CN110257467A - 一种检测肿瘤抑制因子p53显性抑制突变的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于酵母基因工程技术在检测和筛选肿瘤抑制因子p53显性抑制突变方面的应用及相应的试剂盒和方法，属于分子生物学检测领域。利用本发明，可以实现对p53的基因突变是否具有显性抑制特性进行快速有效检测。肿瘤抑制因子p53蛋白作为治疗肿瘤的热门靶点，检测在肿瘤的发生过程中p53突变体是否具有显性抑制突变效应对实现肿瘤个性化治疗有不可估量的精准医疗价值。

Description

一种检测肿瘤抑制因子p53显性抑制突变的试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体地，涉及一种检测肿瘤抑制因子p53显性抑制突变的试剂盒及其应用。

背景技术

p53肿瘤抑制因子在细胞内充当"细胞生长和分裂的守卫者"。当细胞受到不同的压力的时候，例如DNA损伤，病毒感染，异常的生长信号或者化学药物刺激，都会激活细胞内不同的p53信号传导途径，抑制p53蛋白降解，将p53蛋白稳定在较高的水平，从而发挥P53作为转录因子的作用，激活许多下游基因的表达，使受损伤的细胞停在细胞周期检验点，修复受到损伤的DNA，或者使细胞进入细胞凋亡途径，从而维护细胞基因组的完整，因而p53是最重要的肿瘤抑制基因。

然而，大约一半的肿瘤中会发生p53基因突变，使p53蛋白失去转录活性，使肿瘤细胞不对各条通路上的信号做出反应，因此肿瘤细胞不会在细胞周期滞留或发生细胞凋亡，而是发生恶性的增生。对于没有发生p53基因突变的肿瘤细胞，也往往会通过改变p53通路上的蛋白表达来降低p53通路的敏感性以逃避p53蛋白的调控。

肿瘤抑制蛋白p53在体内以四聚体的形式行使其转录激活功能。在肿瘤发展过程中的一个明显现象是突变型和野生型的等位基因在细胞内会共存很长的一段时期。从理论上讲，当细胞内有既有野生型又有突变型的p53蛋白时，由单一野生型、野生与突变混合型和单一突变型组成的四聚体的比例为1：14：1。所以突变型的p53蛋白很大几率上可以与野生型的p53蛋白结合，对四聚体的转录活性产生影响。在杂合细胞内使野生型p53蛋白不能行使正常转录激活功能的p53基因突变称为显性抑制突变。对p53显性抑制突变的研究最先是基于哺乳动物细胞系统，但哺乳动物细胞系统中野生型和突变型在细胞内的表达量不易控制，也容易受到内源性因素的干扰，导致实验结果不稳定。

1995年Flaman,J.M.等建立了一种在RNA水平上对p53突变进行检测的酵母基因工程技术，通过改造一个内源腺嘌呤基因(ADE2)缺陷型的酿酒酵母菌株，在其染色体上整合了一个含有p53蛋白RGC启动子调控的一个可以表达正常ADE2的报告基因，由此获得酿酒酵母菌株yIG397。当酿酒酵母菌株yIG397转入从肿瘤组织样品中得到的p53cDNA RT-PCR产物和带有缺口的酵母表达载体时，发生同源重组产生缺口修复的p53表达载体，如果该表达载体表达转录功能正常p53蛋白，就会与宿主菌株染色体上的特异性序列(RGC)结合，激活下游报告基因ADE2的表达，从而在选择性培养基平板上形成大的白色菌落。反之如果表达转录功能不正常的p53蛋白，就不能结合并激活ADE2的表达，形成为小的红色菌落。通过红色/白色菌落的颜色就能判断p53基因的状态。由于绝大多数的p53突变都会造成p53蛋白转录激活功能的丧失，所以yIG397系统可以很灵敏地检测到各种类型的p53蛋白功能突变。但其检测方法仍有待改进。

发明内容

为了解决上述技术问题，发明人基于yIG397系统建立一种对p53基因显性抑制效应检测方法。通过将突变型和野生型的p53基因分别克隆到带有色氨酸Trp和组氨酸His基因标记的两个表达载体上，然后在缺少Trp和His的平板上筛选细胞体内有两种p53基因型的转化酵母菌yIG397，通过观察酵母菌克隆的颜色可以判断突变的p53蛋白是否影响了野生型蛋白的转录激活活性，也就是检测p53突变是否具有显性负调控作用。

本发明第一方面提供第一氨基酸标记基因、第一氨基酸标记基因及酵母表达质粒在制备用于检测肿瘤抑制因子p53显性抑制突变的试剂盒中的应用。

在本发明的一些实施方案中，所述第一氨基酸标记基因为组氨酸标记基因。进一步地，所述组氨酸标记基因为pMV-HIS3载体中包含的组氨酸标记基因，所述pMV-HIS3载体具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，更进一步地，利用具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的引物对扩增所述pMV-HIS3载体可以得到所述组氨酸标记基因。

在本发明的一些具体实施方案中，所述组氨酸标记基因具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列。

在本发明的另一些具体实施方案中，所述组氨酸标记基因能够编码SEQ ID NO.5所示氨基酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述第二氨基酸标记基因为色氨酸标记基因。进一步，所述色氨酸标记基因为pGBKT7载体包含的色氨酸标记基因，所述pGBKT7载体具有SEQID NO.6所示的核苷酸序列，更进一步地，利用具有SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的引物对扩增所述pGBKT7载体载体可以得到所述色氨酸标记基因。

在本发明的一些具体实施方案中，所述色氨酸标记基因具有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述色氨酸标记基因能够编码SEQ ID NO.10所示氨基酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述酵母表达质粒为pLS76。

本发明的第二方面提供一种用于检测肿瘤抑制因子p53显性抑制突变的试剂盒，所述试剂盒包括第一氨基酸标记基因、第一氨基酸标记基因及酵母表达质粒。

在本发明的一些实施方案中，所述第一氨基酸标记基因为组氨酸标记基因。进一步地，所述组氨酸标记基因为pMV-HIS3载体中包含的组氨酸标记基因，所述pMV-HIS3载体具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，更进一步地，利用具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的引物对扩增所述pMV-HIS3载体可以得到所述组氨酸标记基因。

在本发明的一些具体实施方案中，所述组氨酸标记基因具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列。

在本发明的另一些具体实施方案中，所述组氨酸标记基因能够编码SEQ ID NO.5所示氨基酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述第二氨基酸标记基因为色氨酸标记基因。进一步，所述色氨酸标记基因为pGBKT7载体包含的色氨酸标记基因，所述pGBKT7载体具有SEQID NO.6所示的核苷酸序列，更进一步地，利用具有SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的引物对扩增所述pGBKT7载体载体可以得到所述色氨酸标记基因。

在本发明的一些具体实施方案中，所述色氨酸标记基因具有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述色氨酸标记基因能够编码SEQ ID NO.10所示氨基酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述酵母表达质粒为pLS76。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒包括带有组氨酸标记基因的酵母表达质粒和带有色氨酸标记基因的酵母表达质粒。

进一步地，所述试剂盒还包括限制性内切酶，更进一步地，所述限制性内切酶包括EcoR I和Hpa I。

再进一步地，所述试剂盒还包括连接试剂，包括但不限于DNA连接酶。

再进一步地，所述试剂盒还包括酵母菌培养基，所述酵母菌培养基缺少第一氨基酸和第二氨基酸。

再进一步地，所述试剂盒还包括酵母菌。

本发明的第三方面提供一种非诊断目的的检测肿瘤抑制因子p53显性抑制突变的方法，包括以下步骤：

(1)分别构建带有第一氨基酸标记基因和第二氨基酸标记基因的酵母表达载体；

(2)将野生型p53基因克隆到带有第一氨基酸标记基因的酵母表达载体上；将突变型p53基因克隆到带有第二氨基酸标记基因的酵母表达载体上；

(3)将步骤(2)获得的两种酵母表达载体转化至酵母菌yIG397中；

(4)在缺少第一氨基酸和第二氨基酸的固体培养基上筛选带有两种类型p53基因的酵母菌，并观察菌落颜色，

若菌落颜色为红色，表明所述待检测突变型p53基因具有显性抑制作用，若菌落颜色为白色，表达所述待检测突变型p53基因不具有显性抑制作用。

在本发明的一些实施方案中，所述第一氨基酸标记基因为组氨酸标记基因。进一步地，所述组氨酸标记基因为pMV-HIS3载体中包含的组氨酸标记基因，所述pMV-HIS3载体具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，更进一步地，利用具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的引物对扩增所述pMV-HIS3载体可以得到所述组氨酸标记基因。

在本发明的一些具体实施方案中，所述组氨酸标记基因具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列。

在本发明的另一些具体实施方案中，所述组氨酸标记基因能够编码SEQ ID NO.5所示氨基酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述第二氨基酸标记基因为色氨酸标记基因。进一步，所述色氨酸标记基因为pGBKT7载体包含的色氨酸标记基因，所述pGBKT7载体具有SEQID NO.6所示的核苷酸序列，更进一步地，利用具有SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的引物对扩增所述pGBKT7载体载体可以得到所述色氨酸标记基因。

在本发明的一些具体实施方案中，所述色氨酸标记基因具有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述色氨酸标记基因能够编码SEQ ID NO.10所示氨基酸序列。

进一步地，在本发明的步骤(1)中，利用带有EcoR I和Hpa I酶切位点的具有SEQID NO.2和SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的引物对扩增所述pMV-HIS3载体，利用EcoR I和Hpa I双酶切PCR产物，同时利用同样的限制性内切酶处理酵母表达质粒pLS76，后将组氨酸标记基因连接到所述酵母表达质粒pLS76中。

同样地，利用带有EcoR I和Hpa I酶切位点的具有SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的引物对扩增所述pGBKT7载体，利用EcoR I和Hpa I双酶切PCR产物，同时利用同样的限制性内切酶处理酵母表达质粒pLS76，后将色氨酸标记基因连接到所述酵母表达质粒pLS76中。

在本发明的一些实施方案中，所述野生型p53基因编码SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述突变为点突变、插入突变或缺失突变。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明具有以下有效效果：

本发明的应用和试剂盒可以对p53的基因突变是否具有显性抑制特性进行快速有效检测。肿瘤抑制因子p53蛋白作为治疗肿瘤的热门靶点，检测在肿瘤的发生过程中p53突变体是否具有显性抑制突变效应对实现肿瘤个性化治疗有种不可估量的精准医疗价值。

附图说明

图1示出了本发明检测方法的示意图。

图2示出了利用本发明检测方法的检测结果。mutant 1:p53Arg249Ser；mutant 2:p53Ile195Asn；mutant 3:p53His179Asn；mutant 4:p53Glu258Lys；mutant 5:p53DelSCMGG(241-245aa)；mutant 6:p53Arg282Trp；mutant 7:p53Arg273Ser；mutant 8:p53Met246Val；mutant 9:p53Arg181His；mutant 10:p53Glu180Gly。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

本发明用到的酿酒酵母为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae yIG397 MATaade2-1 leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100 ura3-1 URA3 3XRGC::pCYC1::ADE2。

本发明用到的酵母培养基：

完全培养基YEPD：1％酵母提取物，2％多蛋白胨，2％葡萄糖。

合成基本培养基SD-Trp-His+Ade：0.67％ YNB，2％葡萄糖，0.2％ Dropout mix加入5μg/mL腺嘌呤或者200μg/mL腺嘌呤如表1。

表1 Dropout mix配方

以上培养基均为液体培养基，如需要固体培养基，加入2％琼脂。所有培养基都以15磅20min高压灭菌。

培养条件：酵母菌在30℃培养。

本发明用到的1×TE/LiAc溶液配方：0.1M LiAc，10mM Tris-Hcl pH＝7.5。

本发明用到的1mM EDTA-NaOHPEG/TE/LiAc溶液配方：0.1M LiAc，10mM Tris-HclpH＝7.5，1mM EDTA-NaOH，50％ PEG-400。

实施例1酵母表达载体pRDwtHIS3的构建

首先用EcoR I和Hpa I双酶切酵母表达质粒pLS76，释放出一段1.1Kb的LEU2标记基因的片断，回收大片段。

引物PHis3-F和PHis3-R扩增来自载体pMV-HIS3的一段850bp的HIS3标记基因片断，同样用EcoR I和Hpa I双酶切，凝胶回收酶切产物。

其中，pMV-HIS3载体具有以下核苷酸序列(SEQ ID NO.1):

ctagtacactctatatttttttatgcctcggtaatgattttcatttttttttttccacctagcggatgactctttttttttcttagcgattggcattatcacataatgaattatacattatataaagtaatgtgatttcttcgaagaatatactaaaaaatgagcaggcaagataaacgaaggcaaagatgacagagcagaaagccctagtaaagcgtattacaaatgaaaccaagattcagattgcgatctctttaaagggtggtcccctagcgatagagcactcgatcttcccagaaaaagaggcagaagcagtagcagaacaggccacacaatcgcaagtgattaacgtccacacaggtatagggtttctggaccatatgatacatgctctggccaagcattccggctggtcgctaatcgttgagtgcattggtgacttacacatagacgaccatcacaccactgaagactgcgggattgctctcggtcaagcttttaaagaggccctaggggccgtgcgtggagtaaaaaggtttggatcaggatttgcgcctttggatgaggcactttccagagcggtggtagatctttcgaacaggccgtacgcagttgtcgaacttggtttgcaaagggagaaagtaggagatctctcttgcgagatgatcccgcattttcttgaaagctttgcagaggctagcagaattaccctccacgttgattgtctgcgaggcaagaatgatcatcaccgtagtgagagtgcgttcaaggctcttgcggttgccataagagaagccacctcgcccaatggtaccaacgatgttccctccaccaaaggtgttcttatgtag

扩增得到的HIS3标记基因具有以下核苷酸序列(SEQ ID NO.4):

atgacagagcagaaagccctagtaaagcgtattacaaatgaaaccaagattcagattgcgatctctttaaagggtggtcccctagcgatagagcactcgatcttcccagaaaaagaggcagaagcagtagcagaacaggccacacaatcgcaagtgattaacgtccacacaggtatagggtttctggaccatatgatacatgctctggccaagcattccggctggtcgctaatcgttgagtgcattggtgacttacacatagacgaccatcacaccactgaagactgcgggattgctctcggtcaagcttttaaagaggccctaggggccgtgcgtggagtaaaaaggtttggatcaggatttgcgcctttggatgaggcactttccagagcggtggtagatctttcgaacaggccgtacgcagttgtcgaacttggtttgcaaagggagaaagtaggagatctctcttgcgagatgatcccgcattttcttgaaagctttgcagaggctagcagaattaccctccacgttgattgtctgcgaggcaagaatgatcatcaccgtagtgagagtgcgttcaaggctcttgcggttgccataagagaagccacctcgcccaatggtaccaacgatgttccctccaccaaaggtgttcttatgtag

编码的氨基酸序列如下(SEQ ID NO.5)：

MTEQKALVKRITNETKIQIAISLKGGPLAIEHSIFPEKEAEAVAEQATQSQVINVHTGIGFLDHMIHALAKHSGWSLIVECIGDLHIDDHHTTEDCGIALGQAFKEALGAVRGVKRFGSGFAPLDEALSRAVVDLSNRPYAVVELGLQREKVGDLSCEMIPHFLESFAEASRITLHVDCLRGKNDHHRSESAFKALAVAIREATSPNGTNDVPSTKGVLM

将以上酶切载体回收大片段PCR产物连接，转化大肠杆菌Top10，得到转化子，酶切PCR初步鉴定阳性的转化子。

将上面得到的多个阳性转化子转化yIG397，在SD-His+Ade(200μg/mL)的培养基上生长，能长出的白色菌落说明转化子上插入的HIS3标记基因片断功能正常，命名为pRDwtHIS3。

实施例2酵母表达载体pRDmTRP1的构建

首先用EcoR I和Hpa I双酶切酵母表达质粒pLS76，释放出一段1.1Kb的LEU2标记基因的片断，回收大片段。

引物PTrp1-F和PTrp1-R(序列如表2所示)PCR扩增来自载体pGBKT7的一段1.2Kb的TRP1标记基因片断，同样用EcoR I和Hpa I双酶切，凝胶回收酶切产物。

其中，pGBKT7载体具有以下核苷酸序列(SEQ ID NO.6):

tctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatagatcaacgacattactatatatataatataggaagcatttaatagaacagcatcgtaatatatgtgtactttgcagttatgacgccagatggcagtagtggaagatattctttattgaaaaatagcttgtcaccttacgtacaatcttgatccggagcttttctttttttgccgattaagaattaattcggtcgaaaaaagaaaaggagagggccaagagggagggcattggtgactattgagcacgtgagtatacgtgattaagcacacaaaggcagcttggagtatgtctgttattaatttcacaggtagttctggtccattggtgaaagtttgcggcttgcagagcacagaggccgcagaatgtgctctagattccgatgctgacttgctgggtattatatgtgtgcccaatagaaagagaacaattgacccggttattgcaaggaaaatttcaagtcttgtaaaagcatataaaaatagttcaggcactccgaaatacttggttggcgtgtttcgtaatcaacctaaggaggatgttttggctctggtcaatgattacggcattgatatcgtccaactgcatggagatgagtcgtggcaagaataccaagagttcctcggtttgccagttattaaaagactcgtatttccaaaagactgcaacatactactcagtgcagcttcacagaaacctcattcgtttattcccttgtttgattcagaagcaggtgggacaggtgaacttttggattggaactcgatttctgactgggttggaaggcaagagagccccgaaagcttacattttatgttagctggtggactgacgccagaaaatgttggtgatgcgcttagattaaatggcgttattggtgttgatgtaagcggaggtgtggagacaaatggtgtaaaagactctaacaaaatagcaaatttcgtcaaaaatgctaagaaataggttattactgagtagtatttatttaagtattgtttgtgcacttgccgatc

扩增得到的TRP1标记基因具有以下核苷酸序列(SEQ ID NO.9):

atgtctgttattaatttcacaggtagttctggtccattggtgaaagtttgcggcttgcagagcacagaggccgcagaatgtgctctagattccgatgctgacttgctgggtattatatgtgtgcccaatagaaagagaacaattgacccggttattgcaaggaaaatttcaagtcttgtaaaagcatataaaaatagttcaggcactccgaaatacttggttggcgtgtttcgtaatcaacctaaggaggatgttttggctctggtcaatgattacggcattgatatcgtccaactgcatggagatgagtcgtggcaagaataccaagagttcctcggtttgccagttattaaaagactcgtatttccaaaagactgcaacatactactcagtgcagcttcacagaaacctcattcgtttattcccttgtttgattcagaagcaggtgggacaggtgaacttttggattggaactcgatttctgactgggttggaaggcaagagagccccgaaagcttacattttatgttagctggtggactgacgccagaaaatgttggtgatgcgcttagattaaatggcgttattggtgttgatgtaagcggaggtgtggagacaaatggtgtaaaagactctaacaaaatagcaaatttcgtcaaaaatgctaagaaa

编码的氨基酸序列如下(SEQ ID NO.10)：

MSVINFTGSSGPLVKVCGLQSTEAAECALDSDADLLGIICVPNRKRTIDPVIARKISSLVKAYKNSSGTPKYLVGVFRNQPKEDVLALVNDYGIDIVQLHGDESWQEYQEFLGLPVIKRLVFPKDCNILLSAASQKPHSFIPLFDSEAGGTGELLDWNSISDWVGRQESPESLHFMLAGGLTPENVGDALRLNGVIGVDVSGGVETNGVKDSNKIANFVKNAKK

将以上酶切载体回收大片段PCR产物连接，转化大肠杆菌Top10，得到转化子，酶切PCR初步鉴定阳性的转化子。

将上面得到的多个阳性转化子转化yIG397，在SD-Trp+Ade(200μg/mL)的培养基上生长，能长出的白色菌落说明转化子上插入的TRP1标记基因片断功能正常，命名为pRDmTRP1。

表2 HIS3和TRP1标记基因引物序列

引物	序列(5’－3’)	SEQ ID NO.
			PHis3-F	CGG<u>GAATTC</u>CTAGTACACTCTATATTTTTTTA	2
PHis3-R	CCC<u>GTTAA</u>CTACATAAGAACACCTTTGGTGG	3
			PTrp1-F	CGG<u>GAATTC</u>TCGCGCGTTTCGGTGATGAC	7
PTrp1-R	CCC<u>GTTAA</u>GATCGGCAAGTGCACAAACAA	8

实施例3酵母yIG397转化

过夜培养酵母菌株yIG397于20mL YEPD培养基(补充腺嘌呤至终浓度200μg/mL)，然后稀释至OD600为0.1，继续在100mL YEPD培养基(补充腺嘌呤至终浓度200μg/mL)培养5小时，至OD600为0.4-0.5。菌液离心沉淀收集菌体，用无菌水洗一次，离心沉淀，然后用20mL1×TE/LiAc溶液洗一次，离心沉淀，重悬于5mL 1×TE/LiAc溶液中。对于每一个转化反应，取50μL菌液，然后加入1μL插入了野生型p53基因的pRDwtHIS3表达载体，1μL插入了突变型p53基因(突变类型如表3所示)的pRDmTRP1表达载体，10μL单链ssDNA(5mg/ml)，和300μLPEG/TE/LiAc溶液，混匀。在30度摇床温浴30分钟，42度热激15分钟。离心收集菌体，重悬于100μL无菌水中，涂布于合成基本培养基SD-His-Trp+Ade平板。然后置于30度烘箱中培养3天，最后置于4度冰箱1天，观察转化的酵母菌颜色。

其中，野生型p53蛋白具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO.11)：

MEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPPVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDSD

表3几种突变型p53蛋白的突变基因

序列	突变类型
		mutant 1	Arg249Ser
mutant 2	Ile195Asn
		mutant 3	His179Asn
mutant 4	Glu258Lys
		mutant 5	DelSCMGG(241-245aa)
mutant 6	Arg282Trp
		mutant 7	Arg273Ser
mutant 8	Met246Val
		mutant 9	Arg181His
mutant 10	Glu180Gly

结果如图2所示，包含mutant1、3、5-10的菌落呈红色(附图中呈灰色)，表示突变类型显示显性负调；而包含mutant2和4的菌落呈白色，表示无显性负调。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 福州市皮肤病防治院

<120> 一种检测肿瘤抑制因子p53显性抑制突变的试剂盒及其应用

<130> XY-2019-1-W-062

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 851

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctagtacact ctatattttt ttatgcctcg gtaatgattt tcattttttt ttttccacct 60

agcggatgac tctttttttt tcttagcgat tggcattatc acataatgaa ttatacatta 120

tataaagtaa tgtgatttct tcgaagaata tactaaaaaa tgagcaggca agataaacga 180

aggcaaagat gacagagcag aaagccctag taaagcgtat tacaaatgaa accaagattc 240

agattgcgat ctctttaaag ggtggtcccc tagcgataga gcactcgatc ttcccagaaa 300

aagaggcaga agcagtagca gaacaggcca cacaatcgca agtgattaac gtccacacag 360

gtatagggtt tctggaccat atgatacatg ctctggccaa gcattccggc tggtcgctaa 420

tcgttgagtg cattggtgac ttacacatag acgaccatca caccactgaa gactgcggga 480

ttgctctcgg tcaagctttt aaagaggccc taggggccgt gcgtggagta aaaaggtttg 540

gatcaggatt tgcgcctttg gatgaggcac tttccagagc ggtggtagat ctttcgaaca 600

ggccgtacgc agttgtcgaa cttggtttgc aaagggagaa agtaggagat ctctcttgcg 660

agatgatccc gcattttctt gaaagctttg cagaggctag cagaattacc ctccacgttg 720

attgtctgcg aggcaagaat gatcatcacc gtagtgagag tgcgttcaag gctcttgcgg 780

ttgccataag agaagccacc tcgcccaatg gtaccaacga tgttccctcc accaaaggtg 840

ttcttatgta g 851

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgggaattcc tagtacactc tatatttttt ta 32

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccgttaact acataagaac acctttggtg g 31

<210> 4

<211> 663

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgacagagc agaaagccct agtaaagcgt attacaaatg aaaccaagat tcagattgcg 60

atctctttaa agggtggtcc cctagcgata gagcactcga tcttcccaga aaaagaggca 120

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tttctggacc atatgataca tgctctggcc aagcattccg gctggtcgct aatcgttgag 240

tgcattggtg acttacacat agacgaccat cacaccactg aagactgcgg gattgctctc 300

ggtcaagctt ttaaagaggc cctaggggcc gtgcgtggag taaaaaggtt tggatcagga 360

tttgcgcctt tggatgaggc actttccaga gcggtggtag atctttcgaa caggccgtac 420

gcagttgtcg aacttggttt gcaaagggag aaagtaggag atctctcttg cgagatgatc 480

ccgcattttc ttgaaagctt tgcagaggct agcagaatta ccctccacgt tgattgtctg 540

cgaggcaaga atgatcatca ccgtagtgag agtgcgttca aggctcttgc ggttgccata 600

agagaagcca cctcgcccaa tggtaccaac gatgttccct ccaccaaagg tgttcttatg 660

tag 663

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Ile Gln Ile Ala Ile Ser Leu Lys Gly Gly Pro Leu Ala Ile Glu His

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Ser Ile Phe Pro Glu Lys Glu Ala Glu Ala Val Ala Glu Gln Ala Thr

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Gln Ser Gln Val Ile Asn Val His Thr Gly Ile Gly Phe Leu Asp His

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Met Ile His Ala Leu Ala Lys His Ser Gly Trp Ser Leu Ile Val Glu

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Cys Ile Gly Asp Leu His Ile Asp Asp His His Thr Thr Glu Asp Cys

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Gly Ile Ala Leu Gly Gln Ala Phe Lys Glu Ala Leu Gly Ala Val Arg

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Gly Val Lys Arg Phe Gly Ser Gly Phe Ala Pro Leu Asp Glu Ala Leu

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Ser Arg Ala Val Val Asp Leu Ser Asn Arg Pro Tyr Ala Val Val Glu

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Leu Gly Leu Gln Arg Glu Lys Val Gly Asp Leu Ser Cys Glu Met Ile

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Val Asp Cys Leu Arg Gly Lys Asn Asp His His Arg Ser Glu Ser Ala

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Phe Lys Ala Leu Ala Val Ala Ile Arg Glu Ala Thr Ser Pro Asn Gly

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gcaccataga tcaacgacat tactatatat ataatatagg aagcatttaa tagaacagca 240

tcgtaatata tgtgtacttt gcagttatga cgccagatgg cagtagtgga agatattctt 300

tattgaaaaa tagcttgtca ccttacgtac aatcttgatc cggagctttt ctttttttgc 360

cgattaagaa ttaattcggt cgaaaaaaga aaaggagagg gccaagaggg agggcattgg 420

tgactattga gcacgtgagt atacgtgatt aagcacacaa aggcagcttg gagtatgtct 480

gttattaatt tcacaggtag ttctggtcca ttggtgaaag tttgcggctt gcagagcaca 540

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aatagaaaga gaacaattga cccggttatt gcaaggaaaa tttcaagtct tgtaaaagca 660

tataaaaata gttcaggcac tccgaaatac ttggttggcg tgtttcgtaa tcaacctaag 720

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aatgctaaga aa 672

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<212> PRT

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<400> 10

Met Ser Val Ile Asn Phe Thr Gly Ser Ser Gly Pro Leu Val Lys Val

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Cys Gly Leu Gln Ser Thr Glu Ala Ala Glu Cys Ala Leu Asp Ser Asp

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Leu Leu Ser Ala Ala Ser Gln Lys Pro His Ser Phe Ile Pro Leu Phe

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Asp Ser Glu Ala Gly Gly Thr Gly Glu Leu Leu Asp Trp Asn Ser Ile

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Ser Asp Trp Val Gly Arg Gln Glu Ser Pro Glu Ser Leu His Phe Met

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Leu Ala Gly Gly Leu Thr Pro Glu Asn Val Gly Asp Ala Leu Arg Leu

180 185 190

Asn Gly Val Ile Gly Val Asp Val Ser Gly Gly Val Glu Thr Asn Gly

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<211> 393

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln

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Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu

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Claims (10)

1.第一氨基酸标记基因、第二氨基酸标记基因及酵母表达质粒在制备用于检测肿瘤抑制因子p53显性抑制突变的试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，基特征在于，所述第一氨基酸标记基因为组氨酸标记基因。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述组氨酸标记基因具有SEQID NO.4所示核苷酸序列。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述组氨酸标记基因能够编码SEQ IDNO.5所示氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第二氨基酸标记基因为色氨酸标记基因。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述色氨酸标记基因具有SEQID NO.9所示核苷酸序列。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述色氨酸标记基因能够编码SEQ IDNO.10所示氨基酸序列。

8.一种用于检测肿瘤抑制因子p53显性抑制突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一氨基酸标记基因、第一氨基酸标记基因及酵母表达质粒。

9.一种非诊断目的的检测肿瘤抑制因子p53显性抑制突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分别构建带有第一氨基酸标记基因和第二氨基酸标记基因的酵母表达载体；

(2)将野生型p53基因克隆到带有第一氨基酸标记基因的酵母表达载体上；将待检测突变型p53基因克隆到带有第二氨基酸标记基因的酵母表达载体上；

(3)将步骤(2)获得的两种酵母表达载体转化至酵母菌yIG397中；

(4)在缺少第一氨基酸和第二氨基酸的固体培养基上筛选带有两种类型p53基因的酵母菌，并观察菌落颜色，

若菌落颜色为红色，表明所述待检测突变型p53基因具有显性抑制作用，若菌落颜色为白色，表达所述待检测突变型p53基因不具有显性抑制作用。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述突变为点突变、插入突变或缺失突变。