myc-UXT的表达用Myc抗体检测（中间图），质粒pRK-Flag-VHL的表达用Flag抗体检测（下图）。图4C的实验过程与图4B的过程一样，只是转染所用的质粒的配对不一样并且用Myc抗体进行的免疫沉淀实验。
所有以上实验都肯定了通过本酵母双杂交方法筛选到的相互作用的真实性和有效性。
本发明中，相关培养基配方如下：（都在110℃灭菌30min）
YPDA（固体）: 1% Yeast extract, 2% PolyPeptone, 2% Glucose, 0.05%Adenine Sulfate , 1.5% Agar；
YPDA（液体）: 1% Yeast extract, 2% PolyPeptone, 2% Glucose, 0.05%Adenine Sulfate ；
SD–TRP（固体）:3.4%YNB, 0.074%–TRP DO Supplement,2% Glucose, 2% Agar；
SD–TRP（液体）:3.4%YNB, 0.074%–TRP DO Supplement,2% Glucose；
SD–LEU（液体）:3.4%YNB, 0.069%–LEU DO Supplement,2% Glucose;
SD–LEU–TRP（固体）:3.4%YNB, 0.064%–LEU–TRP DO Supplement,2%Glucose, 2% Agar;
SD–LEU–TRP（液体）:3.4%YNB, 0.064%–LEU–TRP DO Supplement, 2% Glucose;
SD–LEU–TRP–HIS–ADE（固体）:3.4%YNB, 0.06%–LEU–TRP–HIS–ADE DO Supplement,2% Glucose, 2% Agar
Claims (3)
1.一种新的酵母双杂交方法，该方法包括下列步骤：
1）文库扩增：以大肠杆菌形式保存的组织或者细胞的cDNA文库，通过10倍梯度稀释测定文库的滴度，计算出扩增文库所需要的原始文库菌液的体积，实际扩增文库是在原始菌液所需体积的基础上增加1-3倍；
2）诱饵质粒转化酵母细胞： 将用来筛选蛋白质相互作用的诱饵质粒与转化混合物一起直接加入酵母菌AH109中并进行热激转化以获得含有能表达诱饵蛋白的重组酵母菌；
3）文库的转化和阳性克隆的筛选：将能表达诱饵蛋白的重组酵母菌通过选择培养基扩大培养后再转接到丰富培养基中培养并达到一定的浓度，然后将需要筛选的cDNA文库直接与转库混合物一起转化酵母菌，通过一系列的逐步增大的选择压筛选准阳性克隆；
4）β-半乳糖苷酶的活性测定筛选阳性克隆：将准阳性克隆富集培养以高表达β-半乳糖苷酶，通过酶促反应后的颜色变化肯定阳性克隆；
5）测序分析后的共转化验证：测序并经过分析后的猎物质粒与诱饵质粒共转化到酵母菌AH109中以表达两个融合蛋白质，通过选择压筛选和β-半乳糖苷酶的活性测定进一步排除假阳性以肯定蛋白质相互作用的真实性。
2.根据权利要求1中新的酵母双杂交方法，该方法包括下列步骤：
1）文库扩增：吸取文库扩增所需的菌液体积的3倍原始文库菌液稀释于LB液体培养基，吸取菌液涂布含氨苄抗生素的LB平板上，在30℃培养2天后用含氨苄的LB液体培养基将每块平板上的菌刮洗下来，收集到一起，再在37℃摇床培养2-6个小时，菌体用QUAJIAN公司的试剂盒进行质粒的提取，并测试质粒的浓度；
2）诱饵质粒转化酵母细胞：活化酵母菌AH109，收集菌体无菌水洗一次，加入一步法转化缓冲液（PEG3350(50%质量体积比)，80微升；LiAc(1摩尔/升)，10微升；鲑鱼精DNA(10毫克/毫升)，5微升；DTT(1摩尔/升)，10微升；质粒1微克），在42℃水浴锅热激30 分钟，离心后用无菌水重悬并涂平板，获得含有能表达诱饵蛋白的重组酵母菌；
3）文库的转化和阳性克隆的筛选：收集通过缺陷培养基培养后转接到丰富培养基中培养4-6小时的， OD660=0.9-1.1的重组酵母菌，并用LiAC重悬，加入转库缓冲液混匀（PEG3350(50%质量体积比)，4800微升；LiAc(1摩尔/升)，720微升；鲑鱼精DNA(10毫克/毫升)，200微升；文库质粒100-200微克在30℃水浴孵育15分钟，加入DMSO后42℃热激20分钟，收集菌体涂SD-LEU-TRP-HIS-ADE平板，并依次转移到SD-LEU-TRP-HIS-ADE并含5毫摩尔/升 3AT，10毫摩尔/升 3AT，15毫摩尔/升 3AT平板上，筛选准阳性克隆；
4）β-半乳糖苷酶的活性测定筛选阳性克隆：将SD-LEU-TRP-HIS-ADE固体平板上长出来的单菌落划线到SD-LEU-TRP固体平板上富集表达足够的β-半乳糖苷酶，挑出菌落点到滤纸上，液氮破菌，在37℃显色，通过酶促反应后的颜色变化进一步肯定阳性克隆，并测序；
5）测序分析后的共转化验证：将测序正确的猎物质粒与诱饵质粒共转化酵母菌AH109，涂布SD-LEU-TRP固体平板，再通过划线转到SD-LEU-TRP-HIS-ADE平板，并依次转移到SD-LEU-TRP-HIS-ADE并含5毫摩尔/升 3AT，10毫摩尔/升3AT，15毫摩尔/升3AT平板上，筛选准阳性克隆。
3.权利要求1或2中新的酵母双杂交方法在筛选蛋白质，和确认蛋白质新功能中的应用。
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