CN114949219B - microRNA-205-5p：抗甲型流感病毒的新型治疗靶标 - Google Patents

microRNA-205-5p：抗甲型流感病毒的新型治疗靶标 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于抗甲型流感病毒的新型治疗靶标。具体地，本发明验证了核蛋白(NP)基因与14种宿主miRNA之间的碱基互补性，并证实了miR‑205‑5p通过与NP基因结合来抑制NP蛋白表达，从而提供了miR‑205‑5p在制备治疗甲型流感病毒感染的药物中的用途。此外，本发明还提供了用于所述用途的试剂盒和药物组合物。

Description

microRNA-205-5p：抗甲型流感病毒的新型治疗靶标
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地涉及一种用于抗甲型流感病毒的新型治疗靶标及其制药用途。本发明还涉及用于治疗甲型流感或抑制甲型流感病毒的药物组合物和试剂盒。
背景技术
虽然迄今为止甲型流感已经多次引起世界范围的大流行，但由于缺乏完全有效的预防和治疗方法，它仍然是全球性的健康威胁。作为甲型流感发病的主因，甲型流感病毒是一种宿主范围广、传染性强、传播速度快、潜伏期长、且容易发生变异的流感病毒(Schweiger B.等，Med Microbiol Immunol， 2002，191(3-4)：133-138)，它可在短时间内引起局部暴发或全球流行。人类感染甲型流感病毒后的症状包括高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者会出现心、肾等多种脏器衰竭进而导致死亡，病死率很高。
核蛋白(NP)在甲型流感病毒复制中起重要作用；它是病毒转录和复制中不可缺少的组成部分(Albo C.等，J Virol，1995，69(6)：3799-3806；Boulo S.等， Virus Res，2007，124(1-2)：12-21；和Liu M.等PLOS ONE，2015，10(9)： e0137802.)。抑制NP的表达可以阻断甲型流感病毒的复制。因此，能够抑制 NP表达的外源性和内源性物质对于抗甲型流感病毒至关重要。
MicroRNAs(miRNAs)是一类天然存在的小的非编码的RNA分子。它们可与靶标mRNA的3’非翻译区(3′-UTR)结合，以阻断其翻译或启动它的转录物的降解(Cuellar T.L.等，JEndocrinol，2005，187：327-332)。2005年，Lecellier C-H等发现宿主miRNA具有抗病毒功能(Lecellier C-H.等，Science，2005， 308(5721)：557-560)。此后，宿主miRNA与病毒基因相互作用成为miRNA 和宿主抗病毒防御领域的新的研究热点。miR-323、miR-491和miR-654靶向甲型流感病毒PB1基因并抑制H1N1流感病毒在Madin-Darby犬肾(MDCK) 细胞中的体外复制(Song L.P.等，J Virol，2010，84(17)：8849-8860)。Let-7c靶向甲型流感病毒中的M基因并抑制流感病毒在A549细胞中的复制(Ma Y.J.等，J Cell Mol Med，2012，16(10)：2539-2546)。然而，到目前为止，miRNA还没有被系统地靶向用于抗甲型流感病毒治疗。因此，亟需提供一种容易获得、成本相对低廉、操作简单、针对性强、疗效显著的抗甲型流感病毒的miRNA 药物，不仅可以弥补市场上的空白，同时对于揭示NP基因和与miRNA之间的相互作用具有开拓性的意义，提供了广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种容易获得、成本相对低廉、操作简单、针对性强、疗效显著的抗甲型流感病毒的miRNA药物。所述药物能够通过与NP基因结合来抑制NP蛋白表达，从而有效地抑制甲型流感病毒的复制。本发明的目的还在于提供一种筛选治疗甲型流感或抑制甲型流感病毒的药物的方法。
为了实现本发明的目的，本发明具体地提供了以下各项技术方案：
一方面，本发明提供miR-205-5p在制备用于治疗受试者中的甲型流感的药物中的用途；或者本发明提供miR-205-5p，其用于治疗受试者中的甲型流感；或者本发明提供治疗甲型流感的方法，其包括对受试者给药miR-205- 5p。在一实施方案中，所述miR-205-5p为过表达的。在一实施方案中，所述受试者中的核蛋白(NP)的表达相对于健康受试者增加。
一方面，本发明提供miR-205-5p在制备用于在受试者中抑制核蛋白(NP) 的表达的药物中的用途；或者本发明提供miR-205-5p，其用于在受试者中抑制核蛋白(NP)的表达；或者本发明提供用于在受试者中抑制核蛋白(NP)的表达的方法，其包括对受试者给药miR-205-5p。在一实施方案中，所述miR- 205-5p为过表达的。在一实施方案中，所述受试者中的核蛋白(NP)的表达相对于健康受试者增加。
一方面，本发明提供一种用于治疗甲型流感或抑制甲型流感病毒的药物组合物，其中所述组合物包括提高miR-205-5p的表达水平和/或提高其表达产物稳定性的物质和任选的药学上可接受的载体和/或辅料。
一方面，本发明提供一种用于治疗甲型流感或抑制甲型流感病毒的试剂盒，其中所述试剂盒包括提高miR-205-5p的表达水平和/或提高其表达产物稳定性的物质和任选的药学上可接受的载体和/或辅料。在一实施方案中，所述的药物组合物或所述的试剂盒，其中所述提高miR-205-5p的表达水平的物质为miR-205-5p过表达载体和/或转化了miR-205-5p过表达载体的细胞。在一实施方案中，在所述的药物组合物或所述的试剂盒中，所述提高miR-205-5p 的表达水平的物质为用于通过PCR对miR-205-5p进行扩增的物质。
一方面，本发明提供一种筛选治疗甲型流感或抑制甲型流感病毒的药物的方法，其包括：
(1)确定被甲型流感病毒感染的组织或细胞中miR-205-5p的表达水平；
(2)施用潜在的治疗甲型流感或抑制甲型流感病毒的药物；
(3)在上述施用后再次确定所述组织或细胞中miR-205-5p的表达水平；
(4)如果(3)中的表达水平相对于(1)中的表达水平被上调，则将所述药物确定为治疗甲型流感或抑制甲型流感病毒的药物。
一方面，本发明提供测定miR-205-5p的表达水平的试剂在制备用于筛选治疗甲型流感或抑制甲型流感病毒的药物的试剂盒中的用途；或者本发明提供筛选治疗甲型流感或抑制甲型流感病毒的药物的方法，其包括使用测定 miR-205-5p的表达水平的试剂。在一实施方案中，测定miR-205-5p的表达水平的试剂包括：(1)提取被甲型流感病毒感染的组织或细胞中的总RNA的试剂；和(2、)以所述总RNA为模板对miR-205-5p进行定量逆转录酶-聚合酶链式反应(qRT-PCR)的试剂。
一方面，一种筛选用于治疗甲型流感或抑制甲型流感病毒的药物的试剂盒，所述试剂盒包括用于确定被甲型流感病毒感染的组织或细胞中miR-205- 5p的表达水平的试剂。在一实施方案中，其中所述用于确定被甲型流感病毒感染的组织或细胞中miR-205-5p的表达水平的试剂包括：(1)提取被甲型流感病毒感染的组织或细胞中的总RNA的试剂；和(2)以所述总RNA为模板对miR-205-5p进行定量逆转录酶-聚合酶链式反应(qRT-PCR)的试剂。
与现有技术相比，本发明具有如下优势：
-本发明采用的miRNA是内源性的小分子RNA，普遍存在于动植物中，容易从总RNA中获得或筛选或者容易直接合成，其生产和存储成本与常规采用的单克隆抗体相比低得多；
-本领域存在可用于miRNA过量表达的载体，操作简便，手段丰富；
-本发明提供的治疗方法直接而有效，miRNA与NP基因结合使NP蛋白表达受到抑制，从而抑制甲型流感病毒的复制而起到抗病毒的作用；
-由于NP是甲型流感病毒的主要结构蛋白，抗原结构稳定，很少发生变异，因此一旦miRNA被确定与NP结合，则其抗病毒的效果是稳定而持续的；
-本发明提供的治疗方法对于揭示NP基因和与miRNA之间的相互作用具有开拓性的意义，提供了miRNA用于抗病毒的广阔的应用前景。
附图简述
图1a和1b显示甲型流感病毒PR8株感染小鼠肺炎模型肺组织病理改变。其中：(a)正常对照组：肺，小鼠肺泡大小均匀，气道通畅，肺间质未见有增生，正常结构H&E×200；(b)正常对照组：支气管，支气管粘膜上皮完整，粘膜周围未见炎症，结构正常H&E×200；(c)感染2天组：肺，小鼠肺间质有渗出性炎症，肺间质细胞有退行性病变，有出血，有大面积坏死，B细胞增大增多；(d)感染2天组：支气管，小鼠支气管周围有炎症浸润，以小淋巴为主，粘膜内细胞增多，有凋亡细胞；(e)感染5天组：肺，小鼠肺间质大面积坏死，失去正常肺结构，血管瘀血，周围炎症浸润，肺部血管扩张，周围有炎症，肺间质肿胀，有大量渗出炎症，以淋巴细胞、浆细胞为主；(f)感染5天组：支气管，小鼠支气管粘膜内上皮细胞脱落，粉色渗出物，肺间质变窄，血管内瘀血，周围有炎症。
图2为差异表达的microRNA聚类分析。其中，横坐标代表了分组间的样本名称，纵坐标代表了差异microRNA，图中红色代表差异microRNA在分组样本中表达值高，绿色代表差异microRNA在分组样本中表达值低。
图3显示显著性下调的microRNA簇，其中图3上方中央标有趋势编号，Profile#15，该趋势按照(3.5，3.0，2.5，2.0，1.5，1.0，0.5，0，-0.5，-1.0，-1.5，-2.0， -2.5，-3.0，-3.5)的幅度变化。如图中所示，该趋势内包含14个差异探针集，按照随机分布情况下该趋势的理论基因数量为5.833；adj_p-value＝0.02976 代表实际的microRNA数量与随机分布的理论microRNA数量相比的显著性水平；significant代表显著性的microRNA表达趋势，若通过多重比较检验校正后的adj_p-value小于0.05，则标为significant。随着天数的增加，microRNA表达出现不断持续下调表达的情况。
图4显示肺组织中甲型流感病毒PB1基因表达水平(与正常对照组比较， **P＜0.01，*P＜0.05)。
图5显示肺组织中甲型流感病毒PB2基因表达水平(与正常对照组比较， **P＜0.01)。
图6显示肺组织中甲型流感病毒NP基因表达水平(与正常对照组比较，**P＜0.01，*P＜0.05)。
图7显示肺组织中甲型流感病毒PA基因表达水平(与正常对照组比较， **P＜0.01)。
图8a和8b是甲型流感病毒肺炎小鼠模型(n＝10，**P＜0.01)，其中图8a 显示甲型流感病毒感染导致肺指数显著增加，而磷酸奥司他韦可显著降低肺指数。肺指数＝肺湿重(g)/体重(g)×100。图8b显示正常对照组肺组织未见炎性浸润，结构正常；模型对照组肺组织内有大量细胞增殖、炎性细胞渗出、脱落细胞，肺泡腔大小不一；磷酸奥司他韦组肺组织中的炎症和水肿减少。 (H&E，400倍)。
图9a和9b显示NP蛋白在甲型流感病毒感染的肺组织和MLE-12细胞中的表达，其中图9a显示NP蛋白在甲型流感病毒感染的肺组织中上调，并被磷酸奥司他韦下调(n＝10，**p＜0.01)；其中图9b显示NP蛋白在甲型流感病毒感染的MLE-12细胞中上调，并被磷酸奥司他韦下调(n＝3，**p＜0.01)。
图10显示miR-744-5p、miR-205-5p或miR-431-5p与NP基因的潜在结合位点(miR-744-5p、miR-205-5p或miR-431-5p与NP基因的靶区之间的互补核苷酸用短垂直线连接)。
图11a和11b显示NP是miR-431-5p和miR-205-5p的靶标(n＝5， **p＜0.01)，图11a显示通过将含有miR-744-5p、miR-205-5p、miR-431-5p结合位点的NP基因序列的pmirGlo载体与miR-205-5p、miR-431-5p或miR- 744-3p共转染到293T细胞中，进行双萤光素酶活性测定，miR-205-5p和 miR-431-5p可显著抑制萤光素酶相对活力；NC：阴性对照miRNA；图11b显示24h后293T细胞的转染效率(100×)；其中(I)为LV5标记的阴性对照 miRNA转染293T细胞24h后光镜观察；(II)为LV5标记的阴性对照miRNA 转染293T细胞24h后的荧光显微镜观察；LV5为用于标记miRNA的荧光标记。
图12a和12b显示NP蛋白表达被miR-205-5p高度显著抑制，被miR- 431-5p、miR-744-3p显著抑制(n＝3，高度显著**p＜0.01，显著*p＜0.05)。
图13显示miR-205-5p抑制甲型流感病毒感染的MLE-12细胞中NP蛋白的表达(n＝5，**p＜0.01，*p＜0.05)。病毒感染的细胞中NP蛋白水平显著上调，而转染了miR-205-5p的细胞在病毒感染后NP蛋白表达显著低于单纯感染细胞。
图14a和14b显示甲型流感病毒感染的肺组织和MLE-12细胞中miR-205- 5p和miR-431-5p的表达，其中图14a显示miR-205-5p和miR-431-5p在甲型流感病毒感染的肺组织中显著下调，而miR-205-5p被磷酸奥司他韦显著上调 (n＝10，**p＜0.01，*p＜0.05)；图14b显示miR-205-5p在甲型流感病毒感染的 MLE-12细胞中下调，并被磷酸奥司他韦显著上调(n＝3，**p＜0.01，*p＜0.05)。
发明详述
1.定义
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。
术语″miRNA″亦称为″微小RNA″或″miR″，是指来自miR基因的未加工的或加工过的RNA转录物。未加工的miR基因转录物也称作″miR 前体″，通常包含长度为约70-100个核糖核苷酸的RNA转录物。miR前体可以用RNA酶(例如，Dicer，Argonaut，或RNA酶III(例如，大肠杆菌RNA 酶III))消化加工成有活性的长度为19-25个核糖核苷酸的RNA分子。该有活性的19-25个核苷酸的RNA分子也称作″加工过的″miR基因转录物或″成熟的″miRNA。所述有活性的19-25个核苷酸的RNA分子可以通过天然加工途径(例如，使用完整细胞或细胞裂解物)或通过合成加工途径(例如，使用分离的加工酶，例如分离的Dicer、Argonaut或RNA酶III)从miR前体得到。应当理解，所述有活性的19-25个核苷酸的RNA分子也可以通过生物或化学合成直接生成，不必从miR前体加工。当在本文中提及miRNA时，该名称对应着前体和成熟形式两者，除非另有说明。
术语″miR-205-5p″是miRNA中的一员，它在小鼠、红鳍东方豚、斑马鱼和人等多种生物体中表达。通过查询miRbase数据库，小鼠mmu-miR-205- 5p(miRbase数据库编号MIMAT0000238)和人has-miR-205-5p(miRbase数据库编号MIMAT0000266)的pri-miRNA最先由位于1q32.2的对应基因在RNA 聚合酶II的作用下转录形成，pri-miRNA进一步自我折叠形成一个发夹状的结构。在细胞核内，RNase III核酸酶Drosha联合DGCR8蛋白对pri-miRNA进行剪切，之后形成pre-miRNA，最终由Dicer酶和辅助因子TRBP将其加工为成熟的miR-205-5p。miR-205-5p的表达具有组织特异性，在乳腺、前列腺和胸腺等组织中均能够检测到其表达；此外，miR-205-5p在体液中亦存在一定的表达量。人和小鼠的miR-205-5p具有完全相同的序列5’-UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG-3’，因此小鼠miR-205-5p和人miR-205-5p对甲型流感病毒的NP基因具有基本上完全相同的作用。
术语″过表达″即过度表达，是指当基因转录或表达的严格控制被打乱时，基因可能以高速度和/或高浓度被转录或表达，从而导致大量mRNA产生或者大量蛋白质产物出现的过程。在一个实施方案中，″过表达″与″提高表达水平和/或提高表达产物稳定性″同义。
术语″受试者″是科研的重要组成部分，受试者不仅是被研究的载体，也是创新和互动式的研究中的合作者。本发明中的受试者可为接受治疗的患者，其与健康者相比具有一种或多种性质的改变。在一个实施方案中，本发明中的受试者可为甲型流感的患者或甲型流感病毒的感染者。在一个实施方案中，本发明中的受试者中的核蛋白(NP)的表达相对于健康受试者增加。在一个实施方案中，本发明中的受试者包括但不限于小鼠和人。
术语″药学上可接受的载体和/或辅料″是指药学领域常规使用的任何药物载体或辅料，包括但不限于：稀释剂、赋形剂、填充剂(如淀粉、糊精、蔗糖、甘露醇、乳糖和微晶纤维素等)、粘合剂(如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮等)、润湿剂(如甘油等)、崩解剂(如甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠等)、吸收促进剂(如季铵化合物等)、表面活性剂(如十六烷醇、吐温80和十二烷基硫酸钠等)、吸附剂(如高岭土和皂粘土等)、润滑剂(如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、微粉硅胶和聚乙二醇等)以及其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
术语″(过)表达载体″是指可将DNA或RNA序列引入宿主细胞中以转化宿主并促进所引入的序列的表达的运载体，其可包括启动子序列、目标序列、终止子序列、调控序列、定位序列、标记序列等等。本发明的(过)表达载体至少包括以如下三种形式构建的载体：pri-miRNA形式、pre-miRNA形式、成熟-miRNA形式。本发明的(过)表达载体可为本领域中采用的任何商业上可得到的(过)表达载体。
术语″PCR″即聚合酶链式反应，是指一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制。PCR通常包括是利用DNA在高温(～95℃)时变性成为单链，在低温(～60℃)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，然后在DNA聚合酶最适反应温度(～72℃)沿着5′-3′的方向合成互补链的过程。
2.本发明的用途
本发明具体涉及miRNA在制备用于治疗受试者中的甲型流感的药物中的用途，其中所述miRNA为miR-205-5p。在一个实施方案中，其中所述miR- 205-5p是过表达的。在一个实施方案中，其中所述miR-205-5p是在(过)表达载体中过表达的。在一个实施方案中，所述受试者中的核蛋白(NP)的表达相对于健康受试者增加。在一个实施方案中，miR-205-5p能够抑制所述受试者中NP的表达。在一个实施方案中，miR-205-5p通过与NP基因结合而抑制所述受试者中NP的表达。在一个实施方案中，miR-205-5p通过与核蛋白(NP) 基因互补而抑制所述受试者中的核蛋白的表达，从而抑制甲型流感病毒的复制。
3.本发明的药物组合物和试剂盒
本发明具体涉及用于治疗甲型流感或抑制甲型流感病毒的药物组合物和试剂盒。在一个实施方案中，所述药物组合物和试剂盒包括提高miR-205- 5p的表达水平和/或提高其表达产物稳定性的物质和任选的药学上可接受的载体和/或辅料。在一个实施方案中，所述提高miR-205-5p的表达水平的物质为miR-205-5p过表达载体和/或转化了miR-205-5p过表达载体的细胞。在一个实施方案中，所述提高miR-205-5p的表达水平的物质为用于通过PCR 对miR-205-5p进行扩增的物质。
4.本发明的筛选治疗甲型流感或抑制甲型流感病毒的药物的方法、用途和试剂盒。
本发明具体涉及筛选用于治疗甲型流感或抑制甲型流感病毒的药物的方法，其包括：(1)确定被甲型流感病毒感染的组织或细胞中miR-205-5p的表达水平；(2)施用潜在的治疗甲型流感或抑制甲型流感病毒的药物；(3)在上述施用后再次确定所述组织或细胞中miR-205-5p的表达水平；(4)如果(3)中的表达水平相对于(1)中的表达水平被上调，则将所述药物确定为治疗甲型流感或抑制甲型流感病毒的药物。本发明具体涉及测定miR-205-5p的表达水平的试剂在制备用于筛选治疗甲型流感或抑制甲型流感病毒的药物的试剂盒中的用途。在一个实施方案中，所述试剂包括(1)提取被甲型流感病毒感染的组织或细胞中的总RNA的试剂；和(2)以所述总RNA为模板对miR-205- 5p进行定量逆转录酶-聚合酶链式反应的试剂。本发明具体涉及用于筛选治疗甲型流感或抑制甲型流感病毒的药物的试剂盒，所述试剂盒包括用于确定被甲型流感病毒感染的组织或细胞中miR-205-5p的表达水平的试剂。在一个实施方案中，所述试剂包括：(1)提取被甲型流感病毒感染的组织或细胞中的总RNA的试剂；和(2)以所述总RNA为模板对miR-205-5p进行定量逆转录酶-聚合酶链式反应的试剂。
实施例
下面通过说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地说明，所述实施例只用于解释本发明的技术方案，但并非用于限定本发明的范围。下述实施例中未注明具体的实验方法，均为常规方法或条件；所使用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径购买得到。
实施例1：甲型流感病毒感染小鼠肺组织中microRNA表达
1.试验材料
1.1实验动物
表1.实验动物的表征
1.2病毒株
甲型流感病毒(A/Puerto Rico/8/34，PR8株)，购买于美国ATCC，本实验室传代，-80℃保存。
2.试验方法及结果
2.1甲型流感病毒PR8株感染小鼠肺炎模型构建
36只ICR小鼠(SPF级，13-15g)，按体重随机分为3组：正常对照组、感染2天组、感染5天组，每组12只，雌雄各半。除正常对照组外，其他各组小鼠乙醚轻度麻醉后，滴鼻感染15×LD50甲型流感病毒PR8株病毒液，每只35μl。感染第2天，小鼠称重后断颈处死，分离肺组织后称量肺湿重，肺组织分为2部分：一部分液氮速冻并保存在液氮中，另一部分用组织固定液固定。按公式：肺指数＝肺湿重(g)×100/体重(g)，计算肺指数；按公式：体重损失率(％)＝[正常对照组体重(g)-模型对照组体重(g)]/正常对照组体重(g)，计算体重损失率。数据采用均数±标准差表示，采用SPSS17.0统计软件进行数据统计，采用单因素方差分析(ANOVA)进行数据分析，P＜0.05为差异存在统计学意义。
表2结果显示：与正常对照组比较，感染2天组与感染5天组肺指数显著增加(P＜0.01)；与感染2天组比较，感染5天组肺指数显著增加(P＜0.01)。感染2天组与感染5天组体重损失率分别为25.23％，38.45％。
表2.甲型流感病毒PR8株感染小鼠肺炎模型肺指数及体重损失率的变化
注：与正常对照组比较**P＜0.01；与感染2天组比较##P＜0.01。
2.2甲型流感病毒PR8株感染小鼠肺炎模型肺组织病理改变
固定于组织固定液中的肺组织，24小时后取出用流水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，切片，H&E染色，中性树胶封片，显微镜下观察、照相。甲型流感病毒PR8株感染小鼠肺炎模型肺组织病理改变参见图1a 和1b。
图1a和1b结果显示：正常对照组小鼠肺、支气管周围未见有炎症，肺泡、间质未见有明显炎症浸润，结构正常。感染2天组小鼠肺、支气管周围有不同程度炎症，肺泡间质有轻重不等炎症浸润，炎症以小淋巴为主，并有少量浆细胞和单核细胞，有肺本身细胞增殖。感染5天组小鼠肺、支气管周围有不同程度炎症，个别肺间质出血、渗出较重，有大量炎症细胞浸润，以淋巴细胞为主，并有浆细胞和单核细胞；支气管粘膜内膜细胞消失。
2.3 microRNA基因芯片分析
取出保存在液氮中的肺组织，每组肺组织随机混合成3份混合样本，每份混合样本包含4个肺组织，在液氮保护下研磨，采用Qiagen miRNeasy Mini 试剂盒(Qiagen，Germany)提取总RNA。所有步骤按试剂盒说明书进行。
采用Affymetrix miRNA 4.0基因芯片对3组(每组三个混合样本)总RNA 进行上机检测。随机方差模型(RVM)F检验用于筛选各组间的差异表达 microRNA，经过显著性(P-值)分析和错误发现率(FDR)分析，根据P值阈值 (P＜0.05)选择差异表达基因。
图2结果显示：共筛选出82个差异表达的microRNA，其中包括microRNA-205-5p。
2.4生物信息学分析
采用Series Test of Cluster(STC)分析对差异microRNA表达趋势进行分析。
图3和表3结果显示：共筛选出1个显著性下调microRNA簇，其中包含14个显著性下调microRNA，其中包括microRNA-205-5p。
表3显著性下调microRNA簇
miRNA 对照 2-天 5-天 簇编号
mmu-miR-30c-1-3p 0 -0.12143 -1.26038 15
mmu-miR-34b-3p 0 -0.08411 -1.74717 15
mmu-miR-92b-3p 0 0.129891 -1.08129 15
mmu-miR-149-5p 0 -0.03333 -1.79601 15
mmu-miR-375-3p 0 0.317032 -0.97915 15
mmu-miR-34c-3p 0 -0.1853 -1.31436 15
mmu-miR-449a-5p 0 0.074039 -1.37899 15
mmu-miR-449c-5p 0 -0.03664 -1.71842 15
mmu-miR-411-3p 0 0.218616 -1.22654 15
mmu-miR-431-5p 0 0.184807 -0.82167 15
mmu-miR-744-3p 0 -0.26914 -1.60234 15
mmu-miR-205-5p 0 0.665344 -2.83009 15
mmu-miR-208a-5p 0 0.431046 -1.30526 15
mmu-miR-299a-3p 0 -0.04044 -1.15337 15
实施例2：可以调控甲型流感病毒的宿主microRNA分析
1.试验材料
(1)实施例1得到的总RNA样本
(2)RevertAidTM第一链cDNA Synthesis试剂盒(Thermo，美国)
(3)Maxima SYBR Green qPCR预混液(Thermo，美国)
(4)引物，如下表4所示，由上海生工合成
表4.引物的表征
2.试验方法及结果
2.1测定肺组织中的病毒基因表达水平
采用RevertAidTM第一链eDNA Synthesis试剂盒对实施例1中的总RNA 样本进行逆转录，所有步骤按试剂盒说明书进行。
(1)如表5所示配置反应体系(20μL)：
表5.反应体系
(2)反应条件如表6所示：
表6.反应条件
采用Maxima SYBR Green qPCR预混液对逆转录得到的eDNA进行实时荧光定量PCR，所有步骤按试剂盒说明书进行。目的基因为PB1、PB2、 NP、PA。
(1)如表7所示配置实时荧光定量PCR反应体系(20μL)：
表7.实时荧光定量PCR反应体系
(2)实时荧光定量PCR反应条件如表8所示：
表8.实时荧光定量PCR的反应条件
图4、图5、图6、图7结果显示：与正常对照组比较，甲型流感病毒感染的小鼠肺组织中病毒PB1、PB2、NP、PA基因表达显著上调。
2.2可以调控甲型流感病毒基因的宿主microRNA分析预测
甲型流感病毒(A/Puerto Rico/8/34，PR8株)是RNA病毒，核酸由8个基因节段组成，分别编码核蛋白(NP)、碱性聚合酶1(PB1)、碱性聚合酶2(PB2)、酸性聚合酶(PA)、基质蛋白(M)、非结构蛋白(NS)、神经氨酸酶(NA)、血凝素 (HA)。甲型流感病毒的核糖核蛋白体复合物(vRNP)是其最基本的复制单位，由病毒RNA及4种病毒蛋白(NP、PB1、PB2、PA)组成，参与病毒基因的转录和复制。在病毒复制过程中，这4种病毒蛋白不仅功能重要，而且存在很多保守位点，针对它们寻找新的抗病毒靶点，具有较强的可行性。
通过生物信息学方法预测microRNA的作用靶标是当前筛选和识别 microRNA靶标的较为理想的途径，而miRanda则是目前预测microRNA较为理想的数据库。miRanda预测碱基互补分析遵循四个规则：(1)microRNA 的第2-4位碱基必须与mRNA的3’UTR精确匹配；(2)microRNA的第3-12 位碱基错配小于或等于五个；(3)第9-25位的碱基至少有一个错配；(4)microRNA的最后五个碱基错配不能多于两个。miRanda采用了一种类似与 Smith-Waterman的算法来构造打分矩阵，允许G-U错配。互补的打分规则为：A-U和G-C为+5、G-U为+2、其他错配方式为-3、空位罚分为-8、空位延伸罚分-2。为了体现出microRNA 5’端和3’端在靶基因结合过程中作用的不均一性，miRanda软件设定了缩放(scale)参数，即microRNA 5’端前11个碱基的互补得分乘以缩放参数，再和3’端11个碱基互补得分相加作为序列的最终碱基互补得分。其次，在microRNA与靶基因形成二聚体的热力学稳定性方面，miRanda利用Vienna软件包中得RNAlib计算microRNA与mRNA 3’UTR结合的自由能。最后，miRanda要求靶点在多物种间保守，即靶点在多物种3’UTR序列比对中相同位置具有相同的碱基。甲型流感病毒基因无 3’UTR序列，此处采用全基因序列。
采用上述生物信息学分析方法预测microRNA-205-5p的作用靶标，待预测病毒基因序列号为：NC_002021.1(PB1)，NC_002023.1(PB2)，NC_002019.1 (NP)，NC_002022.1(PA)，NC_002016.1(26..1007)(M2)，NC_002016.1(26..784)(M1)。
表9结果显示：宿主microRNA-205-5p可以调控的甲型流感病毒 (A/Puerto Rico/8/34，PR8株)靶标基因有核蛋白(NP)、碱性聚合酶1(PB1)、碱性聚合酶2(PB2)、酸性聚合酶(PA)。
表9.基因比对结果
实施例3：宿主microRNA-205-5p对病毒NP基因调控的验证试验
1.材料和方法
所有涉及动物的步骤均由动物管理与使用委员会(中国中医科学院，中国，北京)批准。动物研究严格按照中国中医科学院(中国北京)的《实验动物管理与使用指南》中的建议进行。
1.1病毒
研究中使用的病毒株是A/Puerto Rico/8/34(PR8，H1N1)(ATCC，USA)，其为一种经过充分表征的、小鼠适应的甲型流感病毒实验室株。它被用作产生灭活流感病毒疫苗的病毒的遗传骨架。所有活流感病毒实验均在动物生物安全2级(ABSL-2)实验室或生物安全2级(BSL-2)实验室中进行。
1.2甲型流感病毒肺炎的小鼠模型
雄性和雌性ICR小鼠(SPF，14±1g)用异氟烷轻度麻醉并滴鼻感染 15×LD50的A/Puerto Rico/8/34(PR8，H1N1)(ATCC，USA)。另外，对未感染组滴鼻等体积生理盐水。病毒感染第5天，断颈处死小鼠，并解剖取肺组织。
2.碱基互补分析
实施例2表明，14个miRNA的簇(即miR-30c-1-3p、miR-34b-3p、miR- 92b-3p、miR-149-5p、miR-375-3p、miR-34c-3p、miR-449a-5p、miR-449c-5p、miR-411-3p、miR-431-5p、miR-744-3p、miR-205-5p、miR-208a-5p和miR- 299a-3p)是患有由甲型流感病毒引起的肺炎的小鼠的肺组织中唯一显著下调的miRNA基因簇。在此，使用miRanda分析NP基因与上述14个miRNA 之间的碱基互补性。
miRanda碱基互补分析遵循四个规则：(1)miRNA的碱基2-4必须与 mRNA 3′-UTR精确匹配；(2)miRNA的碱基3-12中的错配小于或等于5； (3)碱基9-25中至少有一个错配；(4)miRNA的最后五个碱基不能有多于两个错配。miRanda使用类似于Smith-Waterman的算法以构建允许G-U错配筛选的评分矩阵。互补评分规则为：A-U和G-C为+5、G-U为+2、其他错配为-3、空位罚分-8、空位延伸罚分-2。为了反映靶基因结合过程中miRNA5’端和3’端的异质性，miRanda软件设置了缩放参数，即miRNA 5’端前11个碱基的互补得分乘以缩放参数，结果加上miRNA 3’端11个碱基的互补得分。结果是序列的最终碱基互补得分。其次，miRanda利用Vienna软件包中的 RNAlib计算miRNA与靶基因mRNA 3’-UTR结合的自由能，以估计miRNA-靶基因二聚化的热力学稳定性。最后，miRanda要求靶标在多个物种间保持保守，即靶标在多个物种的3’-UTR序列比对中的同一位置具有相同的碱基。甲型流感病毒基因无3’UTR序列，此处采用全基因序列。
3.使用培养的MLE-12细胞的感染模型
小鼠肺上皮(MLE-12)细胞系购自BeNa培养物保藏中心(中国)。细胞在含有10％(v/v)胎牛血清(FBS，Gibco，USA)的DMEM培养基(Hyclone，USA) 中，在37℃、95％空气-5％CO2的湿润气氛中培养。用104×TCID50 PR8病毒感染这些培养的MLE-12细胞1小时。随后，将感染溶液替换为维持溶液 (含有2％(v/v)FBS的DMED)，继续培养48小时。
4.双荧光素酶报告基因分析
将含miR-205-5p、miR-431-5p、miR-744-3p结合位点的NP基因序列加载到pmirGlo载体中。miR-205-5p、miR-431-5p、miR-744-3p模拟物和阴性对照(NC)由Genepharma(中国)合成。将293T细胞用加载NP基因的pmirGlo 载体和miR-205-5p、miR-431-5p、miR-744-3p模拟物或NC(使用lipofectamine 2000(Invitrogen，USA))共转染。用含有NP基因序列的pmirGlo载体转染的 293T细胞用作对照。共转染24小时后收获细胞，并在多标记微孔板检测器 (PerkinElmer EnSpire，USA)上用双荧光素酶报告基因测定系统(Promega E1960，USA)测量荧光素酶活性。
5.MicroRNA功能验证
将NP基因(1525bp)加载到pcDNA3.1载体中。miR-205-5p、miR-431-5p、 miR-744-3p和NC由Genepharma(中国)合成。将293T细胞用含有NP基因的pcDNA3.1载体和miR-205-5p、miR-431-5p、miR-744-3p或NC的pcDNA3.1 载体(使用lipofectamine 2000)共转染。未处理的细胞作为空白对照，用 lipofectamine 2000处理的细胞作为阴性对照，仅用pcDNA3.1载体转染的细胞作为载体对照。共转染后48小时收获细胞，并进行蛋白质印迹(Western Blotting)实验，使用针对目的蛋白为NP，内参蛋白为(Abcam，USA)和甘油醛 3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(Cell Signaling，USA)的一抗作为内部对照进行蛋白质 (Western)印迹。
6.MicroRNA过表达验证
MLE-12细胞在6孔培养板中培养，然后使用lipofectamine 2000将miR- 205-5p模拟物、miR-205-5p抑制剂、miR-431-5p模拟物、miR-431-5p抑制剂、阴性对照(NC)或抑制剂阴性对照(INC)转染细胞，转染48小时。这些 miRNA模拟物(或相应的抑制剂)转染的MLE-12细胞同时感染了甲型流感病毒(MLE-12感染模型)。以完全培养基培养的细胞作为正常对照。
7.定量逆转录酶-聚合酶链式反应(qRT-PCR)
进行qRT-PCR以验证肺组织和MLE-12细胞中NP、miR-205-5p和miR- 431-5p的表达水平。用Trizol提取的总RNA(0.5μg)，使用M-MLV逆转录酶(Thermo，USA)以NP的随机引物及miR-205-5p和miR-431-5p的特殊茎环引物(Genepharma，中国)进行逆转录。使用PowerSYBR Green PCR Master混合物(ABI，USA)和Hairpin-it microRNA检测试剂盒(Genepharma，中国)在实时PCR系统(ABI，USA)上进行qRT-PCR。所有样品(包括无模板对照)都包含4个复孔。相对表达水平通过2-ΔΔCt法测定，并归一化为GAPDH或U6。
8.蛋白质印迹分析
从肺组织或MLE-12细胞中提取蛋白质样品。采用SDS-PAGE对蛋白质样品(20μg)进行电泳分析。使用针对目的蛋白NP的一抗(Abcam，USA)，及针对内参蛋白GAPDH的一抗(CellSignaling，USA)进行印记分析。
9.组织病理学分析
将肺组织固定在组织细胞固定液中，梯度乙醇脱水，包埋在石蜡中，切成4-μm厚的切片，并用苏木精和伊红(H&E)染色。使用光学显微镜(Olympus， Japan)拍摄组织病理学照片。
10.统计分析
所有结果均表示为平均值±标准偏差采用SPSS17.0软件进行数据分析，方差分析(ANOVA)用于检验方差齐性。方差齐时采用LSD检验；当方差不齐时使用Dunnett T3检验。显著性水平设定为p＜0.05；p＜0.01表示高度显著差异。
11.结果
甲型流感病毒肺炎的小鼠模型
我们构建甲型流感病毒感染的小鼠肺炎模型。采用肺指数和病理变化对模型进行评价。肺指数定义为每100克体重的肺湿重。甲型流感病毒感染引起高度显著的肺指数增加。此肺指数增加可被磷酸奥司他韦(一种甲型流感病毒特异性药物)显著降低(图8a)。甲型流感病毒感染引起几种肺组织病理变化：在肺组织中观察到细胞增殖、炎性细胞渗出、细胞脱落和不同的肺泡腔大小。这些变化可被磷酸奥司他韦改善(图8b)。
甲型流感病毒感染的肺组织和MLE-12细胞中的NP蛋白表达
通过Western Blot分析验证了NP蛋白在甲型流感病毒感染的肺组织和 MLE-12细胞中的差异表达。NP蛋白表达水平在甲型流感病毒感染的肺组织和MLE-12细胞中均被证实上调，并被磷酸奥司他韦下调(图9a和图9b)。
三种miRNA(miR-431-5p、miR-744-3p和miR-205-5p)与NP基因互补
在上述实施例中，发现了14种miRNA，包括miR-30c-1-3p、miR-34b- 3p、miR-92b-3p、miR-149-5p、miR-375-3p、miR-34c-3p、miR-449a-5p、miR- 449c-5p、miR-411-3p、miR-431-5p、miR-744-3p、miR-205-5p、miR-208a-5p 和miR-299a-3p在甲型流感病毒感染性肺炎小鼠的肺组织(Bao Y.等，Mol Genet Genomics，2015，290(5)：1885-1897)中被下调。在这里，miRanda预测了miR-431-5p、miR-744-3p和miR-205-5p与NP基因互补。通过查询miRBase 数据库得知这3个miRNA在小鼠和人基因组中基因序列完全相同，因此上述结果同时可用于人的相关研究(表10和图10)。
表10.与NP基因互补的miRNA
miR-431-5p和miR-205-5p能够靶向NP基因
双荧光素酶报告基因分析用于验证miR-431-5p、miR-744-3p或miR-205- 5p与NP基因的结合。我们将包含miR-431-5p、miR-744-3p、miR-205-5p结合位点的NP基因序列加载到pmirGlo载体中。将该载体与miR-205-5p、miR- 431-5p或miR-744-3p模拟物共转染到293T细胞中，24小时后进行双荧光素酶活性测定。与对照组相比，miR-205-5p和miR-431-5p模拟物显著抑制双荧光素酶报告基因的相对活性(图11a和11b)。因此，miR-205-5p和miR-431-5p可以与NP基因结合位点紧密结合，从而抑制下游基因表达。
miR-431-5p和miR-205-5p抑制NP蛋白表达
NP全基因真核细胞过表达分析用于进一步验证miR-205-5p、miR-744- 3p或miR-431-5p通过与NP基因结合而抑制NP蛋白表达。将NP全基因加载到pcDNA3.1载体中。将该载体与miR-205-5p、miR-431-5p或miR-744-3p 模拟物共转染到293T细胞中，48小时后收获蛋白质。进行蛋白质印迹实验以检测NP蛋白表达水平。与对照组相比，miR-205-5p、miR-431-5p和miR- 744-3p模拟物均可抑制NP蛋白表达水平。miR-205-5p模拟物对NP蛋白表达水平的抑制作用(p＜0.01)强于miR-431-5p和miR-744-3p模拟物(p＜0.05) (图12a和12b)。
miR-205-5p过表达可以抑制甲型流感病毒复制
使用过表达miR-205-5p或miR-431-5p的MLE-12细胞来验证它们对甲型流感病毒复制的抑制作用。NP蛋白表达水平用于评估甲型流感病毒的复制能力。用miRNA模拟物(miR-205-5p、miR-431-5p模拟物或其抑制剂)转染 MLE-12细胞并同时感染甲型流感病毒。48小时后，从这些细胞中提取总蛋白并进行蛋白质印迹实验以检测NP蛋白表达水平。在过表达miR-205-5p的甲型流感病毒感染的MLE-12细胞中，NP蛋白表达显著降低(图13)。因此，证明了miR-205-5p通过抑制NP蛋白的表达实现抗甲型流感病毒的作用。
miR-205-5p：用于治疗甲型流感病毒感染的药物的可用靶标
通过qRT-PCR验证了miR-431-5p和miR-205-5p在甲型流感病毒感染的肺组织和MLE-12细胞中的差异表达。miR-205-5p表达被证实在所述肺组织和MLE-12细胞中显著下调，并且可被磷酸奥司他韦上调(图14a)。因此，证明了miR-205-5p是用于抗甲型流感病毒药物的可用靶标。miR-431-5p表达的体内和体外实验结果不一致；磷酸奥司他韦没有上调其表达，这表明 miR-431-5p不是针对甲型流感病毒药物的可用靶标(图14b)。
申请人声明，本发明通过上述实施例来举例说明本发明，但本发明并不局限于上述具体实例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例中详细内容才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (6)

1.miRNA在制备用于治疗受试者中的甲型流感的药物中的用途，其中所述miRNA为miR-205-5p。
2.权利要求1所述的用途，其中所述miR-205-5p为过表达的。
3.权利要求1或2所述的用途，其中所述受试者中的核蛋白的表达相对于健康受试者增加。
4.药物组合物在制备用于治疗甲型流感或抑制甲型流感病毒的药物中的用途，其中所述组合物包括提高miR-205-5p的表达水平的物质和任选的药学上可接受的载体和/或辅料，其中所述提高miR-205-5p的表达水平的物质为miR-205-5p过表达载体和/或转化了miR-205-5p过表达载体的细胞。
5.试剂盒在制备用于治疗甲型流感或抑制甲型流感病毒的药物中的用途，其中所述试剂盒包括提高miR-205-5p的表达水平的物质和任选的药学上可接受的载体和/或辅料，其中所述提高miR-205-5p的表达水平的物质为miR-205-5p过表达载体和/或转化了miR-205-5p过表达载体的细胞。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的用途，其中所述提高miR-205-5p的表达水平的物质为用于通过PCR对miR-205-5p进行扩增的物质。
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