CN107034286A - 一种酵母双杂交筛选与mkl‑1蛋白质相互作用蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及遗传生物学技术领域，具体涉及一种酵母双杂交筛选与MKL‑1蛋白质相互作用的蛋白质的方法。制备能表达诱饵蛋白质MKL‑1蛋白质的重组酵母菌，cDNA文库转化至所述的重组酵母菌，利用His、Ade两种营养缺陷和显色反应单独或者组合使用，从而进一步筛选得到与MKL‑1蛋白质不同作用强度的阳性克隆。本发明采用逐步增加选择压的方法，方便快速的筛选出与MKL‑1蛋白质不同作用程度的蛋白质，并有利于后续的验证实验，对进一步阐明MKL‑1在白血病发生发展过程中的功能及调控作用具有重要意义。

Description

一种酵母双杂交筛选与MKL-1蛋白质相互作用蛋白质的方法
技术领域
本发明涉及遗传生物学技术领域，具体涉及一种酵母双杂交筛选与MKL-1蛋白质相互作用蛋白质的方法。
背景技术
基因组计划使大量的新基因不断被发现，然而单纯的基因组DNA序列尚不能解决许多生命问题。基因是相对静态的，而基因编码的产物-蛋白质则是动态的，蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物的功能相关。生命活动过程与蛋白质的相互作用也是密不可分的，如DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、细胞周期调控、信号转导等重要的生命过程均涉及到蛋白质复合体的作用。蛋白质的各种相互作用的性质有很大不同，有些联系很强烈，例如结构性的，有些则是很薄弱、时间有限的，比如在信号路径上的信息传递，因此，各种蛋白质相互作用的强弱和蛋白质复合体的功能关系密切。
目前用于大规模研究蛋白质之间相互作用的方法包括酵母双杂交、串联亲和纯化、质谱鉴定、蛋白质芯片以及基于生物信息学的分析方法等。酵母双杂交系统是1989年由Fields和Song提出的，其作用原理基于真核细胞转录因子(如GAL4和GCN4蛋白质)的结构特性。转录因子通常含有两个独立的结构域：DNA结合域(BD)和转录激活域(AD)，只有当这两种结构域共同作用时才能使转录正常进行。利用此特性，可以分别使BD与AD同“诱饵”蛋白(X)和“猎物”蛋白(Y)形成融合蛋白，一般把用来进行筛选的目的蛋白称为“诱饵”蛋白，而筛到的阳性克隆称为“猎物”蛋白。如果两种蛋白X和Y可以发生相互作用，就能使BD与AD在空间上充分接近，从而激活报告基因的转录；而单独的BD与AD蛋白质游离于细胞中不同的位置而分开，不能激活报告基因的转录。
目前公司开发出来的酵母双杂交系统有很多种，比如Clontech公司的MatchmakerGAL4 Two-Hybrid System系列、Invitrogen公司的ProQuest Two-Hybrid System等。系统中对应的酵母表达载体含有高拷贝的2u复制子(Clontech)，或者是低拷贝的ARS/CEN6复制子(Invitrogen)。其中的酵母菌种经过了基因改造后既不能产生GAL4，又不能合成亮氨酸(LEU)、色氨酸(TRP)、组氨酸(HIS)、腺嘌呤(ADE)，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基(SD-LEU-TRP-HIS-ADE)上无法正常生长。当所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的这些报告基因从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。酵母双杂交的文库转化方法有两种，一种是直接将cDNA文库以质粒的形式转化到含有“诱饵”质粒的酵母感受态细胞中；另外一种是根据酵母有性生殖的特点，事先将cDNA文库质粒转化α接合型酵母细胞，将“诱饵”表达载体转化a接合型细胞。α接合型和a接合型两种单倍体之间接合(mating)能形成二倍体(Bendixen C,et al.Nucleic AcidsRes,1994,22(9):1778-9)。
酵母双杂交系统主要应用于快速验证已知蛋白之间的相互作用及寻找新的相互作用蛋白质，尤其在寻找蛋白质互作区域时相当有优势。其优点有:(1)采用高拷贝和强启动子的表达载体使目的蛋白过量表达，方便复合物的形成；
(2)筛选过程在真核酵母活细胞内进行，一定程度上反映了体内的真实情况；
(3)检测的结果是基因表达产物的级联效应，通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用，而细胞内的免疫共沉淀依赖于两个互作蛋白质的解离程度，因为在免疫沉淀的过程中通过洗涤的过程降低了互作信号；(4)通过激活区域与转录起始复合物蛋白的互作增强了杂交蛋白质的稳定性，提高了检测灵敏度；(5)文库来源广泛，可采用不同组织、器官、细胞类型和特殊分化时期材料构建成cDNA文库(Luban J,et al.Curr Opin 4Biotechnol,1995,6(1):59-64)。根据不同基因和蛋白质的特点，还可构建很多适用于筛选某个特定蛋白质的相互作用的酵母双杂交载体和系统，如筛选激酶底物的酵母双杂交系统(YangX,et al.Science,1992,257(5070):680-2)、筛选药物配体的酵母双杂交系统(Yang M,et al.NucleicAcids Res,1995,23(7):1152-6)、筛选核糖体RNA合成酶相互作用蛋白质的酵母双杂交系统等(Nogi Y,et al.ProcNatlAcad Sci,88(16):7026-38)。
目前的酵母双杂交方法存在操作复杂，假阳性和假阴性多，结果主要为定性数据，不易精确判断蛋白质相互作用的强度等问题。
MKL-1是新近发现的血清反应因子(SRF)协同转录因子，在多种组织中广泛表达，可以诱导多种类型的细胞分化，MKL-1基因还具有抗凋亡的作用。利用酵母双杂交的方法筛选出白血病T淋巴细胞Jurkat细胞中与MKL-1作用的所有蛋白，对阐明MKL-1在白血病发生发展过程中的功能及调控作用具有重要意义，为治疗白血病提供理论基础和可能的药物作用靶点。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种酵母双杂交筛选与MKL-1蛋白质相互作用蛋白质的方法，该方法简单易行，不仅可以筛选出与MKL-1蛋白质相互作用的蛋白质，还可以判断出MKL-1蛋白质与靶蛋白相作用的强弱程度，为研究蛋白质的生物学功能提供依据。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种酵母双杂交筛选与MKL-1蛋白质相互作用蛋白质的方法，包括以下步骤：
(1)cDNA文库扩增并提取文库质粒；
(2)诱饵蛋白的重组酵母菌制备：将编码DNA-BD的基因与MKL-1蛋白质的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein；将融合蛋白BD-Baitprotein表达质粒直接加入酵母菌AH109感受态中并进行热激转化以获得含有能表达诱饵蛋白的重组酵母菌；
(3)cDNA文库转化与准阳性克隆的筛选：将步骤(2)中的能表达诱饵蛋白的重组酵母菌在缺陷培养基中培养后再转接到丰富培养基中培养并达到一定的浓度，然后与步骤(1)中的cDNA文库质粒共转染、涂SD-Trp-Leu-His板筛选准阳性克隆；
(4)His、Ade以及LacZ显色反应筛选不同作用强度的阳性克隆：利用His、Ade两种营养缺陷和显色反应单独或者组合使用进一步筛选得到与MKL-1蛋白质不同作用强度的阳性克隆；
(5)阳性克隆DNA提取和测序比对：将阳性克隆质粒从酵母细胞中提取出来进行DNA测序，并与GenBank数据库中的序列进行比对分析；
(6)测序分析后的共转化验证：测序并经过分析后的猎物质粒与诱饵质粒共转化到酵母菌AH109中以表达两个融合蛋白质，通过选择筛选和β-半乳糖苷酶的活性测定进一步排除假阳性以肯定蛋白质相互作用的真实性。
进一步地，所述的His、Ade以及LacZ显色反应筛选不同作用强度的阳性克隆的具体方法为：(1)使用Ade2或His3两者中的一种作为报告基因作为进行营养缺陷筛选，得到与诱饵蛋白具有中等强度或较弱结合的蛋白，分离筛选出来的蛋白对应的文库质粒；(2)同时使用Ade2、His3两种报告基因进行营养缺陷筛选，得到与诱饵蛋白具有较强结合的蛋白，分离出这些蛋白对应的文库质粒；(3)利用Ade2，His3以及lacZ三个报告基因同时筛选，得到与诱饵蛋白具有最强结合的蛋白，分离筛选出蛋白质对应的文库质粒。
本发明的有益效果：相发明提供一种酵母双杂交筛选与MKL-1蛋白质相互作用蛋白质的方法，与相对于现有技术，本发明采用逐步增加选择压的方法，方便快速的筛选出与MKL-1蛋白质不同作用程度的蛋白质，并有利于后续的验证实验。可见，本发明所述的一种酵母双杂交筛选与MKL-1蛋白质相互作用蛋白质的方法对进一步阐明MKL-1在白血病发生发展过程中的功能及调控作用具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2中MKL-1PCR扩增结果示意图；
图2为本发明实施例2中诱饵质粒pGBKT7-MKL-1菌落PCR结果示意图；
图3为本发明实施例3中MKL-1筛选文库的转化效率示意图；
图4为本发明实施例4中HIS、ADE以及LacZ显色反应筛选不同作用强度的阳性克隆数柱状图。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。
实施例1：酵母双杂交中文库扩增的优化方案(以人胎脑的cDNA文库为例)
1.从原始购买的以大肠杆菌形式保存的文库中吸取1μL菌液，进行一系列的梯度稀释，本实例中是将人胎脑cDNA文库以10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6进行稀释，根据梯度稀释涂布的平板上的菌落数量准确计算菌液的滴度。而一般采取2个梯度的稀释进行计算，由于实验过程中容易产生误差导致计算的结果不一致，所以本实验中采取6个梯度稀释来缩小误差，本实例中文库的滴度为2×108。
2.一般涂布150μL菌体到直径为15cm的LB平板上的平均菌落数为20000cfu/plate(克隆形成单位/平板)，如果我们打算用200μg文库，(一般100-500μg文库质粒可以检测大约1×106独立克隆)那么筛选的文库大小为2×106。
3.一般选择3倍文库大小的克隆数来进行酵母双杂交的筛选，即要求筛选的文库能够达到3×2×106＝6×106独立克隆数，那么所需的文库扩增平板的数量N＝独立克隆数/平均菌落数，即3×2×106/20000＝300块平板。
4.计算文库扩增所需的菌液体积V1＝待检测的独立克隆数/文库的滴度，即6×106/2×108＝30μL菌液，我们采用3倍计算体积的菌体即90μL菌液以获得高覆盖度的文库。
5.计算总的用于稀释文库的培养基的体积V2＝300块平板×150μL＝52.5μL LB液体培养基。
6.吸取原始文库90μL菌液稀释于52.5mL LB液体培养基，吸取150μL涂布300块直径为15cm的含氨苄抗生素的LB平板上，在30℃培养2天后用含氨苄的5mL LB液体培养基将每块平板上的菌刮洗下来，收集到一起，再在37℃摇床培养2-6个小时，菌体用QUAJIAN公司的试剂盒进行质粒的提取，并测试质粒的浓度。
实施例2：诱饵蛋白的重组酵母菌制备
为将MKL-1基因cDNA克隆构建到酵母双杂交的诱饵载体上，需对含有目的基因的载体进行扩增、SfiI酶切，获得该克隆片段，并与SfiI酶切的酵母双杂交诱饵载体质粒pGBKT7载体连接。
1.引物合成
根据MKL-1基因的cDNA序列分别在其两端添加SfiI的酶切位点序列设计引物，用于扩增MKL-1基因的cDNA片段，引物序列如下：
MKL-1-F：aaGGCCATTAC GGCCATGGCAAGTAACTGTGAGAAAATG
MKL-1-R：ccGGCC GAGGC GGCC TTAGAGGTTCCCATTTTGTTTG
2.目的基因扩增
用于扩增目的片段的热聚合酶：全式金TransStartFastPfu DNA Polymerase
如图1所示，条带M为DNA Marker，条带所对应的浓度从上至下依次为3k、2k、1.5k、1k、750bp、500bp，泳带1～3为扩增的MKL-1产物。
3.MKL-1与诱饵载体质粒pGBKT7的酶切和连接
酶切和连接反应体系：
4.连接产物转化大肠杆菌Top10
向步骤3中连接反应体系中加入100μL大肠杆菌Top10感受态，冰浴30min；然后仪次42℃水浴热激90s(45s-2min)和冰浴2min。冰浴结束后，向其中加入900μLLB液体培养基，37℃，150rpm，孵育1h；离心收菌，弃上清液，留约100μL混匀后涂布含Kan抗性的LB平板，恒温培养过夜。
5.酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-MKL-1的鉴定
从步骤4的连接体系转化平板上，随机挑取8个大肠杆菌转化子接种于带卡那抗性的液体LB培养基，于37℃，250rpm振荡培养16h(过夜)后，用质粒引物进行PCR扩增，并对扩增得到阳性条带的克隆选取两个(编号为1、2)进行质粒抽提(Axygen质粒小量抽提试剂盒)和测序。插入片段测序结果经比对确认正确后，进行后续实验。
如图2所示，M为DNAMarker，条带所对应的浓度由上至下依次为：3k、2k、1.5k、1k、750bp、500bp，泳带1～8为pGBKT7-MKL-1转化子PCR产物。选取泳带1和2进行质粒抽取和测序，结果显示插入片段测序正确，可进行后续实验。
6.MKL-1自激活检测
pGBKT7-MKL-1+pGADT7共转化AH109长出的酵母转化子随机挑取了6个菌落进行自激活检测，以pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53为阳性对照、pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC为阴性对照。包括HIS3、ADE2和LacZ共3个报告基因的检测。
HIS3和ADE2的检测采用点板培养的方法，将转化子点板至SD-TLHA平板，30℃恒温培养4天，观察其生长状态。
以pGADT7-T+pGBKT7-53(已经明确T蛋白和53蛋白是在酵母细胞内能够发生结合并启动报告基因表达的两种蛋白)为阳性对照，pGADT7-T+pGBKT7-lam(已经明确T蛋白和lam蛋白在酵母细胞内不能发生结合)为阴性对照，LacZ报告基因的检测方法如下：
1)从转化平板随机挑取6个菌落于滤纸片上；
2)将滤纸完全浸于液氮中90s，取出常温放置2min晾干；
3)在培养皿中加入新鲜配制的显色液，一般9cm培养皿用2-3mL显色液。显色液配方：
4)将显色液加入培养皿中，再放入一张干净的滤纸，让其完全浸湿，将冻溶后的滤纸放在最上面，使显色液浸透表层，盖上皿盖。30℃避光培养，20min后开始观察，一般2h后可开始看到颜色变化，4-5h拍照记录结果。结果表明，对照菌株在SD-TL缺陷平板上都能正常生长，而仅有阳性对照可在SD-TLHA缺陷平板生长，pGBKT7-MKL-1+pGADT7转化子中随机挑选的6个菌落在SD-TLHA缺陷平板上不能生长，生长状态与阴性对照相同，LacZ检测结果也与阴性对照相同，因此MKL-1诱饵克隆没有自激活作用。
实施例3：cDNA文库转化与准阳性克隆的筛选
用含有正确pGBKT7-MKL-1诱饵质粒的AH109酵母转化子作为受体菌制备感受态，将文库质粒pGADT7--cDNA转入其中，涂SD-Trp-Leu-His+5mM 3AT平板。
1)从SD-T平板挑取单克隆菌种接于液体SD-T培养基50ml，30℃，225rpm，振荡培养18h；
2)转接于YPDA液体500ml，使初始OD600＝0.2，30℃，225rpm，振荡培养4-5h，至OD600＝0.6；
3)离心收菌，室温，4000rpm，5min；
4)用30ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；
5)用20ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；
6)用10ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；
7)向离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1min左右，至完全混匀；
8)30℃水浴孵育，30min；
9)42℃水浴热激，25min；
10)30℃水浴复苏1h；
11)离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清，用8mL无菌水重悬菌体，尽量温和地混匀，从中取20μL培养物经梯度稀释后涂SD-TL平板3块，用于检测文库转化效率。其余涂SD-TLH+5mM 3AT平板，每块200μL，共40块；
12)30℃恒温培养3-4天，观察转化结果，记录转化效率，结果如图3所示，计算出的转化总数为(27/0.2+118/2+340/20)×1/3×8000＝5.6×105，转化效率为5.6×105/25μg＝2.25×104/μg。
实施例4：HIS、ADE以及LacZ显色反应筛选不同作用强度的阳性克隆
1.阳性克隆His报告基因的检测
以pGADT7-T+pGBKT7-53(已经明确T蛋白和53蛋白是在酵母细胞内能够发生结合并启动报告基因表达的两种蛋白)为阳性对照，pGADT7-T+pGBKT7-lam(已经明确T蛋白和lam蛋白在酵母细胞内不能发生结合)为阴性对照，将实施例3中初始阳性克隆转化子转接到SD-TL缺陷型平板中继续培养2-3天，然后将此SD-TL缺陷型平板上长出的72个初始阳性克隆转化子分别用无菌水稀释后点种至SD-TL和SD-TLH缺陷平板，30℃恒温培养3-4天，在HIS3报告基因的检测结果中，可以看到，阳性对照在SD-TL和SD-TLH都能正常生长，而阴性对照由于不会激活HIS3报告基因，在SD-TL可以正常生长，但在缺少His这种氨基酸的SD-TLH平板上不能生长。因此，在72个初始阳性克隆中，能在SD-TLH生长的是激活了His报告基因质粒，从而筛选出与40种能与诱饵蛋白具有中等强度或较弱结合的蛋白。
2.阳性克隆His和Ade报告基因的检测
以pGADT7-T+pGBKT7-53(已经明确T蛋白和53蛋白是在酵母细胞内能够发生结合并启动报告基因表达的两种蛋白)为阳性对照，pGADT7-T+pGBKT7-lam(已经明确T蛋白和lam蛋白在酵母细胞内不能发生结合)为阴性对照，将实施例3中初始阳性克隆转化子转接到SD-TL缺陷型平板中继续培养2-3天，然后将此SD-TL缺陷型平板上长出的72个初始阳性克隆转化子分别用无菌水稀释后点种至SD-TL和SD-TLHA缺陷平板，30℃恒温培养3-4天，在ADE2和HIS3报告基因的检测结果中，可以看到，阳性对照在SD-TL和SD-TLHA都能正常生长，而阴性对照由于不会激活HIS3和ADE2报告基因，在SD-TL可以正常生长，但在缺少His和Ade这种氨基酸的SD-TLH平板上不能生长。因此，在72个初始阳性克隆中，能在SD-TLHA生长的是激活了His和Ade报告基因质粒，从而筛选出23种能与诱饵蛋白具有较强结合的蛋白。
3.阳性克隆LacZ报告基因检测
以pGADT7-T+pGBKT7-53(已经明确T蛋白和53蛋白是在酵母细胞内能够发生结合并启动报告基因表达的两种蛋白)为阳性对照，pGADT7-T+pGBKT7-lam(已经明确T蛋白和lam蛋白在酵母细胞内不能发生结合)为阴性对照，将筛选出的与诱饵蛋白具有较强结合的蛋白质粒用无菌水重悬后点于滤纸片上进行LacZ报告基因检测，结果显示，上述阳性克隆中共有9个没能通过LacZ报告基因的检测，即筛选出14种能与诱饵蛋白具有最强结合的蛋白。
如图4所示，在72种准阳性克隆中，使用His3作为报告基因进行营养缺陷筛选，得到40种与诱饵蛋白具有中等强度或较弱结合的蛋白，同时使用Ade2、His3两种报告基因进行营养缺陷筛选，得到23种与诱饵蛋白具有较强结合的蛋白，利用Ade2，His3以及lacZ三个报告基因同时筛选，得到14种与诱饵蛋白具有最强结合的蛋白，分别分离筛选出蛋白质对应的文库质粒。
实施例5：阳性克隆DNA提取和测序比对
将实施例4中的阳性克隆菌株分别接入SD-TL液体培养基，振荡培养过夜后采用酵母小量抽提试剂盒(索莱宝公司)抽提酵母质粒。然后，将抽提得到的酵母质粒转化大肠杆菌Top10新鲜感受态进行扩增。
大肠杆菌Top10新鲜感受态制备步骤：
1)种子液：接种TOP10单克隆至3ml LB液体培养基，37℃，220rpm，振荡培养16h(过夜)；
2)转接1ml种子液至100ml LB液体培养基，37℃，220rpm，振荡培养2h；
3)待菌液降至室温后离心收菌，或冰浴一段时间后离心收菌，离心：4℃，5000rpm，5min，弃上清；
4)用0.1M MgCl2悬浮菌体，100ml菌液用10ml 0.1M MgCl2，轻轻吹打，充分混匀，冰浴10min-1h；
5)离心收菌，4℃，5000rpm，5min，弃上清；
6)用0.1M CaCl2悬浮菌体，100ml菌液用4ml CaCl2。轻轻吹打，充分悬浮；
7)冰浴30min后可用于质粒扩增，每个酵母抽提产物用100μL的感受态进行转化。
将含有阳性克隆的Top10转化子转接含有Amp的LB液体培养扩增后抽提质粒(Axygen质粒小量抽提试剂盒)，对质粒进行DNA测序和BLAST比对。
本实验筛选到与MKL-1蛋白质相互作用的72个准阳性克隆质粒和与MKL-1蛋白质不同作用强度的阳性克隆质粒，经过BALST比对，分别属于40种不同的蛋白编码基因。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种酵母双杂交筛选与MKL-1蛋白质相互作用蛋白质的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)cDNA文库扩增并提取文库质粒；
(2)诱饵蛋白的重组酵母菌制备：将编码DNA-BD的基因与MKL-1蛋白质的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein；将融合蛋白BD-Baitprotein的表达质粒直接加入酵母菌AH109感受态中并进行热激转化以获得含有能表达诱饵蛋白的重组酵母菌；
(3)cDNA文库转化与准阳性克隆的筛选：将步骤(2)中的能表达诱饵蛋白的重组酵母菌在缺陷培养基中培养后再转接到丰富培养基中培养并达到一定的浓度，然后与步骤(1)中的cDNA文库质粒共转染、涂SD-Trp-Leu-His板筛选准阳性克隆；
(4)HIS、ADE以及LacZ显色反应筛选不同作用强度的阳性克隆：利用HIS、ADE两种营养缺陷和显色反应单独或者组合使用进一步筛选得到与MKL-1蛋白质不同作用强度的阳性克隆；
(5)阳性克隆DNA提取和测序比对：将阳性克隆质粒从酵母细胞中提取出来进行DNA测序，并与GenBank数据库中的序列进行比对分析；
(6)测序分析后的共转化验证：测序并经过分析后的猎物质粒与诱饵质粒共转化到酵母菌AH109中以表达两个融合蛋白质，通过营养缺陷选择筛选和β-半乳糖苷酶的活性测定进一步排除假阳性以肯定蛋白质相互作用的真实性。
2.根据权利要求1所述的一种酵母双杂交筛选与MKL-1蛋白质相互作用蛋白质的方法，其特征在于：His、Ade以及LacZ显色反应筛选不同作用强度的阳性克隆的具体方法为：
(1)使用Ade2或His3两者中的一种作为报告基因进行营养缺陷筛选，得到与诱饵蛋白具有中等强度或较弱结合的蛋白，分离筛选出来的蛋白对应的文库质粒；
(2)同时使用Ade2、His3两种报告基因进行营养缺陷筛选，得到与诱饵蛋白具有较强结合的蛋白，分离出这些蛋白对应的文库质粒；
(3)利用Ade2，His3以及lacZ三个报告基因同时筛选，得到与诱饵蛋白具有最强结合的蛋白，分离筛选出这些蛋白质对应的文库质粒。
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