CN101921713A - 一种甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系、系统及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于基因工程技术领域，提供了一种靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系、系统及应用，该靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系、系统包括甲型流感病毒PB1基因和PB2基因、PB1基因和PA基因、PB1和PB2及PA基因。利用该靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系、系统的药物筛选具有特异性高、筛选通量高和目标药物作用机理明确的优点。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系、系统及应用。
背景技术
流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，为有囊膜的负链RNA病毒，成员包括甲、乙、丙三型流感病毒，目前感染人的主要是甲、乙型流感病毒。甲、乙型流感病毒基因组含有8个节段，为单链、负链的RNA，分别编码至少10种以上的蛋白。根据病毒表面血凝素(Hemaglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)抗原性质的不同，甲型流感病毒又可以分为1-16种HA亚型和1-9种NA亚型。目前引起人类感染的流感病毒主要是H1(N1)、H3(N2)亚型和B型流感病毒。流感病毒的RNA依赖的RNA聚合酶由PB1、PB2、PA三个亚基组成，负责流感病毒RNA的复制和转录。
现有技术中针对抑制甲型流感病毒PB1亚基内切酶活性进行抗流感病毒药物筛选，但是，该类药物的作用机理与宿主细胞某些RNA聚合酶相同，不具有特异性，达不到抑制流感病毒复制的效果。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系，解决现有技术针对甲型流感病毒药物筛选特异性、筛选通量低，目标药物作用机理不明确等技术问题。
本发明实施例是这样实现的，
一种靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系，该靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系转化、引入甲型流感病毒的PB1基因和PB2基因，该甲型流感病毒PB1基因的表达产物是诱饵蛋白，该甲型流感病毒PB2基因的表达产物是猎物蛋白。
以及，一种靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系，该靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系包括甲型流感病毒的PB1基因和PA基因，该甲型流感病毒PB1基因的表达产物是诱饵蛋白，该甲型流感病毒PA基因的表达产物是猎物蛋白。
本发明实施例的进一步目的在于提供一种靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交系统，解决现有技术针对甲型流感病毒药物筛选特异性、筛选通量低，目标药物作用机理不明确等技术问题。
本发明实施例是这样实现的，
一种靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交系统，该靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交系统包括上述两种靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系。
本发明实施例进一步目的在于提供上述靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系在筛选抗甲型流感病毒药物中的应用。
本发明实施例进一步目的在于提供上述靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交系统在筛选抗甲型流感病毒药物中的应用。
本发明实施例的靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系及系统，通过转化、引入甲型流感病毒PB1和PB2基因序列；PB1和PA基因序列；PB1、PB2及PA基因序列，保证了该靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系及系统所表达的蛋白质中，包括甲型流感病毒RNA聚合酶的PB1亚基和PB2亚基的氨基酸序列或PB1亚基和PA亚基的氨基酸序列或PB1亚基和PB2亚基及PA亚基的氨基酸序列。实现了通过筛选、确定对该靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系及系统在营养缺陷型培养基中生长起抑制作用的药物，来筛选抗流感病毒的药物，保证了该靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系及系统的药物筛选具有特异性高、筛选通量高和目标药物作用机理明确的优点。
附图说明
图1是本发明实施例提供的甲型流感病毒PB2、PB1、PA基因PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳的结果图；
图2是本发明实施例提供的PB2-pGADT7、PA-pGADT7和PB1-pGBKT7酵母双杂交重组质粒PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳的结果图；
图3是本发明实施例实施例的酵母双杂交体系、系统在培养基上的生长情况图；
图4是本发明实施例的酵母双杂交体系、系统PCR之后进行琼脂糖凝胶电泳的结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例的靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系及系统通过转化、引入甲型流感病毒的PB1和PB2基因序列、PB1和PA基因序列或PB1、PB2及PA基因序列，实现了通过筛选、确定对该酵母双杂交体系及系统在营养缺陷型培养基中生长起抑制作用的药物，来筛选抗甲型流感病毒的药物，保证了该靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系及系统的药物筛选具有特异性高、筛选通量高和目标药物作用机理明确的优点。
本发明实施例提供了一种靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系，该靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系包括甲型流感病毒的PB1基因和PB2基因，该甲型流感病毒PB1基因的表达产物是诱饵蛋白，该甲型流感病毒PB2基因的表达产物是猎物蛋白。
本发明实施例还提供了一种靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系，该靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系包括甲型流感病毒的PB1基因和PA基因，该甲型流感病毒PB1基因的表达产物是诱饵蛋白，该甲型流感病毒PA基因的表达产物是猎物蛋白。
本发明实施例进一步提供了一种靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交系统，该靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交系统包括上述两种靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系。
本发明实施例进一步提供上述靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系在筛选抗甲型流感病毒药物中的应用。
本发明实施例进一步提供上述靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交系统在筛选抗甲型流感病毒药物中的应用。
本发明实施例的靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系，通过转化、引入甲型流感病毒的PB1和PB2基因序列；PB1和PA基因序列；PB1、PB2及PA基因序列，保证了该靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系及系统，包括甲型流感病毒的RNA聚合酶的PB1亚基和PB2亚基的氨基酸序列；PB1亚基PA亚基的氨基酸序列；PB1亚基和PB2亚基及PA亚基的氨基酸序列。实现了通过筛选、确定对该酵母双杂交体系在相应的营养缺陷型培养基中生长起抑制作用的药物，来筛选抗流感病毒的药物，保证了该抗流感病毒药物筛选酵母双杂交体系的药物筛选具有特异性高、筛选通量高和目标药物作用机理明确的优点。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述：
本发明实施例中的甲型流感病毒包括各种甲型流感病毒，例如流感病毒国际标准株A/PR8/34，H1(N1)、H3(N2)亚型等。甲型流感病毒RNA聚合酶的三个亚基PB1、PB2、PA在分子特征上具有保守性，在分子进化中具有相同的基本序列。
因此，本发明实施例中所述的甲型流感病毒PB1基因、PB2基因或PA基因，没有特别的限制，可以为任何的甲型流感病毒的PB1基因、PB2基因或PA基因。
本发明实施例的靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系及系统使用的酵母双杂交质粒包括两种，一种酵母双杂交质粒表达的产物中包括酵母细胞转录激活因子AD结构域的氨基酸序列，将甲型流感病毒PB2或PA的基因序列转化、引入到该类酵母双杂交质粒中；另一种酵母双杂交质粒表达的产物中包括酵母细胞转录激活因子BD结构域的氨基酸序列，将甲型流感病毒PB1的基因序列转化、引入到该类酵母双杂交质粒中。对本发明实施例的靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系中所用的到的酵母双杂交质粒没有其他的限制。
酵母双杂交质粒是指其表达产物中包含有酵母细胞转录激活因子AD结构域或BD结构域的氨基酸序列，且用于蛋白质相互作用的质粒。
甲型流感病毒的RNA聚合酶中，PB1亚基和PB2亚基的氨基酸序列相互作用，PB1亚基和PA亚基的氨基酸序列相互作用，形成有效的RNA聚合酶。本发明实施例的靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系的靶点是上述PB1亚基和PB2亚基的氨基酸序列相互作用或者PB1亚基和PA亚基的氨基酸序列的氨基酸序列相互作用或上述两种作用的组合。
实施例1
本发明实施例1提供了一种靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系，使用酵母双杂交质粒pGADT7和pGBKT7，该靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系还包括甲型流感病毒国际标准株A/PR8/34的PB1基因和PB2基因，该PB1基因和pGBKT7重组，该PB2基因和pGADT7重组。
与该PB1基因互补的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，在SEQ ID NO：1中，第25位至2298位的碱基序列对应甲型流感病毒国际标准株A/PR8/34的PB1基因的蛋白质编码区；与该PB2基因的碱基序列互补的DNA序列如SEQ IDNO：2所示，在SEQ ID NO：2中，第28位至2307位的碱基序列对应甲型流感病毒国际标准株A/PR8/34的PB2基因的蛋白质编码区。
该靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系中包括的外源基因序列为，甲型流感病毒国际标准株A/PR8/34的PB1-pGBKT7的基因序列、PB2-pGADT7的基因序列，即外源基因序列包括甲型流感病毒国际标准株A/PR8/34的PB1基因序列和pGBKT7的基因序列、甲型流感病毒国际标准株A/PR8/34的PB2基因序列和pGADT7的基因序列。
本发明实施例的靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系以甲型流感病毒PB1亚基和PB2亚基的氨基酸序列存在相互作用形成复合体作为靶点来筛选药物，具有良好的特异性。
实施例2
本发明实施例2提供了靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系，使用酵母双杂交质粒pGADT7和pGBKT7，该靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系还包括甲型流感病毒国际标准株A/PR8/34的PB1基因和PA基因，该PB1基因和pGBKT7重组，该PA基因和pGADT7重组。
与该PB1基因的碱基序列互补的DNA序列如SEQ ID NO：1所示；与该PA基因的碱基序列互补的DNA序列如SEQ ID NO：3所示，在SEQ ID NO：3中，第25位至2175位的碱基序列对应甲型流感病毒国际标准株A/PR8/34的PA基因的蛋白质编码区
该靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系中包括的外源基因序列为，甲型流感病毒国际标准株A/PR8/34的PB1-pGBKT7的基因序列、甲型流感病毒国际标准株A/PR8/34的PA-pGADT7的基因序列，即外源基因序列包括甲型流感病毒国际标准株A/PR8/34的PB1基因序列和pGBKT7的基因序列、甲型流感病毒国际标准株A/PR8/34的PA基因序列和pGADT7的基因序列。
本发明实施例的抗流感病毒药物筛选酵母双杂交细胞以PB1亚基和PA亚基的氨基酸序列存在相互作用形成复合体作为靶点来筛选药物，具有良好的特异性。
实施例3
本发明实施例3提供了一种靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系，该靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系包括上述实施例1和实施例2的靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系。
其中，实施例1的靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系，使用酵母双杂交质粒pGADT7和pGBKT7，该靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系还包括甲型流感病毒国际标准株A/PR8/34的PB1基因和PB2基因，该PB1基因和pGBKT7重组，该PB2基因和pGADT7重组。
实施例2的靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系，使用酵母双杂交质粒pGADT7和pGBKT7，该靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系还包括甲型流感病毒国际标准株A/PR8/34的PB1基因和PA基因，该PB1基因和pGBKT7重组，该PA基因和pGADT7重组。
与该PB1基因、该PB2基因及该PA基因的碱基序列互补的DNA序列如前面所述，在此不重复阐述。
该靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系中包括的外源基因序列为，甲型流感病毒国际标准株A/PR8/34的PB1-pGBKT7的基因序列、甲型流感病毒国际标准株A/PR8/34的PA-pGADT7的基因序列以及甲型流感病毒国际标准株A/PR8/34的PB2-pGADT7的基因序列。
本发明实施例的抗流感病毒药物筛选酵母双杂交体系以PB1亚基和PA亚基的氨基酸序列、PB1亚基和PB2亚基的氨基酸序列存在相互作用形成复合体作为双靶点来筛选药物，具有良好的特异性。
制备实施例4
本发明实施例制备方法中，A/PR8/34毒株即流感病毒国际标准株的PB2、PB1、PA等基因T载体克隆由房师松克隆并保存；酵母双杂交体系、酵母转化试剂盒、YPDA(完全培养基)、SD(基础培养基)、-Leu/-Trp、-Ade/-His/-Leu/-Trp、X-α-Gal等购自Clontech公司；PrimeStar Taq酶购自TAKARA公司；所有限制性内切酶、T4连接酶均购自NEB公司；引物合成和序列测定在大连宝生物公司完成。
步骤一、引物设计
根据Genebank公布的流感病毒国际标准株A/PR8/34的PB2基因序列、PB1基因序列、PA基因序列和pGADT7、pGBKT7载体多克隆位点序列，设计三对引物，序列和酶切位点见表1。
表1酵母双杂交体系构建所用引物
该表1中的引物序列中，PB1基因的引物有PB1 Forward即PB1正向引物和PB1 Reverse即PB1反向引物；PB1基因正向引物的序列如SEQ ID NO：4所示，PB1反向引物的序列如SEQ ID NO：5所示；PB2基因的引物有PB2Forward即正向引物和PB2 Reverse即反向引物；PB2正向引物的序列如SEQ IDNO：6所示PB2反向引物的序列如SEQ ID NO：7所示，PA基因的引物有PAForward即PA正向引物和PA Reverse即PA反向引物，PA正向引物的序列如SEQ ID NO：8所示，PA反向引物的序列如SEQ ID NO：9所示。引物序列划有下划线的表示为该引物所对应的限制性内切酶的酶切位点。
步骤二酵母双杂交重组质粒的构建
分别以A/PR8/34毒株PB2基因T载体质粒DNA、PB1基因T载体质粒DNA、PA基因T载体质粒DNA为模板，在上述PB2基因、PB1基因和PA基因的正反向引物和PrimeSTAR TAQ酶条件下，利用PCR扩增PB2、PB1和PA基因，反应条件为：95℃，5min；[94℃、15sec，58℃、20sec，72℃、2.5min]，35cycles；72℃，10min；4℃，forever。
割胶回收PB2基因、PB1基因和PA基因，将2μg的PB2基因、PA基因回收产物以及2μg的pGADT7分别进行Sfi I和BamH I双酶切，将2μg的PB1基因回收产物和2μg的pGBKT7分别进行Sfi I和Xma I双酶切。
分别割胶回收上述PB2基因、PB1基因、PA基因、pGADT7、pGBKT7双酶切产物，将PB2酶切产物与pGADT7酶切产物连接、PA酶切产物与pGADT7酶切产物连接、PB1酶切产物与pGBKT7酶切产物连接，得到PB2-pGADT7质粒DNA、PB1-pGBKT7质粒DNA、PA-pGADT7质粒DNA，构建PB2-pGADT7、PA-pGADT7和PB1-pGBKT7酵母双杂交重组质粒。
将上述PB2-pGADT7酵母双杂交重组质粒、PA-pGADT7酵母双杂交重组质粒，分别转化大肠杆菌DH5α后经Amp+LB培养基筛选培养，上述PB1-pGBKT7酵母双杂交重组质粒转化大肠杆菌DH5α后经Kana+LB培养基筛选培养。
本步骤中流感病毒PB2、PB1、PA基因PCR扩增的结果
请参阅图1，图1显示了步骤二中以PB2-T、PB1-T、PA-T质粒DNA为模板，分别以PB2、PB1、PA基因正反向引物进行PCR反应，将扩增后的反应产物进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
其中，M1为1000bp DNA分子量标准；11为PB2基因PCR后琼脂糖凝胶电泳条带；12为PB1基因PCR后琼脂糖凝胶电泳条带；13为PA基因PCR后琼脂糖凝胶电泳条带；14为阴性对照。
A/PR8/34毒株PB2、PB1、PA基因全长分别为2280bp、2274bp和2151bp。从图1可以看出，利用所设计的双杂交引物，成功扩增了流感病毒A/PR8/34PB2、PB1、PA基因。
本步骤中PB2、PB1、PA基因酵母双杂交重组质粒构建的结果
请参阅图2，图2显示了PB2-pGADT7、PA-pGADT7和PB1-pGBKT7酵母双杂交重组质粒构建的结果。
其中，M2为1000bp DNA分子量标准；21为PB2-pGADT7经过PCR后琼脂糖凝胶电泳条带图；22为PB1-pGBKT7经过PCR后琼脂糖凝胶电泳条带；23为PA-pGADT7经过PCR后琼脂糖凝胶电泳条带；24为PB2基因阳性对照；25为PB1基因阳性对照；26为PA基因阳性对照；27为阴性对照。
PCR结果表明，构建的PB2-pGADT7、PA-pGADT7和PB1-pGBKT7重组质粒均扩增出了目的条带，条带分别与阳性对照一致。由此说明，构建的PB2-pGADT7、PA-pGADT7和PB1-pGBKT7重组质粒是成功的。
本步骤中酵母双杂交阳性克隆的鉴定
分别随机挑取10个PB2-pGADT7(Amp+)、PA-pGADT7(Amp+)和PB1-pGBKT7(Kana+)转化克隆，接种到筛选培养基中37℃震荡培养过夜，提取质粒DNA并分别用克隆引物进行PCR鉴定，反应条件同本步骤的PCR反应。将PCR阳性质粒DNA进行序列测定，阳性克隆质粒DNA用于步骤三酵母转化。
分别将PCR结果阳性的酵母双杂交重组质粒DNA进行序列测定，
PB1基因的正向序列测试结果如SEQ ID NO：10所示；
PB1基因的反向序列测试结果如SEQ ID NO：11所示；
PB2基因的正向序列测试结果如SEQ ID NO：12所示；
PB2基因的反向序列测试结果如SEQ ID NO：13所示；
PA基因的正向序列测试结果如SEQ ID NO：14所示；
PA基因的反向序列测试结果如SEQ ID NO：15所示；
上述PB1、PB2、PA基因的反向测序中，测序结果所得的序列分别和相应的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中的反向序列互补。
例如，PB1反向测序结果即SEQ ID NO：11第1位的C对应SEQ ID NO：1中第2298位G，SEQ ID NO：11第570位的G对应SEQ ID NO：1中第1729位的C。
分别将DNA检测结果和甲型流感病毒国际标准株的PB1基因、PB2基因PA基因进行比对，表明，构建的PB2-pGADT7、PA-pGADT7和PB1-pGBKT7酵母双杂交重组质粒目的基因插入序列正确，没有移码突变，适用于酵母细胞转化。
步骤三、建立酵母双杂交体系及系统
按Clontech公司酵母转化试剂盒的方法，制备AH109酵母感受态细胞，将100ng的PB2-pGADT7质粒DNA和PB1-pGBKT7质粒DNA转化到AH109酵母双杂交细胞中，构建流感病毒PB2-PB1酵母双杂交细胞，得到甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系。该流感病毒PB2-PB1酵母双杂交细胞是指转化了流感病毒PB1基因和PB2基因的酵母细胞；
将100ng的PA-pGADT7质粒DNA和PB1-pGBKT7质粒DNA转化到AH109酵母双杂交细胞中，构建流感病毒PA-PB1酵母双杂交细胞，得到甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系。该流感病毒PA-PB1酵母双杂交细胞是指转化了流感病毒PA基因和PB 1基因的酵母细胞。
本发明实施例4的酵母双杂交系统包括上述PB2-PB1酵母双杂交细胞和PA-PB1酵母双杂交细胞，即甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交系统包括上述两种甲型流感病毒药物帅选酵母双杂交体系。
同时共转化各100ng的pGBKT-53+pGADT-T质粒DNA为阳性对照；并且以未经转化的酵母细胞为阴性对照。
将转化产物的10倍稀释液涂布SD/-Leu/-Trp筛选平板，30℃培养3-5天。计算转化效率并将生长菌落划线接种于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal筛选平板，30℃培养3-5天。将兰色菌落接种于液体SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基中，30℃震荡培养过夜，提取酵母质粒DNA进行PCR鉴定，反应条件同步骤二。
根据下列公式计算转化效率：Transformation efficiency＝[cfu×suspensionvolume(ml)]/[vol.plated(ml)×amount of DNA(μg)
上述PB2-pGADT7+PB1-pGBKT7的转化效率为1.4×104cfu/μg，上述PA-pGADT7+PB1-pGBKT7的转化效率为1.6×104cfu/μg，阳性对照pGBKT-53+pGADT-T亮的转化效率为1×104cfu/μg。
在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal中，缺失组氨酸、亮氨酸和色氨酸，并且缺失Ade，同时加入了X-α-Gal作为显色底物。转化后的流感病毒PB2-PB1酵母双杂交细胞、流感病毒PA-PB1酵母双杂交细胞和pGBKT-53+pGADT-T质粒DNA阳性对照、阴性对照分别在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal培养基上生长。菌落呈兰色即说明，酵母细胞的基因组能够表达，生成了多肽，和显色底物X-α-Gal相结合，使得菌落呈蓝色，因此上述细胞能够生长，说明酵母双杂交体系或系统构建成功。pGBKT-53+pGADT-T质粒DNA阳性对照是指，在酵母细胞中转化、引入了pGBKT-53+pGADT-T质粒DNA，而没有上述甲型流感病毒的PB1、PB2、PA基因序列；阴性对照是指在酵母细胞没有转化、引入任何的上述本制备方法中的质粒DNA或甲型流感病毒PB1、PB2或PA基因序列。
在上述SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal培养基中由于缺失了上述氨基酸，阴性对照的酵母细胞不能生长菌落，没有颜色。
由于，PB1基因的表达产物是流感病毒RNA聚合酶PB1亚基的氨基酸序列；PB2基因的表达产物是流感病毒RNA聚合酶PB2亚基的氨基酸序列；PA基因的表达产物是流感病毒RNA聚合酶PA亚基的氨基酸序列；质粒pGADT7的表达产物中包括了酵母细胞基因转录因子的AD(转录活化结构域)的氨基酸序列；质粒pGBKT7的表达产物包括了酵母细胞基因转录因子BD(转录结合结构域)的氨基酸序列。另外，PB1基因的表达产物和PB2基因的表达产物能够相互结合形成复合物，PB1基因的表达产物和PA基因的表达产物能够相互结合形成复合物，由此能够将酵母细胞转录因子的AD区域和BD区域在空间上建立了联系，形成了具有活性的酵母细胞基因转录因子，能够启动酵母细胞基因转录。
由此可知，本发明实施例的流感病毒PB2-PB1酵母双杂交细胞由于转化、引入了PB2-pGADT7和PB1-pGBKT7的基因序列，因此该酵母细胞的基因能够表达，在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal培养基能够生长，并且显兰色，本发明实施例的甲型流感病毒药物帅选酵母双杂交体系构建成功；本发明实施例的流感病毒PA-PB1酵母双杂交细胞由于转化、引入了PA-pGADT7和PB1-pGBKT7的基因序列，因此能够该酵母细胞的基因能够表达，在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal培养基能够生长，并且显兰色，本发明实施例的甲型流感病毒药物帅选酵母双杂交体系构建成功；本发明实施例的酵母双杂交系统由于转化、引入了PB2-pGADT7和PB1-pGBKT7的基因序列，PA-pGADT7和PB1-pGBKT7的基因序列，因此能够该酵母双杂交体系的酵母细胞的基因能够表达，在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal培养基能够生长，并且显兰色。
同时，由于pGBKT-53和pGADT-T质粒DNA的阳性对照的酵母细胞转化、引入了pGBKT-53和pGADT-T质粒DNA，其表达的产物中含有酵母细胞转录因子AD区域的氨基酸序列和BD区域的氨基酸序列，并且在空间上能够建立联系，因此能够形成有效的转录因子，能够启动酵母细胞基因的表达，能够在上述缺陷型培养基上生长。
本步骤中酵母双杂交细胞培养生长的结果
请参阅图3，图3显示了上述流感病毒PB2-PB1酵母双杂交细胞、流感病毒PA-PB1酵母双杂交细胞、pGBKT-53+pGADT-T质粒DNA为阳性对照和阴性对照在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal培养基的生长情况：
其中，a为流感病毒PA-PB1酵母双杂交细胞的生长情况；b为流感病毒PB2-PB1酵母双杂交细胞的生长情况；c为阳性对照的生长情况；d为阴性对照的生长情况。
图a中，流感病毒PA-PB1酵母双杂交细胞在上述培养基能够生长并且呈兰色，因此可以说明，流感病毒PA-PB1酵母双杂交细胞转化、引入PA-pGADT7和PB1-pGBKT7是成功的。
图b中，流感病毒PB2-PB1酵母双杂交细胞在上述培养基能够生长并且呈兰色，因此可以说明，流感病毒PB2-PB1酵母双杂交细胞转化、引入PB2-pGADT7和PB1-pGBKT7是成功的。
本步骤中酵母双杂交细胞及体系PCR结果
请参阅图4，图4显示以提取的上述双杂交酵母质粒DNA为模板，分别以PB2+PB1、PB2、PB1和PA+PB1、PB1、PA的正反向引物进行PCR反应，PCR的反应条件和上述步骤二相同，然后进行琼脂糖凝胶电泳的结果。同时以酵母双杂交体系阳性对照(pGBKT-53+pGADT-T)和AH109酵母为阴性对照，以PB2、PB1、PA基因T载体质粒DNA为相应阳性对照。
其中，M3为1000bp DNA分子量标准；
1为PB2-PB1双基因经过PCR后琼脂糖凝胶电泳条带；
2为PB2基因经过PCR后琼脂糖凝胶电泳条带图；
3为PB1基因经过PCR后琼脂糖凝胶电泳条带图；
4为PA-PB1双基因经过PCR后琼脂糖凝胶电泳条带图；
5为PB1基因经过PCR后琼脂糖凝胶电泳条带图；
6为PA基因经过PCR后琼脂糖凝胶电泳条带图；
7为PB2基因阳性对照；
8为PB1基因阳性对照；
9为PA基因阳性对照；
10为酵母双杂交阳性对照；
11为阴性对照。
图4结果表明，在PB2-PB1、PA-PB1酵母双杂交细胞及体系，PB2、PB1基因和PA、PB1基因均分别共转化到酵母AH109中。
本制备方法使用甲型流感病毒国际标准株作为样本试验，但是甲型流感病毒的其他变种，也可以用本试验方法，得到的试验结果相似，在此不详细说明。
应用实施例5
将制备的甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系(PB2-PB1、PA-PB1)冻存菌液50μl分别接种至5ml SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp液体培养基中，30℃震荡培养过夜。分别将培养液10μl接种至96孔深孔板中(每孔含1mlSD/-Ade/-His/-Leu/-Trp液体培养基)，将待筛选药物按不同浓度加入至每孔，30℃震荡培养18小时，对每孔培养物进行OD600测定，以酵母AH109作为对照。运用统计学方法计算候选药物对酵母细胞生长的抑制率，以反映候选药物抗甲型流感病毒的药物作用效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系，其特征在于，所述靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系包括甲型流感病毒的PB1基因和PB2基因，所述甲型流感病毒PB1基因的表达产物是诱饵蛋白，所述甲型流感病毒PB2基因的表达产物是猎物蛋白。
2.一种靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系，其特征在于，所述靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系包括甲型流感病毒的PB1基因和PA基因，所述甲型流感病毒PB1基因的表达产物是诱饵蛋白，所述甲型流感病毒PA基因的表达产物是猎物蛋白。
3.一种靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交系统，其特征在于，所述靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交系统包括如权利要求1和权利要求2所述的靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系。
4.如权利要求1或2所述的靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系在筛选抗甲型流感病毒药物中的应用。
5.如权利要求3所述的靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交系统在筛选抗甲型流感病毒药物中的应用。
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